專利名稱：一種短肽及其衍生物,以其為活性成分的藥物與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種短肽及其衍生物，以該短肽及其衍生物為活性成分的鎮(zhèn)痛藥物與應用鎮(zhèn)痛藥能選擇性地減輕或消除疼痛及伴隨的焦慮不安情緒，并為其他治療贏得良好的條件。目前，臨床上使用的止痛藥物基本上只有嗎啡及其衍生物，它們都是阿片類受體，特別是μ-型阿片受體的激動劑，具有相似的分子結(jié)構(gòu)和作用機制，具有快速強效的鎮(zhèn)痛作用，同時也有較強的成癮性。因此，這類藥物都具有兩重性，既是藥，也是毒，用以治病是藥，用以過癮是毒。
本發(fā)明通過高通量篩選方法得到了一個五肽化合物，具有明顯的鎮(zhèn)痛活性，動物實驗表明該五肽的衍生物具有更好的穩(wěn)定性和一致的鎮(zhèn)痛活性，分子水平的研究證實該五肽的衍生物與μ-型阿片受體的親和力極低，而與k-型阿片受體的親和力極高，因此該五肽衍生物可能成為良好的低成癮性的鎮(zhèn)痛藥物。
本發(fā)明短肽的氨基酸殘基序列為Y-A-A-F-M它的衍生物有 本發(fā)明短肽及其衍生物的獲得，采用現(xiàn)有技術(shù)中的公知方法進行，既可以用多肽自動合成儀進行化學合成，又可以將短肽序列推導成核苷酸序列，然后克隆到表達載體中進行生物合成。
實驗證明，本發(fā)明的5肽Y-A-A-F-M與它的衍生物(I)、(II)在基本特性，特別是在鎮(zhèn)痛作用上，其機理與效果是一致的，但由于小肽在體外不穩(wěn)定，因此在實際應用中一般以衍生物(I)、(II)為主。
本發(fā)明的鎮(zhèn)痛藥以上述短肽或其衍生物為活性成分，含有治療有效量的本發(fā)明短肽或其衍生物。
需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液及注射液等多種形式，各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明化合物的藥用量可根據(jù)患者的年齡、體重、疾病的嚴重程度進行調(diào)整，日劑量一般為10mg/kg體重。
以本發(fā)明的短肽或其衍生物為活性成分的藥物，既有與嗎啡相近似的鎮(zhèn)痛功效，同時由于它是k-型阿片受體的激動劑，因此使用者不會產(chǎn)生成癮性。本發(fā)明的短肽及其衍生物在制造鎮(zhèn)痛藥物中將會得到廣泛的應用，并且將會帶來巨大的社會及經(jīng)濟效益。
圖2為本發(fā)明短肽與其它配體介導的信號比較分析直方圖。
圖3為本發(fā)明短肽與U69593和嗎啡鎮(zhèn)痛活性的比較。
CHO衍生工程細胞株CHO-OPR8 CGMCC №06 13及CHO衍生工程細胞株CHO-PCGMCC №0612的獲得過程為1、取人體正常分娩胎盤為組織供體，保存于-70℃低溫冰箱中備用。
2、RNA的提取從-70℃低溫冰箱中取出胎盤組織樣品1克，置于已經(jīng)降溫處理的研缽中，加入少量液氮將組織塊磨碎，然后加入10ml Trozol試劑，轉(zhuǎn)入冰浴的勻漿器中進行勻漿破碎細胞，然后加入2毫升氯仿，混勻后離心取上清，進行異丙醇沉淀，離心沉淀后用70％乙醇洗滌，室溫干燥后溶解于100μl水中，取2μl進行紫外檢測，5μl用來進行逆轉(zhuǎn)錄，其余樣品置于-70℃?zhèn)溆?。腦組織的總RNA購自CLONTECH公司，用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增μ-型阿片受體。
3、逆轉(zhuǎn)錄取5μlmRNA樣品加入2μlSMARTIII/3’PCR引物，混均后72℃保溫2分鐘，迅速置于冰上冷卻2分鐘，依次加入4.0μl5×buffer，2.0μlDTT，2.0μldNTPMix，1.0μlRNase Inhibitor和2.0μlSuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶，混均后至于42℃溫箱中保溫1小時，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、PCR擴增根據(jù)K-型及μ-型阿片受體的cDNA的序列和序列內(nèi)限制性內(nèi)切酶識別位點的情況以及將要克隆載體上酶切位點的有關(guān)情況，設計下列引物5’-CATGCCATGGACTCCCCGATCCAGATC-3’(a)5’-CCGCTCGAGTCATACTGGTTTATTCATC-3’(b)5’-CCGGGTACCATGGACTCCCCGATCCAGATC-3’(c)5’-TCCACGACTGGTTTATTCATC-3’(d)采用Oligo(dT)18(PROMEGA公司產(chǎn)品)作為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA的一條鏈之后，采用外側(cè)引物(c)和(d)進行第一輪PCR擴增，再采用內(nèi)側(cè)引物(a)和(b)進行PCR擴增，PCR擴增的反應循環(huán)參數(shù)為95℃ 