專利名稱：生物堿類化合物、鎮(zhèn)痛藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物堿類化合物，特別是小分子量生物堿及其制備方法。本發(fā)明還涉及鎮(zhèn)痛藥物，具體地是指含有本發(fā)明提供的生物堿的鎮(zhèn)痛藥物。本發(fā)明還涉及該鎮(zhèn)痛藥物的制備方法，該方法是以安絡小皮傘為原料的制備方法。
背景技術(shù)：
人類一直受到疾病的困擾。而在許多情況下，疾病除了造成人體機能甚至是生命的喪失外，還造成人肉體的痛苦，例如晚期癌癥，外傷等。為了減輕病人的痛苦，人們已經(jīng)研制了許多鎮(zhèn)痛藥物。具有較好鎮(zhèn)痛效果的藥物有嗎啡、杜冷丁。這是目前臨床應用中最有效的鎮(zhèn)痛藥物。但是，該藥物的最大缺點是不能長期使用，否則，會產(chǎn)生依賴性或成癮性。在這類鎮(zhèn)痛藥物之外，我國民間用安絡小皮傘菌絲體來治療跌打刀傷、骨折疼痛。上海中藥制藥廠將野生小皮傘菌的干菌絲體連同基質(zhì)的粗提取物制成“安絡解痛片”。這些都是粗制劑，技術(shù)含量低，成分復雜。中國衛(wèi)生部部頒藥品標準收載了安絡小皮傘的四種制劑安絡痛片、安絡痛膠囊、安絡痛酒和安絡痛酊，均采用乙醇提取工藝。后有文獻報道安絡小皮傘中的有效成分，如方圣鼎等人提取的鎮(zhèn)痛有效成分為對羥基肉桂酸(《中草藥》1989年第20卷第10期)；朱紹雄等人提取的鎮(zhèn)痛有效成分為三十烷酸和麥角甾醇(《中草藥》1988年第19卷第8期)。
方圣鼎等人的提取方法是將干菌絲體連同培養(yǎng)基質(zhì)加冷水浸泡洗滌，烘干、磨粉后用乙醇回流提取，醇溶液減壓濃縮，濾取析出物。溶液再減壓濃縮的糖漿狀物，經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷中遞增甲醇洗脫。從二氯甲烷-甲醇96∶4中分得苜蓿素，95∶5中分得對羥基肉桂酸。
朱紹雄等人提取方法是將安絡小皮傘醇浸膏用乙酸乙酯提取，過濾，適當濃縮，5％碳酸鈉溶液洗滌兩次，再用水洗至中性、干燥，回收溶媒得浸膏，經(jīng)G柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫依次得到2，3，5，6-四氯-1，4-二甲氧基苯(石油醚重結(jié)晶)，三十烷酸(無水結(jié)晶)，β-谷甾醇(先硅膠G旋轉(zhuǎn)薄層分離，正己烷-乙酸乙酯洗脫，濃縮得結(jié)晶)，5，8-過氧麥角甾醇(乙酸乙酯重結(jié)晶)。

發(fā)明內(nèi)容
雖然，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有不少從安絡小皮傘中提取鎮(zhèn)痛有效成分的報道，但本申請人進一步在其中找到了新的鎮(zhèn)痛有效成分，并且不但具有好的鎮(zhèn)痛效果，而且不產(chǎn)生依賴性。這也是本發(fā)明要解決的技術(shù)問題。
本發(fā)明提供化合物是 分子式為C7H11NO2。
本發(fā)明提供的另一化合物是 分子式為C6H12N2O2。
上述兩種化合物均可由化學方法合成。但本發(fā)明提供了一種以安絡小皮傘為原料的提取制備方法，直接得到兩種化合物。其具體方法是(1)以安絡小皮傘為原料，用乙醇提?。?2)回收乙醇后得清膏，用水稀釋并調(diào)PH值為8--9，脫脂后，用氯仿萃??；(3)回收氯仿后得稠膏，上硅膠H柱，用丙酮洗脫；(4)回收丙酮后得稠膏，用醋酸乙酯洗滌，抽濾得結(jié)晶；(5)將得到的結(jié)晶上硅膠H柱，用丙酮洗脫，第1出峰的為生物堿I，第2出峰的為生物堿II，再用醋酸乙酯-丙酮(2∶1)重結(jié)晶，進一步純化分離得到生物堿I、II。
本申請人通過實驗分析了化合物(I)、(II)的化學結(jié)構(gòu)。證明該化合物的結(jié)構(gòu)為上述所示的結(jié)構(gòu)。詳細分析和實驗數(shù)據(jù)見后面所附的結(jié)構(gòu)分析部分。
同時本申請人也通過實驗證明，此兩個化合物均具有良好的鎮(zhèn)痛作用。因此可用于制備鎮(zhèn)痛藥物。
因此本發(fā)明提供一種鎮(zhèn)痛藥物，其中的有效成分是化合物(I)。
優(yōu)選化合物(I)的含量大于25％。
