專利名稱：曼得利特制備治療人獸弓形蟲病的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及曼得利特治療人獸共患弓形蟲病的新用途。
弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種寄生于人和多種動物(190余種)有核細(xì)胞內(nèi)的專性寄生原蟲，引起人和動物弓形蟲病(Toxoplasmosis)，感染和流行極為普遍。據(jù)調(diào)查，歐美國家人群血清陽性率為25—50％，高者可達(dá)80％以上，據(jù)Kean綜合世界文獻(xiàn)，估計(jì)全球人類弓形蟲平均感染率為33％，感染人數(shù)約為10—12億。國內(nèi)調(diào)查，其感染率為4—35.7％，平均感染率為5.17％，家畜感染率達(dá)10—50％。我國6000多萬人為弓形蟲感染者。孕婦感染弓形蟲可通過胎盤垂直傳播給胎兒，導(dǎo)致胎兒畸形。資料表明，有近1/1000的新生兒有先天性弓形蟲感染，嚴(yán)重影響優(yōu)生優(yōu)育和人口素質(zhì)。在艾滋病患者中，弓形蟲病流行占10％左右，是艾滋病等免疫缺陷病的致死因素之一。同時(shí)，弓形蟲感染還與惡性腫瘤、器官移植、免疫功能低下及長期應(yīng)用免疫抑制者有關(guān)。因此，弓形蟲病對人類健康和畜牧業(yè)的危害極為嚴(yán)重，對其防治日益受到世界各國的關(guān)注。目前對弓形蟲病的治療仍以磺胺嘧啶或乙胺嘧啶為主(世界衛(wèi)生組織推薦藥物)，但其毒副作用(抑制骨髓、損害肝臟、致畸、過敏等)而限制了推廣和應(yīng)用螺旋霉素常用于孕婦弓形蟲病的治療，但作用較弱。目前仍無理想的特效藥物。因此，尋找和研究高效低毒的抗弓形蟲新藥非常必要。
本發(fā)明的目的在于克服目前治療弓形蟲病常用藥物磺胺嘧啶和乙胺嘧啶存在的缺點(diǎn)，為曼得利特制備的藥物提供一種新用途，并為防治弓形蟲病提供一種新藥制劑。
曼得利特的原料藥曼得利酸是從薔薇科植物桃樹(runus persica(L.)Batsch)的葉子中用普通工藝提取的天然產(chǎn)物，其化學(xué)名稱2-羥基苯乙酸，已用苯乙酮經(jīng)氯化、重排、冷卻法人工合成，分子式為C8H8O3，結(jié)構(gòu)式為C6H5CH(OH)COOH，分子量為152.14。其鹽結(jié)構(gòu)式為C6H5CH(OH)COOM(M＝Na、K、NH4及有機(jī)胺類等)。
申請人在長期進(jìn)行弓形蟲的研究過程中，首先發(fā)現(xiàn)曼得利特(如鈉、鉀、銨及有機(jī)堿之鹽類等)對弓形蟲有顯著抑制和殺滅作用，對它的抗弓形蟲作用從體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及各種給藥途徑(腹腔注射、口服、靜脈注射等)均做了系統(tǒng)地、動態(tài)地、詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究，并研究了其抗弓形蟲的機(jī)制。
有效成分用曼得利特制備治療人獸共患弓形蟲病的藥物以常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的常規(guī)藥用制劑含作為活性成分的曼得利特，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于胃腸內(nèi)和胃腸外給藥的有機(jī)或無機(jī)的固體或液體賦形劑混合。該藥用制劑可以是固體形式，如片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑，或液體形式如糖漿劑、乳劑及針劑等。
上述制劑中可含輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤濕劑和其它常用的添加劑，如乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸鎂、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、抗壞血酸、粘合劑、羥丙基纖維素等。
上述制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
