專利名稱：雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙鏈核糖核酸(dsRNA)的結(jié)構(gòu)是兩條單鏈核糖核酸(RNA)以所謂互補的方式由氫鍵相連構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。dsRNA被預(yù)期具抗病毒的生理活性，但我國對dsRNA的研究幾乎處于停滯狀態(tài)，原因是由于原有的核酸類藥物明顯的毒副作用而限制了它的臨床使用。
發(fā)明公開鑒于上述，本發(fā)明的目的是為以公知方法制備的dsRNA，找到新的醫(yī)療用途。
本發(fā)明所制備的核糖核酸是失配dsRNA，其制備方法是以RNA為基體，經(jīng)退火而成；核酸是核糖等與嘌呤環(huán)或嘧啶環(huán)相連，兩條RNA以所謂互補的方式由氫鍵相連構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明在dsRNA技術(shù)的基礎(chǔ)上，將分子大小分布由沉降系數(shù)為≤42s的dsRNA修飾至4-28s左右的失配dsRNA，以改變現(xiàn)有抗病毒藥物毒副作用大的缺點，通過對dsRNA的結(jié)構(gòu)的修飾，保留其原有的抗病毒功能，降低毒副作用，并用于治療包括病毒性心肌炎、肝炎、腦炎及呼吸道感染等疾病在內(nèi)的柯薩奇病毒感染。
高分子的dsRNA在體內(nèi)停留時間很短，可以很快地被RNA酶水解為短的堿基對片段，小的堿基對片段可以在細(xì)胞膜間傳遞，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮免疫作用，也可穿過粘膜，對體液、腦組織液等也有免疫作用。
實施發(fā)明的最佳方式在本說明書中，把作為合成dsRNA的多聚肌苷酸稱之為“PolyI”，而把多聚胞苷酸稱之為“PoltC”。
失配雙鏈核糖核酸的制備工藝(可參照Molecular Pharmacology,12,299-232)a．制備修飾的多聚胞苷酸(PolyC)取36毫摩爾的胞苷二磷酸、7毫摩爾的尿苷二磷酸、15毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷、2毫克/毫升的多核苷酸磷酸化酶，于37℃下反應(yīng)4.5小時。反應(yīng)后的溶液經(jīng)冷凍干燥，獲得的白色固體即為上述的修飾的PolyC。
b．制備雙鏈核糖核酸產(chǎn)物(dsRNA)使用市售的PolyI和PolyC或修飾的PolyC，溶解于50毫摩爾的三羥甲基氨基甲烷溶液中，使之為10-12毫克/毫升的濃度，于水浴中將溫度從室溫緩慢地提高到68℃，在68℃下保溫約10分鐘，放置至其溫度降至室溫，再于4℃保存。上述溶液經(jīng)冷凍干燥，獲得白色固體，這種物質(zhì)即為上述的dsRNA。
所述雙鏈核糖核酸是雙鏈的，最好是失配的，PolyI·PolyC11-32U或稱rln·r(C11-32U)n。
所述雙鏈核糖核酸可以核糖核酸RNA為對照物，分子量大小分布以沉降系數(shù)表示，集中在4S-28S范圍內(nèi)。
所述雙鏈核糖核酸可以核糖核酸RNA為對照物，分子量大小分布以堿基數(shù)表示，集中在50-10000的范圍內(nèi)。
柯薩奇病毒的感染在人群中很常見，由此引起的病癥多種多樣，常見的有急性或慢性心肌炎、流行性胸痛、肝炎、腦炎及呼吸道感染等，孕婦感染后可通過胎盤傳播給胎兒，引起胎兒畸形甚至死胎。在新生兒和嬰兒中可引起病情危重的廣泛性腦炎，常伴心肌炎和肝炎，一旦心腦受到該病毒嚴(yán)重侵害，極易引起死亡。目前，對由柯薩奇病毒引起的疾病的治療缺乏有效的抑制藥物，而傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療又存在特異性差、且治療不佳的缺陷，而失配雙鏈核糖核酸可刺激機體產(chǎn)生廣譜的內(nèi)源干擾素及其它免疫因子，干擾病毒合成、改變細(xì)胞骨架，促進(jìn)2’,5’-寡聚腺苷酸合成、激活蛋白激活酶和核糖核酸L酶的活力，以降解進(jìn)入機體的病毒，提高機體綜合免疫能力，保護(hù)正常細(xì)胞免受病毒感染，達(dá)到抑制、治療惡性病毒性疾病的目的。
