專利名稱：金葡菌毒力刺激因子抑制肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組能夠特異抑制金葡菌毒力刺激因子活性的多肽。本發(fā)明還涉及這些金葡菌毒力刺激因子抑制肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(金葡菌)是一類常見的革蘭氏陽性致病菌，是引起燒傷及戰(zhàn)傷感染、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年僅醫(yī)院內(nèi)感染金葡菌的人數(shù)就超過數(shù)百萬。目前臨床上對金葡菌感染的治療多采用聯(lián)合使用抗生素的辦法，但是效果并不理想。由于金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，控制金葡菌感染已成為目前臨床醫(yī)學(xué)中亟待待解決的問題之一。
金葡菌的主要致病物質(zhì)是毒素，包括溶血毒素、殺白細(xì)胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調(diào)節(jié)RNA分子，即RNA III控制的。RNA III激活毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，通過堿基互補調(diào)節(jié)毒力因子的翻譯。在細(xì)菌生長的對數(shù)早期，其RNA III水平低，但到對數(shù)晚期RNAIII水平會增加40倍，而RNA III的水平是由金葡菌自身分泌的因子RAP(RNA III activating protein)，即RNA III激活蛋白調(diào)節(jié)的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續(xù)分泌RAP，在RAP達到一定濃度后才有激活毒力因子產(chǎn)生的作用。沒有RAP產(chǎn)生的金葡菌本身并不致病。1998年Science雜志研究結(jié)果表明，用RAP免疫動物，其抗體可以有效地保護小鼠免受金葡菌的感染，存在的主要問題是個體間抗體差異大，所以保護效果差異也大(Balaban N，et al.Autoinducer of virulence as a target for vaccine andtherapy against Staphylococcus aureus.Science，1998，280(17)438-440)。目前，文獻報道一種一種小分子肽可抑制肽金葡菌毒力刺激因子的活性，該抑制肽被命名為RIP，氨基酸序列為YSPWTNF。它與RAP蛋白N-末端氨基酸序列有高度同源性(Balaban N，et al.Regulation of Staphylococcus aureuspathogenesis via target of RNA III-activating protein(TRAP).J.Bio.Chem.2001，2762658-2667)。

發(fā)明內(nèi)容
我們采用噬菌體展示技術(shù)從隨機肽庫中篩選出能特異與RAP分子結(jié)合并抑制其活性的小分子多肽，目的是用RAP抑制劑阻斷RAP對毒力因子產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用，從而切斷金葡菌毒素產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為治療金葡菌感染開辟新的途徑。本發(fā)明的多肽無論從來源還是從結(jié)構(gòu)上完全不同于上述抑制肽RIP。
本發(fā)明的目的是提供一類能夠與金葡菌毒力刺激因子特異結(jié)合并抑制其活性的多肽。
本發(fā)明的另一目的是提供這些金葡菌毒力刺激因子抑制肽在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途。
本發(fā)明的金葡菌毒力刺激因子抑制肽是具有以下通式結(jié)構(gòu)的12肽W1-X1-A1-X2-W1-X4-P1-X1，其中，W代表色氨酸殘基，X代表任何天然L-型氨基酸殘基或D-型異構(gòu)體，A代表芳香族氨基酸殘基，如色氨酸殘基(W)、酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)等，腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)。
具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽能夠與金葡菌毒力刺激因子RAP特異結(jié)合，并抑制其活性。具體表現(xiàn)為，在體外具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽無論是以何種形式如展示在噬菌體上、或體外化學(xué)合成、或用基因工程方法重組表達，都能夠與RAP特異結(jié)合，并抑制金葡菌中由RAP調(diào)控的RNAIII的表達，動物實驗結(jié)果表明，具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽能夠抑制金葡菌引起的感染。
本發(fā)明的小分子多肽可通過本技術(shù)領(lǐng)域的的常規(guī)方法，如化學(xué)合成或基因重組表達的方法制得。
傳統(tǒng)抗生素治療產(chǎn)生抗藥性的原因主要為用藥后細(xì)菌在生存壓力下產(chǎn)生分解抗生素中有效基團的誘導(dǎo)酶。本發(fā)明利用特異抑制RAP活性的多肽建立的治療金葡菌感染的方案，由于不殺滅細(xì)菌而使細(xì)菌的致病性喪失，所以不會象傳統(tǒng)抗生素治療那樣對細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力而產(chǎn)生抗藥株，這就為一直困擾臨床的抗藥性金葡菌感染這一常見、多發(fā)且有致命性的疾病的治療找到新的出路。