本發(fā)明還提供一種鎮(zhèn)痛藥物，其中的有效成分是化合物(II)。
優(yōu)選生物堿(II)的含量大于25％。
本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛藥物是以安絡小皮傘為原料制備的。
優(yōu)選的制備方法是(1)以安絡小皮傘為原料，用乙醇提??；(2)回收乙醇后得清膏，用水稀釋并調(diào)PH值為8--9，脫脂后，用氯仿萃取；(3)回收氯仿后得稠膏，上硅膠H柱，用丙酮洗脫；(4)回收丙酮后得稠膏，用醋酸乙酯洗滌，抽濾得結(jié)晶。
由上述方法得到結(jié)晶中除含有本發(fā)明指明的化合物I、II之外，還含有三萜類化合物。但化合物I、II的總量超過51％，其中單一的主要有效成分占總生物堿量的25％以上。
將上述總生物堿結(jié)晶與淀粉、糊精混均后，經(jīng)過篩制粒即得鎮(zhèn)痛藥物。要求總生物堿的含量在51％以上。
實驗證明上述方法得到的鎮(zhèn)痛藥物具有良好的鎮(zhèn)痛效果。其可能為外周鎮(zhèn)痛與中樞鎮(zhèn)痛兼有的鎮(zhèn)痛藥物，杜冷丁則為明顯的中樞鎮(zhèn)痛藥物。
經(jīng)藥效學試驗證明，總生物堿有效部位的鎮(zhèn)痛有效劑量為640mg/日/人，相當于日服生藥量160g(麥麩、谷殼固體發(fā)酵培養(yǎng)物)或相當于干菌絲體約53g。
更重要的是本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛藥物不產(chǎn)生依賴性。


圖1化合物I紫外吸收光譜圖；圖2化合物II紫外吸收光譜圖；圖3化合物I紅外吸收光譜圖；圖4化合物II紅外吸收光譜圖；圖5化合物I質(zhì)譜圖；圖6化合物II質(zhì)譜圖；圖7、8、9化合物I核磁共振譜圖；
圖10、11化合物II核磁共振譜圖。
實施例1化合物I和化合物II的制備方法將安絡小皮傘藥材40kg，粉碎成最粗粉，加乙醇回流3次，每次加8倍量提取2小時，濾液合并，減壓回收乙醇，得約6kg(相對密度約1.20-1.25，60℃熱測)，加10倍量水稀釋，加濃氨水調(diào)PH8-9，加石油醚5次，回收石油醚，加氯仿5次，回收氯仿，得稠膏約1kg(相對密度1.35-1.38，60℃熱測)，加約5kg硅膠H∶硅藻土(2∶1)拌勻，干燥，上硅膠H柱[硅膠H∶硅藻土(2∶1)，丙酮濕法上柱]，加丙酮洗脫，收集丙酮洗脫液至顏色極淺(浸膏量較少)，回收丙酮，得稠膏(約0.5kg，相對密度1.35-1.38，60℃熱測)，加醋酸乙酯洗滌，抽濾，不溶物加醋酸乙酯重結(jié)晶2-3次，抽濾，70℃以下干燥，得總生物堿結(jié)晶干品約160g。
再將得到的結(jié)晶上硅膠H柱，用丙酮洗脫，分別收集第1出峰和第2出峰的洗脫液，用醋酸乙酯-丙酮(2∶1)混合溶液重結(jié)晶，純化分離得到生物堿I約30g，化合物II約18g。純度可達98％以上。
化合物(I)、(II)的結(jié)構(gòu)確認上述得到的化合物(I)和(II)進一步純化后，經(jīng)湖南師范大學和湖南大學四大光譜鑒定，為低分子生物堿類化合物，分子中具有明顯的對稱結(jié)構(gòu)，測定結(jié)果如下(本申請中，化合物I和II又稱為生物堿I和生物堿II。)(1)溶解度化合物I易溶于氯仿、丙酮、甲醇、乙醇，微溶于醋酸乙酯。
化合物II易溶于氯仿、乙醇、甲醇，溶于丙酮，微溶于醋酸乙酯。
(2)熔點化合物I68～69℃ 化合物 II82～84℃(3)UV圖譜化合物I儀器日本島津PE-λ16型紫外可見分光度計，掃描測定。λmuxMeOH＝201.2nm。測定條件及結(jié)果見圖1。
化合物II儀器日本島津PE-λ16型紫外可見分光光度計，掃描測定。λmaxMeOH＝203.3nm。測定條件及結(jié)果見圖2。
(4)IR圖譜化合物I儀器510P型傅里葉變換IR光譜儀，美國尼高力公司。
IRνmaxKBr(cm-1)3534(NH)，2997-2465(脂肪CH，強)，1726，1705(c＝0)，1298，1221 )。測定條件及結(jié)果見圖3。
化合物II儀器IRνmaxKBr＝(cm-1)3295(NH)、3090-2860(脂肪CH)，1653，1561(c＝0)，1445，1366，1289，1236(CH2)。測定條件及結(jié)果見圖4。
