專利名稱：治療肥胖癥、糖尿病及相關(guān)疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于治療肥胖癥及其相關(guān)疾病的藥物，如治療高胰島素癥，高血糖癥，高血壓癥，心血管疾病，肌肉萎縮癥及不育癥等疾病的藥物。尤其是，本發(fā)明涉及采用特定的基因打靶技術(shù)及組織蛋白酶的基因產(chǎn)物來(lái)治療肥胖癥及非胰島素依賴型糖尿病。
背景技術(shù)：
肥胖癥是西方國(guó)家最嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)紊亂疾病。在中年人中，估計(jì)占30％到50％的人患有此病。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)人體重量超過(guò)正常體重的20％則被認(rèn)為患有肥胖癥。嚴(yán)重的肥胖癥是一種需要長(zhǎng)期治療來(lái)減輕并保持體重的慢性疾病，并且這種疾病正在影響越來(lái)越多的人。
肥胖癥是由于含有肥胖細(xì)胞或是脂肪細(xì)胞的多余的脂肪組織在皮膚，腹部，骨骼肌肉，血管周圍以及乳腺周圍堆積而引起。70公斤的正常人的脂肪組織里大約含有15公斤的脂肪。
脂肪細(xì)胞由類纖維原細(xì)胞發(fā)展而成，無(wú)論是在正常的哺乳類的發(fā)展還是在不同的病理環(huán)境中進(jìn)行，當(dāng)肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)時(shí)，肌肉細(xì)胞死亡的地方慢慢的被脂肪過(guò)多的連接組織代替。脂肪細(xì)胞的分化始于一種特殊酶的產(chǎn)生，接著是小脂肪顆粒的積累，這些小脂肪顆粒相互結(jié)合，直到細(xì)胞被極大的擴(kuò)張，只有很薄的一圈細(xì)胞質(zhì)圍繞在一大塊脂質(zhì)周圍。參見(jiàn)SUL(1989)CURR.OPIN.CELL BIOL.11116-1121。
脂肪細(xì)胞的分化受不同因素的影響。其中一種因素即為生長(zhǎng)素，它是一種蛋白質(zhì)，通常通過(guò)垂體腺分泌進(jìn)入血液。但生長(zhǎng)素并不是唯一調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞發(fā)展的信號(hào)分子。已被生長(zhǎng)素刺激過(guò)的脂肪細(xì)胞的先驅(qū)(前脂肪細(xì)胞)對(duì)類胰島素的生長(zhǎng)劑敏感(IGF-1)，IGF-1能激發(fā)分化的肥胖細(xì)胞增殖。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，LEPTIN(一種源自脂肪細(xì)胞的激素)的整合，在丘腦下部網(wǎng)絡(luò)中能引起控制能量的組建和消耗的外圍代謝路徑的活性。血漿中LEPTIN的水平與脂肪的儲(chǔ)存有關(guān)聯(lián)，并且受酶的平衡的改變的影響。最初認(rèn)為L(zhǎng)EPTIN是一種抗肥胖癥的基礎(chǔ)激素，它的作用常常被抗LEPTIN的物質(zhì)所干擾。AHIMA AND FLIER(2000)ANNU.REV.PHYSIOL.62413-437。
目前最常見(jiàn)的治療肥胖癥的方法是“抑制食欲”療法。抑制食欲的藥物治療是通過(guò)降低食欲或是增加已經(jīng)吃飽的感覺(jué)來(lái)使體重減輕。這些療法是通過(guò)增加血液中的復(fù)合胺或是兒茶酚胺，這兩種能影響心情和胃口的大腦化學(xué)產(chǎn)物來(lái)達(dá)到目的。
長(zhǎng)期采用這類藥物治療會(huì)有一些潛在的副作用。例如，兩種已獲FDA批準(zhǔn)的通過(guò)影響血液中復(fù)合胺的釋放和再吸收來(lái)抑制食欲的藥物(FENFLURAMINE及DEXFENFLURAMINE)已從市場(chǎng)上消失。通過(guò)影響兒茶酚胺的水平來(lái)進(jìn)行治療的藥物如PHENTERMINE，DIETHYLPROPION，MAZINDOL能引起失眠，神經(jīng)質(zhì)和興奮等的綜合癥。關(guān)于采用SIBUTRAMINE來(lái)進(jìn)行治療的基本副作用是使血壓上升和脈搏加快，該副作用通常很輕微，但對(duì)患有高血壓，心臟病，不規(guī)則心跳，以及有中風(fēng)史的人來(lái)說(shuō)則不宜使用。
肥胖癥使發(fā)生心血管疾病、糖尿病、中風(fēng)、肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)以及不育癥的危險(xiǎn)性增高。特別是肥胖癥能逐漸在連續(xù)的階段下發(fā)展成II型糖尿病。臨床上，這些階段可分為一般性的葡萄糖耐受性，削弱了的葡萄糖耐受性，高胰島素的糖尿病，低胰島素的糖尿病。這種對(duì)葡萄糖儲(chǔ)存的逐步削弱伴隨著基本血糖的增高。
一般說(shuō)來(lái)，糖尿病主要有兩種胰島素依賴型(I型)和非胰島素依賴型(II型)。I型糖尿病也叫幼年發(fā)作糖尿病，通常是在人的幼年時(shí)代突然發(fā)病，相反，II型糖尿病，也叫成年發(fā)作糖尿病，一般是在40歲后逐步形成。
多肽型的胰島素激素主要對(duì)肌肉、肝臟和脂肪組織細(xì)胞起作用，它刺激肝糖、脂肪和蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)抑制這些代謝能源的衰減。此外，胰島素刺激大部分細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，但對(duì)大腦和肝臟細(xì)胞特別例外。與之起相反作用的胰高血糖素一起，胰島素維持著人體內(nèi)血糖的適當(dāng)水平。
在糖尿病人中，胰島素不是分泌得不夠就是對(duì)靶細(xì)胞的刺激作用不夠。結(jié)果，血糖水平升高導(dǎo)致尿中血糖升高，這為檢測(cè)該種疾病提供了方便的臨床診斷。盡管血糖水平如此高，細(xì)胞卻由于胰島素刺激葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的作用被削弱而“饑餓”。甘油三酯的水解，脂肪酸的氧化，葡萄糖生成，以及酮體的形成，這一切的加速，將導(dǎo)致血液量的減少，并最終危及生命狀況。
I型糖尿病是由于胰島素缺乏，胰腺缺乏引起的胰島素不足或是產(chǎn)生有缺陷的β細(xì)胞引起。這種情況是由于自體免疫反應(yīng)對(duì)β細(xì)胞有選擇的破壞造成。胰島素依賴型的個(gè)體需要定期注射胰島素來(lái)維持生命，并且要配合非常講究的飲食控制和體育鍛練。
II型糖尿病或叫非胰島素依賴型糖尿病，占臨床案例的90％，在美國(guó)影響著1.6億多的人，在世界范圍影響20億多的人(YOUSEF ETAL.(1999)DIABETES Review 755-76.)。與I型糖尿病相比，II型糖尿病患者具有正常的或是更高的胰島素水平。其癥狀起因于正常對(duì)胰島素起反應(yīng)的細(xì)胞含有的胰島素受體的數(shù)量非常少。假定過(guò)量飲食導(dǎo)致胰島素分泌增多，接著引起肥胖癥，最終抑制了胰島素受體器的合成。
II型糖尿病能引起多種微循環(huán)紊亂并發(fā)癥。除了視網(wǎng)膜病，腎病，神經(jīng)病，這種疾病還會(huì)加速動(dòng)脈硬化癥和早熟性心血管病的發(fā)病率和死亡率。動(dòng)脈硬化癥(如心肌梗塞，中風(fēng)和血管末梢疾病)發(fā)病率的提高與抗胰島素的阻力有非常復(fù)雜的聯(lián)系，這種II型糖尿病中的對(duì)胰島素的阻力是一種主要的病理生理學(xué)反常，是由高血糖癥、高胰島素癥、高血壓癥以及高凝固性癥所引起的代謝反常而導(dǎo)致的。
近年來(lái)，肥胖癥和糖尿病的基因原理已逐步被查明(參見(jiàn)ZHANGET AL.CLONED THE MOUSE OBESITY (OB)GENE AND ITSHUMAN HOMOLOGUE IN 1994.ZHANG ET AL.(1994)NATURE372425-432)。肥胖基因上的改變導(dǎo)致了肥胖癥的癥狀。最常見(jiàn)的用于研究遺傳肥胖癥的動(dòng)物模型是含有正染色體隱性改變的OB/OB和DB/DB的老鼠。這些改變分別位于染色體6和4上，但在臨床上引起類似肥胖癥的癥狀包括多食癥，嚴(yán)重的葡萄糖和胰島素代謝的反常，很難調(diào)節(jié)體溫和非顫抖性的生熱作用，極端遲鈍，以及瘦的人體胞塊發(fā)育不好。限制這些動(dòng)物的飲食來(lái)恢復(fù)正常的人體脂質(zhì)塊和瘦的人體胞塊的比例是最關(guān)鍵的，并且不會(huì)影響到正常的體質(zhì)。
OB和DB的基因產(chǎn)物由成對(duì)的激素/受體(LEPTIN和LEPTIN受體)組成。LEPTIN是一種由肥胖細(xì)胞產(chǎn)生的縮氨酸激素，OB/OB和DB/DB的老鼠不能產(chǎn)生LEPTIN(OB/OB)，或是對(duì)LEPTIN不受影響(DB/DB)。給OB/OB的老鼠加入LEPTIN，老鼠吃得更少，更有活力，并且極大的減輕了體重。
除了OB和DB，在老鼠身上已發(fā)現(xiàn)了幾種能導(dǎo)致肥胖癥的單一的基因改變。例如，發(fā)現(xiàn)刺豚鼠位點(diǎn)的黃色改變能引起多向的綜合癥，這種綜合癥能引起中年人患上肥胖癥，并使腫瘤形成的可能性加大(HERBERG AND COLEMAN 1977，METABOLISM 2659)，還可引發(fā)人體脂質(zhì)的解剖學(xué)上的反常分布(COLEMAN 1978，DIABETOLOGIA 14141-148)。此外，在肥胖位點(diǎn)的改變能引起中等程度的成年人肥胖癥，并伴有比在OB和DB老鼠身上稍微緩和一點(diǎn)的葡萄糖靜態(tài)平衡失調(diào)[COLEMAN AND EICHER(1990)J.HEREDITY 81424-427]。更進(jìn)一步的是，已經(jīng)證實(shí)在染色體7上的脂肪細(xì)胞位點(diǎn)上的常染色體的顯性改變能引起肥胖癥。
其他的動(dòng)物模型，包括FA/FA(肥胖)老鼠，是一種和OB/OB或DB/DB老鼠有多處類似的老鼠。區(qū)別之一在于當(dāng)FA/FA老鼠對(duì)寒冷非常敏感時(shí)，他們對(duì)非顫抖性生熱作用的能力是正常的。相比老鼠的突變異種來(lái)說(shuō)，在FA/FA老鼠身上，遲鈍對(duì)肥胖癥的保持起更大的作用。此外，天生的老鼠族群如NZO老鼠和日本KK老鼠都較肥胖。某種雜交鼠如WELLESLEY老鼠則天生肥胖。還有，一些沙漠里的嚙齒動(dòng)物，如刺鼠，在其棲息地則不會(huì)肥胖，而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)則可變得肥胖。
用來(lái)研究肥胖癥的動(dòng)物模型還經(jīng)過(guò)藥理學(xué)上的或是身體上的處理。例如VMH和VLH的雙面損害的老鼠同時(shí)分別患有食欲過(guò)盛和肥胖癥，以及不能吞咽和惡病質(zhì)。更進(jìn)一步的是，已經(jīng)證實(shí)對(duì)新生老鼠喂養(yǎng)谷氨酸一鈉-谷氨酸鹽(MSG)同樣能導(dǎo)致肥胖癥綜合癥。
已經(jīng)有人利用這些動(dòng)物模型來(lái)從分子上研究肥胖癥的致病機(jī)理。如，ADIPSIN，一種鼠類的絲氨酸蛋白酶，其活性與人類的產(chǎn)于前脂肪細(xì)胞的D劑極為相似，這種蛋白酶在OB/OB，DB/DB，及由MSG引發(fā)的肥胖癥中受到了抑制(FLIER(1987)SCIENCE 237405)。每個(gè)模型都是先發(fā)現(xiàn)ADIPSIN的被抑制，然后出現(xiàn)肥胖癥。對(duì)這些模型中的缺陷位點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，以便了解促ADIPSIN劑的活性[PLATT(1989)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 867490]?？茖W(xué)家又更深入的了解到，在OB/OB老鼠的視丘下部的中，神經(jīng)傳遞縮氨酸的表達(dá)出現(xiàn)變化[WILDING(1993)ENDOCRINOLOGY 1321939]，在β細(xì)胞島上葡萄糖的傳遞蛋白出現(xiàn)變化，以及G蛋白的水平也出現(xiàn)變化[MCFARLANE-ANDERSON(1992)BIOCHEM.J.28215]。
對(duì)不同于當(dāng)前有關(guān)機(jī)理的肥胖癥、糖尿病及相關(guān)疾病的治療，仍然需要做進(jìn)一步的改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于發(fā)明人的一個(gè)研究結(jié)果，即某種組織蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特別是蛋白酶L，在脂肪形成以及脂肪或是肥胖細(xì)胞的分化過(guò)程中起著非常重要的作用。
通過(guò)發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特別是L，與脂肪儲(chǔ)存的調(diào)控、血糖水平的高低以及胰島素水平的高低有著緊密聯(lián)系，基于這項(xiàng)研究，本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存、血糖水平及胰島素水平改變的藥物和方法。該藥物和方法也可用于診斷、監(jiān)測(cè)和治療各種由不適當(dāng)?shù)?、反常的或是多余的脂肪?chǔ)存，血糖水平和胰島素水平所引起的疾病。
因此，本發(fā)明提供了一種可用來(lái)降低動(dòng)物體內(nèi)的脂肪儲(chǔ)存的制劑，這種制劑可用來(lái)降低動(dòng)物體內(nèi)組織蛋白酶L的活性，從而降低了動(dòng)物體內(nèi)的脂肪儲(chǔ)存。
本發(fā)明還提供了一種用來(lái)降低血糖水平的制劑，這種制劑可用來(lái)降低動(dòng)物體內(nèi)組織蛋白酶L的活性，從而降低了動(dòng)物體內(nèi)的血糖水平。
本發(fā)明還提供了一種用來(lái)降低胰島素水平的藥物，這種制劑可用來(lái)降低動(dòng)物體內(nèi)組織蛋白酶L的活性，從而降低了動(dòng)物血液中的胰島素水平。
另外，本發(fā)明的藥物制劑還可以用于治療高胰島素癥，高血糖癥，高血壓癥，心血管疾病，肌肉萎縮癥及不育癥等疾病，這種制劑可用來(lái)降低動(dòng)物體內(nèi)組織蛋白酶L的活性。本發(fā)明還提供了組織蛋白酶L，K，和S抑制劑的藥物新用途，即，組織蛋白酶L，K，和S抑制劑在制備治療肥胖癥、糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了組織蛋白酶L，K，和S抑制劑的藥物新用途，即，組織蛋白酶L，K，和S抑制劑在制備治療高胰島素癥、高血糖癥、高血壓癥、心血管疾病、肌肉萎縮癥及不育癥等疾病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所說(shuō)的組織蛋白酶L，K，和S抑制劑包括如下物質(zhì)1、組織蛋白酶S的選擇性抑制劑包括α-氧代-β-醛衍生物和乙烯砜，參見(jiàn)表2；如Cbz-Phe-Leu-COCHO，嗎啉脲-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜-苯基(LHVSN-morpholinurea-leucine-homophenylalanine-vinylsulfone-phenyl)；2、組織蛋白酶K抑制劑包括非肽類氨腈；非肽類碳酰肼類；烷氧甲基酮衍生物，參見(jiàn)表3；如，1-氰基-吡咯啉基氨基甲酸卞基酯，N-[1-(氰基-3-氮雜環(huán)丁烷基)甲基]環(huán)己烷羧酰胺，2，2′-(N-卞基氧基羰基-L-亮氨酸基)碳酰肼，(3S)-3-[(N-卞基氧基羰基)-L-亮氨酸基]氨基-1-(4-苯基)-苯甲?；?氧-5-甲基-2-己酮；3、組織蛋白酶L抑制劑包括多肽類物質(zhì)，如，mutant CystatinC(V10W/W106W)，saxiphilin；環(huán)氧琥珀酸酯衍生物，如，CLIK 148〖L-(+)-(2S，3S)-N-[2-(2，-吡啶基-)-1-乙基-]-鈉-氨基-(L-苯丙氨酸-二甲基酰胺)-反式-環(huán)氧琥珀酰胺〗，其IUPAC名稱N-[2-(2-吡啶基)-1-乙基]-L-(+)-(2S，3S)-3-[(S)-1-二甲基氨基甲?；?2-苯基乙基氨基甲?；鵠-2-環(huán)氧乙烷羧酰胺，和CLIK 195，即，(L-(+)-(2S，3S)-雙-(鈉-氨基-L-苯丙氨酸二甲基酰胺)-反式-環(huán)氧琥珀酰胺，IUPAC名稱是N，N-二甲基-L-(+)-(2S，3S)-2-{3-[(S)-1-二甲基氨基甲?；?2-苯基-乙基氨基甲?；鵠-2-環(huán)氧乙烷氨基甲?；被鶀-(S)-3-苯基-丙酰胺)；氮丙啶-2，3-重碳酸鹽衍生物，如，N-{(2S，3S)-1-[[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨?；鵠-3-(乙氧基羰基)氮丙啶-2-基]羰基}-(S)-亮氨酸卞基酯，(2R，3S)+(2S，3S)1-[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨?；鵠氮丙啶-2，3-二羧酸；肽醛衍生物，如，L-異亮氨酰基-L-色氨酸基醛衍生物，N-(1-奈基黃?；?-L-異亮氨?；?L-色氨酸基醛，N-(卞基氧基羰基)-L-苯基丙氨?；?L-酪氨酸基醛，N-(2-卞基-3-苯基丙酰基)-L-色氨酸基醛；二肽羥酰胺酸酯衍生物和磺?；苌?，參見(jiàn)表4，如(3S)-3-[(N-卞基氧基羰基)-L-亮氨酸基]氨基-1-(4-苯基)-苯甲酰基-氧-5-甲基-2-己酮，Z-Phe-Gly-NHO-Bz，Z-Phe-Gly-NHO-NBz，SB468430，SB468432，N-(1-奈基黃?；?L-異亮氨?；?L-色氨酸基醛。
反義RNA作為組織蛋白酶L的抑制劑已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制(European Journal of Cancer，36，787-795，2000)。因此，該文獻(xiàn)所說(shuō)的反義RNA也可以用作本發(fā)明的組織蛋白酶L的抑制劑，用于治療肥胖癥、糖尿病及相關(guān)性疾病。
組織蛋白酶L前肽是一種很好的組織蛋白酶抑制劑(Eur.J.Biochem.267，6311-6318，2000)。它對(duì)組織蛋白酶K和L的Ki分別是0.27和0.12nM，因此，組織蛋白酶L前肽可以用作本發(fā)明的組織蛋白酶抑制劑，用于治療肥胖癥、糖尿病及相關(guān)性疾病。
因此，本發(fā)明提高了一種降低動(dòng)物脂肪儲(chǔ)存的藥物，該藥物包含治療有效量的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)。所說(shuō)的降低體內(nèi)蛋白酶L的活性包括蛋白酶L表達(dá)的降低和蛋白酶L表達(dá)的被抑制。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)是一種核酸，所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的核酸選自含有反義分子，核糖酶和三倍的螺旋分子，具體說(shuō)，所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的核酸是一種與部分人類組織蛋白酶L的CDNA序列(表1，SEQ ID NO1)互補(bǔ)的反義分子，更具體說(shuō)，所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的核酸是一種與部分人類組織蛋白酶L基因的5’-末端未翻譯的區(qū)域互補(bǔ)的反義分子。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)還可以是一種抗體，這種抗體是一種與組織蛋白酶L相結(jié)合的抗體。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的抗體是一種完全的人類抗體，一種單克隆抗體或一種人性化的抗體。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)還可以是一種能抑制蛋白酶L活性的多肽，這種多肽是一種如表3所列的CYSTATIN C的突變異種，所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)還可以是一種能抑制蛋白酶L活性的環(huán)氧琥珀酸鹽的衍生物，所說(shuō)的環(huán)氧琥珀酸鹽的衍生物選自于表3中包含有環(huán)氧琥珀酸鹽的衍生物的一個(gè)小組。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)也可以是一種能抑制蛋白酶L活性的氮丙啶-2，3-重碳酸鹽衍生物，這種氮丙啶-2，3-重碳酸鹽衍生物選自如表3所列含有氮丙啶-2，3-重碳酸鹽衍生物的一組。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)也可以是一種能抑制蛋白酶L的活性的二肽羥酰胺酸酯衍生物和磺?；苌?，所說(shuō)的二肽羥酰胺酸酯衍生物和磺酰基衍生物選自表3所列的包含有二肽羥酰胺酸酯衍生物和磺?；苌锏男〗M。所說(shuō)的能降低體內(nèi)組織蛋白酶L活性的物質(zhì)也可以是一種肽的乙醛的衍生物，這種衍生物是選自表3所列的包含有肽的乙醛的衍生物的小組。