本發(fā)明對研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽藥物具有重要意義，并具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景。另外，金葡菌毒力刺激因子RAP結(jié)合肽作為生物制劑也有潛在的應(yīng)用價值，如可用于RAP的親和純化或作為探針用于RAP的檢測等。
本發(fā)明的RAP抑制肽在抑制RAP活性方面優(yōu)于RIP。


圖1是RAP抑制肽對金葡菌細(xì)胞內(nèi)RNA III水平的影響(Northern blot結(jié)果)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。
實施例1.RAP抑制肽對金葡菌細(xì)胞內(nèi)RNA III水平的影響1.實驗方法提取培養(yǎng)90分鐘的金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)總RNA。具體方法是4℃12000g離心，從5毫升細(xì)菌培養(yǎng)物中回收細(xì)胞，重懸菌體于0.5毫升裂解緩沖液，并在冰中凍結(jié)。超聲破碎后，用等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，再用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提1次，400微升水相加入15微升5M NaCl，并加2.5倍體積乙醇沉淀，-204℃過夜。4℃離心后，沉淀用70％乙醇洗一次，干燥后用無RNA酶的DNA緩沖液溶解，加入DNA酶消化60分鐘，37℃酚氯仿抽提，標(biāo)準(zhǔn)乙醇沉淀方法回收RNA，溶解于100微升DEPC處理水中，定量。
利用RNA III特異性探針(序列為RNA III基因序列中1320～1566片段)，通過Northern blot方法檢測金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)RNA III的水平，以此來檢測結(jié)合肽的活性。
結(jié)合肽1為WHWTNWGKTSPA結(jié)合肽2為WPFAHWPWQYPR2.實驗結(jié)果結(jié)果表明結(jié)合肽1和結(jié)合肽2均能夠明顯抑制RNA III的轉(zhuǎn)錄，參見附圖1。圖中，A為陽性對照；B、C、D、E為單克隆噬菌體，其中B為1號結(jié)合肽，E為2號結(jié)合肽；F為無關(guān)噬菌體展示肽。每加樣孔加入5μg細(xì)菌總RNA。
實施例2.在感染金葡菌的動物模型上檢測結(jié)合肽的活性1.實驗方法采用經(jīng)典的動物感染模型，即分別將同等培養(yǎng)條件且相同數(shù)量(1×108個細(xì)胞)的金黃色葡萄球菌單獨或與結(jié)合肽混合注射到Balb/c來源的具有正常免疫力的無毛小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供)皮下，所有注射物中含有終濃度為5毫克/毫升的Cyfodex(Ampharmacia公司產(chǎn)品)。72小時后觀察小鼠皮膚感染面積的大小，感染面積的計算公式如下。
面積＝(π/6)×長度(厘米)×寬度(厘米)結(jié)合肽為WPFAHWPWQYPR2.實驗結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAP結(jié)合肽能夠明顯抑制金葡菌造成的動物皮膚感染，見下表組 別 感染面積(平方厘米)金葡菌+生理鹽水 2.763±0.86金葡菌+結(jié)合肽 0.776±0.37*金葡菌+無關(guān)肽 2.154±1.24n＝8，*表示與加生理鹽水對照組和無關(guān)肽對照組相比都有顯著性差異(p＜0.001)
權(quán)利要求
1.金葡菌毒力刺激因子抑制肽，具有以下通式結(jié)構(gòu)的氨基酸組成W1-X1-A1-X2-W1-X4-P1-X1，其中，W代表色氨酸殘基，X代表任何天然L-型氨基酸殘基或D-型異構(gòu)體，A代表芳香族氨基酸殘基，腳注數(shù)字代表氨基酸殘基的個數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特征在于A代表酪氨酸殘基。
3.權(quán)利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特征在于A代表苯丙氨酸殘基。
4.權(quán)利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特征在于A代表色氨酸殘基。
5.權(quán)利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子RAP抑制肽，其特征在于氨基酸組成為WHWTNWGKTSPA。
6.權(quán)利要求3所述的金葡菌毒力刺激因子RAP抑制肽，其特征在于氨基酸組成為WPFAHWPWQYPR。
7.權(quán)利要求1至5中的任意一項所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽在制備抗金葡菌感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組能夠特異抑制金葡菌毒力刺激因子活性的多肽。該抑制肽的氨基酸組成為W
文檔編號A61K38/10GK1394871SQ0111997
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月5日
發(fā)明者邵寧生, 楊光, 柳川, 薛沿寧, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 海南通用同盟藥業(yè)有限公司