專利名稱：用甲醇酵母(Pichia Pastoris)生產(chǎn)神經(jīng)營養(yǎng)素－3(NT－3)的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程藥物領域，具體地說，涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)制備神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)，以及在制備治療維持和促進多種神經(jīng)元早期的增殖、分化、損傷的感覺和運動神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元和聽神經(jīng)元和糖尿病所致外周神經(jīng)炎和化療引起的神經(jīng)疾病等多種疾病藥物中的應用。
從目前已有技術而言，雖然動物細胞表達系統(tǒng)得到的NT-3蛋白活性較高。但動物細胞培養(yǎng)條件要求高，成本高，表達量低，當前還主要處在實驗室摸索階段；大腸桿菌表達系統(tǒng)本身較成熟，易培養(yǎng)，對大規(guī)模生產(chǎn)更有利，但是仍然存在嚴重的缺陷，必須解決復性問題，而且產(chǎn)率也不高。
作為真核表達系統(tǒng)，甲醇酵母具有許多其它蛋白表達系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點?？筛爬ㄈ缦?1)具有強有力的乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動子，可嚴格調控外源蛋白的表達；(2)作為真核表達系統(tǒng)，可對表達的蛋白進行翻譯后的加工和修飾，從而使表達出的蛋白具有生物活性；(3)營養(yǎng)要求低，生長快，培養(yǎng)基廉價，便于工業(yè)化生產(chǎn)；(4)可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細胞干重甚至可達130g/L以上；(5)表達量高，許多蛋白可達到每升克以上水平，如破傷風毒素C片段表達量高達12g/L；(6)在甲醇酵母(Pichia Pastoris)中表達的蛋白既可存在于胞內(nèi)，又可分泌至胞外。Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有利于純化。如表達的重組水蛭素(HIR)，僅經(jīng)過二步層析純化，純度就高達97％以上；(7)糖基化程度低。和釀酒酵母相比，甲醇酵母中加到翻譯蛋白上的糖鏈長度平均每條側鏈為8-14個甘露糖殘基，較之釀酒酵母每條側鏈平均50-150甘露糖殘基短得多。
甲醇酵母系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種蛋白表達宿主。它兼顧了動物細胞表達系統(tǒng)和大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)點而克服了彼此的不足(動物細胞表達系統(tǒng)成本高、表達量低、培養(yǎng)條件高，難于工業(yè)化生產(chǎn)；大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)率也不高，純化繁瑣，需要復雜的變性和復性才能恢復生物活性)。
目前，國內(nèi)外還未見有NT-3和用作醫(yī)藥產(chǎn)品出售，美國Promega公司有分子生物學試劑級產(chǎn)品，NT-3為$240/5ug包裝($4.8萬/mg)，抗體為$255/200ug包裝。因為用大腸桿菌表達NT-3表達量低，純化繁瑣，需要復雜的變性、復性才能恢復生物活性，并且復性率也不高(成熟NT-3含三對二硫鍵，容易形成不正確的二硫鍵連接)。這些問題造成成本過高，價格如此昂貴也就不足為奇了。
發(fā)明人克隆NT-3基因于甲醇酵母分泌型表達載體pPIC9K，測序、轉化、篩選，得到多拷貝轉化子。然而轉化子經(jīng)甲醇誘導后，根本檢測不到表達。通過檢查NT-3基因全序列，發(fā)現(xiàn)了轉錄提前終止位點的存在，Northern雜交證實了誘導后的NT-3基因轉錄出的是截短而非全長mRNA。定點突變消除轉錄提前終止位點并克隆突變基因于載體pPIC9K，再一次原生質球轉化甲醇酵母。選出的高拷貝轉化子經(jīng)甲醇誘導，得到了14kD的產(chǎn)物，表明NT-3在甲醇酵母中得到表達。表達產(chǎn)物能刺激培養(yǎng)的PC12細胞的分化，證明具有生物學活性。該工程菌已交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，登記入冊編號為CGMCC NO.0549。