如上所述，本發(fā)明是基于如下的研究結(jié)果，即某種組織蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特別是蛋白酶L，在脂肪形成以及脂肪或是肥胖細(xì)胞的分化過(guò)程中起非常重要的作用。研究觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)的組織蛋白酶L活性降低時(shí)，其體內(nèi)儲(chǔ)藏脂肪的能力比蛋白酶L活性正常時(shí)顯著降低。同時(shí)還注意到，蛋白酶K和S與L一起有著同樣的作用，所以認(rèn)為他們都具有調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存的功能。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，其他的蛋白酶，功能大多類似于組織蛋白酶L，K和S，特別是類似與L的蛋白酶，同樣在體內(nèi)存在，并且對(duì)脂肪儲(chǔ)存的調(diào)節(jié)路徑起一定作用。做為一個(gè)功能相近的小組，在此我們把參與調(diào)節(jié)脂肪儲(chǔ)存的所有組織蛋白酶稱為“調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶群”。
針對(duì)組織蛋白酶的不同構(gòu)成采用選擇性抑制劑來(lái)進(jìn)行的一系列生物化學(xué)試驗(yàn)表明，蛋白酶L極為密切的參與了在胰島素和胰島素受體之間的復(fù)合體的代謝。與未分化的人類細(xì)胞(前脂肪細(xì)胞)相比，在人體脂肪細(xì)胞分化后蛋白酶L的活性加大。抑制組織蛋白酶L將導(dǎo)致完整的胰島素受體和類胰島素受體在人體前脂肪細(xì)胞中的堆積，或是在鼠的前脂肪細(xì)胞中降低退化的胰島素受體中間體的數(shù)量。更進(jìn)一步的是，抑制組織蛋白酶L將阻礙人類和老鼠的前脂肪細(xì)胞形成脂肪。下文將對(duì)所做的生物化學(xué)研究做出說(shuō)明。
根據(jù)本發(fā)明的研究結(jié)果，即體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，尤其是蛋白酶L，K，和S，特別是L，與脂肪儲(chǔ)存的調(diào)控、血糖水平的高低以及胰島素水平的高低有緊密聯(lián)系，基于這項(xiàng)研究，本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存、血糖水平及胰島素水平改變的藥物和方法。該藥物和方法也可用于診斷、監(jiān)測(cè)和治療各種由不適當(dāng)?shù)?、反常的或是多余的脂肪?chǔ)存，血糖水平和胰島素水平所引起的疾病。例如此項(xiàng)發(fā)明提供了可治療肥胖癥，糖尿病和由于體內(nèi)反常的脂肪儲(chǔ)存水平、血糖水平和胰島素水平所導(dǎo)致的疾病的成分。
另外，通過(guò)降低動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶群的活性，可以控制從前脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的分化(脂肪形成)，類似的也可控制IR復(fù)合體的轉(zhuǎn)換。那么，降低體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶群的活性，特別是組織蛋白酶L，能用于此項(xiàng)發(fā)明來(lái)治療肥胖癥和與胰島素再吸收相關(guān)的疾病，如高胰島素癥，高血糖癥，II型糖尿病，和肥胖癥相關(guān)疾病，如高血壓，心臟血管病，肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)癥和不育癥。
目前已有多種可用來(lái)進(jìn)一步發(fā)展成為調(diào)節(jié)脂肪的靶蛋白酶，特別是關(guān)于蛋白酶L的治療制劑。這些制劑可用來(lái)設(shè)計(jì)成為以組織蛋白酶為靶向，增加或是降低調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的體內(nèi)活性。
這些治療制劑在CDNA的基礎(chǔ)上或在蛋白酶調(diào)節(jié)脂肪的調(diào)節(jié)區(qū)域的基礎(chǔ)上來(lái)以調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶為靶向。例如，以DNA為基礎(chǔ)的治療劑，如反鏈抑制劑和核糖酶，能以組織蛋白酶基因的基因內(nèi)區(qū)和外顯子為靶向，在RNA的水平上也一樣。
做為選擇，治療劑可在氨基酸序列的基礎(chǔ)上來(lái)以調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶為靶向，該基礎(chǔ)包括調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和/或前體。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療劑，如人類的抗體，非人類的單克隆型抗體和已人化的抗體，則可專門用來(lái)以調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶的不同抗原為靶向。肽或是PEPTIDOMIMETICS可作為高親和力的抑制劑專門用來(lái)與一種特殊的蛋白酶的活性位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制了體內(nèi)蛋白酶的活性。小分子也可用來(lái)以組織蛋白酶為靶向，特別是那些對(duì)蛋白酶L有高選擇性的分子。
除了對(duì)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶靶向化，通過(guò)與組織蛋白酶的自然底物相競(jìng)爭(zhēng)地參與與酶的結(jié)合，治療劑也可用于競(jìng)爭(zhēng)性的抑制調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶。
以調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶為靶向的治療劑，相比與非調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶，更有選擇的以調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶為靶向。如，與其他非調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶相比，治療劑更有選擇的以蛋白酶L，K或S為靶向。又如，治療劑對(duì)蛋白酶L比對(duì)其他非脂肪調(diào)節(jié)蛋白酶的靶向更有選擇性。再如，相比與組織蛋白酶K和S，治療劑更有選擇的以蛋白酶L為靶向。
上文所說(shuō)的“更有選擇的以……為靶向”，如果沒(méi)有特殊說(shuō)明，起含義為“更有選擇的抑制……的表達(dá)”，“更有選擇的與……相結(jié)合”，或是“更強(qiáng)的降低了……的在體內(nèi)的活性”。
當(dāng)一種更有選擇性的靶向治療劑具備了更強(qiáng)的降低某種特定的組織蛋白酶在體內(nèi)活性的能力，這種更強(qiáng)的能力的衡量是以這種治療劑對(duì)改變組織蛋白酶的活性的能力為基礎(chǔ)的。
治療劑與一種組織蛋白酶結(jié)合的實(shí)施方案是這種結(jié)合的親和力可用于作為為更強(qiáng)的選擇性做測(cè)定。在這種情況下，以調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶為靶向的治療劑，相比與非調(diào)劑脂肪的蛋白酶，對(duì)調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力。一個(gè)表達(dá)是，相比非調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶，治療劑對(duì)蛋白酶L，K和S的粘合親和力更強(qiáng)。另一個(gè)實(shí)施方案是，對(duì)蛋白酶L的結(jié)合親和力超過(guò)其他非調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶。還有一個(gè)實(shí)施例是，這種親和力對(duì)蛋白酶L的程度強(qiáng)于蛋白酶K和S。在一個(gè)特定的實(shí)施例當(dāng)中，相比與其他的特定的蛋白酶或蛋白酶類別，特殊的治療劑更有選擇性的以某種特定的蛋白酶或是蛋白酶的某個(gè)特殊類別為靶向(如蛋白酶L)，在這種意義上說(shuō)，治療劑與特定蛋白酶或蛋白酶類別的結(jié)合親和力最少要強(qiáng)10倍，較好的情況下要強(qiáng)100倍，最好的情況下強(qiáng)1000倍。舉例來(lái)說(shuō)，某種治療劑對(duì)蛋白酶L的結(jié)合親和力可能是對(duì)蛋白酶K或S的親和力的10倍，較好的情況下100倍，最好的情況下達(dá)1000倍。
應(yīng)注意到，可以將調(diào)節(jié)脂肪為靶向的不同的治療劑混合到不同的藥物制劑當(dāng)中，使之在生物體中發(fā)揮這些作用。這些制劑可能會(huì)包含一種或多種制藥載體。這些制劑可以以各種適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)形式給藥，例如，非腸道(靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)的，胸內(nèi)的，或肌肉內(nèi)給藥)，透皮或口服給藥。
對(duì)于選擇性以調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶為靶向的治療劑，本發(fā)明提供了多種使用方法。這些方法可對(duì)任何動(dòng)物使用。如，該動(dòng)物為脊椎動(dòng)物，又如，該動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。采用了這些方法的特定的動(dòng)物例子包括，不僅僅局限于人類，寵物(如貓，狗，馬等)，家畜(如雞，鴨，鵝，豬，馬等)，以及在動(dòng)物園里飼養(yǎng)的動(dòng)物。
通過(guò)使用這些治療劑，可以在動(dòng)物體內(nèi)降低調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的活性(在此可稱作為“體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的活性”)。這種狀況也許是由動(dòng)物體內(nèi)的調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶的數(shù)量降低引起，也可能是由于動(dòng)物體內(nèi)的調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶受到抑制而引起。
如，一種方法可以降低動(dòng)物體內(nèi)的脂肪儲(chǔ)存。某種治療劑可以降低體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶的活性，從而降低了體內(nèi)脂肪的儲(chǔ)存。這種方法就是通過(guò)服用這種治療劑來(lái)達(dá)到目的。這種方法也許在已測(cè)定的體內(nèi)活性的基礎(chǔ)上，更進(jìn)一步的添加了一些測(cè)定體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶的活性的成分和對(duì)這種治療劑所起的作用進(jìn)行調(diào)節(jié)的成分。通過(guò)降低調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶的活性，如蛋白酶L，在前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化時(shí)進(jìn)行抑制，則可導(dǎo)致前脂肪細(xì)胞的傳導(dǎo)阻滯，從而用了這種治療劑的動(dòng)物的體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存就被降低了。
又如，一種方法是用來(lái)降低動(dòng)物體內(nèi)的血糖水平的。某種治療劑可以降低體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的蛋白酶的活性，從而降低了體內(nèi)的血糖水平。這種方法就是通過(guò)服用這種治療劑來(lái)達(dá)到目的。這種方法可能還添加了一些測(cè)定血糖水平和體內(nèi)蛋白酶活性的成分。對(duì)這種治療劑的服用要依據(jù)這一種或這兩種測(cè)定的結(jié)果來(lái)調(diào)節(jié)。
這種方法較適于用于人類，更適用于在比正常人的血糖水平高的人身上(如高于1.26克葡萄糖/升血液的正常值)，用在II型糖尿病人身上效果最好。
通過(guò)降低調(diào)節(jié)組織蛋白酶的活性，如組織蛋白酶L的活性，可阻礙胰島素受體或類胰島素受體的水解或極大限度地減小水解以產(chǎn)生完整的受體。已發(fā)現(xiàn)II型糖尿病的主要起因是胰島素阻抗，胰島素受體的變異可造成對(duì)胰島素投藥的阻抗或非響應(yīng)性。盡管有極高的血漿胰島素含量，具有胰島素阻抗的人們還是容易患上糖尿病。這樣，提高完整胰島素受體和類胰島素受體的含量將促進(jìn)胰島素的響應(yīng)性并降低血糖含量，因而緩解糖尿病癥狀。
在另一種情況下，有一種降低動(dòng)物血液胰島素含量的方法，它是通過(guò)給動(dòng)物投用一種在體內(nèi)降低調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶活性制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種方法還可包括測(cè)量動(dòng)物和/或體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶活性血液胰島素含量。當(dāng)然，這種制劑的使用還可在此種或此兩種測(cè)量基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。這種方法最好在人體上進(jìn)行，以患有胰島素功能亢進(jìn)型的人體為上，以患有II型糖尿病的人體為佳。
在另一種情況下，有一種治療患有肥胖疾病，或與胰島素再循環(huán)相關(guān)的疾病(如胰島素功能亢進(jìn)，多糖癥，II型糖尿病)或與肥胖相關(guān)的疾病(如高血壓，心血管疾病，肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和不孕癥)的動(dòng)物的方法。這種方法包括給動(dòng)物服用一種可降低體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶活性的制劑，這樣動(dòng)物的血液胰島素含量就可降低。這種方法還可進(jìn)一步包括測(cè)量動(dòng)物的血糖量，動(dòng)物的血液胰島素含量和/或動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)組織蛋白酶活性的脂肪。當(dāng)然，這種制劑的使用還可在此種或此兩種測(cè)量基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。
至于上述任何一種方法，降低調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪的組織蛋白酶制劑比非調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶更能降低體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶活性。其中一種變化是，此制劑比其它非調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶更能降低體內(nèi)組織蛋白酶L，K或S的活性。在另一種情況下，此制劑比其它非調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶更能降低體內(nèi)組織蛋白酶L的活性。在另一種情況下，此制劑降低體內(nèi)組織蛋白酶L的活性比降低體內(nèi)組織蛋白酶K或S活性更強(qiáng)。
在某種具體情況下，此制劑比組織蛋白酶K或S更能有選擇地作用于組織蛋白酶L。從這個(gè)意義來(lái)說(shuō)，此治療制劑對(duì)組織蛋白酶L的親和力比組織蛋白酶K或S至少大10倍，100倍或1000倍。
至于上述情況，值得注意的是，體內(nèi)某種組織蛋白酶活性的降低可能與另一種組織蛋白酶表達(dá)的顯著降低有關(guān)，或是與體內(nèi)某一表達(dá)組織蛋白酶活性的顯著降低有關(guān)。
本發(fā)明也與通過(guò)測(cè)量調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶mRNA數(shù)量，例如組織蛋白酶L；調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶表達(dá)數(shù)量，例如組織蛋白酶L；和/或調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶含量，例如組織蛋白酶L，以診斷某一疾病狀態(tài)的方法有關(guān)。
這一疾病狀態(tài)包括異常的，不規(guī)則的或非希望有的脂肪積存量，血糖含量和/或胰島素含量。值得注意的是，可一同監(jiān)測(cè)包括組織蛋白酶L和K，L和S或L，K和S在內(nèi)的調(diào)節(jié)組織蛋白酶的一種或多種脂肪。
本發(fā)明與通過(guò)測(cè)量調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，如L，mRNA數(shù)量，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，如L，表達(dá)數(shù)量，和/或調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，如L，含量，以診斷某一疾病狀態(tài)起因的方法有關(guān)。這一疾病狀態(tài)包括異常的，不規(guī)則的或非希望有的脂肪積存量，血糖含量和/或胰島素含量。
與通過(guò)測(cè)量調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，如L，mRNA數(shù)量，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，如L，表達(dá)數(shù)量，和/或調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶，如L，含量，以檢測(cè)動(dòng)物感染某種疾病狀態(tài)的遺傳性易患病體質(zhì)的方法有關(guān)。這一疾病狀態(tài)包括異常的，不規(guī)則的或非希望有的脂肪積存量，血糖含量和/或胰島素含量。
上述每種診斷方法中，對(duì)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶L有關(guān)的測(cè)量可與對(duì)動(dòng)物的脂肪積存量，血糖含量和/或胰島素含量的測(cè)量同時(shí)進(jìn)行。例如，組織蛋白酶活性升高或異常高的動(dòng)物在體內(nèi)可能同時(shí)具有更高的脂肪含量。組織蛋白酶L的高度活性(或含量)和高脂肪含量結(jié)合起來(lái)可被用來(lái)鑒別高脂肪含量的可能起因。