5分鐘，1個循環(huán)；95℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，30個循環(huán)；72℃ 10分鐘，1個循環(huán)。
克隆K-型及μ-型阿片受體基因時采用高保真的Taq DNA聚合酶，并采用二輪PCR擴增，反應體系為100ul，檢測用普通Taq DNA聚合酶PCR體系，反應體系為25ul。
5、克隆到T載體中并進行酶切鑒定和序列分析將采用高保真PCR擴增的片段進行末端補A，然后進行初步純化，將純化的PCR產(chǎn)物與T載體進行連接，連接后的產(chǎn)物進行電激，轉(zhuǎn)化JM109，然后涂LB氨芐青霉素平板。平板上含有IPTG和X-Gal，首先進行藍白斑篩選，挑取白斑進行接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，將鑒定含有目的的片段大小的克隆進行序列分析進行進一步的鑒定。測序結(jié)果顯示所獲得片段的序列與文獻報道的K-型及μ-型阿片受體的cDNA序列完全一致。
6、將K-型及μ-型阿片受體cDNA克隆至真核表達載體中將經(jīng)過序列分析的K-型及μ-型阿片受體cDNA進行PCR擴增，更換兩端的酶切位點，將PCR產(chǎn)物進行初步純化后進行酶切，將酶切的片段與已經(jīng)完全雙酶切的載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)進行連接，連接后進行電激轉(zhuǎn)化JM109，然后涂LB氨芐青霉素平板，挑取12個單菌落進行接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。一共挑選了11個單克隆的質(zhì)粒進行酶切鑒定，獲得了10個重組質(zhì)粒，分別命名為pOPR5-10和pMOR1-5。
7、CHO細胞的復蘇及培養(yǎng)凍存的CHO細胞(來自ATCC)從液氮中取出后迅速置于37℃恒溫水浴鍋進行融化，一旦融化，迅速轉(zhuǎn)入裝有已經(jīng)預熱的培養(yǎng)基的試管中，混勻后離心收集細胞，然后再用培養(yǎng)基洗滌一次，最后懸浮于8ml培養(yǎng)基中，裝入細胞瓶中進行培養(yǎng)。
8、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細胞取3個細胞培養(yǎng)皿(φ35mm)，各接種1-2×105細胞約1ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)過夜，制備轉(zhuǎn)染液A(1-10ugDNA，用無血清的培養(yǎng)基稀釋到100ul)和B(10ul脂質(zhì)體，用無血清的培養(yǎng)基稀釋到100ul)；輕輕混勻A和B，室溫靜置15分鐘；用2ml無血清培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)皿中的細胞2次，再加入1ml無血清培養(yǎng)基；然后緩慢加入A和B的混合液；混勻后37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時，吸除無血清培養(yǎng)基，約一個星期后對照出現(xiàn)細胞大量死亡，而質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的CHO細胞則出現(xiàn)大量的細胞集落，用維持培養(yǎng)基(含有200ug/mlG418)進行繼續(xù)培養(yǎng)。