該方法包括以下步驟8. 基因組DNA的提取和純化。2. NT-3基因的擴增，克隆和測序3. 重組表達載體的構建、轉化、轉化子的篩選4. NT-3的誘導表達5. NT-3高抗性轉化子RNA提取和Northern雜交6. NT-3基因的定點突變及突變的NT-3基因的克隆7. 突變的NT-3基因的測序，轉化，轉化子的篩選及誘導表達8. 表達產(chǎn)物NT-3的生物學活性測定到目前為止，國內(nèi)外有關NT-3在甲醇酵母中的還未見任何報道。本發(fā)明NT-3在甲醇酵母中的表達無論表達生物量以及提取制備步驟都優(yōu)于其它表達體系，為NT-3藥物的生產(chǎn)和應用成為現(xiàn)實。
以下的實施例可以使本專業(yè)技術領域的技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
取0.6g中國人胎兒腦組織，研磨后加入盛有5ml提取裂解液(3M異硫氰酸胍，0.01M醋酸鈉)的離心管中，30℃搖床中溫和振蕩1h。用大口徑吸管將腦組織裂解液加入盛有18ml乙醇的離心管液面以下，用玻棒緩慢攪拌至完全混勻?；厥誅NA，滴干乙醇后溶于2ml TE中，過DEAE微型柱純化。引物根據(jù)Jones等報道的NT-3基因序列，設計了NT-3基因5’末端(引物I)和3’末端引物(引物II)。引物I5’-TCT AAG AGA GAG GCT GAG GCT TAC GCG GAG CAT AAG AGT CAC AGA G 劃線處為5’末端非配對區(qū)，虛線為XhoI酶切位點。引物II5’-CAC TTA TCT TCC GAT CTT TCT GGA C-3’虛線為EcoRT位點。
此外為了消除基因內(nèi)部轉錄提前終止位點，設計了引物III和引物IV，也在上海生工合成引物III5’-GAA GTA TTG CTT GAC GGG -3’引物IV 5’-TAC GAA ACG CGA TGT AAG -3’2. NT-3基因的擴增，克隆和測序以提取的DNA為模板，以引物I和引物II進行擴增。PCR條件為94℃ 40sec，60℃ 40sec，72℃ 60sec，反應30個循環(huán)，結束后72℃延伸10min。利用PCR產(chǎn)物兩端的EcoRI和XhoI位點，將其克隆于載體SK。連接、轉化均按分子克隆進行。重組表達載體pPIC9K-NT-3的構建如

圖1所示。經(jīng)序列測定，BDNF基因是由如序列表所示的357bp的核苷酸組成(見圖2)。3. 重組表達載體的轉化、轉化子的篩選重組表達載體pPIC9K-NT-3用SacI酶切線性化，原生質球方法轉化甲醇酵母。轉化子長出后在含G418的抗性平板上篩選，并不斷提高G418的濃度，以得到高抗性的轉化子，抽提高抗性轉化子DNA，用引物I和引物II PCR擴增，以確證NT-3基因的整合。4. 原生質球法轉化甲醇酵母GS115方法試劑a)SOS1M山梨醇，0.3X YPD，10mmol/L CaCl2b)SE 1M山梨醇，25mmol/L EDTA(pH8.0)c)SCE1M山梨醇，10mmol/L檸檬酸鈉緩沖液pH5.8d)CaS1M山梨醇，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，10mmol/L CaCl2e)CaT20mmol/L Tri-HCl(pH7.5)，20mmol/L CaCl2原生質球的制備a)將甲醇酵母SMD1168接種YPD平板，30℃培養(yǎng)2-3天，挑取單一克隆并接種到盛有10ml YPD培養(yǎng)基的100ml搖瓶，30℃，300rpm培養(yǎng)過夜。b)接種10μl上述菌懸液到含200ml YPD的500ml搖瓶。30℃300rpm培養(yǎng)至OD600為0.2-0.3時，1500g離心5min，去掉上清。c)分別用20ml無菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇各洗滌細胞一次，每次洗完1500g離心5min，去上清。最后加20ml SCE重懸細胞。分成10ml的A、B兩管。d)取19支無菌干凈的1.5ml EP管，每管加800μl5％ SDS，并分別標上0、2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、28、30、32、35、38、40、45分別代表Zymolyase消化細胞壁的時間(min)。從上述A管中取200μl菌懸液加入后，放入冷凍中，作為Zymolyase消化分鐘的對照管。加7.5μl Zymolyase(2.25 Units)到A管，輕輕混勻，根據(jù)管中標記的時間，每次從A管取200μl正在消化的細胞懸液至裝有0.8ml 5％SDS的EP管中，并立即放置冰中，以終止酶反應。e)依下列公式計算每個時間點形成原生質球的百分比原生質球％＝100-[(OD800(tmin)/OD800(0min))×1 00]并決定形成70％原生質球的反應時間。加7.5μl Zymolyase到B管，30℃保溫，反應時間的長短依上述步驟確定(形成70％原生質球)。f)室溫750g離心10min，去上清，分別用10ml 1M山梨醇、10ml CaS洗滌原生質球，去上清，最后用0.6ml CaS重懸原生質球，在30分鐘之內(nèi)用于轉化。