在某一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶L的基因表達(dá)活性。其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性表明此動(dòng)物先天患有遺傳性肥胖癥。調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的基因表達(dá)活性包括但不僅限于如受制于調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因和轉(zhuǎn)錄mRNA促進(jìn)劑區(qū)域的轉(zhuǎn)錄性因素的轉(zhuǎn)錄活性，如調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶蛋白產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄活性，以及如調(diào)節(jié)組織蛋白酶脂肪產(chǎn)生母體的解蛋白過(guò)程的轉(zhuǎn)錄后活性，與調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶內(nèi)源性抑制劑的表達(dá)有所差別。
在另一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶L基因表達(dá)活性；測(cè)量動(dòng)物的血糖含量和/或胰島素含量。其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性以及異常高的血糖和胰島素含量等表明此動(dòng)物先天患有II型糖尿病或胰島素功能亢進(jìn)癥。
在另一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶如L基因表達(dá)活性；測(cè)量動(dòng)物的血糖含量和/或胰島素含量。其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性以及異常高的血糖和胰島素含量等表明此動(dòng)物先天患有II型糖尿病或胰島素功能亢進(jìn)癥。
本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性或表達(dá)(組織蛋白酶K，L或S較好，組織蛋白酶K和L為佳，組織蛋白酶L為上)為調(diào)節(jié)脂肪形成的化合物或制劑也提供了鑒別方法。
在某一情況下，可提供鑒別在細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)抑制脂肪形成制劑的方法。此方法包括把含有前成脂肪細(xì)胞的細(xì)胞與測(cè)試制劑進(jìn)行接觸，檢測(cè)一下從前成脂肪細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的不同含量。其中前成脂肪細(xì)胞含量的降低表明測(cè)試化合物抑制了脂肪的形成。變化之一是，此方法進(jìn)步包括檢測(cè)組織蛋白酶一個(gè)或更多脂肪的活性。調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性的降低與前成脂肪細(xì)胞含量的降低相關(guān)。變化之二是，此方法進(jìn)一步包括檢測(cè)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的降低。調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的降低與前成脂肪細(xì)胞差異含量的降低相關(guān)。
調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶活性包括但不僅限于上述酶的活性及基因表達(dá)活性。前成脂肪細(xì)胞分化水平包括但不僅限于分化細(xì)胞的數(shù)量(即脂肪細(xì)胞)，胰島素受體含量(如胰島素受體β亞單位)和其前體，胰島素受體樣β亞單位和其前體的含量，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α及PPAR-γ的表達(dá)量。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)具有改善體內(nèi)脂肪含量的非人類動(dòng)物，如具有所希望的脂肪含量的牲畜，的方法，該方法是改變一種或幾種調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶(組織蛋白酶K，L和S較好，KL為佳，L為上)體內(nèi)活性。
在某一情況下，可提供一種能降低動(dòng)物脂肪儲(chǔ)量的方法。此方法包括給動(dòng)物投用一種可降低動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性的制劑，由此，動(dòng)物的脂肪含量可降低。
在另一種情況下，可提供一種提高動(dòng)物脂肪儲(chǔ)量的方法。此方法包括給動(dòng)物投用一種可提高動(dòng)物體內(nèi)調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性的制劑，由此，動(dòng)物的脂肪含量可提高。此動(dòng)物可為脊椎動(dòng)物，哺乳動(dòng)物比較好，象雞、鴨、火雞、鴕鳥(niǎo)、牛、豬和馬這些牲畜最佳。此動(dòng)物還可包括貓、狗在內(nèi)的寵物。此制劑為調(diào)節(jié)組織蛋白酶L的脂肪。
本發(fā)明還為降低動(dòng)物的脂肪儲(chǔ)量提供了某一合成物，此合成物包括能降低調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶如L在內(nèi)的活性含量的制劑和動(dòng)物食品。例如，對(duì)一只狗而言，此食品可以是包含有能降低調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性量制劑的狗食品；對(duì)一只貓而言，此食品可以是包含有能降低調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性量制劑的貓食品；對(duì)象馬、豬、羊等牲畜來(lái)說(shuō)，此食品可以是牲畜食品，而在這種食品中已添加了能降低調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性量的制劑。
此合成物的攝取可通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性量的降低來(lái)減少脂肪的吸收和貯存，從而在調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶調(diào)節(jié)下來(lái)抑制脂肪形成。
1、半胱氨酸蛋白酶科目中的組織蛋白酶蛋白酶是通過(guò)催化氨基化合物酰氨鍵水解來(lái)把蛋白質(zhì)或聚縮氨酸降解為小成分的一種酶。在蛋白質(zhì)水解過(guò)程中，所有蛋白酶具有的共同原理是催化作用是由對(duì)氨基化合物酰氨鍵的碳?；歼M(jìn)行親核攻擊來(lái)發(fā)起的。不同的蛋白酶利用不同的方法來(lái)產(chǎn)生親核基團(tuán)，并使之與目標(biāo)鍵并列?；谠诜肿雍可系倪@些差別，蛋白酶可分為四個(gè)主要類別絲氨酸酶，半胱氨酸酶，天冬氨酸鹽酶和金屬蛋白酶。絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶分別利用其副鏈的羥氫氧基和硫醇組直接作為親核基團(tuán)，而天冬氨酸鹽和金屬蛋白酶分別利用天冬氨酸鹽殘基和重金屬，來(lái)固定和極化水分子，以便水中的氧原子成為親核基團(tuán)。
如上所述，半胱氨酸蛋白酶是在催化反應(yīng)過(guò)程中起決定作用的。蛋白酶的活躍區(qū)中以半胱氨酸殘基的存在為區(qū)別的一種蛋白酶。在生物系統(tǒng)中已分離出了多種無(wú)數(shù)半胱氨酸蛋白酶。包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中，通常通過(guò)包括半胱氨酸蛋白酶的活性在內(nèi)的許多原理來(lái)降解和處理蛋白質(zhì)。然而當(dāng)含量提高或當(dāng)受異常刺激或當(dāng)受病毒或細(xì)菌或寄生性感染而注入生物系統(tǒng)時(shí)，其表達(dá)受到影響。人們通常認(rèn)為半胱氨酸蛋白酶與細(xì)胞內(nèi)的許多病理生理性過(guò)程和疾病狀況有關(guān)。它具有許多消化性或處理性功能。而在細(xì)胞外，它可能與組織重塑和病理學(xué)有關(guān)，如關(guān)節(jié)炎、發(fā)炎、心肌梗塞、早老性癡呆、癌癥、肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、動(dòng)脈硬化病及動(dòng)脈瘤等。
半胱氨酸蛋白酶習(xí)慣上被看作是最終降解的溶酶體介質(zhì)。然而，在人類生物學(xué)中，半胱氨酸蛋白酶還曾起了更多更廣泛的作用。人們發(fā)現(xiàn)這個(gè)家族中的一些成員由有限的組織表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)并在細(xì)胞生理學(xué)中起重要作用，如細(xì)胞刁亡，激素的激活，MHC二級(jí)免疫反應(yīng)，以及對(duì)骨骼發(fā)展十分重要的細(xì)胞外基質(zhì)重塑等。
基于其不同的結(jié)構(gòu)和功能，半胱氨酸蛋白酶可分為兩大類。與ICE相關(guān)的酶類和木瓜酶類。ICE酶類和木瓜酶類不具有序列同族關(guān)系，在炎癥和細(xì)胞刁亡中起到越來(lái)越明顯的作用。ICE促進(jìn)了白細(xì)胞間介素-1β的形成，以及從其非活躍性產(chǎn)生母體，Pro-1β和pro-IGIF中IGIF的形成。白細(xì)胞間介素-1β為與發(fā)炎、糖尿病、敗血休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和早老性癡呆有關(guān)的一種免疫調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)。ICE和/或其它c(diǎn)aspases亦與包括帕金森疾病，局部缺血癥和橫向肌萎縮硬化癥在內(nèi)的與抑制神經(jīng)紊亂相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞刁亡有關(guān)。
在半胱氨酸蛋白酶的木瓜酶類中，鈣激活中性蛋白酶包括一組在哺乳動(dòng)物組織中無(wú)處不在地表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶。鈣激活中性蛋白酶嚴(yán)格地依賴鈣，但其蛋白酶區(qū)卻與木瓜酶的極其相似。鈣的感受性來(lái)自木瓜酶類蛋白酶與類調(diào)鈣蛋白區(qū)的遺傳性聚變。
現(xiàn)已鑒定出三種主要的鈣激活中性蛋白酶。鈣激活中性蛋白酶I，II和p94。半胱氨酸蛋白酶的鈣激活中性蛋白酶家族與許多疾病和紊亂有涉，包括中風(fēng)、抑制神經(jīng)病、早老性癡呆、肌萎縮、運(yùn)動(dòng)原神經(jīng)細(xì)胞損壞、急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，骨再吸收、血小板聚合，白內(nèi)障和炎癥。鈣激活中性蛋白酶I與由包括局部缺血、血糖過(guò)低和癲癇病在內(nèi)的毒害神經(jīng)性紊亂引起的刺激性氨基酸有涉。半胱氨酸蛋白酶p94是鈣激活中性蛋白酶家族中一個(gè)肌肉-特異成員，已被認(rèn)為是一種對(duì)肢帶肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)負(fù)責(zé)的基因產(chǎn)物。
組織蛋白酶是屬于半胱氨酸蛋白酶超級(jí)家族中木瓜酶類的一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶。它在組織中廣泛地分布而表達(dá)各異。在部分小環(huán)境中，這些酶素在具體蛋白質(zhì)和組織的蛋白質(zhì)水解和更新過(guò)程中起著一份作用。組織蛋白酶也通過(guò)酶原活化來(lái)啟動(dòng)分解蛋白串聯(lián)，參與受制于抗原性多肽的功能性MHC II級(jí)分子表達(dá)，并在抗原表達(dá)細(xì)胞中處理抗原。
此家族中不同成員表達(dá)各異，某些形式的組織蛋白酶與免疫系統(tǒng)中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它細(xì)胞聯(lián)系密切。這一家族中的一些能釋放到細(xì)胞外面的成員通過(guò)膠原質(zhì)，昆布氨酸，彈性蛋白和其它結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)的降解在組織重塑中起作用，并和與免疫性反應(yīng)密切相關(guān)的炎癥有涉。
組織蛋白酶的異常調(diào)節(jié)和反應(yīng)在不同的發(fā)炎性疾病狀態(tài)下非常明顯。在與發(fā)炎的關(guān)節(jié)骨液相隔離的細(xì)胞中，scromelysin，激素，TIMP-1，組織蛋白酶，膠原蛋白酶和其它分子的mRNA最先表達(dá)出來(lái)。例如組織蛋白酶L和D的表達(dá)，在患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的病人的關(guān)節(jié)骨液組織中會(huì)提高。組織蛋白酶L的表達(dá)還可以促成加劇風(fēng)濕性滑膜破壞的單核細(xì)胞的注入。
組織蛋白酶還與其它幾種免疫性反應(yīng)有涉。在人類腎小球疾病的老鼠樣本中，投用半胱氨酸蛋白酶的一種特有的，不可逆性的抑制劑可顯著降低蛋白尿癥。與血栓性血小板減少紫癜有關(guān)的血小板聚合半胱氨酸蛋白酶顯示了溶酶體組織蛋白酶的特點(diǎn)。而且，組織蛋白酶的增加的表達(dá)與不同調(diào)節(jié)和多種癌癥的新陳代謝潛力相關(guān)，因而在治療和預(yù)兆方面具有意義。
目前，有許多種溶酶體半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶，其特點(diǎn)在于酶素活性的標(biāo)準(zhǔn)蛋白離析及隨后的物理特性以及所使用的分子生物技術(shù)。當(dāng)前組織蛋白酶的已知形式包括組織蛋白酶B，C，F(xiàn)，H，J，K，L，M，O，Q，R，S，T，U，V，W和Z。在將來(lái)還可能鑒定出其它形式的組織蛋白酶。
在組織蛋白酶的所有形式中，組織蛋白酶B的數(shù)量最為豐富，分布最為廣泛。它的內(nèi)場(chǎng)酶活性較弱，但其羧肽酶活性極強(qiáng)。其主要作用是降解不需要的和循環(huán)的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至內(nèi)涵體和溶酶體內(nèi)的酸性成分中。組織蛋白酶B的作用似乎由其促進(jìn)劑的輔助性來(lái)反應(yīng)。已發(fā)現(xiàn)其在固狀瘤中高度表達(dá)從而與瘤的侵入和轉(zhuǎn)移有涉。
盡管表達(dá)的僅是N-端二肽酶活性，組織蛋白酶C已被發(fā)現(xiàn)是一種典型的木瓜酶類酶。
組織蛋白酶O也是一種典型的木瓜酶類酶。其首先從乳房癌cDNA庫(kù)相分離但卻被發(fā)現(xiàn)在其它組織分布中也很廣泛。
組織蛋白酶F與組織蛋白酶W具有58％的相似性，而這一相似性與組織蛋白酶L，K，S，H和O為42-43％，與組織蛋白酶B為38％。
組織蛋白酶F在心臟、骨骼肌、大腦、睪丸及卵巢處大量表達(dá)，在前列腺、胎盤、肝臟和結(jié)腸處表達(dá)適度，在白細(xì)胞末梢和胸腺處未見(jiàn)其表達(dá)。
組織蛋白酶K最初在兔子的破骨細(xì)胞中作為cDNA而被發(fā)現(xiàn)，被稱為OC-2。組織蛋白酶K為一典型的半胱氨酸蛋白酶，具有木瓜酶家族顯著的信息肽，前體肽及催化反應(yīng)區(qū)特點(diǎn)。組織蛋白酶K的表達(dá)既有限又可調(diào)節(jié)。其在卵巢和破骨細(xì)胞中大量表達(dá)，亦在人類肺巨噬細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)少量的這種酶。組織蛋白酶K似乎在炎癥部位不受調(diào)節(jié)。
組織蛋白酶K是目前所知的最有效的哺乳動(dòng)物彈性蛋白酶。其它彈性蛋白酶，例如與組織蛋白酶K具有一定程度氨基酸序列相似性的組織蛋白酶S和L，要比組織蛋白酶K較弱。組織蛋白酶K雖然比組織蛋白酶S或L更有效，但其中性pH值并不穩(wěn)定，組織蛋白酶K的pH值不穩(wěn)定性與其作為溶酶體酶和作為由破骨細(xì)胞隱匿于酸環(huán)境下的酶體的基本功能是相一致的。組織蛋白酶K在細(xì)胞外基體重塑中可能起一定作用，從而可作為治療目標(biāo)治療象骨質(zhì)疏松癥那樣的骨紊亂癥。
組織蛋白酶S最初被確定為在淋巴節(jié)中活性的一種獨(dú)特的酶。人們發(fā)現(xiàn)其顯著表達(dá)隨后從脾中得到凈化。如上所述，組織蛋白酶S是一種具有大量酶素活性及中性pH值穩(wěn)定性的彈性蛋白酶。此種酶顯示了組織表達(dá)的有限性和可調(diào)性，可由如γ干擾素和白介素1β等激素的刺激來(lái)產(chǎn)生。在老鼠身上，組織蛋白酶S在甲狀腺組織中表達(dá)，并可由刺激甲狀腺性荷爾蒙產(chǎn)生。組織蛋白酶S亦在脾和抗原顯示細(xì)胞中大量表達(dá)，這種細(xì)胞包括B淋巴球、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞。
人們發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶S在II級(jí)抗原顯示中起關(guān)鍵性作用。這與其在脾和淋巴節(jié)中大量表達(dá)是一致的。其也可以由激素產(chǎn)生，而激素已知與MHCII級(jí)抗原表達(dá)有涉。組織蛋白酶S與MHCII級(jí)抗原表達(dá)通道中的兩個(gè)步驟有涉。1)降解與MHCII結(jié)合的不變性陪伴分子(Ii)。2)產(chǎn)生與肽分子來(lái)取代與MHCII結(jié)合的Ii終產(chǎn)物。
研究表明組織蛋白酶S對(duì)一相對(duì)較遲的Ii降解起作用，并被用來(lái)對(duì)隨后多肽細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的進(jìn)行有效蛋白質(zhì)水解。組織蛋白酶S的抑制或不足會(huì)導(dǎo)致MHCII級(jí)過(guò)程進(jìn)而造成抗原表達(dá)的削弱。人們已設(shè)想，白組織蛋白酶S在抗原表達(dá)中起重要作用以來(lái)，可把其作為發(fā)展治療某些疾病的療法目標(biāo)，這些疾病與對(duì)外生性抗原免疫性反應(yīng)有關(guān)，例如哮喘，移植注射，超敏性肺炎和可能的自體免疫性疾病。
組織蛋白酶L為彈性蛋白酶的一種，和組織蛋白酶B，F(xiàn)，H和O相比，與組織蛋白酶S和K具有更高的氨基酸序列同族關(guān)系。因其與組織蛋白酶K具有序列同族關(guān)系，組織蛋白酶L在骨形成和再吸收特別是在膠原質(zhì)骨蛋白的分解中起了作用。
不同的組織蛋白酶蛋白酶在其基因結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上不同。組織蛋白酶L基因促進(jìn)劑沒(méi)有TATA box但包括幾個(gè)SP-1區(qū)，2個(gè)AP-2轉(zhuǎn)系調(diào)整元素結(jié)合區(qū)和一個(gè)cAMP反應(yīng)元素區(qū)。組織蛋白酶L的表達(dá)可由惡性變化，生長(zhǎng)因素，瘤促進(jìn)劑和循環(huán)性AMP來(lái)引起。最近，組蛋白L被發(fā)現(xiàn)參與了胸腺上皮細(xì)胞Ii的降解過(guò)程，從而影響了CD4+細(xì)胞的選擇。
2、調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的抑制劑現(xiàn)已有許多組織蛋白酶的抑制劑被發(fā)現(xiàn)，尤其是組織蛋白酶L。這些制劑可通過(guò)降低組織蛋白酶表達(dá)的體內(nèi)活性來(lái)對(duì)準(zhǔn)調(diào)節(jié)脂肪。此制劑可在cDNA或調(diào)節(jié)組織蛋白酶的調(diào)整區(qū)基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)組織蛋白酶的活性。例如，可利用象反義抑制劑和核糖酶一類的以DNA為基礎(chǔ)的制劑來(lái)對(duì)準(zhǔn)組織蛋白酶基因的基因內(nèi)顯子和外顯子。
或者，在包括處理和/或調(diào)節(jié)組織蛋白酶的三維蛋白結(jié)構(gòu)的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，這些制劑可調(diào)節(jié)組織蛋白酶的活性。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的制劑，如人體抗原，非人體單克隆抗體和教化性抗體，可被用來(lái)對(duì)準(zhǔn)調(diào)節(jié)組織蛋白酶脂肪的抗原決定基?？s氨酸可充任受制于某一組織蛋白酶活躍區(qū)的高親和抑制劑，因而抑制了組織蛋白酶的體內(nèi)活性。小分子亦可被用來(lái)對(duì)準(zhǔn)組織蛋白酶，尤其是對(duì)組織蛋白酶L具有高度選擇性的組織蛋白酶。
