專利名稱：具有抗腫瘤活性的植物鞘氨醇衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種含有植物鞘氨醇(4-羥雙氫神經(jīng)鞘氨醇)的抗腫瘤劑，具體的是，涉及到一種抗腫瘤劑，它含有一種植物鞘氨醇，是具有抗腫瘤活性的植物鞘氨醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式I作為一種活性成份。 其中R1，R2和R3分別代表一個(gè)氫原子或一個(gè)C1-C8烷基；X代表一個(gè)原子，或一個(gè)原子團(tuán)，該原子團(tuán)由一個(gè)鹵素原子，一個(gè)羥基，一個(gè)烷基磺酸鹽原子團(tuán)或一個(gè)芳基磺酸鹽原子團(tuán)組成。
脂質(zhì)體可通過使用一種或兩三種上述脂類制備。脂質(zhì)體公認(rèn)的是藥物傳遞系統(tǒng)中的一種良載體。當(dāng)藥劑結(jié)合到脂質(zhì)體中時(shí)，藥物的親水部分被封閉在脂質(zhì)體的內(nèi)部水相中，而藥物的疏水部分則插入到脂質(zhì)體的雙層之間。作為一種藥物載體，脂質(zhì)體可準(zhǔn)確地把一種需要的藥物傳遞到生病的部位，既便是少量的藥物也可由脂質(zhì)體傳遞。因此，脂質(zhì)體可極大地減少副作用，例如在大劑量中的多藥物阻力。近來脂質(zhì)體作為一種藥物載體已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到多種領(lǐng)域，例如抗原、基因、醫(yī)藥，包括阿霉素(一種抗腫瘤劑)，兩性霉素B(一種抗真菌劑)，其他化學(xué)藥物以及美容領(lǐng)域(M.Grunaug及其合伙人，歐洲醫(yī)學(xué)研究雜志，1988年第21期，13-19頁；D.S.Alberts，D.J.Garcia，藥物雜志，1997年第54期，30-35頁；F.Braun及其合伙人，移植方法，1988年第30期，1481-1483頁；V.Heinemann及其合伙人，抗微生物制劑化學(xué)療法，1997年第41期，1275-1280頁；N.Weiner及其同伙，藥物目標(biāo)雜志，1994年第2期，405-410頁)。
神經(jīng)鞘脂基以植物鞘氨醇(PhytoS)，神經(jīng)鞘氨醇(SPN)和二羥神經(jīng)鞘氨醇的形式存在于人身中，它們分別是含有18個(gè)碳原子的氨基醇。這些化合物有幾個(gè)立構(gòu)中心，在位置3上排列有D-紅細(xì)胞的是在自然界中發(fā)現(xiàn)的。神經(jīng)鞘氨醇和二羥神經(jīng)鞘氨醇是在人體所有的組織中發(fā)現(xiàn)的，而植物鞘氨醇只存在于人類皮膚的角質(zhì)層。在90年代(二十世紀(jì))早期便開始了對(duì)神經(jīng)鞘氨醇及其衍生物的廣泛研究，當(dāng)發(fā)現(xiàn)這些化合物是蛋白激酶C(PKC)的強(qiáng)力抑制劑時(shí)，對(duì)它們的研究加快了步伐。此外，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)鞘氨醇既便是在低濃度下，也與大多數(shù)細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)(D.J.Bibel及其合伙人，臨床實(shí)驗(yàn)皮膚病學(xué)，1995年第20期，395-400頁；D.J.Bibel，皮膚病研究雜志，1992年第98卷，269-273頁；Y.A.Hannun，科學(xué)雜志，1996年第274卷，1855-1859頁)。這些活性最主要地在角質(zhì)層中展示出來，人們對(duì)植物鞘氨醇的興趣已經(jīng)大大地提高了，然而，它們非常昂貴，并且對(duì)合成它們的衍生物及對(duì)它們的生物活性知之甚少。特別是，公認(rèn)的N，N-二甲基神經(jīng)鞘氨醇(DMS)和N，N，N-鹵化三甲基鞘氨醇(簡稱為TMS·hal)，-神經(jīng)鞘氨醇的衍生物—在它們抑制蛋白激酶方面要優(yōu)于神經(jīng)鞘氨醇，而且還已知它們?cè)隗w內(nèi)和在玻璃試管內(nèi)都能抑制各種癌細(xì)胞的生長。此外，還發(fā)現(xiàn)TMS·hal在老鼠的B16/BL6黑素瘤細(xì)胞系中具有一種抗腫瘤活性和抗轉(zhuǎn)移活性，在此實(shí)驗(yàn)中使用了脂質(zhì)體三甲基鞘氨醇，其中卵磷脂(PC)∶膽固醇(chol)∶TMS·hal的克分子比是4.5∶4.5∶1。