轉化a)將10μg線性化的pPIC9K-NT-3載體與100μl剛制備的原生質球輕輕混合，室溫放置10min。b)加1ml新配制的PEG/CaT(1∶1)溶液，輕輕混合，室溫再放置10min。c)750g離心10min，盡可能吸去上清，用150μl SOS重懸細胞并靜置20min，加850μl 1M山梨醇。d)每150μl已轉化的原生質球與10ml熔化的RD瓊脂糖培養(yǎng)基混合，并鋪在RDB平板上層，28-30℃，培養(yǎng)4-6天并觀察結果。5. NT-3的誘導表達高拷貝轉化子接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃搖瓶培養(yǎng)約24h后，離心，棄上清，用BMMY培養(yǎng)基懸浮酵母菌體，搖床培養(yǎng)，每隔24h加一次甲醇，并且每隔24h取2ml發(fā)酵液，離心去菌體。用0.1％SDS-12％PAGE和Western Blotting分析上清。6.NT-3高抗性轉化子RNA提取和Northern雜交同時提取NT-3高抗性轉化子和分泌表達的BDNF重組菌株的RNA，在同一塊膠上(2％甲醛變性瓊脂糖凝膠)電泳。電泳完畢后把凝膠一分為二，一塊含NT-3轉化子RNA，另一塊含BDNF重組菌株RNA，將兩者分別轉移至NC膜上。以pUC-BDNF和pUC-NT-3質粒為模板，α-32P-dCTP為同位素，隨機引物標記法分別制備BDNF基因探針和NT-3基因探針。制備好的探針分別與對應的NC膜上的RNA雜交(見圖3)。7.NT-3基因的定點突變及突變的NT-3基因的克隆以pUC-NT-3質粒為模板，以引物I和引物III為一對引物，引物II和引物IV為另一對引物，分別PCR擴增，得到的產(chǎn)物分別命名為片段A和片段B。(見圖4)PCR條件為94℃ 40 sec，55℃ 40 sec，72℃ 60sec，反應30個循環(huán)，結束后72℃延伸10min。片段A、B回收后，T4 DNA聚合酶削平片段A、B 3’末端。XhoI酶切片段A，EcoRI酶切片段B，兩者分別回收?；厥蘸蟮钠蜛、B經(jīng)T4多核苷激酶處理后，直接連接過夜，連接產(chǎn)物和XhoI，EcoRI雙切的載體pPIC9K再一次連接(見圖5)。轉化，Amp篩選。轉化子XhoI，EcoRI雙酶切鑒定。8. 突變的NT-3基因的測序，轉化，轉化子的篩選及誘導表達見上面(圖6、7、8)。9. 表達產(chǎn)物的純化發(fā)酵培養(yǎng)液離心去除菌體，上清加硫酸銨至80％飽和度，4℃下沉淀6小時。離心得沉淀。沉淀溶解后，對25mM硼酸鈉，pH9.0溶液長時間透析。透析好的樣品上DEAE-Sephadex陰離子交換柱(2.5×12cm，已用25mM，pH9.0硼酸鈉溶液平衡)。用0.1-1.0M NaCl(溶于平衡緩沖液中)梯度分部洗脫。合并有ELISA反應的分管，濃縮后對25mM磷酸緩沖液(PBS)、pH7.0溶液透析。透析好的樣品上S-sepharose柱(2.5×20cm，預先用25mM PBS，pH7.0溶液平衡)，用0.1-0.5M NaCl溶液洗脫。收集有ELISA反應的部分，電泳分析。10 表達產(chǎn)物NT-3的生物學活性測定甲醇酵母表達產(chǎn)物NT-3經(jīng)小型離子交換柱純化后(純度達95％以上)，采用微量考馬氏亮藍CBBG-250染料結合法測其蛋白含量。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的PC12細胞傳3-4代后，調整細胞懸液至濃度為0.8×105-1×105個/mL，加入24孔培養(yǎng)板(已用多聚賴氨酸液包被)，每孔1mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。待細胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，加入1ml新鮮培養(yǎng)基，并加入不同濃度的純化的NT-3樣品(1至100ng范圍內(nèi))，以不加樣品的培養(yǎng)孔為陰性對照，以NGF為陽性對照，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天。相差倒置顯微鏡下進行觀察、計數(shù)(見圖9-13)。結果重復三次，計數(shù)結果取平均值。
下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細發(fā)明。
權利要求
1，一種用甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌生產(chǎn)人神經(jīng)營養(yǎng)素NT-3的方法，其特征包括以下步驟人腦基因組DNA的提取和純化；NT-3基因的擴增，克隆和測定；NT-3重組表達載體的構建；NT-3基因的定點突變；含有NT-3重組表達載體的甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的構建NT-3在甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌中的誘導表達。