有效成分用曼得利特制備治療人獸共患弓形蟲病的藥物的用途，所制成的各種劑型的口服藥物，成人口服，每天65毫克左右，所制成的注射藥物，靜脈點(diǎn)滴，成人每天30毫升左右，一周到十天為一個(gè)療程，兒童酌情減量。
下面是申請人作出的曼得利特抗弓形蟲的有關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及其結(jié)果，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明其治療弓形蟲病的有效性。
一、藥效試驗(yàn)1.體外殺蟲和抑蟲試驗(yàn)試驗(yàn)藥物曼得利特試驗(yàn)蟲株RH株弓形蟲(國際公認(rèn)強(qiáng)毒株)試驗(yàn)方法收集感染小鼠腹水，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算蟲數(shù)，用生理鹽水調(diào)整蟲數(shù)至1.5—3.5×107/ml懸液。實(shí)驗(yàn)設(shè)不同濃度藥物組，每組取弓形蟲懸液0.5ml，加入藥物1.5ml于10ml離心管內(nèi)，使藥物終濃度分別為0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml和1.0mg/ml。對照組取弓形蟲懸液0.5ml，加1.5ml生理鹽水于離心管中。不同濃度藥物組(各4管)和對照組(4管)的混合液用H84混合器充分振蕩混勻，置37℃溫箱，于1h、2h、4h、8h分別取出1管，用生理鹽水離心洗滌3次(2000rpm，5min)，最后用生理鹽水調(diào)至2ml/管，用臺盼蘭染色，姬姆薩染色，顯微觀察蟲體著色率及弓形蟲形態(tài)變化情況。同時(shí)，取不同濃度、作用不同時(shí)間藥物組和對照組生理鹽水洗滌的蟲體懸液再轉(zhuǎn)種小鼠，記錄存活時(shí)間并取腹水鏡檢。
試驗(yàn)結(jié)果(1)、臺盼蘭染色藥物組臺盼蘭染色，蟲體著色率隨著藥物濃度增高，作用時(shí)間延長而逐漸升高(見表1)。
(2)、姬姆薩染色對照組蟲體呈典型香蕉形，胞質(zhì)染色淡蘭色，均勻，胞核呈紫紅色，疏松。低濃度藥物組和高濃度藥物組早期，部分蟲形體態(tài)略有變化，兩端變鈍，或橢圓，核稍固縮，染色稍深。隨著藥物濃度增高和作用時(shí)間延長，蟲體形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化逐漸顯著，多為橢圓和圓形，蟲體表面不光滑，核固縮，染色加深明顯。胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒。
(3)、小鼠再接種結(jié)果對照組共做小鼠接種5組，平均存活時(shí)間5.6d。藥物組藥物濃度分別為0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml/0.75mg/ml，作用時(shí)間分別為1h，2h，4h，8h后，經(jīng)小鼠腹腔接種。0.1mg/ml組小鼠存活時(shí)間平均延長1.2d；0.25mg/ml組作用4h以上；0.5mg/ml及1.0mg/ml組作用2h以上，接種的第1代小鼠存活時(shí)間均超過1個(gè)月，無發(fā)病跡象，處死小鼠腹水中均未查到弓形蟲。
結(jié)論
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的曼得利特(0.1mg/ml、0.25mg/ml)作用1—2h即有明顯地抑蟲作用。0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml的曼得利特作用1-2h即可使1.5～3.5×107/ml腹水中的弓形蟲完全、徹底地被殺滅。0.5mg/ml(即0.05％)的曼得利特是體外殺滅弓形蟲的最低有效濃度，體外最短有效作用時(shí)間為2h。