但是，需要相對(duì)大量的TMS·hal(例如每個(gè)老鼠大約0.1-0.3毫克)來展示上述作用，這往往導(dǎo)致副作用，例如血細(xì)胞溶解，血紅蛋白尿和發(fā)炎反應(yīng)。通過使用脂質(zhì)體技術(shù)對(duì)解決這些毒性做了很大的努力，結(jié)果表明，脂質(zhì)體的TMS·hal顯示無毒性，并且與未使用脂質(zhì)體的TMS·hal相比，在體內(nèi)系統(tǒng)中，在抑制癌細(xì)胞的生長和抗轉(zhuǎn)移方面更為有效(Y.S.Park，S.Hakomori，S.Kawa，F(xiàn).Ruan，和Y.Igarashi，癌研究，1994年第54期，2213-2217頁)。
有一份關(guān)于植物鞘氨醇——其結(jié)構(gòu)非常類似于神經(jīng)鞘氨醇—的報(bào)告，揭示了由于一種輔助脂質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致了在體內(nèi)系統(tǒng)KK-1，COS-7和MSC-1細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)變感染效率的差異(T.Paukku及其同伙，化學(xué)物理療法的脂類，1997年第87期，23-29頁)。另外，還已知植物鞘氨醇對(duì)于廣泛的微生物具有優(yōu)異的抗微生物活性，并且通過分泌白細(xì)胞介素作為一種蛋白激酶的抑制劑來減輕對(duì)皮膚的刺激。N，N，N-鹵化三甲基植物鞘氨醇(TMP·hal)是植物氨醇的一種衍生物，這是最近公布的(韓國未經(jīng)檢驗(yàn)的專利號(hào)1999-78610)，其中的衍生物是作為一種美容組分描述的，其用途局限于保護(hù)皮膚。然而沒有先例表明TMP·hal是一種抗腫瘤劑。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所涉及到的一種抗腫瘤劑，它含有一種如下面結(jié)構(gòu)式(I)的植物鞘氨醇衍生物作為活性成份。

在上面的結(jié)構(gòu)式I中，R1，R2和R3分別代表一個(gè)氫原子或一個(gè)C1-C8烷基；X代表一個(gè)原子或一個(gè)原子團(tuán)，它含有一個(gè)鹵素原子，一個(gè)羥基，一個(gè)烷基磺酸鹽原子團(tuán)或一個(gè)芳基磺酸鹽原子團(tuán)。
本發(fā)明的抗腫瘤劑含有以脂質(zhì)體或一種乳化液形式存在的上述植物鞘氨醇衍生物，除了植物鞘氨醇衍生物以外，也可含有其他成份，例如抗血管生成劑或阿霉素，—一種具有細(xì)胞毒素的抗腫瘤劑。
本發(fā)明涉及到一種抗腫瘤劑，它含有如以上結(jié)構(gòu)式(I)的一種植物鞘氨醇衍生物(以下簡稱為TMP)，這種衍生物是以一種脂質(zhì)體或一種乳化劑的形式制造的。作為本發(fā)明的一種TMP，擇優(yōu)的是使用N，N，N-鹵化三甲基植物鞘氨醇(TMP·hal)，更擇優(yōu)的是使用N，N，N-碘化三甲基植物鞘氨醇(TMP·I)。
在本發(fā)明中以各種成份制備了抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體。結(jié)果表明脂質(zhì)體的DPPC/Chol/TMP或DPPC/Chol/PEGPE/TMP成份在與一種抗血管生成劑結(jié)合使用時(shí)，具有優(yōu)異的抗轉(zhuǎn)移活性，并且在抗轉(zhuǎn)移活性中還有一種協(xié)同作用效果。脂質(zhì)體的DPPC/Chol/TMP成份不僅能抑制向肺部的轉(zhuǎn)移，而且它們也抑制LLC(路易斯肺癌)癌細(xì)胞的生長。
在本發(fā)明中，把細(xì)胞毒性抗癌藥物與抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體結(jié)合使用，則抗轉(zhuǎn)移的作用得到加強(qiáng)。例如當(dāng)阿霉素與TMP脂質(zhì)體一起使用時(shí)，要比單獨(dú)使用阿霉素具有更強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)移作用。
在本發(fā)明中，使用了人類的肝臟瘤細(xì)胞系和老鼠黑素瘤細(xì)胞系檢驗(yàn)TMP脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果表明TMP在人類肝臟腫瘤細(xì)胞中有細(xì)胞毒性，而在老鼠黑素瘤細(xì)胞中無細(xì)胞毒性。在老鼠中做了急性毒性實(shí)驗(yàn)，并未觀察到毒性效果。