2，根據(jù)權利要求1所述的人腦基因組DNA的提取和純化方法，是以胎兒腦組織為原料提取和純化腦組織總的DNA。
3，根據(jù)權利要求1所述的NT-3基因的擴增，克隆和測定的方法，是用如下所示的引物I和引物II，以純化的腦組織總DNA為模板，擴增NT-3基因。引物I5’-TCT AAG AGA GAG GCT GAG GCT TAC GCG GAG CAT AAG AGT 劃線處為5’末端非配對區(qū)，虛線為XhoI酶切位點，引物II5’-CAC TTA TCT TCC GAT CTT TCT GGA C-3’虛線為EcoRI位點。
4，根據(jù)權利要求1所述的NT-3基因的擴增，克隆和測定的方法，NT-3基因由357個核苷酸組成，其序列如下所示TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGGGTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAGATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAACAATATTTTTATGAAACGCGATGTAAGGAAGCCAGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAAAACATCCCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGGTGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACA
5，一種NT-3重組載體的構建，是NT-3基因與載體SK連接，重組載體為SK-NT-3。
6，根據(jù)權利要求1所述的重組表達載體的構建，是利用SK-NT-3重組載體與表達載體pPIC9K酶切，連接，轉化，構建為NT-3重組表達載體pPIC9K-NT-3。
7，根據(jù)權利要求1所述的NT-3基因的定點突變，是在不改變編碼氨基酸的前提下，對原NT-3基因序列中的轉錄提起終止位點突變。突變后的基因序列如下所示TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGGGTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAGATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAGCAATACTTCTACGAAACGCGATGTAAGGAAGCCAGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAAAACATCCCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGGTGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACA
8，根據(jù)權利要1的所示NT-3重組甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的構建，重組表達載體pPIC9K-NT-3利用原生質球方法轉化甲醇酵母(Pichia pastoris)，得到重組含有NT-3表達載體的重組甲醇酵母轉化子CGMCC，NO.0549。
9，根據(jù)權利要求4或5或6或7或8，其中任選一項，在生產(chǎn)制備人神經(jīng)營養(yǎng)素NT-3藥物，或制備，治療，維持和促進外周神經(jīng)嵴和基板來源的多種感覺神經(jīng)元的發(fā)育、生長和分化，神經(jīng)中樞的基底前腦、膽堿能神經(jīng)元、GABA能神經(jīng)元、中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元和早老性癡呆、帕金森病、外周神經(jīng)損傷神經(jīng)性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程藥物領域，具體地說，涉及利用工程菌甲醇酵母(Pichia pastoris)生產(chǎn)制備神經(jīng)營養(yǎng)素－3(NT－3)，以及在制備治療維持和促進多種神經(jīng)元早期的增殖、分化、損傷的感覺和運動神經(jīng)元、膽堿能神經(jīng)元、多巴胺能神經(jīng)元和聽神經(jīng)元和糖尿病所致外周神經(jīng)炎和化療引起的神經(jīng)疾病等多種疾病藥物中的應用。
文檔編號A61P25/00GK1394960SQ0112021
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月6日 優(yōu)先權日2001年7月6日
發(fā)明者康良儀, 楊希才, 彭毅 申請人:中國科學院微生物研究所