(5)質(zhì)譜(MS)化合物I儀器GC-17A，QP-5000氣質(zhì)聯(lián)用儀，EI源轟擊電壓70ev，四級桿檢測，分子量范圍40～500，倍增器電壓1.1kv，進樣桿升溫程序真空MS m/z140(m+)，98(M+-42)83(m+-57)，58(m+-82)，42(100％)。測定條件及結(jié)果見圖5。
化合物II儀器GC-17A，QP-5000氣質(zhì)聯(lián)用儀，EI源轟擊電壓70ev，四級桿檢測，分子量范圍40～500，倍增器電壓1.1kv，進樣桿升溫程序真MS m/z143(m+)，85(m-58)，73(m+-70)，60(m+-83)，43(m+-1O0)，30(100％)。測定條件及結(jié)果見圖6(6)核磁共振譜化合物I儀器AC-80MHz核磁共振儀，瑞士布魯克公司，H-NMR(CDCl3)，δPPm1.72(CH3-)，2.13(-CH2-)，2.77(-CH2-)，9.80(＞NH)。13C-NMRδPPm 28.14(CH3-)，50.84(-CH2-)、60.5(＞C＝O)，88(-C-)。測定條件及結(jié)果見圖7、8、9。
化合物II儀器AC-80MHz核磁共振儀，瑞士布魯克公司，H-NMR(CDCl3)δPPm1.78(CH3-)，3.06(-CH2-)，7.77(NH)。13C-NMRδPPm22.59(CH3-)，38.60(-CH2-)，169.40(-C-)。測定條件及結(jié)果見圖10、11(7)元素分析化合物I儀器PE-2400型，C、H、N元素分析儀，美國PE公司測定結(jié)果C53.64％ H13.90％ N6.56％C53.80％ H12.88％ N6.39％化合物II儀器PE-2400型，C、H、N元素分析儀，美國PE公司測定結(jié)果C49.45％ H10.59％ N20.20％C49.65％ H10.68％ N20.11％本發(fā)明提供的化合物I、II的鎮(zhèn)痛效果實驗一、實驗材料1.藥物與試劑安絡小皮傘菌絲體的提取成份A、生物堿I，B、生物堿2。實驗時各種產(chǎn)物采用擬用臨床劑量的1、2、4倍作為低、中、高劑量。
陽性對照藥之一，杜冷丁，沈陽制藥一廠生產(chǎn)，批號980908。
陽性對照藥之二，阿斯匹林，湖南制藥廠生產(chǎn)，批號990704-7。
2.動物BALB/C系、ICR清潔級小鼠，體重18-20g，上海西普爾—必凱實驗動物有限公司提供。
3.儀器BJ-084J熱板鎮(zhèn)痛儀，江蘇白石醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。
二、方法與結(jié)構(gòu)1、對醋酸引起扭體反應的影響(1)方法取BALB/C小鼠90只，雌雄各半，隨機分成9組，除杜冷丁組外，其余各組按表1劑量灌胃給藥1小時，杜冷丁組皮下注射杜冷丁20分后，各鼠腹腔注射0.7％冰醋酸0.1m/10g，記錄5-15分內(nèi)的扭體次數(shù)。
表1 生物堿I、II對小鼠扭體反應的影響(X±SD)組別 動物數(shù) 劑量 扭體次數(shù)(只) (g/kg)空白對照組10 NS 22.6±7.4
杜冷丁組 10 0.020.8±0.8**阿斯匹林組10 0.2017.2±4.2*A低劑量組 10 0.1 15.3±3.6A中劑量組 10 0.2 12.7±3.8**A高劑量組 10 0.4 9.6±2.7**B低劑量組 10 0.2 14.6±3.1*B中劑量組 10 0.4 11.5±2.7**B高劑量組 10 0.8 10.4±2.4**與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01(2)結(jié)果表1可見，與空白對照組比較我，A、B低、中、高組小鼠扭體次數(shù)有顯著性差異，且高、中、代劑量成較明顯的量效關(guān)系，能明顯抑制由醋酸引起的小鼠扭體反應，表明生物堿I和生物堿II結(jié)晶均具有較好的鎮(zhèn)痛作用，杜冷丁具有極明顯的鎮(zhèn)痛作用。