本發(fā)明的抗腫瘤劑含有一種如結(jié)構(gòu)式I的植物鞘氨醇衍生物作為一種活性劑，最終的制劑可以是下列形式粉末，顆粒，膠囊，以及把它與配藥可接受的載體，一種賦形劑和一種稀釋劑混合起來注射。可以口服投藥，也可以胃腸外投藥，如果把藥劑制成一種乳化液或脂質(zhì)體型以后投藥，則生物有效性更為有效。
本發(fā)明的抗腫瘤劑的劑量可根據(jù)身體吸收率、體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、投藥間隔、投藥方法、排泄率、疾病嚴(yán)重程度及類似情況的變化而變化。擇優(yōu)的劑量是大約每公斤體重0.5-1毫克。抗腫瘤劑的制備應(yīng)考慮劑量的有效范圍，這樣制備的單位制劑可以在一定的時(shí)間間隔內(nèi)投藥幾次，或根據(jù)一個(gè)專家的決定，以一種特殊的劑量方法制備，該專家是根據(jù)受治療者(或受實(shí)驗(yàn)者)的要求，負(fù)責(zé)醫(yī)療的監(jiān)視和觀察的。
盡管結(jié)合本發(fā)明具有一定程度特殊性的擇優(yōu)方案對(duì)本發(fā)明做了描述，但擅長工藝的人應(yīng)理解只有通過下面例子的方法才能得到本發(fā)明的擇優(yōu)產(chǎn)品，并且在成份的結(jié)構(gòu)、組合和排列方面的細(xì)節(jié)可以采取多種變化而不離開本發(fā)明的精神和范圍。
圖2示出TMP·I脂質(zhì)體和TMP·I乳化液的抗轉(zhuǎn)移活性的照片，其中的TMP·I脂質(zhì)體和TMP·I乳化液均含有抗血管生成的化合物。
圖3示出TMP·I脂質(zhì)體和一種抗腫瘤劑—阿霉素之間的關(guān)系的照片。
圖4是一張示出一種含有TMP·I的陽離子脂質(zhì)體的細(xì)胞毒素的圖。
圖5是一張示出在4℃的溫度下儲(chǔ)存的含有TMP衍生物的乳化液和各種脂質(zhì)體的穩(wěn)定性的圖。
例1N，N，N-碘化三甲基植物鞘氨醇(TMP·I)的合成向3毫升甲醇中加入0.30克植物鞘氨醇(0.946毫升)，0.523克K2CO3(3.79毫克分子)和0.298毫升碘代甲烷(4.73毫克分子)，在50℃的溫度下攪拌反應(yīng)混合物達(dá)4小時(shí)。在減壓下對(duì)溶劑進(jìn)行蒸發(fā)，并向所得到的混合物中加入4毫升蒸餾水。用8毫升乙酸乙酯對(duì)溶液進(jìn)行萃取，然后干燥(Na2SO4)，過濾。蒸發(fā)乙酸乙酯，得到0.26克白色固體產(chǎn)品。
成品率76％熔點(diǎn)210-213℃IR(KBr)ν最大3309(OH)，2918，2850(C-H)cm-11H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ3.95(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，3.89(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，3.76(d，1H，J＝8.7Hz)，3.6(dd，1H)，3.11(s，9H，N+CH3)，1.68(m，1H，CH2)，1.48(m，1H，CH2)，1.23(s，24H，CH2)，0.84(t，3H，CH3)ppm13C NMR(600MHz，DMSO-d6)δ76.80，71.01，55.69，52.18，33.21，31.21，30.60，29.15，29.03，28.99，28.93，28.62，24.87，22.00，13.84ppmMS(FAB，甘油，m/z)361(M+)。
例2N，N，N-三甲基植物鞘氨醇對(duì)一甲基磺酸鹽的合成向5毫升甲醇中加入0.5克植物鞘氨醇(1.575毫克分子)，1.612克K2CO3(9.449毫克分子)和1.188毫升甲基對(duì)一甲苯磺酸鹽(對(duì)一甲苯磺酸甲酯)(7.874毫克分子)，在50℃的溫度下攪拌混合物達(dá)3個(gè)小時(shí)。在減壓下對(duì)溶劑進(jìn)行蒸發(fā)，在所得到的混合物中加入5毫升蒸餾水。用10毫升乙酸乙酯萃取溶液，然后干燥(Na2SO4)，過濾。蒸發(fā)掉乙酸乙酯，得到0.46克白色固體產(chǎn)品。
