專利名稱：一種生物材料和組織工程材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于新型生物材料在組織工程中的應(yīng)用領(lǐng)域。
目前可以作為組織工程的生物材料的可降解聚合物有許多種，其中聚乳酸(polylactic acid,PLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)以其降解產(chǎn)物無毒和良好的生物相容性，已經(jīng)被美國FDA批準(zhǔn)廣泛用于臨床。雖然PLA,PGA在組織工程中應(yīng)用較為廣泛，但仍然存在一些問題，如親水性不足，細(xì)胞粘附力較弱；易引起無菌炎癥反應(yīng)；機(jī)械強(qiáng)度不足等。聚羥基脂肪酸(Polyhydroxyalkanoate,PHA)是由生物合成的一類可降解的高分子聚合物，對其作為組織工程材料研究較多的是聚羥基丁酸(PHB)，羥基丁酸和羥基戊酸共聚物(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，或簡稱為PHBV)，由于具有較好的壓電效應(yīng)，適合于用作骨組織工程細(xì)胞的外基質(zhì)材料，但是可塑性和機(jī)械性能差等缺點(diǎn)限制了它們的廣泛應(yīng)用。表面改性能夠增加表面的親水性，從而提高表面的生物相容性，如經(jīng)過NaOH處理聚合物材料，親水性和生物相容性增加，但是其缺點(diǎn)是腐蝕性較強(qiáng)，容易引起材料的機(jī)械性能改變，影響組織功能的行使。
本發(fā)明的目的在于為克服已有的組織工程生物材料的不足之處，提出一種新型的PHA,3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)用作為組織工程材料，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和良好的延展性，易加工成型；具有較好的表面親水性，利于組織細(xì)胞的粘附。
本發(fā)明還將PHBHHx引用PHB形成的共混物用作為組織工程材料，可以改善PHB的可塑性和機(jī)械性能，并通過調(diào)節(jié)PHBHHx與PHB在共混物中的比例適應(yīng)不同組織結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度和韌性的需要；進(jìn)一步，本發(fā)明應(yīng)用脂肪酶對PHB、PHBHHx或其共混物材料進(jìn)行表面改性的處理后用作為組織工程材料，可以提高細(xì)胞在聚合物表面的粘附和增殖。
本發(fā)明提出一種生物材料和組織工程材料，其特征在于，所說的生物材料和組織工程材料為3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)。
所說的生物材料和組織工程材料還可為PHBHHx與PHB形成的共混物。
本發(fā)明還提出以脂肪酶作為表面改性劑對PHBHHx或PHB/PHBHHx材料進(jìn)行表面處理后用作為組織工程材料。其具體方法為根據(jù)處理對象的不同，可以選擇不同種類的脂肪酶，脂肪酶溶液的pH范圍為7.0-7.5，處理的溫度范圍為30-40℃。脂肪酶進(jìn)行表面改性的處理方法時(shí)，將聚合物形成的膜完全浸泡于酶溶液中，恒溫保持24小時(shí)后，用去離子水反復(fù)蕩洗，去除殘余的酶液，干燥。
本發(fā)明所述的生物材料與已有的應(yīng)用于組織工程中的生物材料如PHB和聚乳酸PLA相比，具有以下特點(diǎn)(1)是完全由微生物合成的生物高分子材料；(2)具有較好的有機(jī)溶劑的溶解性；(3)具有較好的延展性，易加工成型；(4)具有較好的細(xì)胞相容性和生物可降解性；(5)分子量可通過發(fā)酵條件控制，從30,000到2,000,000道爾頓；(6)通過分子量還可以調(diào)節(jié)PHBHHx的降解速度；(7)與PHB共混形成的共混物，可進(jìn)一步改變物理性能和生物相容性。
本發(fā)明中以脂肪酶作表面改性劑與已有的表面改性方法相比，具有以下特點(diǎn)(1)不使用腐蝕性強(qiáng)的溶劑，操作方法簡單，處理?xiàng)l件溫和；(2)使用的脂肪酶價(jià)格便宜，且用量不大。(3)脂肪酶對材料的表面改性作用溫和，不會(huì)影響材料的物理強(qiáng)度和其他機(jī)械性能。(4)對PHB和PHBHHx共混物的表面處理，細(xì)胞相容性的改變尤為明顯。
附圖簡要說明

圖1為脂肪酶Lipolase100T對PHB和PHBHHx共混物膜表面的細(xì)胞相容性的影響。對照樣品PLA。
