專利名稱：N－乙酰－5，6－二甲氧基色胺用于制備抗氧化自由基藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種褪黑激素衍生物的生產(chǎn)方法，具體地說，是N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺用于制備抗氧化自由基藥物。
褪黑激素(melatonin)，即N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺，其結(jié)構(gòu)式是 褪黑激素在哺乳動(dòng)物和人類主要由位于大腦正中部位的松果體腺生成。其合成和分泌呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性，并隨年齡而變化。年齡越大，生成越少。這種節(jié)律性受機(jī)體內(nèi)在的機(jī)制和環(huán)境的影響。最明顯的環(huán)境因素是光照。當(dāng)暴露于光線后，褪黑激素的合成與分泌立即被抑制。褪黑激素在進(jìn)化過程中為一高度保守的分子，從最低等的單細(xì)胞生物藻類至人類都有這一化合物分子。褪黑激素有許多重要的生理機(jī)能如促進(jìn)睡眠，調(diào)節(jié)機(jī)體的晝夜節(jié)律性及生殖功能，延緩衰老，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，近年發(fā)現(xiàn)褪黑激素為目前最強(qiáng)的內(nèi)源性自由基清除劑，能延長實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的壽命達(dá)30％，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗多種有毒物質(zhì)的損傷，又發(fā)現(xiàn)對(duì)艾滋病有輔助治療效果。其抗氧化作用的主要功能基團(tuán)為其分子結(jié)構(gòu)吲哚環(huán)上第5位碳原子上的甲氧取代基。褪黑激素在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝，由羥化酶將其分子結(jié)構(gòu)中吲哚環(huán)上第6位碳原子羥基化，生成6-羥基褪黑激素而排出體外，所以其半衰期短(約40分鐘)，需要反復(fù)多次給藥才能維持所需要的治療濃度。褪黑激素的抗氧化作用為直接清除自由基，其通過受體介導(dǎo)的作用就成了副作用，例如嗜睡等。因而褪黑激素具有半衰期短，有一定的副作用的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的目的就是為了克服褪黑激素的半衰期短、存在一定的毒副作用的缺點(diǎn)，提供一種具有較強(qiáng)自由基清除作用、半衰期較長、毒副作用較低的化學(xué)物質(zhì)、其制劑、生產(chǎn)工藝及該化合物在醫(yī)用抗氧劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明為以下化合物(I)， 名稱為N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺，又即3-乙酰胺基乙基-5，6-二甲氧基吲哚。與褪黑激素相比，在吲哚環(huán)上第6位引入甲氧基取代原來的氫原子。化合物(I)分子量為262，為淡黃色結(jié)晶，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙腈等有機(jī)溶劑，溶于有機(jī)溶劑后其在水中的溶解度可增高1000倍以上。
本發(fā)明的化合物(I)以5，6-二甲氧基吲哚作為合成起始物，經(jīng)四步合成而得。如采用直接在褪黑激素分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，定向在吲哚環(huán)第6位引入甲氧基，由于空間效應(yīng)及電子效應(yīng)，此基團(tuán)更易在其它部位取代，而得不到目標(biāo)物或其生產(chǎn)率極低。
該四步分述如下第一步3-二乙氨甲基-5，6-二甲基吲哚的合成
取5-6-二甲氧基吲哚，溶于醇中，在低溫下配制醋酸與二乙胺溶液混合后呈微酸性，加入甲醛溶液，攪拌，將其倒入5，6-二甲氧基吲哚醇溶液中，攪拌，加入強(qiáng)堿水溶液，用有機(jī)溶劑提取，經(jīng)洗脫、干燥，得油狀物。
第二步3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚的合成 將第一步的合成物溶于甲醇，二甲基甲酰胺，水，氰化物(如氰化鈉或氰化鉀)混合液中，緩慢滴加一碘甲烷，靜置，攪拌。有機(jī)溶劑抽提。干燥，重結(jié)晶，得結(jié)晶物。
第三步5，6-二甲氧基色胺的合成 采用液氨，130大氣壓下，采用鎳-氫催化劑，在120～130℃合成；或采用鈉+醇法，在3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚的乙醇或甲醇溶液中加入鈉，合成；或者通過四氫鋁鋰還原法制備5，6-二甲氧基色胺，生成物用有機(jī)溶劑提取，結(jié)晶，干燥，得結(jié)晶物。
第四步N-乙酰-5，6-二甲基氧基色胺(化合物I)的合成采用胺的乙酰化反應(yīng)，采用酸酐或酰鹵(如酰氯)酰化法。生成物用有機(jī)溶劑溶解，用水溶液清洗，抽真空揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，用苯純化，即得終產(chǎn)物。