成品率55％熔點(diǎn)185-186℃IR(KBr)ν最大3326(OH)，2920，2852(C-H)cm-11H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.70(d，2H，arom H，J＝8.2Hz)，7.23(d，2H，arom H，J＝8.0Hz)，4.16(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，4.09(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，3.89(d，1H，J＝8.7Hz)，3.73(dd，1H)，3.44(t，1H)，3.21(s，9H，N+CH3)，2.37(s，3H，PhCH3)，1.81(m，1H，CH2)，1.58(m，1H，CH2)，1.29(s，24H，CH2)，0.90(t，3H，CH3)ppm13C NMR(500MHz，CD3OD)δ142.07，140.16，128.31，125.45，76.73，71.56，56.09，52.21，33.25，31.56，29.28，29.26，28.96，25.03，22.22，19.81，12.93ppm例3脂質(zhì)體的制備(1)多層囊泡(MLV)和小型單層囊泡(SUV)的制備把磷脂加入到玻璃瓶中，并用有機(jī)溶劑(CHCl3)溶解。使用一種氮?dú)饣蛞环N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器把溶劑完全除掉，在玻璃瓶內(nèi)形成一種脂質(zhì)薄膜。然后加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，在室溫下輕輕地?fù)u動(dòng)，以便達(dá)到足夠的水合程度，然后劇烈地旋轉(zhuǎn)混合物(使之成旋渦狀)，以便使磷脂的脂質(zhì)薄膜擴(kuò)散，最終形成多層囊泡(MLV)。
通過使用一個(gè)超聲波降解器把得到的MLV轉(zhuǎn)變成小型單層囊泡。此外，使用一臺(tái)擠出機(jī)(此機(jī)在以后的實(shí)驗(yàn)中還要用到)，在高壓下使SUV通過一個(gè)適合的聚碳酸鹽薄膜過濾器，可以制出所需要規(guī)格的脂質(zhì)體。
(2)抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體的制備按下述方法制備含有各種磷脂和TMP—一種抗轉(zhuǎn)移化合物——的脂質(zhì)體。
把TMP和DOPE—一種自然的類脂體—以1∶1(重量/重量)的比率混合起來，溶解在一個(gè)裝有有機(jī)溶劑的20毫升的玻璃瓶中，然后，在存在氮?dú)獾那闆r下，在減壓下進(jìn)行蒸發(fā)，在生成脂質(zhì)薄膜時(shí)，把薄膜完全干燥，用蒸餾水或5％的葡萄糖進(jìn)行水合，通過旋轉(zhuǎn)或超聲波降解制備出陽離子脂質(zhì)體。把TMP加入到含有70％的卵磷脂(PC)；一種1∶1克分子比率的100％卵磷脂和膽固醇(Chol)的混合物；一種1∶1克分子比率的二棕櫚酰卵磷脂(DPPC)和膽固醇(Chol)的混合物；一種克分子比率為5∶5∶1的DPPC，Chol和PE-PEG(磷脂酰乙醇胺—聚乙二醇)的混合物組成的混合組份中，溶解在一種有機(jī)溶劑中，通過使用一臺(tái)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器完全除掉有機(jī)溶劑，在玻璃瓶內(nèi)形成一種脂質(zhì)薄膜。然后加入磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，在室溫下使薄膜足夠地水合，使磷脂的薄膜擴(kuò)散，然后通過旋轉(zhuǎn)或超聲波降解得到抗轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)體。
例4具有抗轉(zhuǎn)移活性的乳化液的制備及其物理性質(zhì)的測量。
(1)乳化液的制備把70％的卵磷脂和TMP擴(kuò)散到橄欖油中，加入丙三醇和少許非離子活性劑20(吐溫20)，加入蒸餾水，并用超聲波降解，得到一種乳化液。把這樣得到的乳化液通過一個(gè)0.2微米的薄膜過濾器，待用。
(2)脂質(zhì)體和乳化液穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)制備出含有TMP的各種組成成份的脂質(zhì)體和乳化液，并在4℃的溫度下儲(chǔ)存。通過使用一個(gè)分粒器測量脂質(zhì)體規(guī)格的變化，并根據(jù)磷脂的組份測量脂質(zhì)體和乳化液的穩(wěn)定性。
