專利名稱：一種具有抗腫瘤作用的血清制劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用蛇毒提取具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法。
癌癥的化學(xué)治療是降低癌癥死亡率的重要措施。用蛇毒及其有效組分抗癌的研究在國內(nèi)外都已經(jīng)開展，并取得一定的成果，特別是在眼鏡蛇毒方面，已先后有用全蛇毒制劑或它的有效組分體內(nèi)注射或體外培養(yǎng)抗癌的報(bào)道，但由于眼鏡蛇毒中成分復(fù)雜，大多數(shù)組分直接進(jìn)入體內(nèi)都可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)，直接用全蛇毒或其某一成分(如對(duì)細(xì)胞有直接溶解作用的組分)的體外抗癌雖確有一定效果，臨床實(shí)際應(yīng)用則風(fēng)險(xiǎn)很大，因此，這些研究成果很難在臨床應(yīng)用和推廣。國內(nèi)外已有用眼鏡蛇毒組分與單抗偶聯(lián)導(dǎo)向性殺傷腫瘤細(xì)胞的研究，但因偶聯(lián)物易于解體而導(dǎo)致眼鏡蛇毒組分脫落失效，或因分子較大不易進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部，以及目前缺乏對(duì)人類腫瘤細(xì)胞親和力強(qiáng)的單抗等原因，眼鏡蛇毒組分與單抗偶聯(lián)導(dǎo)向性殺傷腫瘤細(xì)胞的方法對(duì)人類腫瘤，特別是實(shí)體瘤的療效不確切，目前尚難用于臨床；國內(nèi)有學(xué)者報(bào)道眼鏡蛇毒通過口服途徑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有明顯的抗癌作用，且無明顯的毒副作用，其療效經(jīng)臨床試用得到證實(shí)，但直接用蛇毒口服對(duì)于有消化道破損的病人有直接進(jìn)入血液循環(huán)的危險(xiǎn)，不利于在臨床推廣應(yīng)用，因此有必要對(duì)其制劑加以改造。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種毒性低、選擇性高、療效確切的具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法制得的具有抗腫瘤作用的血清制劑。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述具有抗腫瘤作用的血清制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明是通過下述的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法包括下列步驟(1)給動(dòng)物口服蛇毒或蛇毒在體外消化、變性的產(chǎn)物，連續(xù)口服一天以上；(2)在動(dòng)物服用蛇毒或其消化、變性產(chǎn)物后抽取該動(dòng)物的血清；(3)將抽取的血清加工成制劑。
給動(dòng)物口服蛇毒的劑量范圍為給大型動(dòng)物每日口服量按體表面積折算相當(dāng)于家兔劑量10mg/kg～該動(dòng)物的最大耐受量。
具體地說，可以給健康成年家兔每日口服11.2～45mg/kg的眼鏡蛇毒或給其他大型動(dòng)物口服按體表面積折算與家兔劑量11.2～45mg/kg相應(yīng)等效劑量的眼鏡蛇毒，連續(xù)口服的時(shí)間為3～5天。
本發(fā)明還涉及由本方法制得的具有抗腫瘤作用的血清制劑在制備治療或預(yù)防肝癌、肺癌、鼻咽癌、白血病等多利人類惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有的用蛇毒治療腫瘤的方法相比具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(一)毒性低由于眼鏡蛇毒中成分復(fù)雜，含有多種對(duì)機(jī)體有劇毒的毒素，大多數(shù)天然組分直接注射入體內(nèi)都可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重毒性反應(yīng)，直接注射給藥的方法風(fēng)險(xiǎn)太大，難于在臨床應(yīng)用，直接用眼鏡蛇毒口服也有一定的危險(xiǎn)性。眼鏡蛇毒中具有生物活性的組分均為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，經(jīng)由本方法通過動(dòng)物口服給藥后，這些蛋白質(zhì)經(jīng)過動(dòng)物的胃腸道內(nèi)消化酶的消化和肝內(nèi)首關(guān)消除，最終以各種小分子消化產(chǎn)物的形式進(jìn)入體循環(huán)，眼鏡蛇毒的原有毒性將不復(fù)存在，因而由本方法制得的血清制劑不會(huì)產(chǎn)生全身性的毒性反應(yīng)，使用非常安全。
(二)選擇性高、副作用小既往研究中，用眼鏡蛇毒或其組分的體內(nèi)、體外抗癌實(shí)驗(yàn)表明，它們與傳統(tǒng)化療藥一樣，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也一定程度地對(duì)正常機(jī)體細(xì)胞，特別是增殖較快的機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性。而本發(fā)明制得的血清制劑在對(duì)人肝癌、肺癌、白血病及鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯細(xì)胞毒性的同時(shí)，對(duì)增殖較快的正常人胚肺成纖維細(xì)胞完全沒有細(xì)胞毒性，因而副作用較小。