2、體內(nèi)抗蟲試驗(yàn)試驗(yàn)藥物曼得利特試驗(yàn)蟲種RH株弓形蟲(國際公認(rèn)強(qiáng)毒株)試驗(yàn)動物昆蟲株小鼠試驗(yàn)方法用RH株弓形蟲通過腹腔接種感染小鼠，設(shè)立陰性、陽性對照組及藥物試驗(yàn)組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(給藥組又設(shè)乙胺嘧啶藥物對照組)。經(jīng)腹腔注射、灌服、靜脈注射不同途徑給藥，曼得利特腹腔注射劑量為300mg/kg·d×1；灌服和靜脈注射劑量為200mg/kg·d×2；乙胺嘧啶灌服劑量為62.5mg/kg·d×1；在給藥后的不同時(shí)期(24h、72h，死亡后)處死小鼠，取材，采用實(shí)驗(yàn)室檢測、病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、圖像分析和電子顯微鏡技術(shù)等系統(tǒng)地、動態(tài)地觀察研究曼得利特抗小鼠體內(nèi)弓形蟲的作用及其機(jī)制。
試驗(yàn)結(jié)果(1)、曼得利特對弓形蟲感染小鼠腹水中弓形蟲速殖子繁殖力的影響(感染弓形蟲24h、72h和小鼠死亡后)。
經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明用藥組與陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量相比，腹腔注射組、口服組、靜脈注射組、乙胺嘧啶組小鼠腹水中弓形蟲的數(shù)量均有顯著性差異(P＜0.01)(見表2、表3、表4、表5、表6、表7)。證明曼得利特?zé)o論腹腔注射、口服和靜脈注射給藥，均有明顯地抑制弓形蟲繁殖的作用。曼得利特用藥組與乙胺嘧啶組相比，小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量無顯著性差異(P＞0.05)，說明曼得利特對弓形蟲的抑制作用不低于乙胺嘧啶。
(2)、給藥不同時(shí)間，各用藥組與陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的動態(tài)變化(見

圖1，圖2)。
(3)、曼得利特腹腔注射組，陽性對照組不同時(shí)期肝組織及陰性對照組小鼠肝組織ABC染色圖象分析結(jié)果(表8)。
經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示小鼠感染了弓形蟲24h，曼得利特治療組面密度與陽性對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，而與陰性對照組相比無差異性(P＞0.05)。表明曼得利特治療感染小鼠24h，對小鼠肝組織內(nèi)弓形蟲侵入肝細(xì)胞以及在肝細(xì)胞內(nèi)的繁殖均有明顯的抑制作用。在治療72h后，曼得利特治療組面密度與陽性對照組相比仍有差異性(P＜0.05)。小鼠死亡后，曼得利特治療組面密度與陽性對照組相比無差異性(P＞0.05)。表明弓形蟲對兩組小鼠肝組織破壞程度無差異。
(4)、各治療組對感染小鼠存活時(shí)間的影響經(jīng)用多樣本均數(shù)的秩和檢驗(yàn)，與陽性對照組小鼠生存時(shí)間相比，腹腔注射組、口服組、靜脈注射組、乙胺嘧啶組小鼠生存時(shí)間均有顯著性差異(P＜0.01)。表明曼得利特各治療組均能有效的延長小鼠存活時(shí)間，與乙胺嘧啶對小鼠存活時(shí)間延長的效果相近(P＞0.05)(見表8，表9，表10)。
(5)、曼得利特對小鼠急性弓形蟲病肝臟的保護(hù)作用a、HE染色光鏡檢查結(jié)果弓形蟲感染陽性對照組小鼠肝臟病理變化明顯而嚴(yán)重，通過光鏡觀察，在感染早期(24h)可見組織輕度充血，肝組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤。感染中期(72h)，肝組織內(nèi)有小灶狀肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤灶，血管內(nèi)皮細(xì)胞剝脫。感染晚期(小鼠死亡后)肝組織大片壞死，肝細(xì)胞肝脹，溶解壞死，炎性細(xì)胞浸潤明顯。
曼得利特治療組小鼠肝組織的病理變化與陽性對照組相比，病變輕微。小鼠感染早期(24h)肝臟組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見壞死。感染中期(72h)肝組織結(jié)構(gòu)大致正常，僅見血管內(nèi)淤血，個(gè)別區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞未見明顯壞死，可見小灶狀炎性細(xì)胞浸潤。