例5體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移的分析使用B16F10黑素瘤細(xì)胞在一個(gè)C57/BL6老鼠身上觀察在體內(nèi)系統(tǒng)中的直接肺轉(zhuǎn)移。從一個(gè)老鼠尾部的靜脈注入各種濃度的黑素瘤細(xì)胞(磷酸鹽緩沖鹽水，2×104，2×105和2×106)，以便確定對(duì)老鼠投放的合適的黑素瘤細(xì)胞的濃度。在注射后的15天，在麻醉之后取出它的肺，檢查到在肺部存在著癌的菌落。
進(jìn)一步，把從上面的實(shí)驗(yàn)中確定的合適的黑素瘤細(xì)胞濃度注入到C57/BL6老鼠的尾部靜脈中，以便檢驗(yàn)上述含TMP的抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體和乳化液的抗轉(zhuǎn)移作用。在注射腫瘤細(xì)胞60-90分鐘之后，把制備的含有250微克TMP的脂質(zhì)體投給每個(gè)老鼠，然后，分別在注射黑素瘤細(xì)胞后的第3天和第6天進(jìn)行第2次和第3次投藥。在需要的時(shí)候，在注射后的第9天進(jìn)行第4次投藥。在15天后將肺取出，檢驗(yàn)出肺部的癌菌落。
例6細(xì)胞毒性和體內(nèi)TMP脂質(zhì)體的毒性的測量使用人類的肝臟腫瘤細(xì)胞系SNU398和老鼠的黑素瘤細(xì)胞系B16F10檢驗(yàn)了TMP脂質(zhì)體對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。把SNU398和B16F10進(jìn)行胰酶消化，然后用無血清的介質(zhì)(RPMI-1640)清洗。再用錐蟲蘭把它們?nèi)旧缓笠?×105個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度涂在一個(gè)有48個(gè)凹坑的板上，然后用各種濃度的含有TMP的陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行處理。在3天之后，再次把它們用錐蟲蘭染色，檢驗(yàn)到能生存的細(xì)胞減少了。
為了檢驗(yàn)TMP脂質(zhì)體的體內(nèi)毒性，通過靜脈注射或腹膜內(nèi)注射的方法把它們注入到老鼠身上，然后檢驗(yàn)老鼠的致死率。
例7抑制癌細(xì)胞在體內(nèi)生長的分析使用路易斯肺癌(LLC)細(xì)胞在BDF1老鼠身上檢驗(yàn)了在體內(nèi)系統(tǒng)中對(duì)癌細(xì)胞生長的抑制。所使用的路易斯肺癌細(xì)胞的濃度是這樣的給每個(gè)老鼠皮下注射1,000,000個(gè)癌細(xì)胞，以便誘發(fā)癌癥。在注射上述的LLC細(xì)胞后的第1天、第3天、第6天和第9天分別通過靜脈注射和腹膜注射的方法注入100毫升TMP脂質(zhì)體(TMP100微克)。作為一種正控制，使AG3340(美國阿古龍醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品)—已知的一種MMP-2抑制劑(matrix metaloproteinasse-2)—懸浮在0.2％非離子活性劑/0.5％羧甲基纖維素的混合液中，得到2毫克懸濁液每天進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。在注射LLC細(xì)胞后的21天，將每個(gè)老鼠以頸椎骨錯(cuò)位的方法殺死，然后檢查癌體積的變化，并拍攝照片。
例8片劑的制備活性成份……1克乳糖……7克晶體纖維……1.5克硬脂酸鎂……0.5克總計(jì)……10克在把上述組份搗成碎片之后，再把它們混合起來，通過直接制成片劑的方法把它們制成片劑，每片的總量為500毫克，其中活性成份為50毫克。
例9散劑(粉末)的制備活性成份……1克玉米淀粉……5克羧基纖維……4克總計(jì) ……10克在把它們搗成碎片之后，再把它們混合起來，然后制成粉末狀的散劑，把500毫克粉末裝入一個(gè)軟膠囊中，便可制成膠囊制劑。實(shí)驗(yàn)例1首先，檢驗(yàn)在體內(nèi)系統(tǒng)中TMP·I的抗轉(zhuǎn)移活性。對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的檢驗(yàn)是在不同的4組老鼠中進(jìn)行的，這4組老鼠具有不同的B16F10黑素瘤細(xì)胞濃度，分別是2×104，2×105，2×106和PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)，以便確定適合于觀察癌轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞數(shù)目。