2.對小鼠熱板痛閾值的影響(1)方法取符合要求(平均痛閾值在30s)的BALB/C系雌性小鼠90只，隨機分成9組，除杜冷丁組外，其余各組按表2劑量灌胃給藥1小時，杜冷丁組皮下注射杜冷丁20分后，將小鼠放入熱板測痛儀，熱板溫度為55±0.5℃，自小鼠投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時間為該鼠的痛閾值，隔30分后再測一次，共3次，求出平均痛閾值進行統(tǒng)計。
表2生物堿I、II對小鼠熱板痛閾值的影響(X±SD)組別 動物數(shù) 劑量平均痛閾值(只) (g/kg) (s)空白對照組10 NS 28.0±5.8杜冷丁組 10 0.0258.4±3.6**阿斯匹林組10 0.2038.4±5.2**A低劑量組 10 0.1 36.9±2.8*A中劑量組 10 0.2 42.2±3.7**A高劑量組 10 0.4 44.6±5.4**B低劑量組 10 0.2 44.2±3.1**B中劑量組 10 0.4 46.5±4.1**B高劑量組 10 0.8 49.1±4.8**
與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01(2)結(jié)果與空白對照組比較，A、B低、中、高劑量組平均痛閾值有顯著性差異，表明生物堿I和生物堿II結(jié)晶均能明顯提高小鼠的耐熱痛能力，具有較好的鎮(zhèn)痛作用。杜冷丁具有極明顯的鎮(zhèn)痛作用。
實施例2鎮(zhèn)痛藥物的制備方法將安絡小皮傘藥材40kg，粉碎成最粗粉，加乙醇回流3次，每次加8倍量提取2小時，濾液合并，減壓回收乙醇，得約6kg(相對密度約1.20-1.25，60℃熱測)，加10倍量水稀釋，加濃氨水調(diào)PH8-9，加石油醚5次，回收石油醚，加氯仿5次，回收氯仿，得稠膏約1kg(相對密度1.35-1.38，60℃熱測)，加約5kg硅膠H∶硅藻土(2∶1)拌勻，干燥，上硅膠H柱[硅膠H∶硅藻土(2∶1)，丙酮濕法上柱]，收集丙酮洗脫液至顏色極淺(浸膏量較少)，回收丙酮，得稠膏(約0.5kg，相對密度1.35-1.38，60℃熱測)，加醋酸乙酯洗滌，抽濾，不溶物加醋酸乙酯重結(jié)晶2-3次，抽濾，70℃以下干燥，得總生物堿結(jié)晶干品約160g，加入淀粉約50g，糊精約100g，混勻，粉碎成細粉，過100目篩，混勻，加50％乙醇適量制軟材，16目篩制粒，60-80℃干燥，16目篩整粒，檢驗，灌裝膠囊，消毒，包裝，即得。制成約1000粒。
本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛藥物的鎮(zhèn)痛效果實驗一、試驗材料1、藥物與試劑本發(fā)明實施例1提供的膠囊原料，規(guī)格0.16g(結(jié)晶)/粒。
陽性對照藥藥之一，杜冷丁，湖北荊門市制藥廠生產(chǎn)，批號990508陽性對照藥之二，阿斯匹林片，廣州廣濟堂制藥廠生產(chǎn)，批號990614。
2、動物BALB/C，ICR系清潔級小鼠，體重18-20g，SD系清潔級大鼠，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。
3、儀器
BJ-084J熱板測痛儀，江蘇白石醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。
二、方法與結(jié)果本研究采用5個劑量對小鼠鎮(zhèn)痛試驗進行研究，其劑量分別為0.025、0.05、0.10、0.20、0.40/kg(以小鼠計算)。用杜冷丁作陽性對照藥。
1、對醋酸引起的扭體反應的影響(1)方法取BALBC/小鼠70只，雌雄各半，隨機分成7組，除杜冷丁組外，其余各組按表3劑量灌胃給藥1小時，杜冷丁組皮下注射杜冷丁20分后，各鼠腹腔注射0.7％冰醋酸0.1ml/10g，記錄5-15分內(nèi)的扭體次數(shù)。
表3本發(fā)明提供的膠囊不同劑量對小鼠扭體反應的影響組別 動物數(shù)劑量 扭體次數(shù) 抑制率(只)(g/kg) (％)空白對照組10 NS 36.3±13.2-杜冷丁組 10 0.02 2.8±2.2**92.3本發(fā)明提供膠囊I 10 0.02534.5±14.05.0II 10 0.05 31.7±11.212.8III 10 0.10 24.4±14.6*32.8IV 10 0.20 18.9±12.2**52.0V 10 0.40 13.7±8.6**62.3與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