9、單克隆細胞株的篩選及PCR鑒定將分隔良好的細胞集落用胰酶進行消化，用彎曲的平口注射器針頭吸取消化的細胞集落，轉(zhuǎn)入96孔板中，進行10倍稀釋直至107稀釋度，共吸取2板24個細胞集落，37℃，5％CO2培養(yǎng)直到長出單菌落，然后分別轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中進行大規(guī)模培養(yǎng)，提取DNA進行PCR鑒定。
轉(zhuǎn)化pOPR1-5的CHO細胞株命名為CHO-OPR5-10，并選定CHO-OPR8為供篩選用細胞株，轉(zhuǎn)化空載體的CHO細胞株命名為CHO-P。
實施例1、本發(fā)明短肽與k-型阿片受體和μ-型阿片受體解離常數(shù)的測定采用競爭性結(jié)合的方法分析本發(fā)明5肽分別與k-型阿片受體和μ-型阿片受體的表觀解離常數(shù)。分別采用3H標記的U69593(購自Amersham Pharmacia Biotech公司)和3H標記的嗎啡(購自Sigma公司)作為特異性標記的配體，通過加入不同濃度的5肽進行競爭性結(jié)合，膜受體分別采用CHO-OPR8的膜受體混合物和大鼠腦組織的膜受體混合物，3H標記的U69593的濃度及3H標記的嗎啡的濃度均為0.5nmol/L，再加入不同濃度的合成5肽，通過液閃計數(shù)分析合成5肽濃度的增加與標記配體濃度的變化的關(guān)系。液閃計數(shù)分析結(jié)果如表1所示，其中，Con為5肽的濃度；T1是膜受體的總數(shù)，S1是5肽與k-型阿片受體的特異性結(jié)合量，B1是5肽與k-型阿片受體的特異性結(jié)合百分數(shù)；T2是膜受體的總數(shù)，S2是5肽與μ-型阿片受體的特異性結(jié)合量，B2是5肽與μ-型阿片受體的特異性結(jié)合百分數(shù)。
表1本發(fā)明5肽分別與k型阿片受體和μ型阿片受體的表觀解離常數(shù)

從表1中可以看出，隨著5肽濃度的增加，特異性結(jié)合量和特異性結(jié)合的百分數(shù)都有所降低，而且特異性結(jié)合到K型阿片受體上的同位素隨著5肽濃度的增加，下降的速度比結(jié)合到μ型阿片受體上的同位素要快，如

圖1所示，以5肽濃度的對數(shù)為橫坐標，以特異性結(jié)合的百分數(shù)為縱坐標作圖(B1本發(fā)明5肽與型阿片受體的競爭性結(jié)合曲線；B2本發(fā)明5肽與型阿片受體的競爭性結(jié)合曲線)，根據(jù)作圖的結(jié)果計算IC50，然后根據(jù)公式Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)計算相應的表觀解離常數(shù)。
從圖1中可以得出IC50B1和IC50B2分別為4.38×10-8和2.76×100-6mol/L，根據(jù)公式Ki＝IC50/(1+[L]/Kd)算出相應的Ki分別為1.32nmol/L和＞1000nmol/L，Ki分別與相應的Kd相比，合成的5肽對于K型阿片受體Ki＝1.32nmol/L＜Kd＝1.49nmol/L，該結(jié)果表明合成的5肽與K型阿片受體親和力較U69593更強一些；合成的5肽對于μ型阿片受體Ki＞1000nmol/L，遠遠大于嗎啡與μ型阿片受體的解離常數(shù)，因此合成的5肽對于μ型阿片受體的親和力要遠遠弱于嗎啡。這些分析結(jié)果表明合成的5肽對于K型阿片受體具有很好的特異性和很強的親和力，而對于μ型阿片受體的親和力則很低。
從實驗結(jié)果分析可以看出，合成的5肽對于K型阿片受體的特異性以及親和力與U69593有很大的相似性，而與嗎啡有著較大的差異?？梢酝茢?，合成的5肽在體內(nèi)的作用機理上應該與U69593有很大的相似性而與嗎啡有著較大的差異。
實施例2、本發(fā)明短肽與CHO-OPR8相互作用后介導的信號分析以CHO-P細胞株作為對照細胞株，以U69593，嗎啡，納洛酮作為對照配體，觀察本發(fā)明5肽與CHO-OPPR8相互作用介導的信號反應，采用試劑盒檢測細胞內(nèi)cAMP濃度變化。結(jié)果如表2所示表2細胞內(nèi)cAMP濃度的變化

ΔOD450(實驗組-對照組)如圖2所示，以Δ的值為縱坐標，以不同的樣本號為橫坐標作圖，從圖2可以看出，CHO-P對五肽樣品沒有明顯的反應；而CHO-OPR8對所有的配體及樣品均有不同程度的反應。在對CHO-OPR8的作用中，5肽和U69593一樣，表現(xiàn)出明顯的激動劑特點，特異性地降低細胞內(nèi)的cAMP濃度，而納洛酮則明顯表現(xiàn)出拮抗劑的特點，特異性地升高細胞內(nèi)的cAMP濃度。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明5肽能夠與CHO-OPR8結(jié)合，也能夠介導細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導。從介導信號的效果來看，合成的5肽明顯屬于K型阿片受體激動劑。因此從分子以及細胞學水平證明化學合成的5肽至少具有與U69593相似的鎮(zhèn)痛活性。