在老鼠的尾部靜脈內(nèi)注射后的15天，取出老鼠的肺并加以檢驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從注射2×106B16F10黑素瘤細(xì)胞濃度的一組老鼠身上得到的肺的尺寸長大了，最后形成了大量的菌落。相反，從以2×104和PBS處理的一組中得到的肺在尺寸上未顯示出明顯的變化，同時(shí)也未顯示出癌菌落的生成，而從以2×105處理的一組得到的肺顯示出少量的菌落存在著，并且菌落的數(shù)目持續(xù)地增加，直到處理后的第21天之后為止。因此，對(duì)于TMP·I抗轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)來說，黑素瘤細(xì)胞的適合濃度確定為2×105。
在注射B16F10之后的第1天、第3天和第6天分別給每組實(shí)驗(yàn)的老鼠投300微克的TMP·I衍生物。在注射后的第15天得到的肺比一個(gè)控制組中的老鼠的肺小，并且菌落數(shù)也顯著地減少(表1)。
表1.DOPE/TMP脂質(zhì)體抗轉(zhuǎn)移活性的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例2根據(jù)不同的組分檢驗(yàn)了TMP·I的抗轉(zhuǎn)移活性。把TMP·I加入到70％卵磷脂和100％卵磷脂/膽固醇(Chol)(1∶1克分子比)的混合物中，用于抗轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。從C57BL老鼠的尾部靜脈注入2×105濃度的B16F10黑素瘤細(xì)胞。在注射黑素瘤細(xì)胞后的1小時(shí)用250微克含有TMP·I的脂質(zhì)體對(duì)老鼠進(jìn)行處理，在第二次注射黑素瘤細(xì)胞后的第3天用250微克含TMP·I的脂質(zhì)體對(duì)老鼠進(jìn)行處理，在第3次注射黑素瘤細(xì)胞后的第7天以250微克含脂質(zhì)體的TMP·I對(duì)老鼠進(jìn)行處理。在第一次注入黑素瘤細(xì)胞后的第15天，通過把老鼠的頸椎骨錯(cuò)位的方法把老鼠殺死，然后從每組老鼠身上取出肺，并比較菌落數(shù)(表2)。表2.含有70％卵磷脂和含有100％卵磷脂的TMP·I脂質(zhì)體的抗轉(zhuǎn)移活性的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例3使用含70％卵磷脂的脂質(zhì)體組份檢驗(yàn)TMP·I濃度的抗轉(zhuǎn)移活性。除了70％的卵磷脂外，還加入了膽固醇，以便增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。以含有70％卵磷脂、膽固醇和TMP·I混合物的脂質(zhì)體進(jìn)行抗轉(zhuǎn)移活性的實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果表明含有50微克TMP·I的脂質(zhì)體具有60％以上的抗轉(zhuǎn)移活性(

圖1和表3)。相反，含有250微克TMS(三甲基神經(jīng)鞘氨醇)的常規(guī)TMS脂質(zhì)體顯示出大約50％的抗轉(zhuǎn)移活性(Y.S.Park及其同伙，癌癥研究，1994年第54期，2213-2217頁)。這樣，結(jié)果證明含TMP·I脂質(zhì)體的抗轉(zhuǎn)移作用優(yōu)于TMS脂質(zhì)體。
表3.根據(jù)不同的TMP·I含量確定的抗轉(zhuǎn)移活性

實(shí)驗(yàn)例4根據(jù)不同的組份檢驗(yàn)了各種抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體的抗轉(zhuǎn)移活性，并檢驗(yàn)了加抗血管生成劑(AG3340，美國阿古龍醫(yī)藥公司產(chǎn)品)的脂質(zhì)體的抗轉(zhuǎn)移活性(表4)。通過以4∶4∶1的重量比混合卵磷脂/膽固醇/植物鞘氨醇制成控制脂質(zhì)體。脂質(zhì)與藥物的比保持在20∶1的重量比。在下面的表4中示出脂質(zhì)體的組份和作用。投藥的TMP·I和藥物(抗血管生成藥)的濃度都定在100微克。在給定的脂質(zhì)體中，不管藥物(抗血管生成藥)的存在與否，TMP·I的濃度都保持相同。