(2)結(jié)果與空白對照組比較本發(fā)明提供的膠囊III、IV、V劑量組小鼠體次數(shù)有顯著性差異，且成較明顯的量效關(guān)系，能明顯抑制由醋酸引起的小鼠扭體反應，表明本發(fā)明提供膠囊具有較好的鎮(zhèn)痛作用，其小鼠鎮(zhèn)痛有效劑量為0.1g/kg左右。相當于杜冷丁的1/5(按劑量比較)。
2、對小鼠熱板痛閾值的影響(1)方法取符合要求(平均痛閾值在30s內(nèi))的BALB/C系雌性小鼠70只，隨機分成7組，除杜冷丁組外，其余各組按表4劑量灌胃給藥1小時，杜冷丁組皮下注射杜冷丁20分后，將小鼠放入熱板測痛儀內(nèi)，熱板溫度為55±0.5℃，自小鼠投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時間為該鼠的痛閾值，隔30分后再測一次，共3次，求出平均痛閾值進行統(tǒng)計。
表4本發(fā)明提供膠囊不同劑量對小鼠熱板痛閾值的影響(X±SD)組別 動物數(shù) 劑量 平均痛閾值(只) (g/kg)空白對照組 10 NS 34.7±10.5杜冷丁組 10 0.02 58.8±2.4**本發(fā)明提供膠囊I10 0.02537.6±6.9II 10 0.05 39.8±11.0III 10 0.10 43.1±12.3*IV 10 0.20 48.4±14.5**V10 0.40 52.4±15.2**與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
(2)結(jié)果與空白對照組比較，本發(fā)明提供膠囊III、IV、V劑量組平均痛閾值有顯著性差異，且成較明顯的量效關(guān)系，能明顯提高小鼠的耐熱痛能力，表明本發(fā)明提供的膠囊具有較好的鎮(zhèn)痛作用，其小鼠鎮(zhèn)痛有效劑量為0.1g/kg左右。相當于杜冷丁的1/5(按劑量比較)。
3、鎮(zhèn)痛作用時間的研究采用小鼠有效劑量0.10/kg，給藥后分別在0.5、1、2、3、4、5、6小時測定小鼠的鎮(zhèn)痛效果。
(1)對醋酸引起扭體反應的影響取BALB/C小鼠90只，雌雄各半，隨機分成9組，分別為空白對照組、杜冷丁組、0.5小時組、1小時組、2小時組、3小時組、4小時組、5小時組、6小時組、除杜冷丁組外，其余各組按表5劑量灌胃給藥，杜冷丁組皮下注射杜冷，前3組在給藥后30分，后5組分別在給藥后1、2、3、4、5、6小時，各鼠腹腔注射0.7％冰醋酸0.1ml/10g，記錄5-15分內(nèi)的扭次次數(shù)。
表5本發(fā)明提供膠囊不同時間對小鼠扭體反應的影響(X±SD)組別動物數(shù) 劑量 扭體次數(shù)(只)(g/kg)空白對照組 10 NS27.6±7.8杜冷丁組10 0.02 1.8±1.7**0.5小時組 10 0.10 18.5±9.4**1小時組 10 0.10 15.6±11.2**2小時組 10 0.10 18.4±9.0**
3小時組100.1020.7±6.3**4小時組100.1022.8±5.4*5小時組100.1024.6±6.16小時組100.1027.0±9.5與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
結(jié)果與空白對照組比較，本發(fā)明提供膠囊0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時小鼠扭體次數(shù)有顯著性差異，且成較明顯的時效關(guān)系，能明顯抑制由醋酸引起的小鼠扭體反應，表明本發(fā)明提供的膠囊在藥后0.5-4小時內(nèi)均具有較好的鎮(zhèn)痛作用。
(2)對小鼠熱板痛閾值的影響取符合要求的(平均痛閾值在30s內(nèi))的BALB/C系雌性小鼠90只，隨機分成9組，分別為空白對照組、杜冷丁組、0.5小時組、1小時組、2小時組、3小時組、4小時組、5小時組、6小時組。除杜冷丁組外，其余各組按表6劑量灌胃給藥，杜冷丁組皮下注射杜冷丁，前3組在給藥后30分，后5組分別在給藥后1、2、3、4、5、6小時，將各組小鼠放入熱板測痛儀內(nèi)，熱板溫度為55±0.5℃，自小鼠投入熱板至出現(xiàn)舔后足的時間為該鼠的痛閾值，隔30分后再測一次，共3次，求出平均痛閾值進行統(tǒng)計。