我們以實驗來說明在對病毒性心肌炎的治療中使用dsRNA的可能性。實驗以柯薩奇病毒細(xì)胞為模型，細(xì)胞分別感染后，加dsRNA樣品、非藥物溶液(即樣品空白)，經(jīng)培養(yǎng)3天后，病毒對照的細(xì)胞完全被破壞，而感染病毒后加藥的細(xì)胞生長良好，加非藥物溶液的細(xì)胞均將近90％死亡。說明柯薩奇病毒感染細(xì)胞后加入dsRNA有明顯的抑制病毒感染作用。當(dāng)細(xì)胞生長時，感染病毒1小時，分別加入樣品l和樣品2、空白1和空白2，在37℃條件下孵育72小時，取上清液，再感染正常細(xì)胞。在37℃條件下經(jīng)48小時后染斑，對各樣品抑制空斑的作用進(jìn)行比較，結(jié)果表明，樣品1和樣品2對空斑的形成有明顯的抑制作用，與病毒空斑實驗的結(jié)果相比較，其抑制率分別為74.3％和76.5％。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，以病毒空斑數(shù)量為縱坐標(biāo)做藥物作用濃度曲線，該藥物的量效關(guān)系表明，樣品對病毒的抑制作用隨藥物濃度增加而增加。
在治療中，dsRNA的用量最好是體重約60千克的患者，每周用14-140毫克，治療7次，一般2-4周為一個療程，病情嚴(yán)重者需延長時間。dsRNA的劑型可以是注射用針劑、口服藥劑及氣霧劑，采用靜脈、肌肉、皮下注射，也可經(jīng)鼻咽、口腔給藥。
發(fā)明效果失配雙鏈核糖核酸是對毒性較大的抗病毒藥物dsRNA進(jìn)行修飾而研究制備的新型廣譜抗病毒材料，通過修飾保留了dsRNA原有的干擾素誘導(dǎo)能力和其它正向生物學(xué)特性，而使毒副作用大大降低。因此失配dsRNA是一類低毒、廣譜的抗病毒材料，它可以刺激機體產(chǎn)生廣譜的內(nèi)源干擾素及其它免疫因子，干擾病毒合成，改變細(xì)胞骨架，促進(jìn)2’,5’-寡聚腺苷酸合成，激活蛋白激活酶和RNAL酶的活力，以降解進(jìn)入機體的病毒，提高機體綜合免疫能力，保護(hù)正常細(xì)胞免受病毒感染，達(dá)到抑制、治療惡性病毒性疾病的目的。
本發(fā)明對失配dsRNA進(jìn)行了長期研究，且進(jìn)行了失配雙鏈核糖核酸對柯薩奇病毒(可導(dǎo)致心肌炎、肝炎等疾病的病毒)感染細(xì)胞的抑制作用實驗(見報告1)、動物的急性毒性實驗(見報告2)，并已得到正向的結(jié)果，證明失配dsRNA對由柯薩奇病毒引起的疾病有顯著的抑制作用。
報告1--雙鏈核糖核酸對柯薩奇病毒感染細(xì)胞的抑制作用針對易感細(xì)胞模型，分別輸入病毒感染細(xì)胞、正常細(xì)胞、空白對照及失配dsRNA，研究并確定藥物的對應(yīng)病毒感染類型和適應(yīng)癥，主要進(jìn)行以下實驗1．穩(wěn)定正常細(xì)胞培養(yǎng)2．病毒感染實驗3．病毒滴度定量4．病毒空斑形成實驗5．病毒致細(xì)胞病變作用實驗結(jié)果1．藥物dsRNA樣1、樣2(S1、S2)對柯薩奇病毒致細(xì)胞病變作用的抑制柯薩奇病毒對照在培養(yǎng)3天后，細(xì)胞完全被破壞；感染病毒后加藥，細(xì)胞生長良好；加非藥物溶液(空白基質(zhì))細(xì)胞均將近90％死亡。
2．藥物對空斑形成的抑制當(dāng)細(xì)胞生長貼壁近時，感染柯薩奇病毒，分別平行加入樣品和非藥物溶液，培養(yǎng)72小時。取上清液，感染正常細(xì)胞。培養(yǎng)后染斑，對各樣品抑制空斑的作用進(jìn)行比較。