乙胺嘧啶對照組小鼠感染早期(24h)肝組織結(jié)構(gòu)大致正常，但細(xì)胞腫脹明顯，可見點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤。小鼠感染中期(72h)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，出血，充血明顯，肝細(xì)胞中度腫脹，個(gè)別區(qū)域可見小的肝細(xì)胞壞死灶，血管內(nèi)皮細(xì)胞剝脫。
b、免疫組織化學(xué)ABC法光鏡觀察各治療組小鼠肝組織病理變化與上述(HE染色)病理變化基本相同。
c、電鏡觀察結(jié)果陽性對照組小鼠感染弓形蟲24h，可見肝細(xì)胞核腫脹，染色質(zhì)聚集成塊，電子密度明顯降低，胞質(zhì)溶解，線粒體腫脹，線粒體嵴消失，有的線粒體溶解消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹。小鼠感染弓形蟲72h，可見核膜迂曲，胞核變形，核仁偏移，染色質(zhì)聚集成塊，細(xì)胞質(zhì)溶解，出現(xiàn)空泡，數(shù)量較多，線粒體明顯腫脹，部分線粒體空泡變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹破裂，有少量白細(xì)胞浸潤，毛細(xì)膽管有條離現(xiàn)象，緊密連接擴(kuò)張，肝細(xì)胞間膠原纖維增生。小鼠死亡后，可見肝細(xì)胞核溶解破壞，核膜迂曲、斷裂，線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解、消失，細(xì)胞質(zhì)溶解破壞加重，大量空泡?？梢姼渭?xì)胞內(nèi)含數(shù)個(gè)蟲體，蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，白細(xì)胞浸潤，毛細(xì)膽管內(nèi)可見多量游離蟲體，肝內(nèi)見大片出血。
曼得利特治療組感染小鼠用藥24h后，可見肝細(xì)胞核正常，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常，清晰可見，未見異常改變。同時(shí)可見肝細(xì)胞內(nèi)蟲體輕度破壞，胞膜突出、破裂，蟲體前端細(xì)胞質(zhì)溶解破壞，蟲體電子密度增高。治療72h，可見肝細(xì)胞核大致正常，染色質(zhì)輕度聚集，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，部分線粒體嵴消失。肝竇內(nèi)蟲體破壞明顯，蟲體腫脹，電子密度降低，胞膜崩解，伸出偽足，胞質(zhì)溶解壞死，呈空泡改變，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊不清，線粒體中度腫大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂、消失，致密顆粒消失。小鼠死亡后，肝細(xì)胞核形不規(guī)則，核膜迂曲，染色質(zhì)凝集成塊邊移，線粒體腫、勻質(zhì)改變，細(xì)胞器模糊不清。細(xì)胞內(nèi)蟲體破壞明顯，胞膜破裂，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，結(jié)構(gòu)模糊，致密顆粒消失，蟲體電子密度降低。
乙胺嘧啶治療組感染小鼠治療后24h，可見肝細(xì)胞大量破壞，染色質(zhì)凝集、核模迂曲，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清、勻質(zhì)改變，線粒體消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破裂，可見巨大脂滴出現(xiàn)。用藥72h后，肝細(xì)胞破壞更為嚴(yán)重，核模迂曲破裂，染色質(zhì)聚集邊移，細(xì)胞器明顯溶解破壞。肝細(xì)胞內(nèi)蟲體破壞明顯，形態(tài)尚可，核膜斷裂，細(xì)胞器模糊，可見殘留的棒狀體。小鼠死亡后，肝細(xì)胞大量破壞，肝細(xì)胞界限不清，核形不規(guī)則，核膜迂曲斷裂，染色質(zhì)聚集成塊，細(xì)胞器勻質(zhì)改變，結(jié)構(gòu)不清。