除了對(duì)準(zhǔn)調(diào)節(jié)組織蛋白酶活性的作用外，這些可積極抑制調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶制劑還可通過(guò)與組織蛋白酶中性目標(biāo)分子競(jìng)爭(zhēng)來(lái)與酶結(jié)合。
a)、以核酸為基礎(chǔ)的制劑如反義分子和核糖酶這樣的以核酸為基礎(chǔ)的制劑可被用來(lái)對(duì)準(zhǔn)組織蛋白酶基因的基因內(nèi)顯子和外顯子以抑制基因表達(dá)，由此來(lái)抑制目標(biāo)組織蛋白酶的活性。進(jìn)一步地說(shuō)，三重螺旋分子也可被用來(lái)抑制組織蛋白酶基因活性。這種分子可被用來(lái)降低或抑制野生型組織蛋白酶基因，或突變異種組織蛋白酶基因活性。有關(guān)此種分子的生產(chǎn)及應(yīng)用已為業(yè)內(nèi)所熟知。下面就簡(jiǎn)潔的介紹一下反義RNA和DNA分子通過(guò)與靶mRNA雜交直接阻遏mRNA的翻譯，并阻止蛋白質(zhì)翻譯。反義途徑包括與靶基因mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸的設(shè)計(jì)。寡核苷酸將與互補(bǔ)靶基因mRNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄并阻止翻譯。完全互補(bǔ)雖然是優(yōu)選的，但是不需要。
如這里所提及的，一個(gè)序列“互補(bǔ)”至一個(gè)RNA的一部分意味著一個(gè)序列有足夠的互補(bǔ)與RNA雜交，形成一個(gè)穩(wěn)定的雙鏈，就雙鏈反義核酸而言，雙鏈DNA的一個(gè)單鏈可以這樣被測(cè)定，或者三鏈形成可以被測(cè)定。雜交的能力將取決于互補(bǔ)的程度和反義核酸的長(zhǎng)度。一般來(lái)講，核酸雜交越長(zhǎng)，它所包含的堿基與RNA的錯(cuò)配越多，并形成一個(gè)穩(wěn)定的雙鏈(或者三鏈，可以是這樣)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)定這種雜交復(fù)合物的解鏈點(diǎn)來(lái)確定錯(cuò)配的可容忍程度。
寡核苷酸與信息的5’末端互補(bǔ)，例如互補(bǔ)到5末端非翻譯序列并包括AUG起始密碼子，應(yīng)該在阻止翻譯中最有效，然而，與mRNA的3’端未翻譯序列互補(bǔ)的序列也已顯示有效地阻止mRNA的翻譯[Wagner(1994)《自然》372333-335]。
例如，與人或鼠的組織蛋白酶L基因的3’端或5’端未翻譯區(qū)、非編碼區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸，可被用于反義方法來(lái)阻止內(nèi)源性組織蛋白酶L mRNA的翻譯。表1列出了人[SEQ ID NO5]和鼠[SEQ ID NO6]組織蛋白酶L的5’端未翻譯區(qū)的DNA序列。
與mRNA 5-端未轉(zhuǎn)換區(qū)互補(bǔ)的低核苷酸應(yīng)包括AUG啟動(dòng)密碼子。與mRNA編碼區(qū)互補(bǔ)的反義低核苷酸為效率較低的轉(zhuǎn)換抑制劑，但可以用于本發(fā)明。無(wú)論是否設(shè)計(jì)成與目標(biāo)基因mRNA的5’-，3’-端或編碼區(qū)雜交，反義核酸的長(zhǎng)度優(yōu)選至為6個(gè)核苷酸，長(zhǎng)為6-50個(gè)核苷酸的低核苷酸更佳。具體地說(shuō)，低核苷酸至少為10個(gè)核苷酸，至少17個(gè)為佳。
或者，將反義分子設(shè)計(jì)成以翻譯區(qū)為靶基因，即組織蛋白酶基因的cDNA。表1列出了人類組織蛋白酶L的DNA序列[SEQ ID NO1]及氨基酸序列[SEQ ID NO2]和老鼠組織蛋白酶L的DNA序列[SEQ IDNO3]及氨基酸序列[SEQ ID NO4]。
例如，可使用對(duì)準(zhǔn)成熟老鼠組織蛋白酶L基因的整個(gè)編碼序列或一部分的反義RNA分子來(lái)抑制組織蛋白酶L的表達(dá)，從而降低其酶活性。
此外，全部或部分組織蛋白酶LcDNA(表1)還可被反向進(jìn)一步亞克隆到表達(dá)載體pcDNA3中，并將這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)以產(chǎn)生反義多聚RNA，來(lái)阻止象組織蛋白酶L在內(nèi)的組織蛋白酶內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄，從而抑制組織蛋白酶的表達(dá)。
可在體外進(jìn)行研究以測(cè)定反義低核苷酸抑制基因表達(dá)的能力。這些研究最好使用能夠區(qū)別低核苷酸反義基因抑制和其非特異性生物效應(yīng)的對(duì)照組。最好將目標(biāo)RNA或蛋白質(zhì)水平與內(nèi)部對(duì)照RNA或蛋白質(zhì)的水平相比較。而且要將使用反義低核苷酸獲得的結(jié)果與通過(guò)使用對(duì)照低核苷酸獲得的結(jié)果相比較。對(duì)照低核苷酸最好與測(cè)試低核苷酸在長(zhǎng)度上大體相等，而低核苷酸的核苷酸序列與反義序列的差異不應(yīng)當(dāng)超過(guò)為防止與靶基因特異性雜交所必須的程度。
低核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或修飾物，可以是單鏈或雙鏈，可以對(duì)低核苷酸的堿基，糖基或磷酸鹽主鏈進(jìn)行修飾以改進(jìn)分子或雜交的穩(wěn)定性。低核苷酸可以包括其它附加基團(tuán)，例如多肽(如，為在體內(nèi)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合)，或促進(jìn)通過(guò)細(xì)胞膜[參見(jiàn)Letsinger(1989)Proc.Natl.Acad.sci.U.S.A.866553-6556]或腦血屏障[參見(jiàn)PCT公開(kāi)號(hào)No.WO89/10134]轉(zhuǎn)運(yùn)的制劑，雜交啟動(dòng)阻斷劑[Krol(1988)Bio Techniques6958-976]或嵌入劑[參見(jiàn)Zon(1988)Pharm.Res.5539-549]。低核苷酸還可以結(jié)合到另一種分子上，例如多肽，雜交啟動(dòng)交叉結(jié)合制劑，傳送制劑，雜交啟動(dòng)阻斷劑等。
反義低核苷酸可以包括至少一種修飾的堿基，而且這種堿基是從包括但不局限于下列各項(xiàng)中選擇出來(lái)的5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，6-氧嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿甘，5-羧基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖甙次黃苷，次黃苷，N6-isotentenyladenine，1-甲基鳥(niǎo)嘌呤，1-甲基次黃苷，2，2-二甲基胞嘧啶，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥(niǎo)嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5｀-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基胞嘧啶，2-methylthio-N6-isotentenyladenine，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，-3(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3)w，和2，6-二氨基嘌呤。
反義低核苷酸亦可以包括至少一種修飾的糖基，而這種糖基是從包括但不局限于阿糖，2-氟阿糖，木酮糖，和己糖木糖和己糖中選擇出來(lái)的。
在另一種情況下，反義低核苷酸還可以包括至少一種修飾的磷酸鹽主鏈部，而這種主鏈部是從包括硫代磷酸鹽，二硫代磷酸鹽，硫代氨基磷酸鹽，酰胺磷酸鹽，二酰胺磷酸鹽，甲基膦酸鹽，烷基磷三酯，和甲酰乙縮醛及其類似物在內(nèi)的各項(xiàng)中選擇出來(lái)的。
在另一種情況下，反義低核苷酸是一種α-端基異構(gòu)低核苷酸。α-端基異構(gòu)低核苷酸形成了與RNA互補(bǔ)的特異性雙鏈雜交物，其中，與通常β-單位相比，各鏈互相平行，此低核苷酸為2’-O-甲基核糖核苷酸或?yàn)橐环N嵌合RNA-DNA類似物。
所發(fā)明的低核苷酸可由為業(yè)內(nèi)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如自動(dòng)DNA合成器來(lái)合成；再如，硫代磷酸鹽低核苷酸可通過(guò)Stein方法進(jìn)行合成[1988，Nuci.Acids res.163209]，甲基膦酸鹽低核苷酸可通過(guò)可控制性細(xì)孔玻璃聚合體支撐物來(lái)準(zhǔn)備。
根據(jù)本發(fā)明，反義分子被運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，在體內(nèi)表達(dá)調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因。把反義DNA或RNA運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的許多方法已被找到。例如可把反義分子直接注入到組織部位，或體內(nèi)給藥那些設(shè)計(jì)成直接作用于靶細(xì)胞的修飾反義分子(如，與肽相聯(lián)的反義分子或者與受體特異性結(jié)合的抗體或在白細(xì)胞表面表達(dá)的抗原)。
然而，通常很難獲得足以抑制內(nèi)源性mRNA翻譯的反義的細(xì)胞內(nèi)含量。所以一個(gè)優(yōu)選方法是利用一種重組DNA結(jié)構(gòu)，在這種結(jié)構(gòu)中，反義低核苷酸被置于一種polIII或polII啟動(dòng)子的控制之下。在病人身上使用這種結(jié)構(gòu)來(lái)轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致足量單鏈RNA的轉(zhuǎn)錄，而這種RNA會(huì)與內(nèi)源性目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)性堿基對(duì)，從而阻止目標(biāo)基因的mRNA的翻譯。例如可以將一載體導(dǎo)入體內(nèi)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，控制反義RNA的轉(zhuǎn)錄。只要這種載體能被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的反義RNA，它就可成為附帶體或在染色體水平上整合。可用現(xiàn)有技術(shù)中的重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建這種載體。這種載體可以是質(zhì)粒，病毒或現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中已知的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)用來(lái)復(fù)制或表達(dá)的其他載體。病毒載體的例子包括但不限于基于重組病毒的病毒載體，如修飾或重組上位反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺性病毒，牛痘病毒及皰疹單式病毒。
可用現(xiàn)有技術(shù)中已知的在哺乳動(dòng)物，最好是人類細(xì)胞內(nèi)起作用的任何啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)編碼反義RNA的序列。這種啟動(dòng)子包括但不僅限SV40前期啟動(dòng)子區(qū)(BERNOIST AND CHAMBON(1981)NATURE290304-310)，包含在魯斯氏肉瘤病毒的3’-長(zhǎng)端重復(fù)序列(YAMANOTO ET AL.1980，CELL 22787-797)，皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(WAGNER ET AL.1981 PROC.NATL ACAD SCI.USA 781441-1445)，金屬硫因基因的調(diào)節(jié)序列(BRINSTER ET AL.1982NATURE 29639-42)等。任何形式的質(zhì)粒，YAC或病毒載體都可用來(lái)制備重組DNA結(jié)構(gòu)，以便將其直接導(dǎo)入到組織位點(diǎn)?；蛘撸墒褂糜羞x擇地傳染所需組織的病載體。在這種情況下，可通過(guò)另一途徑來(lái)完成給藥。
亦可使用用來(lái)促進(jìn)斷裂目標(biāo)基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核糖酶分子，以防止目標(biāo)基因mRNA的翻譯，從而組織目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)。
核糖酶是一種能夠促進(jìn)RNA特異性斷裂的酶RNA分子。其作用的機(jī)理包括核糖酶分子與互補(bǔ)目標(biāo)RNA的特異性序列雜交，隨后為一內(nèi)切核苷酸的分裂過(guò)程。核糖酶分子的組成應(yīng)包括與目標(biāo)基因mRNA互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)序列，還應(yīng)包括負(fù)責(zé)斷裂mRNA的催化序列。
盡管可使用在位點(diǎn)特異性識(shí)別序列斷裂mRNA的核糖酶來(lái)破壞目標(biāo)基因mRNA，最好還是使用錘頭狀核糖酶。錘頭狀核糖酶在某些部位分裂mRNA，這些部位由與目標(biāo)mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的側(cè)面區(qū)域決定。唯一的要求是目標(biāo)mRNA具有下列雙堿基序列5’-UG-3’。錘頭狀核糖酶的制取已為業(yè)內(nèi)所熟知，并在Haseloffand Gerlach，1988(Nature)334585-591中有更為詳盡的說(shuō)明。
最好對(duì)核糖酸進(jìn)行設(shè)計(jì)以便使分裂識(shí)別部位位于目標(biāo)基因mRNA的5’末端附近；即提高效率并盡量降低非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞內(nèi)積聚。
目前發(fā)明的核糖酶亦包括RNA核糖核酸內(nèi)切酶。如在嗜熱四膜蟲(chóng)(Tetrahymena thermophila)中自然發(fā)生的(稱作IVS或L-19 IVSRNA)，其已由Thomas Cech及其合作者進(jìn)行過(guò)詳盡的描述。這種類型的核糖酶具有8個(gè)堿基對(duì)活躍部位，其與某一目標(biāo)RNA序列進(jìn)行雜交后便引起了目標(biāo)RNA的分裂。此發(fā)明包括那些對(duì)準(zhǔn)至少8個(gè)在組織蛋白酶基因中存在的堿基對(duì)序列的核糖酶。
與反義方法相同，核糖酶由修飾的低聚核苷酸組成，并被運(yùn)送到在體內(nèi)表達(dá)組織蛋白酶基因的細(xì)胞內(nèi)。一個(gè)更可取的運(yùn)送方法包括使用一DNA結(jié)構(gòu)，在一增強(qiáng)連續(xù)性pol lll或pol ll啟動(dòng)子的控制下對(duì)核糖酶進(jìn)行編碼，以便轉(zhuǎn)染細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生足夠數(shù)量的核糖酶來(lái)破壞內(nèi)源性目標(biāo)基因信息并抑制翻譯。由于核糖酶起催化作用，與反義分子不同，較低的細(xì)胞內(nèi)含量即產(chǎn)生效果。
內(nèi)源性組織蛋白酶基因表達(dá)亦可通過(guò)使用目標(biāo)同源重組技術(shù)滅活或破壞目標(biāo)組織蛋白酶基因或其啟動(dòng)子來(lái)降低。例如，可使用帶有或不帶有可選擇性標(biāo)識(shí)和/或負(fù)性可選擇性標(biāo)識(shí)的一突變性、非功能性、與內(nèi)源性目標(biāo)基因(靶基因的編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū))同源的DNA位于兩側(cè)的目標(biāo)基因(或一完全不相關(guān)的DNA序列)來(lái)轉(zhuǎn)染在體內(nèi)表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞。
通過(guò)目標(biāo)同源重組技術(shù)插入DNA結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)基因的滅活。這些方法特別適合農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其中可使用修正的干細(xì)胞以產(chǎn)生具有非活躍目標(biāo)基因的動(dòng)物后代。例如，可破壞牲畜的組織蛋白酶L基因以產(chǎn)生具有較低體內(nèi)脂肪含量的動(dòng)物。然而只要重組DNA結(jié)構(gòu)被直接投用或使用適當(dāng)?shù)牟《据d體在體內(nèi)對(duì)準(zhǔn)所需部位，此方法在人類身上亦可使用。
或者，可通過(guò)對(duì)準(zhǔn)與組織蛋白酶基因調(diào)整區(qū)域(即，靶基因啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的脫氧核苷酸序列來(lái)降低內(nèi)源性組織蛋白酶基因表達(dá)，以形成避免體內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞中目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)。
用以抑制轉(zhuǎn)錄的在三級(jí)螺旋形成中使用的核酸分子應(yīng)該是單鏈的并由脫氧核苷酸組成。這些寡核苷酸的堿基組成必須通過(guò)Hoogsteen堿基配對(duì)規(guī)則來(lái)設(shè)計(jì)以促進(jìn)三級(jí)螺旋的形成，這通常需要嘌呤或嘧啶的大量伸展以在某一復(fù)式結(jié)構(gòu)的單鏈上展現(xiàn)。核苷序列可以以嘧啶為基礎(chǔ)，這會(huì)導(dǎo)致TAT和CGC三聯(lián)體橫穿三股螺旋的三個(gè)相關(guān)鏈。富含嘧啶的分子提供了與復(fù)式結(jié)構(gòu)的單鏈富嘌呤區(qū)域互補(bǔ)的堿基，并與此單鏈方向平行。此外，可選擇富含嘌呤的核酸分子，例如，包含有G殘基的伸展。這些分子會(huì)形成帶有豐富GC對(duì)DNA復(fù)式結(jié)構(gòu)的三股螺旋，其中嘌呤殘基的大部分位于目標(biāo)復(fù)式結(jié)構(gòu)的單鏈上，導(dǎo)致GGC三聯(lián)體橫穿三股螺旋的三個(gè)鏈。
或者，可通過(guò)創(chuàng)造一個(gè)稱為“之”字核酸分子來(lái)增加可對(duì)準(zhǔn)三股螺旋形成的潛在序列?！爸弊址肿右?’-3’，3’-5’交替的方式合成，這樣它們與復(fù)式結(jié)構(gòu)的第一個(gè)鏈形成基對(duì)，然后再和另一個(gè)形成基對(duì)，排除了嘌呤或嘧啶的大量伸展以在某一復(fù)式結(jié)構(gòu)的單鏈上展現(xiàn)的必要性。
在此所述的利用反義、核糖酶和/或三股螺旋分子來(lái)抑制突變異種基因表達(dá)的情況下，有效的降低或抑制由正常目標(biāo)基因等位基因產(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄(三股螺旋)和/或轉(zhuǎn)換(反義、核糖酶)的技術(shù)是可能的。當(dāng)正常目標(biāo)基因產(chǎn)物的含量比正常顯型所必需的要低時(shí)，這種可能性就會(huì)出現(xiàn)。在這種情況下，為保證目標(biāo)基因活性的正常水平得以維持，可通過(guò)基因治療方法將編碼并表達(dá)顯示一般靶基因活性的靶基因多肽的核酸分子引入到細(xì)胞內(nèi)，而這些細(xì)胞不含有對(duì)使用反義、核糖酶或三股螺旋療法敏感的序列?；蛘?，在目標(biāo)基因編碼一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)的情況下，為了保持目標(biāo)基因活性必不可少的水平，最好同時(shí)一般靶基因蛋白質(zhì)。