結(jié)果表明平行樣品(S1、S2)對空斑的形成有明顯的抑制作用，與病毒空斑實驗的結(jié)果相比較，其抑制率分別在70％以上。
3．藥物作用濃度曲線以藥物濃度為橫坐標(biāo)，以病毒空斑數(shù)量為縱坐標(biāo)做藥物作用濃度曲線，可知隨藥物濃度增加，病毒空斑數(shù)量逐漸減少，表明了藥物的量效關(guān)系，S1、S2對病毒的抑制作用隨藥物濃度增加而增加。
結(jié)論1．病毒抑制實驗顯示柯薩奇病毒感染細(xì)胞后，加入dsRNA，有明顯的抑制病毒感染作用。
2．dsRNA對病毒的抑制作用有一定的量效關(guān)系。
報告2--雙鏈核糖核酸注射液急性毒性實驗劑量給小鼠一次大量注射dsRNA注射液，觀察急性毒性反應(yīng)。實驗時取18-22g昆明種小鼠20只，雌雄各半，dsRNA注射液給予小鼠一次皮內(nèi)注射，每只小鼠給予相當(dāng)于人體推薦用量的1/2劑量，以體重計算，則小鼠給藥量相當(dāng)人體用量的1250-1300倍。給藥后，自由進(jìn)食進(jìn)水，連續(xù)觀察14天，記錄小鼠的各種表現(xiàn)及死亡情況。
結(jié)果動物給藥后無任何異常表現(xiàn)，未見腹腔刺激癥狀，觀察期內(nèi)，小鼠活動正常，無稀便、豎毛，眼內(nèi)無分泌物，20只小鼠無一例死亡。實驗前平均體重為19.1±1.2g，14天后平均體重為32.3±2.9g，顯示體重正常增長。
結(jié)論實驗結(jié)果表明，給小鼠一次皮內(nèi)注射人體臨床推薦用量1000倍以上的dsRNA注射液，連續(xù)觀察兩周，未見任何異常反應(yīng)，表明本藥對小鼠無近期毒性。
權(quán)利要求
1．雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用。
2．如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述治療人類柯薩奇病毒感染藥物包括治療急慢性心肌炎、治療肝炎、治療腦炎及治療呼吸道感染的藥物。
3．如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸是雙鏈的，最好是失配的，PolyI·PolyC11-32U或稱rln·r(C11-32U)n。
4．如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸是以核糖核酸RNA為對照物，分子量大小分布以沉降系數(shù)表示，集中在4S-28S范圍內(nèi)。
5．如權(quán)利要求1所述的雙鏈核糖核酸在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述雙鏈核糖核酸是以核糖核酸RNA為對照物，分子量大小分布以堿基數(shù)表示，集中在50-10000的范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNA)在制備治療人類柯薩奇病毒感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在dsRNA技術(shù)的基礎(chǔ)上,將分子大小分布由沉降系數(shù)為≤42s的dsRNA修飾至4－28s左右的失配dsRNA,以改變現(xiàn)有抗病毒藥物毒副作用大的缺點,通過對dsRNA的結(jié)構(gòu)的修飾,保留其原有的抗病毒功能,降低毒副作用。本發(fā)明可用于治療包括病毒性心肌炎、肝炎、腦炎等疾病在內(nèi)的柯薩奇病毒感染。
文檔編號A61P31/12GK1322529SQ01115648
公開日2001年11月21日 申請日期2001年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月29日
發(fā)明者聶實踐, 胡冬琴 申請人:北京市百林康源生物技術(shù)有限責(zé)任公司