結(jié)論(1)、曼得利特經(jīng)腹腔注射、口服、靜脈注射均對感染小鼠體內(nèi)的弓形蟲有殺滅和抑制繁殖的作用，與陽性對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。與乙胺嘧啶組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，即證明曼得利特對弓形蟲的殺滅和抑制繁殖的作用不低于乙胺嘧啶。
(2)、曼得利特各種途徑治療組均能有效地延長感染小鼠的存活時(shí)間，與陽性對照組相比，有顯著差異性(P＜0.01)。而與乙胺嘧啶組比較對小鼠存活時(shí)間延長的效果相近(P＞0.05)。
(3)、通過HE染色、免疫組化法光鏡觀察及電子顯微鏡觀察，曼得利特各治療組與陽性對照組各相應(yīng)時(shí)期比較，具有明顯的減輕弓形蟲對肝組織、肝細(xì)胞的損傷破壞作用，可阻斷和減輕病理過程，對肝臟有一定的保護(hù)作用。但乙胺嘧啶對肝組織和肝細(xì)胞有明顯的損傷破壞作用，其毒副作用明顯。
(4)、通過電鏡觀察，可以清楚地看到曼得利特對感染小鼠肝組織內(nèi)游離的弓形蟲速殖子及肝細(xì)胞內(nèi)的弓形蟲速殖子均有明顯的損傷破壞作用，起到殺滅、抑制繁殖的作用。
二、曼得利特殺滅和抑制弓形蟲機(jī)制試驗(yàn)1.體外試驗(yàn)將不同濃度的曼得利特加入感染小鼠腹水懸液中(弓形蟲數(shù)1.5—3.5×107/ml)，混勻，置37℃溫箱。在不同時(shí)間(1h、2h、4h、8h)分別取出藥物組和對照組各1管，用生理鹽水離心洗滌3次，取材、制片，染色，用光鏡和電鏡觀察。
(1)、光鏡觀察結(jié)果低濃度藥物組和高濃度藥物組早期，可見部分蟲體兩端變鈍，中部變粗，部分呈橢圓形，核固縮，染色深。隨著藥物濃度增高和作用時(shí)間延長，蟲體變?yōu)闄E圓和圓形，核固縮，深染明顯。而對照組蟲體呈典型的香蕉形，胞質(zhì)染成淡蘭色，較均勻，胞核呈紫紅色、疏松。
(2)、透射電鏡觀察陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲呈半月形或香蕉形，前端較尖，后端鈍圓，一側(cè)扁平，一側(cè)較彎曲，蟲體外被胞膜，胞核位于蟲體中央稍偏后，染色質(zhì)呈細(xì)粒狀散在分布于核質(zhì)中，核仁清晰，位置不定。棒狀體、線粒體、高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、致密顆粒均清晰可見。曼得利特作用于弓形蟲后超微結(jié)構(gòu)改變主要發(fā)生在以下幾個(gè)方面A、細(xì)胞膜可見局部增厚，或疏松甚至斷裂，或局部變薄膨出呈空泡狀。B、細(xì)胞核核形不規(guī)則，核膜增厚、斷裂、溶解、邊緣模糊不清，異染色質(zhì)聚集成塊，核質(zhì)部分溶解并出現(xiàn)多量空泡。C、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)明顯破壞，基質(zhì)溶解，出現(xiàn)大量空泡或空白溶解區(qū)。致密顆粒減少或消失。線粒體斷裂、溶解呈空泡狀。高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等消失。棒狀體電子密度降低，也有部分溶解呈空泡狀，甚至消失。藥物濃度愈大、作用時(shí)間愈長，各種損傷愈重、愈明顯。
觀察結(jié)果表明，曼得利特作用弓形蟲后，首先破壞其細(xì)胞膜，改變其通透性，使藥物滲入蟲體，破壞其正常結(jié)構(gòu)，同時(shí)破壞了各種細(xì)胞器，表明該藥對蛋白質(zhì)及糖原合成有嚴(yán)重破壞作用，同時(shí)影響其呼吸、運(yùn)動、繁殖等功能，起到殺滅蟲體的作用。
2.體內(nèi)試驗(yàn)感染小鼠應(yīng)用曼得利特治療不同時(shí)期，小鼠腹水中蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