如上所討論，反義RNA和DNA、核糖酶以及本發(fā)明的三股螺旋分子可由業(yè)內(nèi)所熟知的任何一種合成RNA和DNA分子的方法來(lái)制備。這些方法包括業(yè)內(nèi)所熟知的用化學(xué)手段合成寡聚脫氧核苷酸和寡核苷酸的技術(shù)，例如固相氨基磷酸酯化學(xué)合成?；蛘?，通過(guò)反義RNA分子RNA分子DNA編碼序列體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生RNA分子。這種DNA序列可被整合入多種載體中，這些載體結(jié)合有合適的RNA聚合酶啟動(dòng)子，如T7或SP6聚合酶啟動(dòng)子?；蛘撸鶕?jù)所使用的啟動(dòng)子，將合成反義RNA的反義cDNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定地引入細(xì)胞系中。
b)抑制組織蛋白酶基因產(chǎn)物的抗體以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的治療劑，如人類抗體，非人類單克隆抗體及人性化抗體，可被用來(lái)特異性地作用于調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶不同抗原決定基。對(duì)組織蛋白酶基因蛋白質(zhì)有特異性并干預(yù)其活性的抗體可被用來(lái)抑制組織蛋白酶基因功能。無(wú)論哪里需要，亦可用對(duì)干預(yù)這種突變異種組織蛋白酶產(chǎn)物活性的突變異種組織蛋白酶蛋白質(zhì)有特效的抗體來(lái)抑制組織蛋白酶基因功能。這種抗體可使用抗組織蛋白酶或抗與組織蛋白酶的部分相一致的多肽的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)產(chǎn)生。這種抗體包括但不限于多克隆的、單克隆的，F(xiàn)ab斷片、單鏈抗體，嵌合體抗體等等。
已發(fā)展了許多方法來(lái)產(chǎn)生能夠特別辨別一個(gè)或更多表達(dá)不同或通路基因抗原決定基的抗體。這種方法包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人性化或嵌合體抗體、單鏈抗體、Fab斷片、F(ab’)2斷片、Fab表達(dá)庫(kù)產(chǎn)生的斷片、抗個(gè)體遺傳型抗體和上述任何一種抗原決定基-結(jié)合斷片。例如，這種抗體可在生物樣本中的指紋、目標(biāo)或通路基因的檢測(cè)中使用，或是作為抑制異常的目標(biāo)基因活性的方法來(lái)使用。因此，這種抗體可被用來(lái)作為體重紊亂治療方法的一部分，和/或被用來(lái)作為診斷技術(shù)的一部分，利用它可檢測(cè)病人的指紋、目標(biāo)或通路基因蛋白質(zhì)的異常水平或這種蛋白質(zhì)異常形式的存在。
為產(chǎn)生某一組織蛋白酶基因的抗體，可通過(guò)注射一組織蛋白酶蛋白質(zhì)或其一部分來(lái)使不同的寄主動(dòng)物獲得免疫。這種寄主動(dòng)物包括但不限于兔、老鼠及田鼠，這里僅舉幾例?？墒褂貌煌拿庖咦魟﹣?lái)提高免疫性反應(yīng)，而這取決于宿主種類，包括但不限于Freund’s礦物膠凝體(完全和不完全)，如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、pluronic多羥基化合物、聚苯胺、縮氨酸、油乳劑、鍵孔帽貝血藍(lán)質(zhì)、二硝基酚及對(duì)人類有潛在用處的輔劑，如BCG和短小棒狀桿菌。
多克隆抗體為衍生自以抗原免疫動(dòng)物的血清的抗體分子的不同種類群體。例如，組織蛋白酶基因產(chǎn)物或其抗原功能衍生物。為產(chǎn)生多細(xì)胞株抗體，上文所述的寄主動(dòng)物可由注射組織蛋白酶基因產(chǎn)物獲得免疫，亦可用上述輔劑加以補(bǔ)充。
單克隆抗體為與某一抗原同類的抗體群體，可由任何通過(guò)人工繁殖的持續(xù)細(xì)胞系為抗體分子的產(chǎn)生創(chuàng)造條件的技術(shù)獲得。這些包括但不限于Kohler和Milstein的雜種細(xì)胞技術(shù)。這些抗體可為任何免疫血球素中的一種，包括1gG、1gM、1gE、1gA和其它任何亞綱?？稍谠嚬芑蝮w內(nèi)培植產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜種細(xì)胞。體內(nèi)mAb高滴度的生產(chǎn)使其成為目前最佳的生產(chǎn)方法。
根據(jù)本發(fā)明，在某一更佳的情況下，抗組織蛋白酶L，前組織蛋白酶L或另一調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的單克隆抗體被用來(lái)作治療肥胖和相關(guān)疾病的基因治療劑。這種抗體的實(shí)例包括但不限于通過(guò)給老鼠注射凈化的人類前組織蛋白酶L使之獲得免疫，因而所產(chǎn)生的老鼠抗組織蛋白酶L單克隆抗體。這種抗體可從德國(guó)Labsoft Diagnostics AG處獲得，包括克隆CPLH2D4，CPLH33/1，CPLH33/2和CLP1/36。
克隆#CPLH2D4可辨別抗原決定基人類前組織蛋白酶L的前體多肽分子T67SEEFRQVMNGFQ79[SEQ ID7]，但不能辨別成熟單或雙鏈組織蛋白酶L。
克隆#CPLH33/1(異型鼠IgG1，kappa)可辨別抗原決定基F241YKE244[SEQ ID8]辨別成熟單或雙鏈組織蛋白酶L。
克隆#CLP1/36(異型鼠IgG1，kappa)可用人類前組織蛋白酶L的多肽Y200SVANDTGFVDIPKQEKA217[SEQ ID9]使老鼠獲得免疫后產(chǎn)生。其能辨別抗原決定基I211PKQ214[SEQ ID10]并亦能辨別成熟單或雙鏈組織蛋白酶L。
克隆#CPLH3G10(異型鼠IgG1，kappa)與抗原決定基結(jié)合老鼠前組織蛋白酶L的H304CGLATAASY313[SEQ ID11]，能辨別成熟單鏈老鼠組織蛋白酶L和成熟雙鏈老鼠組織蛋白酶L(輕鏈)以及老鼠前組織蛋白酶L。此抗體亦可辨認(rèn)成熟人類單鏈組織蛋白酶L，成熟人類雙鏈組織蛋白酶L(輕鏈)，人類前組織蛋白酶L以及老鼠組織蛋白酶L(輕鏈)。
此外，也可利用可產(chǎn)生嵌合體抗體或人性化抗體的技術(shù)來(lái)修飾老鼠單克隆抗體以降低非人類抗體的免疫原性。這種抗體由適當(dāng)抗原特異性的老鼠抗體分子基因與適當(dāng)生物活性的人類抗體分子基因的結(jié)合產(chǎn)生，也可被使用。嵌合體抗體為一不同部分衍生自不同動(dòng)物種類的分子，例如那些具有衍生自老鼠mAb的不同區(qū)域及人類免疫血球素恒定區(qū)域的抗體。
或者，可對(duì)描述單鏈抗體產(chǎn)生的技術(shù)進(jìn)行修改以產(chǎn)生表達(dá)不同或通路基因單鏈抗體。單鏈抗體通過(guò)一氨基酸橋連接Fv區(qū)域的重鏈輕鏈斷片來(lái)形成，產(chǎn)生一單鏈多肽。
能辨別具體抗原決定基的抗體斷片可由已知技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。例如，這種斷片包括但不限于可由胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2斷片以及可由降低F(ab’)2斷片的二硫化物橋所產(chǎn)生的Fab斷片?；蛘?，可構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)，來(lái)迅速而容易地辨認(rèn)具有所需特異性的單克隆Fab斷片。
由于目標(biāo)基因蛋白質(zhì)——組織蛋白酶是一種細(xì)胞內(nèi)酶，可使用整個(gè)抗體而內(nèi)在抗體最佳。然而，脂質(zhì)體可被用來(lái)把抗體或結(jié)合到目標(biāo)基因產(chǎn)品抗原決定基的Fab斷片運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。只要有使用抗體斷片的地方，最好使用結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)的最小抑制性斷片。例如，可使用具有與結(jié)合到組織蛋白酶上的抗體可變區(qū)相一致的氨基酸序列的多肽。這種肽可用化學(xué)方法合成，或通過(guò)重組DNA技術(shù)用業(yè)內(nèi)眾所周知的方法來(lái)制成。
或也可使用結(jié)合到組織蛋白酶抗原決定基的單鏈中和抗體。例如，可對(duì)這種單鏈抗體的給藥可以通過(guò)使用Marasco所表述的技術(shù)把編碼單鏈抗體的核苷序列在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
C)抑制組織蛋白酶基因表達(dá)或合成的制劑根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)使用調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因，優(yōu)選組織蛋白酶K，L和S，更優(yōu)選是組織蛋白酶K和L，最好是組織蛋白酶L，的表達(dá)調(diào)節(jié)劑來(lái)對(duì)脂肪形成加以調(diào)整。
目前有很多方法可以用來(lái)抑制調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)，從而抑制了脂肪形成，于是最終減輕由于肥胖病以及相關(guān)疾病如II型糖尿病和高血壓帶來(lái)的癥狀。
基因的活性可以被抑制。舉例來(lái)說(shuō)，即可通過(guò)降低從靶向組織蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的mRNA的活性，也可通過(guò)抑制蛋白酶基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化或后轉(zhuǎn)化過(guò)程等方法來(lái)加以抑制。
受肥胖病，糖尿病以及相關(guān)疾病困擾的患者可以利用基因療法來(lái)進(jìn)行治療?？刂频鞍踪|(zhì)產(chǎn)生的一份或多份基因或者基因片段可以被用來(lái)注入到細(xì)胞中，以干擾組織蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯機(jī)制。用在基因療法中的載體包括，但并不局限于腺病毒，腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，以及其他可以用來(lái)作為向細(xì)胞中引入DNA的粒子，如脂質(zhì)體。
這些技術(shù)可以被用來(lái)干擾調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，如人類組織蛋白酶L。人類的[SEQ ID NO5]和鼠類的組織蛋白酶L[SEQ IDNO6]的5’調(diào)整序列(如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列)已經(jīng)分別在Chauhan etal.(1993)J.Biol.Cherm 2681045(人類)和Troen et al.(1991)CellGrowth Differ.223-31(鼠類)中加以描述。
另外，可以給藥一種與某種特定的蛋白質(zhì)，如人類組織蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄劑因子，特異性結(jié)合抗體，可以直接或間接地激活組織蛋白酶L的功能。這些抗體包括但并不局限于多克隆或單克隆抗體，F(xiàn)ab片段，單鏈抗體，嵌合性的抗體和類似體等。這些抗體可利用在上述b部分中所描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制造。這些抗體可制備成抗蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)相應(yīng)部分出來(lái)。根據(jù)上文提到的技術(shù)，它們也可做為藥物使用，請(qǐng)參見(jiàn)文章后面的B部分。
此外，任何其他能改變組織蛋白酶基因表達(dá)水平或是蛋白酶基因產(chǎn)物表達(dá)水平的已鑒定出的化合物，都可在此運(yùn)用。用藥的技術(shù)可參見(jiàn)下文的第三部分。d)抑制調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶的活性的藥劑多肽或peptidomimetics由于其能夠非常緊密地附著在調(diào)整脂肪的組織蛋白酶的活性部位，從而可以作為限制組織蛋白酶活性的非常有效的工具。在表2，3，4中分別列出了限制組織蛋白酶S，K和L的例子。
另外，組織蛋白酶的前區(qū)可以用來(lái)限制其親本酶的活性。游離態(tài)的組織蛋白酶的前區(qū)是其成熟酶的強(qiáng)有力的非共價(jià)的活性抑制劑，參見(jiàn)Guay et al.(2000)Euro.J.Biocherm.6311-6318.有結(jié)論證明人類組織蛋白酶L的前肽的抑制作用是人類組織蛋白酶S的500倍，同時(shí)人類組織蛋白酶L的選擇性是人類組織蛋白酶S和人類組織蛋白酶B的至少10000倍。請(qǐng)參見(jiàn)Carmona et al.(1996)Biocherm.358149-8157.有研究表明，與人類組織蛋白酶K，L和B相比，肝吸蟲(chóng)組織蛋白酶L的前肽是更好選擇性的抑制劑。
對(duì)于組織蛋白酶K，L和B的晶體結(jié)構(gòu)的X射線分析顯示，前區(qū)會(huì)在酶之間的有活性的裂縫處產(chǎn)生重疊，使其相互干擾，從而對(duì)其原有或非原有的結(jié)合點(diǎn)進(jìn)行破壞，同時(shí)也影響了所謂前肽結(jié)合環(huán)的作用。關(guān)于這方面的論述可參見(jiàn)Sivaraman et al.(1999)Protein 32504-514.前區(qū)伸展通過(guò)活性位點(diǎn)的方向與天然底物的反向是相反的，因此，前肽的結(jié)構(gòu)不是正確的在活性位點(diǎn)殘基出被切割。
對(duì)于組織蛋白酶K，L和S來(lái)說(shuō)，其相應(yīng)的前肽可依照在Guay etal.supra中描述的方法，利用E.coil細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)獲得。其他的，如利用化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
另外，小分子也可以被用來(lái)抑制組織蛋白酶的活性。這種小分子抑制劑相對(duì)于其他形式的組織蛋白酶來(lái)說(shuō)對(duì)某些特定結(jié)構(gòu)的組織蛋白酶更具有選擇性，或者它只對(duì)于某一種結(jié)構(gòu)的組織蛋白酶具有抑制作用。我們希望這種小分子在各種組織蛋白酶中對(duì)于組織蛋白酶K，L和S的作用更強(qiáng)；在更為理想的情況下，我們希望小分子應(yīng)更傾向于對(duì)組織蛋白酶K，L發(fā)生作用；當(dāng)然，我們最希望看到在各種組織蛋白酶中，它對(duì)于組織蛋白酶L的作用更具有選擇性。
小分子對(duì)于組織蛋白酶L，K或S的抑制作用相對(duì)于其他各種非脂肪控制的組織蛋白酶來(lái)說(shuō)是更好的抑制劑。在某種情況下，小分子抑制劑對(duì)比其他各種非脂肪控制的組織蛋白酶，對(duì)組織蛋白酶L的作用更強(qiáng)；在另一種情況下，小分子抑制劑對(duì)于組織蛋白酶L的作用強(qiáng)于組織蛋白酶K或S；在某種特定情況下，對(duì)于某種或某類組織蛋白酶(如組織蛋白酶L)來(lái)說(shuō)，小分子對(duì)其的抑制作用比對(duì)于其他某種或某類組織蛋白酶的抑制作用要強(qiáng)的多，例如對(duì)組織蛋白酶L的抑制作用是對(duì)于組織蛋白酶K或S抑制作用的至少10倍，更為理想的情況是至少100倍，最理想的情況是至少1000倍。
表4列出了文中所示的利用小分子，多肽以及peptidomimetics抑制組織蛋白酶L進(jìn)行治療的一些范例。表2和表3分別列出了利用小分子抑制組織蛋白酶S或K的一些例子。關(guān)于各種不同結(jié)構(gòu)組織蛋白酶的抑制潛能(Ki，離解常數(shù))以及相關(guān)資料也在這些表格中相應(yīng)列出用于說(shuō)明這些生物材料的合成。3.藥物制劑和給藥方法上文所提到的用來(lái)抑制組織蛋白酶基因表達(dá)、合成和/或活性的化合物，核酸分子和病毒載體可以以治療有效劑量給患者給藥，用來(lái)治療或緩解肥胖病，糖尿病以及相關(guān)疾病。治療的有效劑量是指劑量達(dá)到一定程度，從而有效改善肥胖癥，糖尿病和相關(guān)疾病的癥狀，或是指一定劑量的核酸分子，能表達(dá)一定濃度的基因產(chǎn)物，從而改善了相應(yīng)疾病的癥狀。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的制藥過(guò)程，可以決定這些藥劑的毒性和療效，如，決定LD50和ED50的劑量。在毒性和療效之間的劑量比例是治療的指數(shù)，可以由LD50/ED50的比例來(lái)表達(dá)。有很大的治療指數(shù)的藥劑被優(yōu)先選取。當(dāng)使用的藥劑有毒副作用時(shí)，需要小心地設(shè)計(jì)出一套傳遞系統(tǒng)，使得這些化合物能靶向治療感染的組織，使未感染的細(xì)胞受到的潛在損害降低到最小范圍，從而降低副作用。
從細(xì)胞培養(yǎng)化驗(yàn)和動(dòng)物研究中所獲得的數(shù)據(jù)，可以用來(lái)設(shè)置一個(gè)給人用藥的劑量范圍。這些化合物的劑量范圍傾向與在一個(gè)包含ED50的，有一小點(diǎn)或沒(méi)有毒性的循環(huán)的濃度范圍內(nèi)。劑量是否在這個(gè)范圍內(nèi)取決于使用和給藥的途徑。在這項(xiàng)發(fā)明中所采用的方法中用了的各種藥劑，治療的有效劑量最初從細(xì)胞培養(yǎng)化驗(yàn)中估計(jì)而得。就如同在細(xì)胞培養(yǎng)化驗(yàn)中來(lái)決定那樣，一劑藥可能要用在動(dòng)物模型上來(lái)獲得包括IC50的循環(huán)血漿濃度范圍， 這些信息可以用來(lái)更精確的決定用在人身上的劑量。血漿中的水平可被測(cè)定，如，采用高性能的層析法。
根據(jù)這項(xiàng)發(fā)明所使用的治療劑，可以通過(guò)使用一種或多種生理學(xué)上接受的載體或賦形劑的傳統(tǒng)的制藥方法來(lái)制備。
因而，組織蛋白酶抑制劑以及他們的生理學(xué)上可接受的鹽類和可溶物可通過(guò)吸入，吹入(從嘴或是鼻子)，口服，注射和直腸的方式給藥。
對(duì)口服用藥，藥品可采用藥片或膠囊的形式，這些藥片或膠囊可通過(guò)傳統(tǒng)的制藥方法以及用一些制藥上接受的賦形劑，如黏合劑，填充劑，潤(rùn)滑劑，分解劑，或潤(rùn)濕劑來(lái)獲得。藥片可由廣為人知的工藝來(lái)做包衣。口服液的形式可以是溶液，糖漿或懸浮液，或是在使用前是一種由水或其他方便的媒介組成的干的產(chǎn)品?？诜阂部捎蓚鹘y(tǒng)的方法以及用一些制藥上接受的添加劑，如懸浮劑，乳化劑，非水的媒質(zhì)，防腐劑等來(lái)獲得?？诜褐锌赡苓€適當(dāng)?shù)陌司彌_的鹽類，調(diào)味品，色素和增甜劑。
為了口服，可適當(dāng)?shù)闹苽涑苫钚曰衔锏目蒯屩苿?br> 為了吸入使用，此藥物化合物根據(jù)本發(fā)明可以借助適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑，如二氯四氟代甲烷，三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氧化碳或其它氣體，采用壓力容器或噴霧器形式進(jìn)行輸送。如果是噴霧器的話，其劑量單位可由所提供的用來(lái)輸送一定數(shù)量的活門來(lái)決定。在吸入器或吹藥器中所使用的凝膠膠囊和藥筒，可由包含有如乳糖或淀粉的適當(dāng)粉劑基質(zhì)和化合物的粉劑混合物來(lái)配制。
組織蛋白酶抑制劑可通過(guò)注射，如丸藥注射或持續(xù)灌輸來(lái)配制，以供非腸道注射藥物的使用。注射用配制物與添加的防腐劑一起以單位劑量的形式，如用安瓿或多劑容器來(lái)體現(xiàn)。此化合物可采用在以油或水為媒介物中的懸浮體，乳劑，溶液的形式，可包括如懸浮，穩(wěn)定和/或分散制劑在內(nèi)的配制性制劑，或者，活性成分在使用前以粉劑形式，與一適當(dāng)?shù)拿浇槲锶缦^(guò)毒的脫熱原水來(lái)進(jìn)行配制。
組織蛋白酶抑制劑可在如栓劑的直腸化合物或如包括有可可醬或其它甘油酯的傳統(tǒng)栓劑基質(zhì)的保留灌腸劑中配制。