終產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜分析以及核磁共振結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見

圖1、圖2，其中圖1為終產(chǎn)物的電子轟擊質(zhì)譜圖，圖2為終產(chǎn)物的H1核磁共振圖譜，證實(shí)其結(jié)構(gòu)式為化合物(I)。
本發(fā)明的化合物(I)在褪黑激素分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，在其關(guān)鍵性的吲哚環(huán)第6位碳原子上引入了一個(gè)甲氧基，從而導(dǎo)致了整個(gè)吲哚環(huán)電負(fù)性增加，使其捕獲自由基的能力大大加強(qiáng)，并由于吲哚環(huán)第6位已被甲氧基所占領(lǐng)，推測專一性強(qiáng)的羥化酶的作用被阻斷，從而代謝減慢，半衰期延長。同時(shí)由于關(guān)鍵部位結(jié)構(gòu)的改變，推測其與受體的親和力下降，其副作用也相應(yīng)地減少。因而化合物(I)與褪黑激素相比，具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明考察了化合物(I)的羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)及神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺羥基的自由基清除實(shí)驗(yàn)羥基自由基(OH)為生物體內(nèi)反應(yīng)最劇烈、毒性最大的氧化自由基。許多疾病如神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、老年性癡呆(帕金森綜合癥)、心血管系統(tǒng)的疾病、腫瘤、愛滋病及衰老都與其有直接和間接的關(guān)系。OH·的半衰期非常短，大約10-9秒左右，目前還無法直接測定OH·，但可用電子自旋捕獲劑，例如5，5-dimethylpyrroline N-oxide(DMPO)來捕獲OH·，形成較穩(wěn)定的DMPO與OH·的加成物(DMPO-OH)。然后可用高壓液相及電-化學(xué)檢測器來測定DMPO-OH的量，用以推測OH·的生成量，為了測定N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺羥基自由基清除能力，采用了下述的OH·生成系統(tǒng)，即用短波紫光(波長254nm)光解雙氧水，使一個(gè)分子的雙氧水光解成兩個(gè)分子的OH·，其化學(xué)表達(dá)式如下
在此羥基自由基系統(tǒng)中加入等量的DMPO以及不同濃度的N-乙酰-5，6-二甲基氧基色胺，然后測定DMPO-OH的生成，結(jié)果顯示N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺顯著地抑制DMPO-OH的生成，即具有顯著的羥自由基清除作用(圖3)，其抑制作用呈劑量依賴性(圖4)。半數(shù)抑制劑量IC50為17微摩爾濃度，其自由基清除作用優(yōu)于目前所公認(rèn)的內(nèi)源性的自由基清除劑褪黑激素(IC5021微摩爾濃度)。
神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Kainic Acid(KA)是一種神經(jīng)毒素，能過度地激活腦細(xì)胞興奮性氨基酸受體，產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致神經(jīng)原的損傷與死亡。所以KA常被用于誘導(dǎo)腦細(xì)胞損傷模型，為了探討N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺(化合物I)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，設(shè)計(jì)并完成了如下的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法40只CD2-F1小鼠，雄性，體重26～28克，喂養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，自由進(jìn)食與飲水，室溫22℃左右，光照條件為白天12小時(shí)，黑夜12小時(shí)，即清晨7時(shí)開燈，下午19時(shí)關(guān)燈，由電腦控制室溫與光照。
將小鼠隨機(jī)分為3組，第1組(即KA組)小鼠15只，給予皮下注射KA 40mg/kg體重。第2組[即KA+化合物(I)]小鼠15只，預(yù)先腹腔注射化合物(I)乙醇、水溶液(乙醇∶水比例為1∶500)5mg/kg體重，10分鐘后再皮下注射KA 40mg/kg體重，劑量與第1組相同。第3組(即空白對(duì)照組)10只小鼠僅皮下注射等容積的生理鹽水作為正常對(duì)照觀察。