圖2為脂肪酶Novozym398對L929細(xì)胞在PHBHHx與PHB共混物膜表面增殖。
實(shí)施例一細(xì)胞在PHBHHx膜表面的增殖細(xì)胞系小鼠成纖維細(xì)胞L929；膜表面細(xì)胞增殖測定的對照聚-L-乳酸(PLA)(分子量約為30~40萬)；本實(shí)施例的操作如下將純化的PHBHHx溶解于三氯甲烷，室溫下展膜，經(jīng)冰凍干燥去除殘余在膜中的有機(jī)溶劑，干燥，紫外照射過夜滅菌。取生長旺盛的L929細(xì)胞接種到膜表面，初始的細(xì)胞濃度在2~5×104/ml，培養(yǎng)72小時(shí)后，通過MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2-)-2,5-二苯基四唑)檢測細(xì)胞在聚合物表面的增殖。
細(xì)胞在PLA膜上的增殖量為0.9×105/ml，在PHB膜上的增殖量為0.13×105/ml在PHBHHx膜上的增殖量為5.7×105/ml。與PLA和PHB相比，PHBHHx具有更好的細(xì)胞相容性。
實(shí)施例二細(xì)胞在用脂肪酶水溶液Lipolase100T處理的PHA膜表面PHB/PHBHHx共聚物膜表面的增殖細(xì)胞系小鼠成纖維細(xì)胞L929；PHB與PHBHHx的質(zhì)量比1/0；0.9/0.1；0.75/0.25；0.5/0.5；0.25/0.75；0.1/0.9；0/1。
脂肪酶Lipolase100T(0.1g/ml，酶活約為1KLU/ml，由丹麥諾和諾德公司提供)；脂肪酶溶液的pH值7.0；脂肪酶處理溫度30℃；脂肪酶處理時(shí)間24小時(shí)；膜表面細(xì)胞增殖測定的對照聚乳酸(PLA)(分子量約為30~40萬)
本實(shí)施例的操作如下將純化的PHBHHx再按要求的比例溶解于PHB的三氯甲烷溶液中，室溫下展膜，經(jīng)冰凍干燥去除殘余在膜中的有機(jī)溶劑。將1g固體顆粒的脂肪酶Lipolase100T溶于100ml去離子水，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.0。將膜完全浸入到脂肪酶液30℃恒溫保持24小時(shí)，用去離子水反復(fù)蕩洗，去除殘余的酶液，干燥，紫外照射過夜滅菌。取生長旺盛的L929細(xì)胞接種到膜表面，初始的細(xì)胞濃度在2~5×104/ml，培養(yǎng)72小時(shí)，通過MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2-)-2,5-二苯基四唑)檢測細(xì)胞在聚合物表面的增殖。
細(xì)胞在PHA共混物膜上的增殖如圖1所示，細(xì)胞與聚合物材料表面的相容性是與聚合物的組成有關(guān)。未經(jīng)酶處理之前，細(xì)胞在PHB和PHBHHx共混物膜上的增殖量是隨著PHBHHx的含量比的增加而出現(xiàn)遞增的趨勢，在PHBPHHx膜上的細(xì)胞增殖量5.7×105/ml比PHB膜上的0.2×105/ml增大近30倍。經(jīng)過脂肪酶Lipolase100T處理后細(xì)胞在不同比率的PHB和PHBHHx共混物膜的增殖量都有了明顯的增加，細(xì)胞量為5~10×105/ml，大大超過了PLA膜上的細(xì)胞增殖(1×105/ml)。Lipolase100T對于PHB相對含量比較高的共混物膜的細(xì)胞相容性有明顯的增強(qiáng)作用，相反對于PHBHHx相對含量比較高共混物膜的細(xì)胞的增殖改變較小。
實(shí)施例三細(xì)胞在用脂肪酶Novozym398溶液處理的PHB/PHBHHx共聚物膜表面的增殖細(xì)胞系小鼠成纖維細(xì)胞L929；PHB與PHBHHx的質(zhì)量比0.25/0.75；0.5/0.5；0.75/0.25；0/1。
脂肪酶Novozym398(液體)(30％，酶原液活力為20000LU，由丹麥諾和諾德公司提供)；脂肪酶溶液的pH值7.5；脂肪酶處理溫度40℃；脂肪酶處理時(shí)間24小時(shí)；本實(shí)施例的操作如下將純化的PHBHHx再按要求的比例溶解于PHB的三氯甲烷溶液中，室溫下展膜，經(jīng)冰凍干燥去除殘余在膜中的有機(jī)溶劑。將液態(tài)脂肪酶Novozym398稀釋為30％(液體體積比)，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.5。將膜完全浸入到脂肪酶液40℃恒溫保持24小時(shí)，用去離子水反復(fù)蕩洗，去除殘余的酶液，干燥，紫外照射過夜滅菌。取生長旺盛的L929細(xì)胞接種到膜表面，初始的細(xì)胞濃度約為1×104/ml，培養(yǎng)72小時(shí)，通過MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑基-2-)-2,5-二苯基四唑)檢測細(xì)胞在聚合物表面的增殖。
