專(zhuān)利名稱(chēng)：人的類(lèi)硫氧化蛋白基因及其編碼蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)和生理功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一個(gè)與人胎腦發(fā)育相關(guān)的基因/蛋白，人的類(lèi)硫氧化蛋白的基因及其編碼蛋白，(human thioredoxin like gene/protein，hTRXL/hTRXL)，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新基因、新蛋白的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
發(fā)明目的克隆在人胎腦發(fā)育過(guò)程中起作用的基因hTRXL，表達(dá)其編碼蛋白，解析蛋白三維空間結(jié)構(gòu)，闡明TRXL蛋白在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理生化過(guò)程中的功能與三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，從而為干預(yù)腫瘤細(xì)胞的增殖提供可能的抑癌基因和新藥篩選的靶分子。內(nèi)容與要求應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、分子克隆、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、cDNA文庫(kù)篩選、DNA序列測(cè)定技術(shù)、Northern印跡雜交、蛋白表達(dá)與純化技術(shù)、蛋白晶體生長(zhǎng)技術(shù)、X-光晶體結(jié)構(gòu)衍射技術(shù)及晶體三維結(jié)構(gòu)解析技術(shù)等，克隆鑒定編碼hTRXL蛋白的新基因全長(zhǎng)cDNA，獲得原核表達(dá)的目標(biāo)蛋白及蛋白晶體，并通過(guò)X-光晶體結(jié)構(gòu)衍射技術(shù)收集和分析所收數(shù)據(jù)，得到該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，用于蛋白功能分析。該基因/蚩白達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.hTRXL的cDNA全長(zhǎng)為1230bp，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有289aa。
2.這個(gè)基因在人胎腦發(fā)育的不同階段具有差異表達(dá)的特征。
3.hTRXL的編碼蛋白hTRXL全長(zhǎng)及N端1-105位氨基酸殘區(qū)域基為典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域具有典型的胰島素還原酶活性，而C端106-289位氨基酸殘基區(qū)域?yàn)楣δ芪粗蛄?，無(wú)單獨(dú)的胰島素還原酶活性。
4.N端1-105位氨基酸殘基硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域具有典型的硫氧還蛋白三維空間結(jié)構(gòu)。
5.該基因及其編碼蛋白與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，可用于腦發(fā)育相關(guān)疾病，腫瘤發(fā)生的基因診斷和基因治療，還可用于新藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。
PCR循環(huán)參數(shù)94℃變性3分鐘，94℃變性30秒，40℃退火2分鐘，72℃延伸30秒，循環(huán)35次后，在72℃延伸5分鐘，產(chǎn)物4℃保存。
PCR產(chǎn)物加等體積上樣緩沖液，于90℃變性5分鐘，置冰浴，每個(gè)樣品取4.5μl上樣于6％變性聚丙烯酰胺凝膠，45W功率電泳。按常規(guī)方法進(jìn)行放射自顯影后，對(duì)其圖譜進(jìn)行比較分析，切取差異表達(dá)的cDNA凝膠條帶，分別浸泡于50μl TE緩沖液中，65℃保溫2小時(shí)，離心，直接取上清液進(jìn)行再擴(kuò)增?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，克隆于pGEM-T(Promega)載體上，宿主菌為XLl-blue。采用溫度循環(huán)雙脫氧測(cè)序法對(duì)克隆片段進(jìn)行測(cè)序。3.人的類(lèi)硫氧還蛋白全長(zhǎng)cDNA的篩選將上述所有在胎腦發(fā)育中差異表達(dá)的EST在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比較，再結(jié)合查尋Unigene的結(jié)果，得到一個(gè)可能與人的硫氧還蛋白具有同源性的基因片段HFBEST12(GenBank Acc.No.U48630)。
α-32P標(biāo)記HFBEST12，用于胎腦cDNA文庫(kù)的篩選。以噬菌斑原位雜交法篩選全長(zhǎng)cDNA。所用胎腦cDNA文庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建。4.Northern印跡雜交RNA樣品變性后經(jīng)1％甲醛瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳完畢后凝膠由DEPC H2O淋洗數(shù)次，0.05M NaOH浸泡20分鐘，20、SSC浸泡凝膠45分鐘，用20、SSC轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，在6×SSC中漂洗，晾干。紫外交聯(lián)。
α-32P隨機(jī)標(biāo)記HFBEST12，用做雜交探針。5.人的類(lèi)硫氧還蛋白全長(zhǎng)cDNA的原核表達(dá)及純化將所獲得的硫氧還蛋白全長(zhǎng)cDNA的編碼區(qū)克隆到PET28和PGEX-4T-3載體的EcoR I酶切位點(diǎn)上。并用CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后分別獲得高效表達(dá)的His-tag和GST融合蛋白。
以GST融合蛋白為例描述蛋白純化過(guò)程5.1 細(xì)胞抽提物的制備1)將攜帶有hTRXL & hTRXL-N PGEX-4T-3重組質(zhì)粒的BL21菌種接種于20ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2)將20ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于1～1.5L氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，200rpm/30℃搖菌2小時(shí)，使菌懸液的OD值達(dá)到0.6左右。
3)加入1M IPTG至終濃度0.1mM，30℃下繼續(xù)誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)5小時(shí)，4℃ 5000rpm離心10分鐘以收集菌體。
4)150ml PBS緩沖液(pH 7.4)離心洗滌菌體一次后，用80ml PBS將菌懸浮，冰浴超聲破菌至菌液不再粘稠。5.2 親和柱層析GST融合蛋白的純化采用Amersham Pharmacia生物技術(shù)公司的glutathione-Sepharose親和層析柱及PBS(pH 7.4)緩沖系統(tǒng)進(jìn)行純化。
1)用預(yù)冷的3倍柱床體積PBS緩沖液平衡glutathione-Sepharose親和柱后，4℃下將破菌液掛柱。