(三)療效確切先期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證已證實(shí)口服眼鏡蛇毒具有一定的抗癌作用，而由本發(fā)明制得的血清制劑由于具有毒性低和選擇性高的優(yōu)點(diǎn)，因而治療范圍大，劑量調(diào)整空間充足，不會(huì)受到毒性作用的制約，易于確保體內(nèi)達(dá)到足夠的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證明本發(fā)明對(duì)多種腫瘤具有明顯的抗癌活性，既抑制癌細(xì)胞增殖，更促進(jìn)其凋亡。同時(shí)，由于消化吸收產(chǎn)物的分子變小，更易進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部和跨膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，有利于充分發(fā)揮其藥理作用。
(四)應(yīng)用前景好由于本發(fā)明具有上述特點(diǎn)，因而較之既往研究的眼鏡蛇毒制劑更有利于在臨床推廣應(yīng)用；又由于本發(fā)明的原料資源非常豐富，制備方法簡便，所以可極方便地批量生產(chǎn)；由本方法制得的產(chǎn)品為血清凍干粉，便于保存，也便于根據(jù)需要制作膠囊劑或注射劑使用，同時(shí)，它還為進(jìn)一步分離純化出有效組分，以生化制藥手段開發(fā)安全、高效的國家一類抗癌新藥提供了良好的基礎(chǔ)。
為了更好地體現(xiàn)本發(fā)明的效果，下面將用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果來說明由本方法制得的血清制劑對(duì)人體腫瘤細(xì)胞的抑制作用及低毒特點(diǎn)。在體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)口服眼鏡蛇毒的動(dòng)物血清對(duì)HpeG2等多種人類腫瘤細(xì)胞確能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒作用，可使腫瘤細(xì)胞生存率明顯下降，而與之對(duì)照的動(dòng)物空白血清作用明顯較弱；該血清與動(dòng)物空白血清相比，對(duì)增殖迅速的人胚肺成纖維細(xì)胞完全沒有細(xì)胞毒作用。該血清對(duì)癌細(xì)胞的分裂指數(shù)有明顯的抑制，表明它具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用；流式細(xì)胞儀檢查及DNA條帶分析結(jié)果表明，它還可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。用昆明種小鼠口服該制劑的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠對(duì)高劑量蛇毒血清制劑的口服最大耐受量大于5g/kg，說明該制劑為低毒制劑。下面是相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.血清制劑的制備健康成年新西蘭兔21只，分為7組，每組3只，每日以眼鏡蛇毒(高劑量45mg/kg、低劑量22.5mg/kg)或蒸餾水灌胃，各組給藥方案分別為蛇毒45mg/kg×1天，蛇毒45mg/kg×3天，蛇毒45mg/kg×5天，蛇毒22.5mg/kg×1天，蛇毒22.5mg/kg×3天，蛇毒22.5mg/kg×5天，蒸餾水1ml/kg×3天。在末次給藥后4小時(shí)，在乙醚麻醉狀態(tài)下，經(jīng)動(dòng)物頸動(dòng)脈用無菌導(dǎo)管收集盡可能多的血液，待血液在體外凝結(jié)后，以1500轉(zhuǎn)/分速度離心15分鐘，抽取全部上清(血清)，合并組內(nèi)3只動(dòng)物的血清，經(jīng)60℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體后，冷凍干燥成凍干粉，常溫密封保存?zhèn)溆谩?br> 2.最佳給藥天數(shù)選擇以人肝癌HepG-2細(xì)胞株按常規(guī)方法體外培養(yǎng)，待細(xì)胞開始增殖并達(dá)到一定數(shù)量后，分別接種到含上述血清凍干粉1mg/ml的培養(yǎng)基中，48小時(shí)后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在高倍鏡下計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果表明灌服兩種劑量蛇毒動(dòng)物的血清在細(xì)胞毒作用上均為1天組較弱，3或5天組作用強(qiáng)度相似。表明連續(xù)給藥3天后，血清中藥物有效組分含量已達(dá)穩(wěn)態(tài)水平，可見3天為最佳給藥天數(shù)，以下實(shí)驗(yàn)均用給藥3天的血清為受試血清。
3.對(duì)四種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞毒作用按常規(guī)方法分別測定受試血清對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞四種腫瘤細(xì)胞，以及正常人胚肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。四種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)均分為13組進(jìn)行，分別為正常血清、低劑量蛇毒血清和高劑量蛇毒血清各3種濃度(凍干粉1、2.5、5mg/ml)，陽性對(duì)照藥阿霉素3種濃度(5、10、15μg/ml)，空白對(duì)照(正常培養(yǎng)基)，每組10孔。加藥48小時(shí)后作生存細(xì)胞計(jì)數(shù)，并參照空白對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)均值計(jì)算各受試藥對(duì)細(xì)胞的抑制率，結(jié)果分別見表1～表2。