表6本發(fā)明提供膠囊不同時間對小鼠熱板痛閾值的影響(X±SD)組別動物數(shù) 劑量扭體次數(shù)(只) (g/kg)空白對照組 10 NS 20.8±5.4杜冷丁組10 0.0255.9±2.4**0.5小時組 10 0.1031.5±7.2**1小時組 10 0.1034.9±2.8**2小時組 10 0.1035.2±5.0**3小時組 10 0.1029.0±4.8**4小時組 10 0.1025.6±4.4*5小時組 10 0.1023.2±5.16小時組 10 0.1022.2±5.9與空白對照組比較P＞0.05，***與空白對照組比較P＜0.01。
結(jié)果與空白對照組比較，本發(fā)明提供的膠囊0.5小時、1小時、2小時、3小時、4小時組小鼠平均痛閾值有顯著性差異，且成較明顯的時效關(guān)系，能明顯提高小鼠的耐熱痛能力，表明本發(fā)明提供膠囊在給藥后0.5-4小時內(nèi)均具有較好的鎮(zhèn)痛作用。
4、對鎮(zhèn)痛部位的研究方法取SD清潔級大鼠50只，雄性，隨機分成5組，于每鼠右后足跖注射20％啤酒酵母混懸液0.1ml，造成無菌性炎癥水腫后1小時，除杜冷丁組外，其余各組按表7劑量胃給藥1小時，杜冷丁組皮下注射杜冷丁20分后，用尾部壓痛裝置測定各鼠雙后足跖的痛閥值，比較在左右后跖的痛閥值。
表7本發(fā)明提供膠囊對大鼠鎮(zhèn)痛部位的影響(X±SD)組別 動物數(shù)劑量右足跖痛閥 左足跖痛閥(只) (g/kg) (g)(g)空白對照組10NS 4.3±1.925.2±6.9杜冷丁組 100.0221.6±2.5**121.0±21.5**本發(fā)明提供膠囊低劑量組100.107.5±4.3*30.5±11.3本發(fā)明提供膠囊中劑量組100.208.2±3.7**33.8±12.0*本發(fā)明提供膠囊高劑量組100.4010.6±5.8**35.3±17.8*與至白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 。
與空白對照組比較，本發(fā)明提供膠囊癌低、中、高組大鼠右足跖(炎癥中跖)的痛閥值顯著性提高，升高幅度在70％以上；而左右跖(非炎癥足跖)只有中、高劑量的痛閥值顯著性升高，升高幅度只有30％，表明本發(fā)明提供膠囊可能為外周鎮(zhèn)痛與中樞鎮(zhèn)痛兼有的鎮(zhèn)痛藥物，杜冷丁則為明顯的中樞鎮(zhèn)痛藥物。
本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛藥物依賴性實驗1、試驗材料1.1藥物與試劑本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛膠囊，用時配成13.3mg/ml、26.7mg/ml混懸液美菲康(鹽酸嗎啡控釋片)西南藥業(yè)股份有限公司，批號980801，用時配成2.9mg/ml、6.67mg/ml。
1.2動物
BALB/C清潔級小鼠，雌雄各半，體重20～24g，由上海西普爾-必凱公司提供。
SD大鼠，雌雄各半，體重200-220g，由上海西普爾-必凱公司提供。
2、試驗方法和結(jié)果2.1自然戒斷試驗2.1.小鼠自然戒斷試驗2.1.1.1方法取小鼠40只，雌雄各半2，隨分為為4組，分別給予蒸餾水.鹽酸嗎啡及高、低二個劑量藥物。第1～3天按每日劑量平均分四次給藥，第4～7天每日上、下午在固定時間內(nèi)灌胃一次，連續(xù)給藥7天，于第7天起，72小時內(nèi)每隔4小時測一次體重，記錄體重變化情況，并觀賞動物的精神、活動、飲食等情況，記錄停藥后動物的變化。見表8。
表8對小鼠自然戒斷癥狀的影響(X±SD)組別 劑量(mg/kg.日) 動物(只) 體重變化空白 10 0.01±0.45鹽酸嗎啡 20010 1.12±0.6g***藥物 40010 0.23±0.49*藥物 80010 0.19±0.59**與空白對照組比較，P＞0.05，***與空白對照組比較P＜0.01。