除了在注射黑素瘤細(xì)胞之后的第1小時(shí)，第3天、第6天和第9天分4次投脂質(zhì)體外，實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行與例5中的方法相同。結(jié)果表明在含有植物鞘氨醇的脂質(zhì)體的控制組內(nèi)，菌落數(shù)稍有減少，然而，作用并不明顯。當(dāng)投用DPPC脂質(zhì)體加上一種藥物(一種抗血管生成藥)時(shí)，顯示出幾乎很小的抗轉(zhuǎn)移效果。但是，當(dāng)投用含有TMP·I的脂質(zhì)體加上一種藥物(一種抗血管生成藥)時(shí)，菌落數(shù)明顯地減少到少于15個(gè)計(jì)數(shù)。當(dāng)投用(TMP·I加上PEG)脂質(zhì)體時(shí)，這種脂質(zhì)是將10％的PEG-PE加入到含TMP·I的脂質(zhì)體中制成的，這樣投用增加了脂質(zhì)體在血液中的滯留時(shí)間，觀察到了類似的優(yōu)越性(圖2)。
表4.含TMP·I脂質(zhì)體加入抗血管生成劑的協(xié)同抗轉(zhuǎn)移活性的檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)例5使用一種乳化液測量抗轉(zhuǎn)移活性，這種乳化液是由具有抗轉(zhuǎn)移活性的一種TMP·I衍生物制成的。除了抗轉(zhuǎn)移乳化液是以腹膜內(nèi)投藥外，實(shí)驗(yàn)按實(shí)驗(yàn)例4的方法進(jìn)行。從未經(jīng)處理的一組(一個(gè)控制組)得到的肺與那些經(jīng)TMP·I乳化液處理的老鼠的肺相比較。結(jié)果示出在控制組中的老鼠的菌落數(shù)為250，而以TMP·I乳化液處理過的組的菌落數(shù)為70±20。這個(gè)值的含義是抗轉(zhuǎn)移活性大于70％(圖2)。實(shí)驗(yàn)例6把含有轉(zhuǎn)移活性的TMP·I脂質(zhì)體(DPPC/Chol/TMP·I＝5∶5∶1克分子比投給接種了路易斯肺癌(LLC)細(xì)胞的BDF1老鼠，觀察到了它們對(duì)癌腫瘤生長的抑制效果。所使用的LLC癌細(xì)胞的濃度是每個(gè)老鼠一百萬個(gè)癌細(xì)胞，通過皮下注射誘發(fā)腫瘤。皮下注射后的第1天，給每個(gè)老鼠靜脈注射和腹膜內(nèi)注射TMP·I脂質(zhì)體(TMP·I含量100微克)。在皮下注射后的第3天、第6天和第9天，給每個(gè)老鼠重復(fù)地皮下注射相同的劑量，在注射后的第21天用把老鼠頸椎骨錯(cuò)位的方法殺死每個(gè)老鼠，用下面的公式測量癌的體積，在下面的表5中示出測量的結(jié)果。[公式1](癌的長軸)×(癌的短軸)2/2表5.TMP·I脂質(zhì)體和AG3340(一種正控制)的投藥途徑和劑量數(shù)，以及對(duì)癌生長的抑制結(jié)果

如上表所示，在一個(gè)控制組中，癌生長的體積非常大，并顯示出在癌區(qū)周圍有一種活動(dòng)的血管生成進(jìn)程。在腹膜內(nèi)注射TMP·I脂質(zhì)體的組中，癌的體積顯著地減小，血管生成的進(jìn)程也大大地惡化。同時(shí)，在另一個(gè)組中，把2000微克的AG3340—一種MMP-2抑制劑—懸浮到非離子活性劑/羧甲基纖維混合液中，然后在20天內(nèi)，每天都給老鼠注射，癌的體積并未大大縮小；也就是說，當(dāng)AG3340，一種正控制，做腹膜內(nèi)注射時(shí)，癌的體積只減小了大約30％。相反，當(dāng)TMP脂質(zhì)體做腹部注射時(shí)，癌的體積減小大約85％，而將TMP脂質(zhì)體做靜脈注射時(shí)，癌的體積減小大約60％。實(shí)驗(yàn)例7用B16F10黑素瘤細(xì)胞，檢驗(yàn)TMP·I脂質(zhì)體和阿霉素—具有細(xì)胞毒性劑的常規(guī)抗腫瘤劑—對(duì)老鼠癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。給每個(gè)老鼠靜脈注射2×105個(gè)黑素瘤細(xì)胞，在注射后，立即投用33微克阿霉素，并且在靜脈注射黑素瘤細(xì)胞后的第3天、第6天和第9天也分別投入相同劑量的阿霉素，在另一組中投用25微克阿霉素加上TMP·I脂質(zhì)體。結(jié)果表明，投用TMP·I脂質(zhì)體加阿霉素要比單獨(dú)投用阿霉素在抗轉(zhuǎn)移方面更有效，即使使用的阿霉素的量少一些也是如此(圖3)實(shí)驗(yàn)例8制備兩種不同類型的TMP·I脂質(zhì)體，以便檢驗(yàn)體內(nèi)毒性和細(xì)胞毒性。兩種含TMP·I陽離脂質(zhì)體—DOPE/TMP和DPPC/Chol/TMP脂質(zhì)體用來檢驗(yàn)它們對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。