表1.眼鏡蛇毒血清對(duì)四種腫瘤細(xì)胞生存數(shù)的影響(×103，x±s，n＝10)
與同濃度正常血清組比較* p＜0.05，**p＜0.01與阿霉素(5μg/ml)組比較#p＜0.05，##p＜0.01表2.眼鏡蛇毒血清對(duì)四種腫瘤細(xì)胞生存的抑制率(％，x±s，n＝10)
與同濃度正常血清組比較*p＜0.05，**p＜0.01與阿霉素(5μg/ml)組比較#p＜0.05，##p＜0.01上述結(jié)果經(jīng)雙因素方差分析，組間有非常顯著差異(p＜0.01)，組內(nèi)樣本間無明顯差異(p＞0.05)。組間t檢驗(yàn)結(jié)果見表內(nèi)標(biāo)記，與同濃度正常血清比較，高、低劑量蛇毒血清各組的細(xì)胞毒作用均顯著強(qiáng)于正常血清(p＜0.01)，確有獨(dú)特的細(xì)胞毒作用，低、高劑量蛇毒血清5mg/ml的強(qiáng)度稍強(qiáng)于阿霉素5μg/ml(p＜0.05或p＜0.01)。
正常細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分9組，為正常血清、高劑量蛇毒血清各4種濃度(0.5、1、2、5mg/ml)，空白對(duì)照(正常培養(yǎng)基)。每組10孔，給藥前先測定各樣本的細(xì)胞數(shù)，加藥72小時(shí)后作生存細(xì)胞計(jì)數(shù)，并參照給藥前的細(xì)胞數(shù)均值計(jì)算各受試藥對(duì)細(xì)胞的增殖率，結(jié)果見表3。
表3.限鏡蛇毒血清對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞生存數(shù)的影響(x±s，n＝10) 與同濃度正常血清組比較*p＜0.05，上述結(jié)果經(jīng)雙因素方差分析，組間有顯著差異(p＜0.05)，組內(nèi)樣本間無明顯差異(p＞0.05)。組間t檢驗(yàn)結(jié)果見表內(nèi)標(biāo)記。對(duì)正常人胚肺成纖維細(xì)胞，蛇毒血清表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖，其作用略強(qiáng)于正常家兔血清，去除家兔血清本身的作用，蛇毒消化產(chǎn)物對(duì)正常細(xì)胞完全沒有細(xì)胞毒作用，反而略有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的高度選擇性細(xì)胞毒作用。
4.抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
按常規(guī)方法分別測定受試血清對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞、人白血病HL-60細(xì)胞、人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞四種腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)的影響。四種腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)均分為4組進(jìn)行，分別為正常血清、高劑量蛇毒血清(濃度均為5mg/ml)，陽性對(duì)照藥阿霉素(15μg/ml)，空白對(duì)照(正常培養(yǎng)基)。每隔24小時(shí)各組做10張抹片，用HE染色后在高倍鏡下數(shù)100個(gè)完整細(xì)胞，累計(jì)10張片的1000個(gè)完整細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)，得出該組的細(xì)胞分裂指數(shù)，連續(xù)觀察7天，結(jié)果見表4～表7。
表4.眼鏡蛇毒血清對(duì)CNE-2細(xì)胞分裂指數(shù)的影響(10-3) 表5.眼鏡蛇毒血清對(duì)HepG-2細(xì)胞分裂指數(shù)的影響(10-3)
表6.眼鏡蛇毒血清對(duì)HL-60細(xì)胞分裂指數(shù)的影響(10-3)
表7.眼鏡蛇毒血清對(duì)肺腺癌細(xì)胞分裂指數(shù)的影響(10-3)
由上述結(jié)果可見，眼鏡蛇毒血清的抗細(xì)胞增殖作用較正常家兔血清為強(qiáng)，而與濃度為15μg/ml的阿霉素相近。說明它的細(xì)胞毒作用與抑制腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。
5.促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)在上一實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，用流式細(xì)胞法測定了受試藥物對(duì)肝癌和白血病細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果見表8。
表8.眼鏡蛇毒血清對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞凋亡率(％)的影響