除了上述的配制方法外，組織蛋白酶抑制劑亦可作為儲(chǔ)存制劑進(jìn)行配制。如此長(zhǎng)時(shí)間作用的配制物可通過(guò)皮下或肌肉培植或肌肉注射來(lái)使用。然后，例如，此化合物可與適當(dāng)?shù)木酆闲曰虿灰妆凰竦牟牧?，或離子交換樹(shù)脂，或作為如可溶性鹽的可溶性衍生物來(lái)配制。
如果需要的話，此藥物化合物也可在一包裝或分配器裝置中來(lái)體現(xiàn)，而此包裝或分配器裝置可包含具有活性成分的一個(gè)或多個(gè)單位劑量。此包裝可包括金屬或塑料箔片，如薄膜包裝。包裝或分配器裝置可帶有使用說(shuō)明。4、肥胖癥、糖尿病和其它相關(guān)疾病的遺傳性易患病體質(zhì)的診斷。
本發(fā)明亦可通過(guò)特別地檢測(cè)和監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)組織脂肪的蛋白酶活性來(lái)提供診斷動(dòng)物的肥胖癥或其相關(guān)疾病的易患病體質(zhì)的方法。這種調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶可以包括組織蛋白酶K，L和S，組織蛋白酶K和L為佳，組織蛋白酶L為上。
可使用一系列方法，通過(guò)測(cè)量調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶如LmRNA數(shù)量，調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶如L的表達(dá)數(shù)量，和/或調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶如L的含量，來(lái)檢測(cè)動(dòng)物的遺傳性易患病體質(zhì)，而這種體質(zhì)可發(fā)展成與異常的，不規(guī)則的脂肪含量，血糖含量和/或胰島素含量有關(guān)的疾病狀態(tài)。
與調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶如L的相關(guān)的測(cè)量，可與動(dòng)物的血糖含量、胰島素含量和/或脂肪含量的測(cè)量一起使用。例如，具有升高的或異常高的組織蛋白酶L活性的動(dòng)物亦可能具有更高的脂肪含量。還可使用組織蛋白酶L的高度活性(或含量)和脂肪的高度含量共同鑒別高脂肪含量的可能原因。
在某一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶如L的基因表達(dá)活性，其中調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高頻活性表明此動(dòng)物具有先天性肥胖癥。調(diào)節(jié)組織脂肪的蛋白酶基因表達(dá)活性包括但不限于轉(zhuǎn)錄活性如將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到脂肪調(diào)節(jié)組織蛋白酶基因啟動(dòng)子區(qū)的活性和轉(zhuǎn)錄mRNA的活性，翻譯活性如調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，以及后翻譯活性如調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶前體的分解過(guò)程，調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶內(nèi)源性抑制劑的不同表達(dá)。
在另一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶如L基因表達(dá)活性；測(cè)量動(dòng)物的血糖和/或胰島素含量，其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性和異常高的血糖和/或胰島素含量表明此動(dòng)物具有先天性胰島素功能亢進(jìn)或II型糖尿病。
然而在另一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶如L的基因表達(dá)活性；測(cè)量動(dòng)物的血糖和/或胰島素含量，其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性和異常高的血糖和/或胰島素含量表明此動(dòng)物具有先天性胰島素功能亢進(jìn)或II型糖尿病。
本發(fā)明亦提供了通過(guò)特別檢測(cè)或監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶活性(最好是組織蛋白酶K，L和S，組織蛋白酶K和L為佳，組織蛋白酶L為上。)以診斷動(dòng)物的肥胖癥、糖尿病和其它相關(guān)疾病的方法。
在某種場(chǎng)合，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)活性，其中調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性表明此動(dòng)物患有先天性肥胖癥。調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)活性包括但不限于轉(zhuǎn)錄活性如將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到脂肪調(diào)節(jié)組織蛋白酶基因啟動(dòng)子區(qū)的活性和轉(zhuǎn)錄mRNA的活性，翻譯活性如調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，以及后翻譯活性如調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶前體的分解過(guò)程，調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶內(nèi)源性抑制劑的不同表達(dá)。
在另一種情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)活性；測(cè)量動(dòng)物的血糖和/或胰島素含量，其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性和異常高的血糖和/或胰島素含量表明此動(dòng)物患有先天性胰島素功能亢進(jìn)或II型糖尿病。
在另一具體情況下，此方法包括測(cè)量動(dòng)物的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)活性；測(cè)量動(dòng)物的血糖和/或胰島素含量，其中，調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因表達(dá)的異常高度活性和異常高的血糖和/或胰島素含量表明此動(dòng)物具有先天性胰島素功能亢進(jìn)或II型糖尿病。
通過(guò)使用目前發(fā)明的診斷方法，肥胖癥和糖尿病的分子遺傳性致病原因可由具有體內(nèi)脂肪含量和/或血糖和胰島素含量的組織蛋白酶的某一具體形式活性表達(dá)出來(lái)。在其癥狀顯示出來(lái)之前，這些方法尤其可用來(lái)預(yù)測(cè)這些疾病的發(fā)作。
例如，可用此方法來(lái)診斷人體中胰島素的阻抗情況。人們已發(fā)現(xiàn)胰島素阻抗是II型糖尿病的充分起因。在大多數(shù)情況下導(dǎo)致了這種疾病的進(jìn)一步發(fā)展?；加蠭I型糖尿病或成熟發(fā)作糖尿病蜜劑的人，其血漿胰島素含量比非糖尿病患者要高出許多。這些人具有下列特點(diǎn)1、肥胖，尤其是中心肥胖；2、胰島素阻抗；3、異常的胰島素神秘功能；4、后吸收性肝葡萄糖產(chǎn)生率的提高。因而，血液胰島素的更高含量往往與血液葡萄糖的更高含量相關(guān)，它是糖尿病的傳統(tǒng)指示劑。
例如，這些診斷方法可以利用一些試劑，如一種或多種調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶(最好包括組織蛋白酶L)指紋基因核苷序列和針對(duì)表達(dá)不同的組織蛋白酶產(chǎn)物的抗原。例如，這些試劑可特別用來(lái)1、檢測(cè)組織蛋白酶基因的變化或檢測(cè)與非肥胖狀態(tài)相關(guān)的調(diào)節(jié)脂肪的組織蛋白酶基因mRNA過(guò)多或不足表達(dá)。2、檢測(cè)與非肥胖狀態(tài)相關(guān)的調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶基因產(chǎn)物的過(guò)多或不足。例如，在此所描述的方法可利用預(yù)先包裝診斷工具來(lái)實(shí)施。它至少包括一種使用方便的具體組織蛋白酶基因核酸或反組織蛋白酶抗原試劑，比如，在臨床上用來(lái)診斷患有肥胖癥或相關(guān)疾病的病人。在此可利用的方法之一是在治療肥胖或相關(guān)疾病的臨床實(shí)驗(yàn)中，用于監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶抑制劑功效的方法?？捎糜谡{(diào)節(jié)脂肪組織蛋白酶抑制劑包括但不限于上述第三部分所述情況。
例如，在臨床實(shí)驗(yàn)中，組織蛋白酶L基因的表達(dá)或有關(guān)基因表達(dá)的細(xì)胞顯型可由測(cè)試的抑制劑的有無(wú)來(lái)決定。可通過(guò)比較所獲得的表達(dá)資料與通常非肥胖狀況的相對(duì)為人所熟知的表達(dá)來(lái)判斷抑制劑的功效。
在臨床試驗(yàn)中，比較肥胖癥與非肥胖癥或正常人的組織蛋白酶基因的產(chǎn)物或活化可以用于確定其抑制劑的效果。例如，在臨床實(shí)驗(yàn)期間，一種或多種表達(dá)不同的組織蛋白酶基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性，由實(shí)驗(yàn)的合成物存在或缺乏的相關(guān)細(xì)胞和/或組織來(lái)決定。可通過(guò)比較所獲得的蛋白質(zhì)含量和/或活性與在正常的、非肥胖狀態(tài)下相對(duì)為人所知的細(xì)胞和/或組織的活性/含量來(lái)判斷合成物的功效。
顯示功效的合成物為那些把與肥胖相關(guān)的細(xì)胞和/或組織方式改變到與正常的、非肥胖狀態(tài)極其相似的合成物。


圖1、老鼠腹膜的巨噬細(xì)胞采用合成抑制劑對(duì)半胱氨酸蛋白酶的抑制全貌。對(duì)標(biāo)注有[125I]-Z-Tyr-Ala-CHN2的老鼠的腹膜巨噬細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞溶解，并把他們分離到12％的SDS-PAGE來(lái)顯現(xiàn)所標(biāo)注的活性蛋白酶。劑量及所用抑制劑都已做出說(shuō)明。圖2、抑制組織蛋白酶L導(dǎo)致95kDa胰島素受體β亞單位及前體的積累。在有抑制劑和無(wú)抑制劑的條件下，以及不同劑量下，對(duì)人體前脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，溶解，分離到7％SDS-PAGE中，并用山羊的抗人類的胰島素受體β亞單位的多克隆抗體來(lái)探測(cè)。所測(cè)出的成熟的β亞單位及其前體都已標(biāo)出，IR Precursor代表胰島素受體前體，subunit代表亞單位。圖3、抑制組織蛋白酶L導(dǎo)致95kDa類胰島素受體蛋白β亞單位及其前體的積累。細(xì)胞處理如圖2。采用山羊的抗人體的IGF-1R的多克隆抗體來(lái)進(jìn)行免疫檢測(cè)。圖4、抑制組織蛋白酶L阻止CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白質(zhì)α的表達(dá)。如圖2般對(duì)人體前脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化。采用山羊的抗人體C/EBP-α多克隆抗體和10％的凝膠來(lái)進(jìn)行western印跡免疫分析，并用相應(yīng)的HRP-結(jié)合的二級(jí)抗體來(lái)檢測(cè)。圖5、抑制組織蛋白酶L可以阻止PPAR-γ的表達(dá)。如圖4般采用人體前脂肪細(xì)胞和免疫分析來(lái)替代老鼠的抗人體的PPAR-γ單克隆的抗體作為基本抗體。圖6、對(duì)人體的前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞做紅油著色。進(jìn)行細(xì)胞分化時(shí)，使用與前脂肪細(xì)胞一同孵化組織蛋白酶L的選擇性抑制劑CLIK 148(10μM)和195(10μM)，則細(xì)胞的分化完全被這些抑制劑阻塞。圖7、在已分化的人體脂肪細(xì)胞中降低了組織蛋白酶S的表達(dá)，提高了組織蛋白酶L的表達(dá)。從脂肪細(xì)胞(誘導(dǎo)組，以induced表示)和前脂肪細(xì)胞(對(duì)照組，以control表示)所獲得的細(xì)胞溶解產(chǎn)物被溶解，進(jìn)而分離到12％的SDS-PAGE中，并用兔子的抗人體組織蛋白酶S(頂部)，L(底部)，和K(未顯示)的多克隆抗體來(lái)檢測(cè)。在對(duì)照細(xì)胞和分化的細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)有給組織蛋白酶K的信號(hào)。圖8、在老鼠3T3-L1的前脂肪細(xì)胞分化中的組織蛋白酶L和S的表達(dá)。使老鼠的3T3-LI細(xì)胞進(jìn)行分化，并在分化的不同的時(shí)間收集細(xì)胞。所得的溶解產(chǎn)物分離到12％SDS-PAGE中，并用兔子的抗組織蛋白酶L，S的多克隆抗體來(lái)做western印跡免疫分析。圖9、在老鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化中組織蛋白酶L抑制劑的效用。老鼠3T3-L1細(xì)胞被引導(dǎo)形成脂肪。此過(guò)程中在不同的時(shí)間點(diǎn)跳躍使用CLIK148(10μM)。分化的最后階段采用紅油著色。圖10、在老鼠3T3-LI的分化中降低組織蛋白酶K的表達(dá)。在分化中收集細(xì)胞，溶解細(xì)胞，并分離到12％的SDS-PAGE中，用兔子的抗組織蛋白酶K的抗體著色。顯示出了成熟形式的組織蛋白酶K。圖11、經(jīng)組織蛋白酶L抑制劑處理過(guò)的老鼠3T3-L1細(xì)胞，其胰島素受體的消化中間體的形成減少。在脂肪形成中采用不同劑量的抑制劑來(lái)處理3T3-L1細(xì)胞。準(zhǔn)備好細(xì)胞的溶解產(chǎn)物，并把它們分離到10％的SDS-PAGE中，用山羊的抗老鼠IR-β亞單位多克隆抗體來(lái)進(jìn)行western印跡免疫檢測(cè)。
實(shí)施例1我們引用生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究來(lái)展示某種組織蛋白酶尤其是組織蛋白酶L在調(diào)節(jié)脂肪形成和胰島素受體的更新中起著重要的作用。而且也引用了用以抑制組織蛋白酶L活性的方法舉例。
1、材料和方法材料除非特別說(shuō)明，所有的化學(xué)品從Sigma和Aldrich公司購(gòu)買。兔抗人/鼠組織蛋白酶S，K，和L多克隆抗體，羊抗人/鼠IR，IGF-1R，和C/EBP-α多克隆的抗體，以及鼠抗人/鼠PPAR-γ單克隆抗體都從Santa Cruz Biotechnologies公司購(gòu)買。CA 074來(lái)自BachemBiosciences Inc.(King of Prussia，PA)。E64d從Calbiochem(SanDiego，CA)公司獲得.Z-Tyr-Ala-CHN2來(lái)源于Enzyme Systems(Livermore，CA).下述物質(zhì)是根據(jù)Katunuma等人的描述(1999)FEBSLett.4586-10合成而得CLIK 148〖L-(+)-(2S，3S)-N-[2-(2’-吡啶基-)-1-乙基-]-鈉-氨基-(L-苯丙氨酸-二甲基酰胺)-反式-環(huán)氧琥珀酰胺〗，IUPAC名稱N-[2-(2-吡啶基)-1-乙基]-L-(+)-(2S，3S)-3-[(S)-1-二甲基氨基甲?；?2-苯基乙基氨基甲酰基]-2-環(huán)氧乙烷羧酰胺，CLIK 060，即，(N-{L-3-反式[(1-苯基氨基甲?；?5-氨基)戊基氨基甲?；鵠環(huán)氧乙烷-2-羰基}-L-苯丙氨酸基-二甲基酰胺鹽酸鹽，和CLIK 195，即，(L-(+)-(2S，3S)-雙-(鈉-氨基-L-苯丙氨酸二甲基酰胺)-反式-環(huán)氧琥珀酰胺，IUPAC名稱是N，N-二甲基-L-(+)-(2S，3S)-2-{3-[(S)-1-二甲基氨基甲酰基-2-苯基-乙基氨基甲?；鵠-2-環(huán)氧乙烷氨基甲?；被鶀-(S)-3-苯基-丙酰胺)。人體前脂肪細(xì)胞的脂肪形成將人體前脂肪細(xì)胞先在MSCGM培養(yǎng)基(BioWhitaker)當(dāng)中培養(yǎng)，在溫度為37攝氏度，5％的二氧化碳中培養(yǎng)7-12天，并且要進(jìn)行3-4次的培養(yǎng)基更換直到完全融合。未被誘導(dǎo)的細(xì)胞被保存在脂肪形成維持培養(yǎng)基中，該維持培養(yǎng)基含有0.01mg/ml的胰島素，0.05units/ml的青霉素，0.05μg/ml的鏈霉素，和10％胎牛血清。為引導(dǎo)脂肪形成，完全融合的細(xì)胞在分別含有蛋白酶抑制劑和缺少蛋白酶抑制劑的脂肪形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，接著在維持培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。該脂肪形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有1μM的地塞米松，0.2mM的消炎痛(indomethacin)，0.01mg/ml的胰島素，0.5mM的3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤，0.05units/ml的青霉素，0.05μg/ml的鏈霉素，和10％胎牛血清。經(jīng)歷三次誘導(dǎo)和維持的循環(huán)，細(xì)胞要在維持培養(yǎng)基中再進(jìn)行額外的7天培養(yǎng)，期間要進(jìn)行兩次新鮮的培養(yǎng)基換。老鼠前脂肪細(xì)胞的脂肪形成老鼠前脂肪細(xì)胞按Patel and lane(2000)J.Biol.Chem.27517653-17660所描述的那樣被進(jìn)行分化。簡(jiǎn)要地說(shuō)，老鼠的3T3-L1細(xì)胞在含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37℃和10％CO2條件下培養(yǎng)，直到完全融合。在同樣的培養(yǎng)基中再經(jīng)過(guò)額外的兩天維持，分別在有蛋白酶抑制劑和沒(méi)有蛋白酶抑制劑的情況下添加0.5mM的甲基異丁基黃嘌呤，1μM的地塞米松，1μg/ml的胰島素，and 10％的FBS培養(yǎng)兩天，使細(xì)胞分化。用含有1μg/ml的胰島素，和10％FBS的DMEM取代培養(yǎng)基。4天后，在沒(méi)有胰島素的DMEM培養(yǎng)基中隔天添加10％FBS，7-8時(shí)，細(xì)胞就完全被分化了。Western印跡免疫檢測(cè)分化后，收集細(xì)胞并把他們?nèi)芙獾? X RIPA的緩沖器中。根據(jù)從制造商(Bio-Rad，Hercules，CA)處獲得的Bio-RadDc蛋白質(zhì)化驗(yàn)體系來(lái)決定蛋白質(zhì)濃度。等同數(shù)量的蛋白質(zhì)被分離到含有7％的SDS-PAGE中以測(cè)定IR和IGF-IR，含有12％的SDS-PAGE中以測(cè)定組織蛋白酶S，K和L的抗原。IR和IGF-IR的初級(jí)多克隆抗體都從山羊身上獲得，并且所有的組織蛋白酶抗體都是從兔子身上獲得的多克隆抗體。相應(yīng)的共扼辣根過(guò)氧物酶的二級(jí)抗體用于檢測(cè)。半胱氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)標(biāo)注如Shi et al.(2000)J.Exp.Med.1911177-1786所描述通過(guò)向老鼠注射入硫化乙醇酸鹽而產(chǎn)生老鼠腹膜的巨噬細(xì)胞。經(jīng)過(guò)3-4天的孵化，腹膜巨噬細(xì)胞可通過(guò)含有6mM EDTA(pH 8.0)的Tris-EDTA緩沖液沖洗出來(lái)。然后，細(xì)胞被種植到24個(gè)裝有10％FBS的盤子里直到細(xì)胞全面擴(kuò)散。在細(xì)胞黏附在盤子上后，添加不同劑量的抑制劑。經(jīng)過(guò)2-3個(gè)小時(shí)的孵化，把細(xì)胞標(biāo)注為[125I]-Z-Tyr-Ala-CHN2整晚處于37攝氏度下來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的活性半胱氨酸蛋白酶。細(xì)胞被1X的還原蛋白樣本緩沖器溶解并被分離到12％的SDS-PAGE中。