(1)、光鏡觀察結(jié)果用曼得利特經(jīng)不同途徑(腹腔注射、灌服、靜脈注射)給感染小鼠給藥，在不同時(shí)間(24h、72h、小鼠死亡后)分別取小鼠腹水涂片染色(姬姆薩染液)，光鏡觀察弓形蟲滋養(yǎng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲滋養(yǎng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(與體外試驗(yàn)陽性對照組相似，如前所述)。曼得利特治療組，24h后，可見大部分蟲體腫脹，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)許多顆粒和空泡，部分蟲體細(xì)胞核溶解、消失。假包囊內(nèi)(細(xì)胞內(nèi))的蟲體局部破裂。治療72h后，蟲體破壞明顯加重，蟲體腫脹，胞膜不完整，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核腫大、碎裂，假包囊內(nèi)的蟲體亦被破壞。小鼠死亡后，蟲體破壞更加明顯，見假包囊內(nèi)蟲體明顯崩解死亡。
(2)、電鏡觀察試驗(yàn)方法與光鏡觀察組相同。陽性對照組弓形蟲滋養(yǎng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(與體外觀察結(jié)果相同，如前所述)。
曼得利特各治療組24h后，腹水中部分弓形蟲破壞，電子密度降低，胞膜突出、破裂，細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊，勻質(zhì)改變。棒狀體擴(kuò)張，線粒體腫脹、破裂，致密顆粒減少，核固縮，核膜迂曲斷裂。用藥72h，可見蟲體破壞嚴(yán)重，大部分蟲體變圓或橢圓形。蟲體電子密度明顯降低，胞膜界限不清，胞質(zhì)出現(xiàn)許多空泡及脂滴，致密顆粒消失，線粒體明顯腫脹，嵴消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張破裂。小鼠死亡后，腹水中可見蟲體結(jié)構(gòu)大致正常的蟲體，部分蟲體破壞明顯。假包囊內(nèi)蟲體也明顯破壞，蟲體胞膜突出、破裂，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，呈勻質(zhì)化。核膜迂曲、破裂，染色質(zhì)明顯凝集。
感染小鼠應(yīng)用曼得利特治療后，不同時(shí)期小鼠組織結(jié)構(gòu)及組織中(肝組織)弓形蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化(3)、光鏡電鏡觀察結(jié)果見藥效學(xué)觀察結(jié)果(如前所述)結(jié)論通過應(yīng)用曼得利特對感染小鼠腹水及肝組織內(nèi)的弓形蟲作用后的形態(tài)觀察，證明曼得利特的殺蟲機(jī)制主要是該藥可選擇性的直接作用于蟲體(對小鼠體內(nèi)游離的及組織細(xì)胞內(nèi)的弓形蟲均有作用)，破壞弓形蟲的細(xì)胞膜，破壞了細(xì)胞膜的正常功能，改變其通透性，藥物進(jìn)入蟲體，破壞其正常結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及各種細(xì)胞器均發(fā)生損傷、破壞，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)、糖原等合成代謝，并影響其能量代謝以及呼吸、運(yùn)動、繁殖等功能，使蟲體死亡或各種生理代謝功能嚴(yán)重受損，達(dá)到殺滅和抑制蟲體生長發(fā)育、繁殖作用。
三、毒理試驗(yàn)1、急性毒性試驗(yàn)選用ICR小鼠用靜脈注射和灌胃給藥法進(jìn)行試驗(yàn)。
試驗(yàn)結(jié)果靜脈注射的LD50＝1128.702mg/kg，灌胃給藥的LD50＝3285mg/kg。
2、致畸試驗(yàn)選用受精的雌性ICR小鼠，在受孕后的6—15天給藥，每天灌服不同劑量的曼得利特1次。
試驗(yàn)結(jié)果其活胚胎的數(shù)量、體重、身長、發(fā)育與對照組比較未發(fā)現(xiàn)異常，證明曼得利特?zé)o致畸作用。
3、Ames試驗(yàn)與微核試驗(yàn)均證明無致突變性。
四、曼得利特對正?；罱M織及組織細(xì)胞的毒性作用試驗(yàn)給正常昆明株小鼠腹腔注射、灌服及靜脈注射曼得利特2周，觀察小鼠反應(yīng)情況，并取腹水和肝臟組織切片、染色、光鏡和電鏡觀察。