各組動(dòng)物觀察指標(biāo)均為強(qiáng)直性痙攣、抽搐和死亡數(shù)，并用生化的方法測定腦組織脂質(zhì)過氧化物(LPO)的形成。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果第1組小鼠15只全部出現(xiàn)了強(qiáng)直性痙攣及抽搐，其中6只死亡。第2組僅3只動(dòng)物出現(xiàn)強(qiáng)直性痙攣，6只動(dòng)物出現(xiàn)抽搐，但無一死亡(圖5)。
每組余下的小鼠各取6只，在3天后斷頭處死，處死后立即取出整個(gè)腦組織于-80℃低溫冰凍保存，然后用整個(gè)腦組織均漿，按常規(guī)的方法檢測腦組織脂質(zhì)過氧化物的生成量。結(jié)果第1組(KA組)動(dòng)物腦組織脂質(zhì)過氧化物含量顯著增加，此增加與對(duì)照組比較，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而第2組動(dòng)物預(yù)先注射化合物(I)，其腦組織脂質(zhì)過氧化物的含量維持在與對(duì)照組相同的水平(圖6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果再一次顯示KA皮下注射40mg/kg體重可使實(shí)驗(yàn)小鼠大腦海馬CA3區(qū)椎體神經(jīng)原細(xì)胞(與短期記憶有關(guān)的細(xì)胞)全部壞死，而預(yù)先10分鐘腹腔注射化合物(I)5mg/kg體重，可使95％的CA3區(qū)的椎體神經(jīng)原細(xì)胞得以保存。N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺[化合物(I)]通過抗氧化作用達(dá)到了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞強(qiáng)大的保護(hù)作用，也提示了這一化合物(I)存在著巨大的、潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
通過上述化學(xué)法和初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出化合物(I)具有強(qiáng)大的羥基自由基清除作用，因而，推測在臨床上對(duì)于延緩衰老、預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，包括老年性癡呆、帕金森綜合癥、心臟病、腫瘤的輔助治療、艾滋病的輔助治療等與自由基有關(guān)的疾病具有良好的療效及未見明顯的毒副作用，且半衰期長。
圖面說明圖3為高壓液相(HPLC)圖譜，說明N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺對(duì)DMPO-OH·加成物形成的影響。峰1，2為溶劑前沿，峰3為DMPO-OH·信號(hào)。
A為雙氧水在短波紫外線輻射下光解形成OH·后于DMPO作用，形成加成物后的HPLC圖譜。
B為與A相同的條件下加入了60微摩爾濃度的N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺后的HPLC圖譜。DMPO-OH·形成被明顯抑制。
圖4為N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺對(duì)DMPO-OH·形成抑制作用量效反應(yīng)曲線，資料均從HPLC-電化學(xué)檢測器測定DMPO-OH·所得，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，樣本數(shù)為6。
圖5為N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺對(duì)KA小鼠神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖6為N-乙酰-5，6-二甲基色胺對(duì)KA誘導(dǎo)的腦脂質(zhì)過氧化物形成的影響，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，樣本數(shù)為6。
本發(fā)明所說的化合物(I)可加工成口服劑型，包括片劑、緩釋片劑、膠囊劑、沖劑、口服液，也可加工成注射劑型，包括粉針、注射液，還可加工成外用劑型，如透皮吸收膜劑、膏劑、霜?jiǎng)２捎帽炯夹g(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，加工成上述劑型。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果估計(jì)人體的有效劑量為2～10mg/人/天，每天1～4次。
本發(fā)明的化合物(I)也可加工成外用自由基清除劑，添加入化妝品中，作為防曬劑。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1，化合物(I)的合成第一步3-二乙氨甲基5，6-二甲氧基吲哚的合成1克5，6-二甲氧吲哚，溶于2ml EtOH，冷卻至15℃?zhèn)溆?。配?.4ml 60％的乙酸與0.48克Et2NH溶液，冷卻至5℃，然后加入0.51ml37％的福爾馬林，在5℃溫度下攪拌10分鐘，將其倒入配制好的5，6-二甲氧基吲哚EtOH溶液中。當(dāng)溫度上升至室溫23℃左右，攪拌一小時(shí)，再將此混合液倒入20ml冷卻的一個(gè)當(dāng)量的NaOH溶液中，然后用3份Et2O抽提。抽提物用飽和的NaCl溶液洗脫三次，用Na2SO4干燥，Et2O揮發(fā)后留下油狀的3-二乙氨甲基，5，6-二甲氧基吲哚。