2、結(jié)果和討論組織蛋白酶B、S、K和L是在人類病理生理學(xué)上起著非常重要作用的溶酶性半胱氨酸蛋白酶。組織蛋白酶B是一種輔助性蛋白酶，其主要作用是降解不需要的或轉(zhuǎn)移到酸性代謝區(qū)內(nèi)涵體和溶酶體內(nèi)的循環(huán)蛋白質(zhì)。其在固體瘤中的高頻表達(dá)因而與瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有涉。與此相反，組織蛋白酶S在抗原顯示細(xì)胞中有選擇地表達(dá)，并在不變鏈降解中起作用，因而是MHC II級(jí)調(diào)節(jié)免疫性中所需要的。此種蛋白酶的抑制或缺乏會(huì)導(dǎo)致MHC II級(jí)程序的損傷，從而引起抗原顯示。而且，此種蛋白酶與動(dòng)脈硬化癥的病理過(guò)程和早老性癡呆有涉。組織蛋白酶K亦為一有效彈性組織蛋白酶，但其主要在破骨細(xì)胞中表達(dá)因而與骨骼的新陳代謝有涉。組織蛋白酶L是與組織蛋白酶S和K相似的另一種有效彈性蛋白酶，其早在10多年前就已經(jīng)被析出。此種蛋白酶相當(dāng)廣泛地表達(dá)著。其有效彈性蛋白酶活性使得這種蛋白酶成為在患有肺氣腫病人身上治療肺衰弱的酶素候補(bǔ)物質(zhì)之一。最近，此蛋白酶被發(fā)現(xiàn)與胸腺CD4T細(xì)胞選擇有涉。
胰島素的主要作用是通過(guò)刺激葡萄糖轉(zhuǎn)移到肌肉和脂肪細(xì)胞中，并通過(guò)降低肝臟的葡萄糖輸出來(lái)控制血漿葡萄糖含量。胰島素的信號(hào)可由其結(jié)合到細(xì)胞表面受體，隨后通過(guò)內(nèi)涵素覆蓋的小水包的自磷化作用和內(nèi)吞作用來(lái)調(diào)節(jié)的。這種復(fù)合體最終在酸性內(nèi)涵體和溶酶體中得到降解。然而，負(fù)責(zé)此生物過(guò)程的蛋白酶卻不為人們所熟知。已有人建議在體內(nèi)用組織蛋白酶B降解合成性胰島素肽鏈。
根據(jù)本發(fā)明，人們?cè)O(shè)想半胱氨酸蛋白酶可能極大的參與了胰島素/胰島素受體的轉(zhuǎn)換。為檢測(cè)這一假設(shè)，合成性小分子化合物被用來(lái)作為抑制劑，來(lái)有選擇性地阻塞組織蛋白酶S，B，K和L的活性。
首先，檢測(cè)一下合成性小分子化合物對(duì)不同形式組織蛋白酶的選擇性。老鼠腹膜巨噬細(xì)胞在選擇性抑制劑和半胱氨酸蛋白酶活躍部位標(biāo)明探測(cè)器內(nèi)培養(yǎng)。如圖1所示，組織蛋白酶B的活性可由2um的CA074完全抑制，而組織蛋白酶S，K和L的活性則保持原樣。與此相反，所使用的其它抑制劑對(duì)組織蛋白酶B沒(méi)有影響。盡管組織蛋白酶L的活性在某種程度上受到影響，CLIK060在2-10μM的含量時(shí)顯著地抑制了組織蛋白酶S的活性。相比較而言，CLIK148和CLIK195對(duì)組織蛋白酶L具有更大的選擇性。它們?cè)?0μM含量時(shí)完全抑制了組織蛋白酶L的活性，而非沒(méi)有抑制組織蛋白酶B或組織蛋白酶S或組織蛋白酶K的活性(圖1)。因此，這些抑制劑可被用來(lái)實(shí)驗(yàn)上述的組織蛋白酶是否在胰島素受體(IR)或IR更新的衰變中起作用。
為試驗(yàn)?zāi)姆N組織蛋白酶與IR轉(zhuǎn)換有關(guān)，在有無(wú)抑制劑的情況下，可使人類前成脂肪細(xì)胞變成脂肪細(xì)胞。如前所述，分化的的脂肪細(xì)胞比對(duì)照組表達(dá)出更多的IR。組織蛋白酶B抑制劑(CA074，10μM)和組織蛋白酶S抑制劑(CLIK060，2μM)對(duì)IR轉(zhuǎn)換或分化沒(méi)有作用(圖2)。與此相對(duì)照，E64d(20μM)，CLIK148和CLIK195(10μM)處理細(xì)胞增加了95kDa1Rβ亞單位及其前體的含量。當(dāng)用類胰島素受體(IGF-IR)抗體(圖3)進(jìn)行印跡試驗(yàn)時(shí)，結(jié)果相同。
為對(duì)前述抑制劑對(duì)細(xì)胞分化的影響作一評(píng)估，我們對(duì)使用抑制劑和沒(méi)有抑制劑處理過(guò)的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白質(zhì)-α(C/EBP-α)及過(guò)氧物酶體繁殖激活受體-γ(PPAR-γ)的水平進(jìn)行了免疫測(cè)定。C/EBP-α和PPAR-γ皆為重要的脂肪細(xì)胞決定因素。
如圖4和5所示，只有E64d和CLIK/48和CLIK195具有阻塞50kDaC/EBP-a(圖4)和50kDa PPAR-γ(圖5)積累的效果。這些觀察表明組織蛋白酶L的抑制可阻塞人類前脂肪細(xì)胞的分化。此假設(shè)可由CLIK148或195處理前成脂肪細(xì)胞(圖6)的紅油染色進(jìn)一步證實(shí)。此外，此兩種抑制劑對(duì)脂肪形成的抑制要視劑量而定。少于50％的脂肪可由1цM的這種抑制劑阻塞。如果使用10μM的CLIK148或CLIK195(圖6)就可觀察到完全的抑制。與此對(duì)照的是，1μM的CLIK060，1或10μM的CA074對(duì)脂肪形成沒(méi)有效果(未列數(shù)據(jù))。所以，這些觀察表明組蛋白L似乎在脂肪形成中控制胰島素/IR復(fù)合物轉(zhuǎn)換比組織蛋白酶S和K起到更為關(guān)鍵的作用。同時(shí)，組織蛋白酶B似乎未在此過(guò)程中起決定性作用。
有幾個(gè)證據(jù)證明了這種觀察。首先，組織蛋白酶B抑制劑CA074即使在更高的含量時(shí)對(duì)脂肪形成也沒(méi)有影響(未列數(shù)據(jù))。組織蛋白酶S抑制劑CLIK060在1μM時(shí)亦無(wú)效果，但在更高含量時(shí)有一些效果。當(dāng)用10-15μM的CLIK060處理細(xì)胞時(shí)，觀察到了IR積累和脂肪形成抑制。值得注意的是CLIR060在此含量時(shí)亦阻塞了組織蛋白酶L的活性(圖1)。而且，對(duì)不同分化細(xì)胞和對(duì)照組所進(jìn)行的western印跡免疫檢測(cè)分析表明組織蛋白酶L的活性在分化后有所增加，而組織蛋白酶S的活性與非分化細(xì)胞相比在脂肪細(xì)胞中消失了(圖7)。盡管未檢測(cè)出前成脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞中的組織蛋白酶K的信號(hào)，它仍或許是另一潛在的起作用者。在所用的含量時(shí)，所有使用的抑制劑對(duì)組織蛋白酶K沒(méi)有什么抑制性效果(圖1)，所以組織蛋白酶L在控制脂肪形成方面似乎是最重要的蛋白質(zhì)。
在使用老鼠前成脂肪細(xì)胞3T3-L1〕(ATCC，Manassas，VA)時(shí)亦可觀察到類似的顯型。在分化的脂肪細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)活性組織蛋白酶L和S(圖8，8-11天)，然而，在分化后兩種酶的含量有所增加，這與人類前成脂肪的含量有所不同。在3T3-L1細(xì)胞中，組織蛋白酶L在脂肪形成中的作用通過(guò)CLIK148(15μM)抑制脂肪形成得到進(jìn)一步確實(shí)(圖9)。在此試驗(yàn)中的脂肪形成過(guò)程表明，在脂肪形成產(chǎn)生的前4天可能比后幾天(5-9天)更為重要。在前成脂肪細(xì)胞中可檢測(cè)組織蛋白酶K抗原，但在脂肪細(xì)胞或胰島素處理的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到(圖10)。
這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)組織蛋白酶L在脂肪形成中比組織蛋白酶S和K起到更為關(guān)鍵的作用。同時(shí)，組織蛋白酶B似乎仍未起重要作用。因此，有選擇的降低組織蛋白酶K，L和S，特別是組織蛋白酶L在體內(nèi)的活性，可以有效的治療肥胖、糖尿病和相關(guān)疾病。
實(shí)施例2將表5的化合物分別溶于DMSO，化合物A，B，C均為200mg/ml，化合物D為200μg/ml，小鼠在注射化合物2天后開(kāi)始喂食高脂肪食物(Catalog#D12451，Research Diets，Inc.New Brunswick，NJ，USA)，每隔一星期稱重一次，對(duì)照組注射DMSO，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可以看出，服用了表5化合物的小鼠，與對(duì)照組相比均不同程度地減少了體重的增加，說(shuō)明表5的化合物具有減少體重的作用。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)明白，在不背離此項(xiàng)發(fā)明的精神或范圍的情況下，可在此發(fā)明中的方法、方案和成分中進(jìn)行不同的修改和變化。因此，只要這些修正和變化屬于權(quán)利要求或類似情況的范圍內(nèi)，此項(xiàng)發(fā)明就可包括這些修正和變化。此外，為了說(shuō)明這項(xiàng)發(fā)明，提供了上述事例，這些實(shí)施例不能解釋為限制本發(fā)明的范圍。
序列表<110>新世紀(jì)藥業(yè)公司<120>治療肥胖癥、糖尿病及相關(guān)疾病的藥物<130>26748-701<160>11<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1575<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg60cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga120cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg180gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt240tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt tttaaaacat gaatcctaca300ctcatccttg ctgccttttg cctgggaatt gcctcagcta ctctaacatt tgatcacagt360ttagaggcac agtggaccaa gtggaaggcg atgcacaaca gattatacgg catgaatgaa420gaaggatgga ggagagcagt gtgggagaag aacatgaaga tgattgaact gcacaatcag480gaatacaggg aagggaaaca cagcttcaca atggccatga acgcctttgg agacatgacc540agtgaagaat tcaggcaggt gatgaatggc tttcaaaacc gtaagcccag gaaggggaaa600gtgttccagg aacctctgtt ttatgaggcc cccagatctg tggattggag agagaaaggc660tacgtgactc ctgtgaagaa tcagggtcag tgtggttctt gttgggcttt tagtgctact720ggtgctcttg aaggacagat gttccggaaa actgggaggc ttatctcact gagtgagcag780aatctggtag actgctctgg gcctcaaggc aatgaaggct gcaatggtgg cctaatggat840tatgctttcc agtatgttca ggataatgga ggcctggact ctgaggaatc ctatccatat900gaggcaacag aagaatcctg taagtacaat cccaagtatt ctgttgctaa tgacaccggc960tttgtggaca tccctaagca ggagaaggcc ctgatgaagg cagttgcaac tgtggggccc1020atttctgttg ctattgatgc aggtcatgag tccttcctgt tctataaaga aggcatttat1080tttgagccag actgtagcag tgaagacatg gatcatggtg tgctggtggt tggctacgga1140tttgaaagca cagaatcaga taacaataaa tattggctgg tgaagaacag ctggggtgaa1200gaatggggca tgggtggcta cgtaaagatg gccaaagacc ggagaaacca ttgtggaatt1260gcctcagcag ccagctaccc cactgtgtga gctggtggac ggtgatgagg aaggacttga1320ctggggatgg cgcatgcatg ggaggaattc atcttcagtc taccagcccc cgctgtgtcg1380gatacacact cgaatcattg aagatccgag tgtgatttga attctgtgat attttcacac1440tggtaaatgt tacctctatt ttaattactg ctataaatag gtttatatta ttgattcact1500tactgacttt gcattttcgt ttttaaaagg atgtataaat ttttacctgt ttaaataaaa1560tttaatttca aatgt1575<210>2<211>333<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Asn Pro Thr Leu Ile Leu Ala Ala Phe Cys Leu Gly Ile Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Leu Thr Phe Asp His Ser Leu Glu Ala Gln Trp Thr Lys Trp20 25 30Lys Ala Met His Asn Arg Leu Tyr Gly Met Asn Glu Glu Gly Trp Arg35 40 45Arg Ala Val Trp Glu Lys Asn Met Lys Met Ile Glu Leu His Asn Gln50 55 60Glu Tyr Arg Glu Gly Lys His Ser Phe Thr Met Ala Met Asn Ala Phe65 70 75 80Gly Asp Met Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln85 90 95Asn Arg Lys Pro Arg Lys Gly Lys Val Phe Gln Glu Pro Leu Phe Tyr100 105 110Glu Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro115 120 125Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr
130 135 140Gly Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser145 150 155 160Leu Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Gln Gly Asn Glu165 170 175Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp180 185 190Asn Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu195 200 205Glu Ser Cys Lys Tyr Asn Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly210 215 220Phe Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala225 230 235 240Thr Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe245 250 255Leu Phe Tyr Lys Glu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu260 265 270Asp Met Asp His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr275 280 285Glu Ser Asp Asn Asn Lys Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Glu290 295 300Glu Trp Gly Met Gly Gly Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn305 310 315 320His Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val325 330<210>3<211>1374<212>DNA<213>Mus musculus<400>3cggcgacctc cggggatccg agtttgcaga cttcttgtgc gcacgtagcc 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表1人組織蛋白酶L全部長(zhǎng)度序列[SEQ ID NO1]1 agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg61 cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga121 cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg181 gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt241 tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt tttaaaacat gaatcctaca301 ctcatccttg ctgccttttg cctgggaatt gcctcagcta ctctaacatt tgatcacagt361 ttagaggcac agtggaccaa gtggaaggcg atgcacaaca gattatacgg catgaatgaa421 gaaggatgga ggagagcagt gtgggagaag aacatgaaga tgattgaact gcacaatcag481 gaatacaggg aagggaaaca cagcttcaca atggccatga acgcctttgg agacatgacc541 agtgaagaat tcaggcaggt gatgaatggc tttcaaaacc gtaagcccag gaaggggaaa601 gtgttccagg aacctctgtt ttatgaggcc cccagatctg tggattggag agagaaaggc661 tacgtgactc ctgtgaagaa tcagggtcag tgtggttctt gttgggcttt tagtgctact721 ggtgctcttg aaggacagat gttccggaaa actgggaggc ttatctcact gagtgagcag781 aatctggtag actgctctgg gcctcaaggc aatgaaggct gcaatggtgg cctaatggat841 tatgctttcc agtatgttca ggataatgga ggcctggact ctgaggaatc ctatccatat901 gaggcaacag aagaatcctg taagtacaat cccaagtatt ctgttgctaa tgacaccggc961 tttgtggaca tccctaagca ggagaaggcc ctgatgaagg cagttgcaac tgtggggccc1021atttctgttg ctattgatgc aggtcatgag tccttcctgt tctataaaga aggcatttat1081tttgagccag actgtagcag tgaagacatg gatcatggtg tgctggtggt tggctacgga1141tttgaaagca cagaatcaga taacaataaa tattggctgg tgaagaacag ctggggtgaa1201gaatggggca tgggtggcta cgtaaagatg gccaaagacc ggagaaacca ttgtggaatt1261gcctcagcag ccagctaccc cactgtgtga gctggtggac ggtgatgagg aaggacttga1321ctggggatgg cgcatgcatg ggaggaattc atcttcagtc taccagcccc cgctgtgtcg1381gatacacact