試驗(yàn)結(jié)果(1)、曼得利特對正常小鼠的影響在給藥期間，小鼠未出現(xiàn)異常反應(yīng)，停藥后繼續(xù)喂養(yǎng)至小鼠死亡，小鼠死亡時(shí)間與正常對照組小鼠死亡時(shí)間無明顯區(qū)別。
(2)、曼得利特給藥期間，小鼠肝組織的病理、免疫組化和電鏡觀察均未發(fā)現(xiàn)肝組織結(jié)構(gòu)的破壞和肝細(xì)胞壞死。小鼠腹水檢查清亮，僅見少量正常白細(xì)胞。
毒性作用試驗(yàn)證明曼得利特對正常小鼠無毒副作用。
從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明中的曼得利特經(jīng)藥效、毒理、作用機(jī)理等實(shí)驗(yàn)，證明它有很強(qiáng)地殺滅和抑制強(qiáng)毒株(RH株)弓形蟲的作用，毒副作用很低，若用于弓形蟲病的臨床試驗(yàn)，預(yù)期將會有較好的治療效果。
本發(fā)明的實(shí)施例1用常規(guī)工藝制備成片劑，以生產(chǎn)1000片曼得利特片(每片凈重100mg)為例所用的原料和輔料的配比為原料或輔料 重量 配比曼得利特50g 50％玉米淀粉35g 35％羥丙基纖維素10g 10％粘合劑 5g5％硬脂酸鎂適量用常規(guī)工藝制備成注射液，以生產(chǎn)1000ml曼得利特注射液為例所用的原料和輔料的為曼得利特2.5g注射水 1000ml附表1-10曼得利特濃度及作用時(shí)間與弓形蟲(RH株)臺盼蘭染色著色率(％)的關(guān)系 表1
曼得利特對弓形蟲感染小鼠腹水中弓形蟲速殖子繁殖力的影響感染弓形蟲24h曼得利特試驗(yàn)組與陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的比較 表2
感染弓形蟲72h曼得利特試驗(yàn)組與陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的比較表3
感染弓形蟲小鼠死亡后曼得利特試驗(yàn)組與陽性對照組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的比較試驗(yàn)組 表4
陽性對照組
感染弓形蟲24h曼得利特口服試驗(yàn)組及曼得利特注射試驗(yàn)組與陽性對照組、乙胺嘧啶藥物對照組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量的比較感染后24h各組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量(個(gè)/ml)表5
感染后72h各組小鼠腹水中弓形蟲數(shù)量(個(gè)/ml)表6
各組小鼠死亡后腹水中弓形蟲計(jì)數(shù)結(jié)果(個(gè)/ml)表7
曼得利特試驗(yàn)組、陽性對照組小鼠不同時(shí)期肝組織以及陰性對照組小鼠肝組織ABC染色圖像分析 表8
注單位um2面密度＝陽性面積/統(tǒng)計(jì)場總面積曼得利特對弓形蟲感染小鼠生存時(shí)間的影響曼得利特試驗(yàn)組小鼠與陽性對照組小鼠平均存活天數(shù)比較表9
曼得利特試驗(yàn)組與陽性對照組小鼠生存時(shí)間比較 表9
曼得利特對弓形蟲感染小鼠生存時(shí)間的影響曼得利特口服試驗(yàn)組、注射試驗(yàn)組、乙胺嘧啶藥物對照組與陽性對照組小鼠平均存活天數(shù)的比較各組小鼠平均存活天數(shù)(天) 表10
權(quán)利要求
有效成份用曼得利特制備治療人獸共患弓形蟲病的藥物用途。
全文摘要
曼得利特的原料藥曼得利酸是從薔薇科植物桃樹的葉子中用普通工藝提取的天然產(chǎn)物,常規(guī)藥含活性成分的曼得利特在制劑中與藥學(xué)上有機(jī)或無機(jī)的固體或液體賦形劑混合制成片劑、顆粒劑、針劑等,曼得利特經(jīng)藥效、毒理、作用機(jī)理等實(shí)驗(yàn)研究,證明它有很強(qiáng)地殺滅和抑制強(qiáng)毒株(RH株)弓形蟲的作用,毒副作用很低,若用于弓形蟲病的臨床試驗(yàn),預(yù)期將會有較好的治療效果。
文檔編號A61P33/00GK1331970SQ0112870
公開日2002年1月23日 申請日期2001年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月25日
發(fā)明者李哲, 程彥斌, 司開衛(wèi), 郭廣洲 申請人:西安交通大學(xué)