專利名稱：一種治療哮喘病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療哮喘病的藥物，該藥物以組織蛋白酶F的抑制劑為活性成分，通過抑制病人的過敏反應達到治療哮喘的目的，屬于藥物領(lǐng)域。
發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度下(＞lμM)嗎啉脲-亮氨酸-高苯內(nèi)氨酸-乙烯砜-苯基(LHVS，即morpholinurea-lercine-homophenylalanine-vinylsulfone-phenyl)除了能抑制組織蛋白酶S以外還能抑制組織蛋白酶F的活性。在本發(fā)明當中，通過使用一個老鼠的肺部過敏性模型，發(fā)明人研究了組織蛋白酶F參與過敏性哮喘的致病機理。這種蛋白酶的抑制完全阻斷了來自于血清和BAL粘液的IgE產(chǎn)物。此外，采用LHVS對老鼠進行治療后，支氣管的嗜酸性細胞的補充也被抑制住。由此而知，通過小分子抑制劑來調(diào)節(jié)組織蛋白酶F的活性可以用來控制肺部過敏性哮喘的致病機理。
因此，發(fā)明人發(fā)明了一種治療哮喘病的藥物，該藥物以組織蛋白酶F的抑制劑為活性成分。
本發(fā)明治療哮喘病的藥物含有治療有效量的組織蛋白酶F的抑制劑。
所說的治療有效量是按每公斤體重10毫克-1000毫克給藥，優(yōu)選每公斤體重50毫克-800毫克，最好是每公斤體重100毫克。
所說的組織蛋白酶F抑制劑可采用小分子合成抑制劑，例如LHVS或者組織蛋白酶F抗體、組織蛋白酶F反義RNA及核糖體。甚至可以是一些組織蛋白酶F的天然抑制劑，比如Cystatin的類似物等以及一些還未研究清楚的組織蛋白酶F抑制劑均可以用來制備成治療哮喘的藥物。
上述所說的組織蛋白酶F抗體、組織蛋白酶F反義RNA及核糖體以及一些組織蛋白酶F的天然抑制劑，可以根據(jù)已知的現(xiàn)有技術(shù)制備出來。
本發(fā)明藥物還可以含有臨床上適用的藥物賦型劑。本發(fā)明藥物的劑型可以是適用于臨床的各種常規(guī)劑型，例如，丸劑、片劑、散記、口服液體制劑、注射劑等。
本發(fā)明藥物治療哮喘病的機理可以通過如下實驗加以說明
實驗例原料和方法原料除非特別說明，所有該項研究所使用的化學品均來源于Sigma(St.Louis，MO)。C57/B16老鼠(6-8周大)從中國科學院上海實驗動物中心購買。LHVS是根據(jù)先前描述的原始記錄合成而成(Palmer JT，Rasnick D，Klaus JL，Bromme D.1995.J Med Chem38(17)3193-3196.)。動物實驗向C57/B16小鼠注射LHVS(100mg/ml DMSO)(每千克體重100mg)(實驗組n＝48)，或DMSO(對照組n＝48)，注射后的第二天進行免疫注射卵白蛋白。然后，每隔48小時注射一次LHVS或DMSO。所有的小鼠都采用8毫克的OVA與1mg氫氧化鋁的混合物(Goldline實驗室，Middletown，紐約)進行免疫，5天后補充8毫克OVA，并在第12天時，用0.5％的OVA/PBS噴霧30分鐘。第15天取小鼠血清并測定小鼠血清IgE。另一組實驗動物在免疫注射第12天后，用0.5％OVA/PBS噴霧(PBS做對照)分別1，3，6次，每次30分鐘，連續(xù)進行6天實驗。每組噴霧結(jié)束后等待3小時或24小時，再取BAL粘液，小鼠取BAL粘液前，用戊巴比妥麻醉。IgE測定結(jié)果將進行了DMSO和LHVS實驗的小鼠血清樣取出后，用ELISA方法進行總IgE測定。按文獻報道的方法(參見Zuberi RI，Apgar JR，Chen SS，Liu FT.2000 J Immunol 2000 Mar 1；164(5)26672673.)提取BAL粘液。簡單的說，將麻醉的小鼠氣管插入平頭針管，并注射1ml含6mM的EDTA的1XPBS。將采出液中的細胞在1500rpm離心7分鐘離心出來，置于1XPBS中進行染色和記數(shù)。BAL上清液機血清樣本一樣進行IgE ELISA測定。簡單說即將一96孔板涂上一層親和純化后的兔IgE抗體(Pharmingen)，在4℃下過夜，然后用含有1％BSA的PBS在37℃固定1小時。將不同倍數(shù)稀釋后的血清樣、BAL液以及適當倍數(shù)稀釋過的標準IgE液置于孔中并將孔板在4℃下培養(yǎng)3小時。空白孔與其他孔同樣處理。采用在37℃培養(yǎng)1小時的多克隆山羊抗小鼠-IgE抗體檢測IgE變化。然后采用以在37℃培養(yǎng)1小時的馬紅色過氧化物酶(HRP)共扼的兔抗羊抗體進一步測定?？装迳咸砑覱PD進行顯色并在490納米處用ELISA讀取儀讀數(shù)。嗜酸性紅細胞的檢測從BAL液中離心出來的細胞，先加入1XPBS，再用細胞計數(shù)器計數(shù)，然后，將一定數(shù)量的細胞制片。含細胞的玻片采用Hemoxylin和Eosin進行染色，并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。結(jié)果與討論半胱氨酸蛋白酶與許多人類疾病有關(guān)。最近分離出的這種半胱氨酸組織蛋白酶F是一種只在鼠類巨噬細胞中表達的蛋白酶。這種蛋白酶與和組織相容性復合體(MHC)第2類相關(guān)的不變鏈(Ii)有關(guān)系。