cgaatcattg aagatccgag tgtgatttga attctgtgat attttcacac1441tggtaaatgt tacctctatt ttaattactg ctataaatag gtttatatta ttgattcact1501tactgacttt gcattttcgt ttttaaaagg atgtataaat ttttacctgt ttaaataaaa1561tttaatttca aatgt人組織蛋白酶全部長(zhǎng)度氨基酸序列[SEQ ID NO2]MNPTLILAAFCLGIASATLTFDHSLEAQWTKWKAMHNRLYGMNEEGWRRAVWEKNMKMIELHNQEYREGKHSFTMAMNAFGDMTSEEFRQVMNGFQNRKPRKGKVFQEPLFYEAPRSVDWREKGYVTPVKNQGQCGSCWAFSATGALEGQMFRKTGRLISLSEQNLVDCSGPQGNEGCNGGLMDYAFQYVQDNGGLDSEESYPYEATEESCKYNPKYSVANDTGFVDIPKQEKALMKAVATVGPISVAIDAGHESFLFYKEGIYFEPDCSSEDMDHGVLVVGYGFESTESDNNKYWLVKNSWGEEWGMGGYVKMAKDRRNHCGIASAASYPTV-stop鼠組織蛋白酶L全部長(zhǎng)度cDNA[SEQ ID NO3]1cggcgacctc cggggatccg agtttgcaga cttcttgtgc gcacgtagcc gcctcaggtg61 tttgaaccat gaatctttta ctccttttgg ctgtcctctg cttgggaaca gccttagcta121 ctccaaaatt tgatcaaacc tttagtgcag agtggcacca gtggaagtcc acgcacagaa181 gactgtatgg cacgaatgag gaagagtgga ggagagcgat atgggagaag aacatgagaa241 tgatccagct acacaacggg gaatacagca acgggcagca cggcttttcc atggagatga301 acgcctttgg tgacatgacc aatgaggaat tcaggcaggt ggtgaatggc tatcgccacc361 agaagcacaa gaaggggagg ctttttcagg aaccgctgat gcttaagatc cccaagtctg421 tggactggag agaaaagggt tgtgtgactc ctgtgaagaa ccagggccag tgcgggtctt481 gttgggcgtt tagcgcatcg ggttgcctag aaggacagat gttccttaag accggcaaac541 tgatctcact gagtgaacag aaccttgtgg actgttctca cgctcaaggc aatcagggct601 gtaacggagg cctgatggat tttgctttcc agtacattaa ggaaaatgga ggtctggact661 cggaggagtc ttacccctat gaagcaaagg acggatcttg taaatacaga gccgagttcg721 ctgtggctaa tgacacaggg ttcgtggata tccctcagca agagaaagcc ctcatgaagg781 ctgtggcgac tgtggggcct atttctgttg ctatggacgc aagccatccg tctctccagt841 tctatagttc aggcatctac tatgaaccca actgtagcag caagaacctc gaccatgggg901 ttctgttggt gggctatggc tatgaaggaa cagattcaaa taagaataaa tattggcttg961 tcaagaacag ctggggaagt gaatggggta tggaaggcta catcaaaata gccaaagacc1021 gggacaacca ctgtggactt gccaccgcgg ccagctatcc tgtcgtgaat tgatgggtag1081 cggtaatgag gacttatgga cactatgtcc aaaggaattc agcttaaaac tgaccaaacc1141 cttattgagt caaaccatgg tacttgaatc attgaggatc caagtcatga tttgaattct1201 gttcccattt ttacatgggt taaatgttac cactacttaa aactcctgtt ataaacagct1261 ttataatatt gaaaacttag tgcttaattc tgagtctgga atatttgttt tatataaagg1321 ttgtataaaa ctttctttac ctcttaaaaa taaattttag ctcagtgtgt gtgt鼠組織蛋白酶L全部長(zhǎng)度氨基酸序列[SEQ ID NO4]MNLLLLLAVLCLGTALATPKFDQTFSAEWHQWKSTHRRLYGTNEEEWRRAIWEKNMRMIQLHNGEYSNGQHGFSMEMNAFGDMTNEEFRQVVNGYRHQKHKKGRLFQEPLMLKIPKSVDWREKGCVTPVKNQGQCGSCWAFSASGCLEGQMFLKTGKLISLSEQNLVDCSHAQGNQGCNGGLMDFAFQYIKENGGLDSEESYPYEAKDGSCKYRAEFAVANDTGFVDIPQQEKALMKAVATVGPISVAMDASHPSLQFYSSGIYYEPNCSSKNLDHGVLLVGYGYEGTDSNKNKYWLVKNSWGSEWGMEGYIKIAKDRDNHCGLATAASYPVVN-stop人組織蛋白酶L5’-末端UTR[SEQ ID NO5]1agaaccgcga cctccgcaac cttgagcggc atccgtggag tgcgcctgca gctacgaccg61 cagcaggaaa gcgccgccgg ccaggcccag ctgtggccgg acagggactg gaagagagga121 cgcggtcgag taggtgtgca ccagccctgg caacgagagc gtctaccccg aactctgctg181 gccttgaggt ggggaagccg gggagggcag ttgaggaccc cgcggaggcg cgtgactggt241 tgagcgggca ggccagcctc cgagccgggt ggacacaggt accgcagcca ggccggcgcc301 aacgactcag ggcctggccc ggccagacag ggaagctcag tccccgcacg ccagacagcg361 gtactcctgc tggcgtcacc gcaaacatcc tctgaccgct acagccagtg tgtgggcagg421 cgtcatgtcc ccggccctgc cacgcctgga gccctggaag ctggctgcag ggctctggct481 tcccgcgtgc gcccatatga ccccgtccct gatttagggg agcagtttgg ggtgtcggca541 gcacaggccc aagtgaatga aggagggaag cagtgcgtgc tctccttccc agtttttcct601 gggaaagcat ttcagaaagg tttcatttaa gaagaggttg gggcggccag gtggctcact661 cctgtaatcc cagcactttg ggaggctgag gtgggcggat cacctgaggt cagtagttca721 gaccagcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctctactga aaatacaaaa ttagacgggc781 gaggcggcgc acgcctgtag ttccagctat tcaagaggct gaggaagaat ggcttgaacc841 cgggaggcag aggttgctgt gagtcgatat cgcgccgttg aactccagcc tgggccacag901 agcaagactc catctcaaaa aataaataaa taaataaata aataaataaa taggagagat961 tggaaaactt atctcagctt ttggtgtttg ttagtcagga agatgtgtga aggcctccta1021 actcttgggg atctctttgt cccctacttg ggaatcccac cttatcatta gtgaggtttt1081 gcctgggcac gaaacctgga ttttttgcga ttggtacaaa acctggatca accgtttccc1141 ggtttcctag ttgttgcctt aagcttctca cacacaaggt agtttcatac ggttctcata1201 acctaaattg tcatcgcata aactgtttca gctcctacag ctctggacag gctgcttttc1261 attttggtaa gtccatccag tacctccacg tgccctgttt ttctccaggc acatccttgg1321 cctcttccac agtccttggg taaatgcttg ggagaataat ttaaatattt ttattctacc1381 atggtggccc taatttttca gggggcagta agatggcttt ttaggattgg tctaatcaga1441 tcctcatttt tgttcccttc ctaggtttta aaacatgaat ccta鼠組織蛋白酶5’-末端啟動(dòng)子區(qū)[SEQ ID NO6]1gtacggctga ggtggaaatt ccacagcagg tctttttttt ctacgctttt cttacagaac61 caaggcacca cgctggcgtg aaccctccaa agtggatcag cctcgcccca aggcttgcac121 cacaggacag gttacgaccc ggcggcggtc acgcgcccgg actcccgcag gctccgcccc181 gaggcaggca tagccaatga cggggcgggg gcgggccctg tcggggctgt agcctgagag241 cctttaaagc ctgagcccgg cgctgctcct ccagattctc ggacctcggc gacctccggg301 gatccgagtt tgcagacttc ttgtgcgcag ctagccgcct caggtgagtg acccccgcgg361 gtttaaaggc ttcccgagca agggcaggta ggggaatcta gaatgtggga accatagcat421 ctgcaacccg gactggagac ccccggatgg gccaggatct cgaggatgtg tcctcggcct481 ccccgaagtg ataggccctt gttgtcgagc ggggtcttca tcaggtcatg tgactccggg541 ctgccgggac ccgtagggac agcgggaccc cctcaagctg gtcacgggac ccagggctcc601 ttatgccgcc ataacattcg cgggcggtgg cccgagcgcg gagcggacgc ccatccccct661 ctcccccgga cgggcccagc ttggccccta acccgaactg agatcgcata aggaggcatc721 gccttgaggc ttcagttcgc ctgatgtgca gctgtgcgtt aaagtgtgtg gtggcagccc781 accctctggg tattcctgta tgcccacttg gggtcactaa tacttgtcaa taaatgacct841 ggacccagtt gtcctcttaa gattttgacg catacaatat cggaagactt aagactaccg901 tggccctata ataagagaaa ggtggggagg ggggggctgt cgagatggtt cagcgggtaa961 gagcactgac cgttctttca aaggtcctga gtgcaaatct cagcaaccac atggtggctc1021 acaaccaccc ataatgagat ctgacaccct cttctagtgc gtcaaaaatc agctacagtg1081 tacttatgta tgataataaa tcctaataaa taaaagagaa aagggtttat ccctgttcca1141 atgactacta ggctgttttt gtttcagtag ctagagtcta gtaacctcca aagattaatt1201 cctgacttgt ttttctccac tcataatcac atttgttaac acgtgcaagg atgcttcaac1261 tcagaacggt ttactgctgg gctggtggct catggatccc taaacttgag agatgggtca1321 ttgaaaaagt ttaaagcctg aactacatga gaaactgtcc ttaaaagaga aagcttccgt1381 gggattctca tttcctcttt ttccttccct aggtgtttga ac[SEQ ID NO7]<210>7<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Thr Ser Glu Glu Phe Arg Gln Val Met Asn Gly Phe Gln1 5 10[SEQ ID NO8]<210>8<211>4<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Phe Tyr Lys Glu1[SEQ ID NO9]<210>9<211>18<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly Phe Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu1 5 10 15Lys Ala[SEQ ID NO10]<210>10<211>4<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Ile Pro Lys Gln1[SEQ ID NO11]<210>11<211>10<212>PRT<213>Mus musculus<400>11His Cys Gly Leu Ala Thr Ala Ala Ser Tyr1 5 10
表2組織蛋白酶S選擇性抑制劑 表3組織蛋白酶K選擇性抑制劑 表4組織蛋白酶L選擇性抑制劑 表4組織蛋白酶L選擇性抑制劑(續(xù)-1) 表4組織蛋白酶L選擇性抑制劑(續(xù)-2)
權(quán)利要求
1.一種治療肥胖癥、糖尿病及相關(guān)疾病的藥物，其特征在于該藥物含有治療有效量的組織蛋白酶L，K，S的抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶L，K，S抑制劑是一種核酸或抗體或多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的核酸是一種與部分人類組織蛋白酶L的CDNA序列(SEQ ID NO1)互補(bǔ)的反義分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的核酸是一種與部分人類組織蛋白酶L基因的5’-末端未翻譯區(qū)互補(bǔ)的反義分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的抗體是一種與組織蛋白酶L特異性結(jié)合的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的多肽是一種希斯它丁(CYSTATIN C)的突變異種。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的多肽是撒克斯非林(saxiphilin)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的多肽是組織蛋白酶L前肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是一種能降低組織蛋白酶L活性的環(huán)氧琥珀酸鹽的衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的環(huán)氧琥珀酸鹽的衍生物是L-(+)-(2S，3S)-N-[2-(2，-吡啶基-)-1-乙基-]-鈉-氨基-(L-苯丙氨酸-二甲基酰胺)-反式-環(huán)氧琥珀酰胺。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的環(huán)氧琥珀酸鹽的衍生物是(L-(+)-(2S，3S)-雙-(鈉-氨基-L-苯丙氨酸二甲基酰胺)-反式-環(huán)氧琥珀酰胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是一種能抑制蛋白酶L活性的氮丙啶-2，3-重碳酸鹽衍生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是N-{(2S，3S)-1-[[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨?；鵠-3-(乙氧基羰基)氮丙啶-2-基]羰基}-(S)-亮氨酸卞基酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是(2R，3S)+(2S，3S)1-[N-(叔-丁氧基羰基)-(S)-苯基丙氨?；鵠氮丙啶-2，3-二羧酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是一種能抑制蛋白酶L活性的肽醛衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是L-異亮氨?；?L-色氨酸基醛衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是N-(1-奈基黃酰基)-L-異亮氨?；?L-色氨酸基醛。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是N-(卞基氧基羰基)-L-苯基丙氨?；?L-酪氨酸基醛。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是N-(2-卞基-3-苯基丙酰基)-L-色氨酸基醛。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是一種能抑制蛋白酶L活性的二肽羥酰胺酸酯衍生物和磺?；苌?。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是(3S)-3-[(N-卞基氧基羰基)-L-亮氨酸基]氨基-1-(4-苯基)-苯甲?；?氧-5-甲基-2-己酮。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是Z-Phe-Gly-NHO-Bz。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是Z-Phe-Gly-NHO-NBz。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所說(shuō)的藥物，其特征在于所說(shuō)的組織蛋白酶抑制劑是N-(1-奈基黃?；?L-異亮氨?；?L-色氨酸基醛。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物，其特征在于所說(shuō)的相關(guān)疾病是高胰島素癥，高血糖癥，高血壓，心臟血管病，肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和不育癥這些疾病中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療肥胖癥、糖尿病以及相關(guān)疾病的藥物，該藥物含有治療有效量的組織蛋白酶抑制劑。該藥物通過(guò)以組織蛋白酶，特別是組織蛋白酶L，K和S，尤其是蛋白酶L的基因和基因產(chǎn)物為靶向，來(lái)降低血糖水平，降低血液胰島素水平，及治療糖尿病，肥胖癥及相關(guān)疾病如高胰島素，高血糖，高血壓，心血管病，肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和不育癥等。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1400018SQ0112395
公開(kāi)日2003年3月5日 申請(qǐng)日期2001年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月8日
發(fā)明者陳競(jìng)明, 雍衡 申請(qǐng)人:沈愛(ài)福, 雍衡