結(jié)果表明，正常家兔血清不能明顯增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，而蛇毒血清則可使細(xì)胞凋亡率增加10倍以上，其作用接近15μg/ml濃度的阿霉素。DNA條帶分析也表現(xiàn)出類似結(jié)果，這提示眼鏡蛇毒血清對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用主要與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。
6.高劑量眼鏡蛇毒血清制劑口服的急性毒性試驗(yàn)取健康昆明種小鼠20只，雌雄各半，體重20.1±1.5g，禁食12小時(shí)后按5g/kg劑量一次灌胃給予25％濃度的高劑量蛇毒血清凍干粉溶液，經(jīng)連續(xù)14日觀察，未發(fā)現(xiàn)任何明顯毒性反應(yīng)，小鼠在觀察期內(nèi)無一死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠口服該制劑的最大耐受量大于5g/kg，由此可見該血清制劑為一種低毒制劑。
下面將描述本發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。
實(shí)施例1將眼鏡蛇毒粗毒干燥物用蒸餾水配制成4.5％濃度藥液，每日按1ml/kg體重給健康成年家兔灌胃，使用藥劑量相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)荷瘤小鼠口服眼鏡蛇毒有效劑量(30mg/kg)的4倍(按體表面積折算)，連續(xù)給藥3天；在末次給藥4小時(shí)后，在乙醚麻醉狀態(tài)下，經(jīng)動(dòng)物頸動(dòng)脈用無菌導(dǎo)管收集盡可能多的血液；待血液在體外凝結(jié)后，以1500轉(zhuǎn)/分速度離心15分鐘，抽取全部上清(血清)，經(jīng)60℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體后，冷凍干燥成凍干粉，常溫密封保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2按照實(shí)施例1中描述的方法，家兔口服的藥液濃度為含眼鏡蛇毒粗毒干燥物1.12％，使用藥劑量相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)荷瘤小鼠口服眼鏡蛇毒的有效劑量(按體表面積折算)。
實(shí)施例3按照實(shí)施例1中描述的方法，家兔口服的藥液濃度為含眼鏡蛇毒粗毒干燥物2.25％，使用藥劑量相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)荷瘤小鼠口服眼鏡蛇毒有效劑量的2倍(按體表面積折算)。
實(shí)施例4按照實(shí)施例1中描述的方法，但家兔口服眼鏡蛇毒藥液僅給藥1天。
實(shí)施例5按照實(shí)施例1中描述的方法，但家兔口服眼鏡蛇毒藥液為連續(xù)給藥5天。
實(shí)施例6按照實(shí)施例1中描述的方法，但家兔口服的眼鏡蛇毒粗毒先用胃蛋白酶在體外部分消化，其方法是將0.1克胃蛋白酶溶解于10ml 0.4％的稀鹽酸溶液中做成消化液，然后將眼鏡蛇毒4.5克加入消化液中，攪拌溶解后消化30分鐘，然后以蒸餾水稀釋至100ml。
實(shí)施例7按照實(shí)施例1中描述的方法，但家兔口服的眼鏡蛇毒粗毒藥液在給藥前先用100℃水浴加熱30分鐘，使其中的蛋白質(zhì)變性。
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法，其特征在于包括下列步驟(1)給動(dòng)物口服蛇毒或蛇毒在體外消化、變性的產(chǎn)物，連續(xù)口服一天以上；(2)在動(dòng)物服用蛇毒或其消化、變性產(chǎn)物后抽取該動(dòng)物的血清；(3)將抽取的血清加工成制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法，其特征在于給動(dòng)物口服蛇毒的劑量范圍為給動(dòng)物每日口服量按體表面積折算相當(dāng)于家兔劑量10mg/kg～該動(dòng)物的最大耐受量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法，其特征在于給健康成年家兔每目口服11.2～45mg/kg的眼鏡蛇毒或給其他大型動(dòng)物口服按體表面積折算與家兔劑量11.2～45mg/kg相應(yīng)等效劑量的眼鏡蛇毒，連續(xù)口服的時(shí)間為3～5天。
4.一種用權(quán)利要求1所述方法制備的具有抗腫瘤作用的血清制劑。
5.權(quán)利要求4所述的具有抗腫瘤作用的血清制劑在制備治療或預(yù)防肝癌、肺癌、鼻咽癌、白血病等多種人類惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤作用的血清制劑的制備方法,先給動(dòng)物定量口服一定劑量的蛇毒或其體外變性、消化的產(chǎn)物,連續(xù)口服一天以上;在動(dòng)物服用蛇毒或其消化、變性產(chǎn)物一定時(shí)間后抽取該動(dòng)物的血清;再將抽取的血清加工成制劑。本方法制得的血清制劑具有毒性低、選擇性高、療效確切、應(yīng)用前景好的優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于生產(chǎn)制備治療或預(yù)防肝癌、肺癌、鼻咽癌、白血病等多種人類惡性腫瘤的藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1333021SQ01114650
公開日2002年1月30日 申請(qǐng)日期2001年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月24日
發(fā)明者任先達(dá), 李紅良, 張海偉, 羅英儒, 葉春玲 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)