2.1.1.2試驗結(jié)果動物在頭三天給藥后，進食減少，活動遲緩，三天后恢復正常，各組動物在停止給藥后48小時內(nèi)，活動無異常情況，各組也未見興奮狀態(tài)。由表8可見，在72小時觀察期內(nèi)，空白組動物體重無異常變化，藥物市、兩個劑量動物體重變化很小，與空白對照組比較無顯著性差異，而鹽酸嗎啡組動物體重出現(xiàn)明顯減輕。與空白對照組比較有非常顯著性的差異。鹽酸嗎啡組動物在停藥后出現(xiàn)體重下降，在停藥第12～24內(nèi)為體重減輕最明顯的。隨后，體重逐步恢復。而給藥組未出現(xiàn)這種情況。
2.1.2大鼠自然戒斷試驗將動物隨機分為組，分別灌胃給予蒸餾水、鹽酸嗎啡及高、低二個劑量藥物組。第1～3天按每日劑量平均分成四次給藥，第4～7天分二次給藥，給藥時間為800、1100、1400、1 700和800、400。共給藥7天。于第7天起，72小時內(nèi)每隔4小時測一次體重，記錄體重變化情況，并觀察動物的精神、活動、飲食等情況，詳細記錄停藥后的變化情況。見表9。
表9對大鼠自然戒斷癥狀的影響(X±SD)組別 劑量(mg/kg·日) 動物(只) 體重變化(g)空白10 -0.86±0.98鹽酸嗎啡 200 10 -8.54±0.63***藥物 400 10 -1.24±0.83*藥物 800 10 -1.62±0.88**與空白對照組比較，P＞0.05，***與空白組比較P＜0.01。
2.1.2.2試驗結(jié)果動物在給藥初期(頭三天左右)，進食減少，活動遲緩，三天后逐漸恢復正常?；謴驼：蠹巴Ｋ?8小時內(nèi)，各組動物活動無異常情況，也未見興奮狀態(tài)。從表9可見在72小時觀察期內(nèi)，空白組動物體重逐日略有增加，其體重減輕最大值亦只有0.86g，體重變化非常小。藥物高、低兩個劑量組動物體重最大下降量也很小，與空白對照組比較，無顯著差異。鹽酸嗎啡組動物在停藥后48小時的中段體重持續(xù)下降，在停藥第12～18小時內(nèi)下降最大，隨后，體重小幅回升，至觀察期結(jié)束，體重仍未恢復正常，而給藥組未出現(xiàn)這種體重變化情況。
2.2催促戒斷試驗2.2.1小鼠催促戒斷試驗2.2.1.1試驗方法取小鼠40只，雌雄各半，按體重隨機分為空白、嗎啡、小、大劑量藥物組4組，后三組按15ml/kg灌胃給藥，每日二次，頭4嗎啡組和藥物組劑量分別為60mg/kg、180mg/kg、332mg/kg、665mg/kg；空白對照組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥13天，在第14天900至1200之間腹腔注射納洛酮30mg/kg，立即放入大玻璃容器內(nèi)測定小鼠20分內(nèi)的跳躍數(shù)，并觀察2小時小鼠的行為，測量體重和排便。
2.2.1.2試驗結(jié)果由表10可見，經(jīng)注射納洛酮后，嗎啡組動物在2小時觀察期內(nèi)明顯比其他幾組動物興奮，表現(xiàn)為跳躍、濕狗樣抖動、腹瀉、前爪震顫、流淚等。與空白對照組比較，嗎啡組小鼠跳躍數(shù)，腹瀉只數(shù)及體重政降均有明顯的差異，而鎮(zhèn)痛II號膠囊大、小劑量組均無明顯差異。見表10。
表10鎮(zhèn)痛II號膠囊對小鼠催促戒斷的影響組別 平均劑量 N跳躍 體重變化 腹瀉(mg/kg·日)(次) (g) (只)空白對照組- 10 0.6±1.20.06±0.18 0嗎啡組157 10 22.3±14.8***-0.17±0.32***10***小劑量組 332 10 0.8±0.9*-0.12±0.14*0大劑量組 665 10 0.3±0.5*0.02±1.3*0*與空白對照組比較P＞0.5，***與空白對照組比較P＜0.01。
2.2.2對大鼠催促戒斷試驗2.2.2.1試驗方法取大鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，嗎啡組和藥物組灌胃給藥，每日二次，連續(xù)給藥14天，空白對照組給予同體積的生理鹽水；第14在800末次給藥后40分皮下注射納洛酮4mg/kg，然后立即觀察記錄1小時內(nèi)大鼠的戒斷反應癥狀。并于30、60分稱體重。
2.2.2.2試驗結(jié)果由表11可見，經(jīng)注射納洛酮后，嗎啡動物在觀察期明顯比其他幾組動物興奮，表現(xiàn)為跳躍、顯狗樣抖動、腹瀉、流淚、咬牙、前爪震顫等。與空白對照組比較，嗎啡的大鼠跳躍數(shù)，腹瀉只數(shù)及體重下降均有明顯的差異，而本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛膠囊大、小劑量組各項指示均無明顯差異。