在鼠巨噬細胞中組織蛋白酶F的抑制能使含有MHC-II Leupeptin抑制性多肽(CLIP)的10kDa未完全降解的Ii片斷囤積(Shi GP，Bryant RA，Riese R，Verhelst S，Driessen C，Li Z，Bromme D，Ploegh HL，Chapman HA.2000.Role forcathepsin F in invariant chain processing and major histocompatibility complex class II peptideloading by macrophages.J Exp Med 191(7)1177-1186)。可見，組織蛋白酶F對于巨噬細胞對抗原調(diào)節(jié)的表達有非常大的作用。巨噬細胞是呼吸系統(tǒng)中對過敏原起免疫反應的主要細胞型。因此我們假設(shè)這種蛋白酶可以造成所有的過敏性哮喘癥IgE的產(chǎn)生和隨之的嗜酸性細胞的增加，而這是過敏性哮喘發(fā)病機理中最主要也是最重要的部分。本發(fā)明的結(jié)果表明一種合成小分子抑制劑LHVS能夠有效的抑制早期肺部過敏反應和后期出現(xiàn)的軟組織和氣管上皮組織內(nèi)炎性的細胞的滲入。當給小鼠注射100毫克/千克體重計量的LHVS，并與DMSO對比組進行對比實驗中可以發(fā)現(xiàn)LHVS組完全抑了鼠血清中對卵清蛋白(OVA)的IgE的產(chǎn)生(

圖1)。類似的，LHVS治療小鼠的BAL液在最后依次噴霧抗原后3小時和24小時IgE產(chǎn)物也有了明顯的降低(圖2)。因此，組織蛋白酶F抑制劑可以在體內(nèi)有效的改善過敏性哮喘的典型癥狀-肺部的早期過敏反應。過敏性哮喘的另一個典型癥狀是炎性細胞的滲透和增加，這種癥狀是較后期的病理表現(xiàn)。這些細胞多數(shù)屬于嗜酸性細胞、淋巴細胞和巨噬細胞(Kotsimbos TC，Ernst P，Hamid QA..1996.Proc Assoc Am Physicians108(5)368-373.)。通過細胞hemoxylin和eosin染色可以看出超過90％的細胞是嗜酸性細胞。與對照組相比，細胞計數(shù)證明LHVS-組織蛋白酶F抑制劑可以明顯的降低小鼠體內(nèi)嗜酸性細胞的滲透。事實上，在經(jīng)LHVS作用最后一次噴霧后3小時或24小時內(nèi)都基本未發(fā)現(xiàn)嗜酸性細胞(圖3)，類似于PBS噴霧作用的小鼠。因此，我們確定組織蛋白酶F可以調(diào)節(jié)氣管過敏免疫反應，在注射了組織蛋白酶F抑制劑以后，早期和晚期的過敏反應都得到了抑制。抑制組織蛋白酶F可采用小分子合成抑制劑，例如LHVS或者組織蛋白酶F抗體、組織蛋白酶F反義RNA及核糖體。甚至可以用一些組織蛋白酶F的天然抑制劑，比如Cystatin的類似物等以及一些還未定義的組織蛋白酶F抑制劑也可以緩解過敏性哮喘癥。
實施例1取LHVS原料純品500克，加注射用油劑，配制成每毫升含LHVS10毫克的注射液，裝瓶，即可。
實施例2取LHVS原料純品500克，加藥用淀粉10000克，混合均勻，造粒，整粒，壓片，制成1000000片。
權(quán)利要求
1.一種治療哮喘病的藥物，其特征在于含有治療有效量的組織蛋白酶F抑制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所說的組織蛋白酶F抑制劑是嗎啉脲-亮氨酸-高苯內(nèi)氨酸-乙烯砜-苯基類物質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所說的組織蛋白酶F抑制劑是組織蛋白酶F的抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所說的組織蛋白酶F抑制劑是組織蛋白酶F的反義RNA及核糖體。
5.如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于所說的組織蛋白酶F抑制劑是是一種組織蛋白酶F的天然抑制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于所說的組織蛋白酶F抑制劑是Cystatin的類似物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其特征在于所說的治療有效量是每公斤體重10毫克-1000毫克。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其特征在于所說的治療有效量是每公斤體重50毫克-800毫克。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物，其特征在于所說的治療有效量是每公斤體重100毫克。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物，其特征在于還含有藥物賦型劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療哮喘病的藥物，該藥物以組織蛋白酶F的抑制劑為活性成分，通過抑制病人的過敏反應達到治療哮喘的目的，屬于藥物領(lǐng)域。所說的組織蛋白酶F的抑制劑包括小分子合成抑制劑，例如LHVS或者組織蛋白酶F抗體、組織蛋白酶F反義RNA及核糖體，也可以是一些組織蛋白酶F的天然抑制劑，例如Cystatin C。
文檔編號A61P11/06GK1400017SQ0112358
公開日2003年3月5日 申請日期2001年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者徐順田 申請人:上海韋池生物技術(shù)有限公司