實施例3、熱輻射法(甩尾法)測定本發(fā)明短肽的鎮(zhèn)痛作用熱輻射法測定小鼠對疼痛的敏感程度的方法是，將光輻射熱測痛儀熱板置于桌面上，將小鼠置于小鼠固定桶中，尾部暴露于桶外，實驗前先用75％的乙醇擦凈鼠尾，用記號筆在鼠尾的下1/3處作出標記，作為光輻射刺激點，測定各小鼠的正常痛反應(甩尾)時間，共測兩次，每次間隔5分鐘。
挑選8只具有正常痛反應的小鼠，分成4組，每組2只。第一組腹腔注射生理鹽水約0.3ml(15ul/g)；第二組注射嗎啡約0.3mg(15ug/g)；第三組注射U69593約0.3mg(15ug/g)；第四組注射0.3mg(15ug/g)的本發(fā)明結(jié)構(gòu)式(I)短肽衍生物。給藥后15，30，45，60分鐘后分別測定痛反應時間，結(jié)果如表3所示，表中A、B是給藥前各小鼠的痛反應時間；C＝(A+B)/2；D-G是給藥后15，30，45，60分鐘時的痛反應時間。
表3不同處理小鼠的痛反應時間


從表3可以看出，生理鹽水沒有鎮(zhèn)痛活性，嗎啡、U69593以及化學合成的短肽(I)具有明顯的鎮(zhèn)痛活性。其中，嗎啡的鎮(zhèn)痛活性最強，在給藥后30分鐘后就達到很好的鎮(zhèn)痛效果，隨著時間的延長，鎮(zhèn)痛活性雖然有所上升，但上升的速度明顯放慢；U69593與5肽衍生物(I)隨著時間的延長，鎮(zhèn)痛活性穩(wěn)步升高。從上表還可以看出，嗎啡產(chǎn)生明顯效果的時間很短，為30分鐘左右，而U69593以及5肽衍生物(I)達到同樣的效果則需要一個小時甚至一個小時以上的時間。根據(jù)表中的數(shù)據(jù)，計算痛閾提高百分率(用藥后痛反應時間減去用藥前同反應時間在初一用藥前同反應時間)，以兩只小鼠痛閾提高百分率的平均值作為該藥的痛閾提高百分率，結(jié)果如表4所示。
表4不同處理小鼠不同時間的痛閾提高百分率

以痛閾提高的百分數(shù)為縱坐標，以給藥后的時間為橫坐標作圖，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，化學合成的5肽衍生物(I)具有明顯的鎮(zhèn)痛活性，其鎮(zhèn)痛效果的時間反應特性與U69593有著很好的相似性，與嗎啡則有著較大的區(qū)別。5肽衍生物(I)鎮(zhèn)痛活性的時間反應特性可能與在體內(nèi)的作用機理有關(guān)，可以推測，其與嗎啡在體內(nèi)的作用機理應有很大的差別，雖然5肽衍生物(I)的鎮(zhèn)痛效果不及嗎啡，但是由于其低成癮性，因此具有廣泛的應用前景。
權(quán)利要求
1.一種短肽，它的氨基酸殘基序列為Y-A-A-F-M
2.一種權(quán)利要求1所述短肽的衍生物，是結(jié)構(gòu)式(I)或(II)的物質(zhì)。
3.一種鎮(zhèn)痛藥，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的短肽。
4.一種鎮(zhèn)痛藥，它的活性成分是權(quán)利要求2所述的短肽。
5.權(quán)利要求1或2所述的短肽在制造鎮(zhèn)痛藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種短肽及其衍生物，以其為活性成分的藥物與應用。本發(fā)明的短肽為本發(fā)明短肽的氨基酸殘基序列為Y－A－A－F－M，它的衍生物有化學式1。以本發(fā)明的短肽或其衍生物為活性成分的藥物，既有與嗎啡相近似的鎮(zhèn)痛功效，同時由于它是k－型阿片受體的激動劑，因此使用者不會產(chǎn)生成癮性。本發(fā)明的短肽及其衍生物在制造鎮(zhèn)痛藥物中將會得到廣泛的應用，并且將會帶來巨大的社會及經(jīng)濟效益。
文檔編號A61P29/00GK1406947SQ01120370
公開日2003年4月2日 申請日期2001年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月23日
發(fā)明者段海清, 張兆山 申請人:段海清, 張兆山