表11本發(fā)明提供的膠囊對大鼠催促戒斷的影響組別 平均劑量 N 跳躍 體重變化(g)腹瀉(mg/kg.日) (次) 30min 60min (只)空白對照組 - 10 0.2±0.45 0.48±0.24 0.31±0.18 0嗎啡組 15010 19.4±11.2***-4.62±1.64***-4.89±1.76***10***小劑量組 30010 0.0±0.0*0.06±0.86*0.12±0.20*0大劑量組 60010 0.3±0.5*-0.13±0.37*0.02±0.65*0與空白對照組比較***P＜0.01，*P＞0.05。
3討論經(jīng)大、小鼠自然戒斷和催促戒斷試驗，本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛膠囊太、小劑量組各戒斷指標與空白對照組比較，均無顯著性的差異，而嗎啡組則有明顯的差異，表現(xiàn)出明顯的依賴性。表明本發(fā)明提供的鎮(zhèn)痛膠囊沒有身體依賴性。
權(quán)利要求
1.具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物。
2.具有式(II)結(jié)構(gòu)的化合物。
3.制備權(quán)利要求1或2所述的化合物的方法，(1)以安絡小皮傘為原料，用乙醇提??；(2)回收乙醇后得清膏，用水稀釋并調(diào)PH值為8--9，脫脂后，用氯仿萃??；(3)回收氯仿后得稠膏，上硅膠H柱，用丙酮洗脫；(4)回收丙酮后得稠膏，用醋酸乙酯洗滌，抽濾得結(jié)晶；(5)將得到的結(jié)晶上硅膠H柱，用丙酮洗脫，第1出峰的為生物堿I，第2出峰的為生物堿II，再用醋酸乙酯-丙酮(2∶1)重結(jié)晶，進一步純化分離得到生物堿I、II。
4.一種鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于其中的有效成分是權(quán)利要求1所述的化合物I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于上述有效成分的含量大于25％。
6.一種鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于其中的有效成分是權(quán)利要求2所述的化合物II。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于還含有化合物II。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鎮(zhèn)痛藥物，其特征在于化合物II的含量大于25％
9.制備權(quán)利要求7或8所述的鎮(zhèn)痛藥物的方法，其特征在于它是以安絡小皮傘為原料提取的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的鎮(zhèn)痛藥物的方法，其特征在于(1)以安絡小皮傘為原料，用乙醇提??；(2)回收乙醇后得清膏，用水稀釋并調(diào)PH值為8-9，脫脂后，用氯仿萃?。?3)回收氯仿后得稠膏，上硅膠H柱，用丙酮洗脫；(4)回收丙酮后得稠膏，用醋酸乙酯洗滌，抽濾得結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有鎮(zhèn)痛作用的化合物及其藥物和該藥物的制備方法?，F(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物在鎮(zhèn)痛效果好的條件下，具有依賴性。本發(fā)明提供了兩種化合物(I)、(II)，該兩種化合物均具有良好的鎮(zhèn)痛效果，同時還不產(chǎn)生依賴性。本發(fā)明還提供了該兩種化合物的制備方法，和鎮(zhèn)痛藥物的制備方法。
文檔編號A61K31/445GK1428334SQ0113164
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者高守泉, 謝昭明, 李勇敏, 朱紹雄, 王曉洪, 唐正平 申請人:湖南隆來福生物工程有限公司