2)50～80倍柱床體積PBS緩沖液緩慢沖洗層析柱，用考馬斯亮蘭G250檢測(cè)流出液至沒(méi)有蛋白為止。
3)用PBS溶解凝血酶，使其終濃度達(dá)30u/ml后，等體積加入層析柱?；靹?，4℃振蕩柱上酶切14小時(shí)。
4)將反應(yīng)液放出，電泳檢測(cè)目的蛋白純度。
5)用還原型谷胱苷肽處理洗滌glutathione-Sepharose親和柱以循環(huán)利用，電泳檢測(cè)洗出液，確定酶切是否完全。6.目標(biāo)蛋白的胰島素還原酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前新鮮配制胰島素溶液將胰島素溶于0.1M磷酸鉀緩沖液和2mM EDTA，至終濃度為1mg/ml。將500μl胰島素溶液和純化的蛋白混合，至終體積600μl。加入2`10μl100mM DTT后混勻，開(kāi)始反應(yīng)。同時(shí)用紫外分光光度計(jì)每隔1分鐘記錄650nm波長(zhǎng)下的光吸收值。用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)軟件繪制曲線。7.蛋白晶體的生長(zhǎng)在分離提純得到足量的hTRXL-N及hTRXL全長(zhǎng)蛋白后，我們用懸滴氣相擴(kuò)散法對(duì)結(jié)晶條件進(jìn)行了摸索。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，最后得到可用于衍射晶體的結(jié)晶體系為，懸液0.85M硫酸銨，0.05M乙酸鈉，15mg/ml蛋白，pH 5.0，總體積2μl；池液1.7M 硫酸銨，0.1M乙酸鈉，pH 5.0，總體積200μl；整個(gè)體系密封后置于18℃條件下，懸液與池液通過(guò)氣相擴(kuò)散慢慢達(dá)到平衡。4天后得到大小為1mm、0.25mm、0.15mm的晶體。8.結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的收集與處理hTRXL-N晶體在Rigaku旋轉(zhuǎn)靶光源下，用Mar 345 Image Plate探測(cè)系統(tǒng)收集，其分辨率為2.2。用DENZO和SCALEPACK軟件包(Otwinowski & Minor，1997)對(duì)衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明該晶體空間群為C2，晶胞參數(shù)為a＝87.5，b＝48.5，c＝29.8數(shù)據(jù)處理結(jié)果(見(jiàn)表1)。以人的還原型硫氧還蛋白(PDB entry code，1ERT)為初始模型，用CNS軟件包進(jìn)行旋轉(zhuǎn)函數(shù)和平移函數(shù)的計(jì)算，并用該程序進(jìn)行自動(dòng)結(jié)構(gòu)優(yōu)化。然后用“O”軟件進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化。結(jié)構(gòu)修正完畢后，R因子為22.1％，Rfree因子為25.3％。表1晶體學(xué)數(shù)據(jù)收集及優(yōu)化結(jié)果A. Data statisticsResolution() 15～2.2Space groupC2a＝87.5Unit cell(，deg.)b＝48.5c＝29.8β＝99.59Rmerge(％) 0.089(0.316)aNo.of reflections 6710(624)Completeness(％) 99.8(98.7)B.Refinement statisticsRworking(％) 22.2 for 6026 reflectionsRfree(％) 25.3 for 337 reflectionsNo.of non-hydrogen atomsProtein atoms816Solvent 44rms deviation from ideal valuesBond length() 0.02Bond angle(deg.) 1.97Average B-factor(2)Protein atoms24.0Solvent molecules37.權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個(gè)與人胎腦發(fā)育相關(guān)的基因/蛋白，人的類(lèi)硫氧化蛋白基因/蛋白(humanthioredoxin like gene/protein，hTRXL/hTRXL)，包括編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列和該蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。其特征在于hTRXL的cDNA全長(zhǎng)為1230bp，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有289aa。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述之人的類(lèi)硫氧化蛋白基因/蛋白，其特征在于這個(gè)基因在人胎腦發(fā)育的不同階段具有差異表達(dá)的特征。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之人的類(lèi)硫氧化蛋白基因/蛋白，其特征在于hTRXL的編碼蛋白hTRXL全長(zhǎng)及N端1-105位氨基酸殘區(qū)域基為典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域具有典型的胰島素還原酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之人的類(lèi)硫氧化蛋白基因/蛋白，其特征在于N端1-105位氨基酸殘基硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域具有典型的硫氧還蛋白三維空間結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述之人的類(lèi)硫氧化蛋白基因/蛋白，其特征在于該基因及其編碼蛋白與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，可用于腦發(fā)育相關(guān)疾病，腫瘤發(fā)生的基因診斷和基因治療，還可用于新藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)與人胎腦發(fā)育相關(guān)的基因/蛋白，人的類(lèi)硫氧化蛋白的基因/蛋白(humanthioredoxin likegene/protein，hTRXL)，包括編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列和該蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。該基因在不同發(fā)育階段的人胎腦組織中具有差異表達(dá)的特征，其編碼蛋白與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，對(duì)闡明相關(guān)類(lèi)型的腫瘤發(fā)生，細(xì)胞分化的生物學(xué)機(jī)制有重要的意義，可用于腦發(fā)育相關(guān)疾病，腫瘤發(fā)生的基因診斷和基因治療，還可用于新藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1394874SQ0112019
公開(kāi)日2003年2月5日 申請(qǐng)日期2001年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月11日
發(fā)明者袁建剛, 饒子和, 強(qiáng)伯勤, 彭小忠, 金鑑 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所