第二步3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚的合成第一步的合成物溶于20ml MeOH，1ml DMF，1ml水與1.4克NaCN混合液中，緩慢滴入2.1ml MeI，靜置1小時(shí)，再攪拌1小時(shí)。將此混合物倒入大量的冷卻的雙蒸水中(400m1)。再用CH2Cl2抽提，抽提物水洗3次，Na2SO4干燥，抽真空除去溶劑，然后用benzene-hexane(1∶1苯-正己烷)再結(jié)晶。產(chǎn)量為0.5克(基于合成起始物產(chǎn)量約為50％)。
第三步5，6-二甲氧基色胺的合成將4ml含有0.52ml 100％H2SO4的THF溶液滴入預(yù)先配制的0.76克LiALH4與20ml THF混合液中，不要移除所沉淀的Li2SO4，緩慢滴入4ml含有0.5g的3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚(30分鐘加完)，攪拌1小時(shí)，加入冰塊破壞過度的氫化物。傾掉大部分的THF上清液(目的是減少在抽提過程中乳化形成)，沉淀的鋁鹽與20％的NaOH起反應(yīng)，形成云霧狀的溶液，由CHCl3抽提，抽提物中仍含有部分THF溶液，用飽和NaCl溶液洗脫3次，Na2SO4干燥，抽真空除去溶劑。剩余物由Et2O-Pentane(1∶1乙醚∶正戊烷)結(jié)晶，然后水洗，干燥后可獲得0.4g純的5，6-二甲氧基色胺(產(chǎn)量約80％)。
第四步N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺的合成將含有0.4g 5，6-二甲氧基色胺的3.2ml C6H6和0.8ml吡啶的混合液冰浴，然后加入0.4ml Ac2O，移除冰浴，攪拌3小時(shí)，抽真空揮發(fā)掉有機(jī)溶劑。用1∶1的CHCl3和EtOAc再溶剩余物，然后用5％的NaHCO3的飽和NaCl溶液交替清洗3次，抽真空揮發(fā)掉有機(jī)溶劑，然后用煮沸的C6H6純化，即得到0.35g化合物(I)(產(chǎn)量約87％)。
制劑的制備取化合物(I)，以1mg/ml的濃度過濾，溶于注射用水中，分裝，滅菌，制備成注射劑。
實(shí)施例2，化合物(I)的合成第一步、第二步同實(shí)施例1。
第三步5，6-二甲氧基色胺的合成取3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚，溶于乙醇中，加入金屬鈉，反應(yīng)1小時(shí)，加入水，除去多余的鈉，加三氯甲烷(氯仿)抽提，用飽和NaCl溶液洗脫，無水硫酸鈉干燥，除去溶劑，重結(jié)晶，即得。
第四步化合物(I)的合成采用 (乙酰氯)取代乙酸酐，其余同實(shí)施例1。
制劑的制備取化合物(I)，加入淀粉或糊精或糖粉或微晶纖維素作稀釋劑，以水或淀粉漿或膠類或羥甲基纖維素作潤濕劑，以干淀粉或羧甲基淀粉鈉或低取代羥丙基纖維素作為崩解劑，以硬脂酸鎂、滑石粉作潤滑劑、助流劑，通過濕法制粒，干燥，加入潤滑劑、助流劑，壓片，即得片劑。劑量為每片含1mg化合物(I)。
實(shí)施例3，化合物(I)的合成。
第一步、第二步同實(shí)施例1。
第三步5，6-二甲氧基吲哚取3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚，在130大氣壓，120～130℃情況下，采用鎳氫催化劑，催化加成，經(jīng)抽提，凈化，制得5，6-二甲氧基色胺。
第四步同實(shí)施例1。
制劑的制備取化合物(I)適量，加聚乙烯醇，加熱，混勻，加氮酮作為透皮吸收促進(jìn)劑，制備成透皮吸收膏劑。
本發(fā)明的化合物(I)的合成的每一步之間相互獨(dú)立，如第三步，即可采用催化加氫法，也可采用鈉加醇法，也可采用四氫鋁鋰還原法，第四步，即可以采用乙酰酐酰基化反應(yīng)，又可以采用酰氯的酰基化反應(yīng)制備。而不限于上述實(shí)施例。
本發(fā)明的化合物(I)的制劑的制備，采用本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，制備成各種劑型，不限于上述實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺用于制備抗氧化自由基藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺用于制備抗氧化自由基藥物，其特征在于將其添加入化妝品中，作為防曬劑。
全文摘要
一種褪黑激素衍生物N－乙酰－5，6－二甲氧基色胺的用于制備抗氧化自由基藥物，其合成分四步，以5，6－二甲氧基吲哚為起始原料，該化合物在制藥上作為醫(yī)用抗氧化劑使用，其半衰期長，未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。
文檔編號(hào)A61P39/00GK1411808SQ0112502
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期1998年3月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月18日
發(fā)明者譚敦憲, 雷特, 顏美婷 申請(qǐng)人:譚敦憲, 雷特, 顏美婷