所使用的肝臟腫瘤細(xì)胞系是人類的肝臟腫瘤細(xì)胞系SNU398和老鼠黑素瘤細(xì)胞系B16F10。以不同的濃度制備出陽離子脂質(zhì)體(TMP·I∶DOPE＝1∶1重量比)，然后檢驗(yàn)了它們對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用(圖4)。結(jié)果表明在老鼠黑素瘤細(xì)胞系內(nèi)未觀察到細(xì)胞毒性作用(高達(dá)200微克)，當(dāng)肝臟腫瘤細(xì)胞系經(jīng)12.5微克的TMP·I脂質(zhì)體處理過后，觀察到一些癌細(xì)胞的死亡，當(dāng)用100微克的TMP·I脂質(zhì)體處理之后，幾乎所有的癌細(xì)胞均死亡。在SNU癌細(xì)胞的情況下，LD50是25微克(圖4)。
當(dāng)對(duì)老鼠腹膜內(nèi)注射2000微克的含TMP·I陽離子脂質(zhì)體，并且在第一次注射后的第3天和第6天分別重復(fù)地進(jìn)行相同的注射時(shí)，在第一次注射后的第15天進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察到老鼠仍然活著。此外，當(dāng)按上面的方式以1000微克的DPPC/Chol/TMP·I脂質(zhì)體給老鼠做靜脈注射時(shí)，在第一次注射后的第15天進(jìn)行檢驗(yàn)，它們也仍然活著(表6)。
表6.含TMP·I脂質(zhì)體的體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)例9使用一個(gè)臺(tái)分粒器3000，根據(jù)脂質(zhì)體和乳化液的規(guī)格的變化，檢驗(yàn)了保持在4℃的抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體和抗轉(zhuǎn)移乳化液的穩(wěn)定性。結(jié)果示出陽離子TMP·I脂質(zhì)體在蒸餾水和5％的葡萄糖溶液中穩(wěn)定。如果是PC基的脂質(zhì)體，含DPPC和PEG-PE的脂質(zhì)體最穩(wěn)定，乳化液在兩個(gè)月的期間內(nèi)也顯示穩(wěn)定(圖5)。
如上所示，本發(fā)明提供了含有TMP的多功能脂質(zhì)體，如結(jié)構(gòu)式I的一種植物鞘氨醇衍生物，它不僅能抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長，并且當(dāng)與另一種抗腫瘤劑結(jié)合使用時(shí)，還能使抗轉(zhuǎn)移作用達(dá)到最佳程度。和常規(guī)的脂質(zhì)體不同的是，這些抗轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體可單獨(dú)展示出抗轉(zhuǎn)移活性，因而，它們?cè)诳鼓[瘤劑的傳遞系統(tǒng)中將是非常有用的，而且也能夠減少給定的抗腫瘤劑的劑量水平。
權(quán)利要求
1.一種具有抗腫瘤活性的植物鞘氨醇衍生物，含有一種結(jié)構(gòu)式(I)的植物鞘氨醇衍生物作為一種活性成份。 其中R1，R2和R3分別代表一個(gè)氫原子或一個(gè)C1-C8烷基；X代表一個(gè)原子或一個(gè)原子團(tuán)，該原子團(tuán)含有一個(gè)鹵素原子，一個(gè)羥基，一個(gè)烷基磺酸鹽原子團(tuán)或一個(gè)芳基磺酸鹽原子團(tuán)。
2.按照權(quán)利要求1所述的植物鞘氨醇衍生物，其特征是該植物鞘氨醇衍生物是N，N，N-鹵化三甲基植物鞘氨醇。
3.按照權(quán)利要求1所述的植物鞘氨醇衍生物，其特征是該植物鞘氨醇衍生物含在脂質(zhì)體或乳化液中。
4.按照權(quán)利要求1所述的植物鞘氨醇衍生物，其特征是含有一種抗血管生成活性的物質(zhì)或一種細(xì)胞毒性癌藥物加上該植物鞘氨醇衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤活性的植物鞘氨醇衍生物，更具體的是，涉及到一種含有結(jié)構(gòu)式I的一種植物鞘氨醇衍生物作為活性成分的抗腫瘤劑。其中R
文檔編號(hào)A61K31/21GK1403439SQ01125299
公開日2003年3月19日 申請(qǐng)日期2001年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者南宮成鍵, 樸宣怡 申請(qǐng)人:蟬真有限公司