與PHBHHx相比，沒有經(jīng)過表面改性的共混物的膜表面的細(xì)胞增殖數(shù)量小于在PHBHHx表面細(xì)胞增殖量的二分之一，如圖2所示。經(jīng)過Novozym398處理后的膜表面的細(xì)胞增殖發(fā)生很大變化，對于純的PHBHHx來說，細(xì)胞的數(shù)量只增大了近1倍。而經(jīng)過酶處理的共混物膜表面的細(xì)胞增加了20~30倍，在PHB含量30％的共混物膜上，其細(xì)胞量達(dá)到最高值為3.3×105/ml，比經(jīng)過酶改性的PHBHHx膜表面的細(xì)胞量(0.6×105/ml)增大了5~6倍。Novozym398的表面改性作用更適用于PHB/PHBHHx共混物。
通過以上三個(gè)實(shí)施例說明，和PLA和PHB相比較，PHBHHx具有更好的細(xì)胞相容性，加上其優(yōu)良的機(jī)械性能和生物可降解性，能夠滿足組織工程對生物材料的要求，是一種良好的新型生物材料。在PHB中引入PHBHHx形成共混物，不僅提高PHB的延展性和可塑性，而且其表面的生物相容性可以通過脂肪酶的表面改性得到很大的提高，拓展了PHB在組織工程中的應(yīng)用。
另外，通過利用脂肪酶對聚合物膜表面進(jìn)行修飾，說明脂肪酶對材料表面生物相容性的影響是與聚合物的組成相關(guān)的，對于PHB及PHB相對含量較高的PHB/PHBHHx共混物的細(xì)胞相容性有比較大的提高，而對于PHBHHx和PHBHHx相對含量較高的PHB/PHBHHx共混物膜表面的細(xì)胞增殖沒有明顯的增大；對于共混物膜表面的生物相容性的提高程度要大于純的PHBHHx。
權(quán)利要求
1．一種生物材料和組織工程材料，其特征在于，所說的生物材料和組織工程材料為3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)。
2．用如權(quán)利要求1所述的生物材料和組織工程材料，其特征在于，以脂肪酶作為表面改性劑對所說的PHBHHx的表面進(jìn)行處理，以提高聚合物表面的親水性，增強(qiáng)細(xì)胞在聚合物膜表面的粘附、增殖的狀態(tài)。
3．用如權(quán)利要求2所述的生物材料和組織工程材料，其特征在于，所說的以脂肪酶作為表面改性劑對聚合物進(jìn)行表面處理的方法具體包括所說的脂肪酶溶液的pH范圍為7.0-7.5，處理的溫度范圍為30-40℃，將聚合物膜完全浸于脂肪酶溶液中，恒溫保持24小時(shí)后，用去離子水反復(fù)蕩洗，干燥。
4．一種生物材料和組織工程材料，其特征在于，所說的生物材料和組織工程材料為的3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物PHBHHx/PHB共混物。
5．用如權(quán)利要求4所述的生物材料和組織工程材料，其特征在于，以脂肪酶作為表面改性劑對所說的PHB/PHBHHx共混物的表面進(jìn)行處理，以提高聚合物表面的親水性，增強(qiáng)細(xì)胞在聚合物膜表面的粘附、增殖的狀態(tài)。
6．用如權(quán)利要求4所述的生物材料和組織工程材料，其特征在于，所說的以脂肪酶作為表面改性劑對聚合物進(jìn)行表面處理的方法具體包括所說的脂肪酶溶液的pH范圍為7.0-7.5，處理的溫度范圍為30-40℃，將聚合物膜完全浸于脂肪酶溶液中，恒溫保持24小時(shí)后，用去離子水反復(fù)蕩洗，干燥。
全文摘要
本發(fā)明屬于新型材料作為生物材料在組織工程中的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明不但提供了一種新型的生物材料PHBHHx,而且通過與PHB形成共混物可提高PHB的生物相容性,拓寬了PHB在組織工程中的應(yīng)用。用脂肪酶進(jìn)行的表面改性較其他表面改性的方法具有許多優(yōu)點(diǎn),條件溫和且不會(huì)影響材料本身的物理和機(jī)械性能。
文檔編號A61L31/04GK1324666SQ01129618
公開日2001年12月5日 申請日期2001年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者陳國強(qiáng), 楊霰霜, 趙鍇, 陳金春 申請人:清華大學(xué)