專利名稱：HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
目前全世界每年新增1000萬癌癥患者，而且癌癥的發(fā)病率呈急劇上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，每年全世界死于癌癥患者約600萬。我國1995年主要疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成中，惡性腫瘤排列第2位，占死亡總?cè)藬?shù)的21.85％。其中發(fā)病率較高的腫瘤有胃癌(占癌總死亡率21.76％)、肝癌(17.83％)、肺癌(15.19％)、食管癌(15.02％)等。長期以來，由于腫瘤高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的惡性特點，一直是治療療效亟待解決的問題。目前國內(nèi)外抗癌治療關(guān)注的熱點之一是抗腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移規(guī)律極其復(fù)雜，涉及諸多因素，如(1)蛋白水解酶；(2)血管生成因子；(3)粘附因子，如整合素，選擇素，鈣粘合素等；(4)相關(guān)運動因子；(5)瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞分泌蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)最為重要，目前已發(fā)現(xiàn)了20余種，它們幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。MMPs的作用可概括為(1)降解間質(zhì)，破壞膠原限制腫瘤生長的機械屏障作用；(2)破壞基底膜完整性，利于癌細(xì)胞穿過血管壁進入血流；(3)通過對細(xì)胞外基質(zhì)的改建，促進腫瘤新生血管或轉(zhuǎn)移灶的形成。由于MMPs在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的重要作用，因而腫瘤組織中MMPs的來源一直是人們研究的重點問題。近年來多個實驗室研究發(fā)現(xiàn)，CD147分子與腫瘤細(xì)胞膜有關(guān)，可刺激腫瘤間質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌MMPs，且最近的一篇文獻(xiàn)報道，CD147分子不僅能刺激MMPs的產(chǎn)生，而且還與MMPs在腫瘤細(xì)胞表面形成復(fù)合物，這種復(fù)合物的形成相當(dāng)于將MMPs濃縮在腫瘤細(xì)胞周圍，有利于腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)的降解，使腫瘤細(xì)胞易于擴散和轉(zhuǎn)移。目前，抗間質(zhì)降解多采用酶抑制劑，如天然酶抑制劑—組織型金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)，能夠與MMPs結(jié)合并抑制酶活性，但TIMPs在組織中含量極微且難于提取，人工重組TIMPs是大分子蛋白質(zhì)，存在降解和口服吸收不良等問題。人工合成的擬肽類金屬蛋白酶抑制劑，如Batimastat(BB-94)，只能抑制早期腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMPs的活性，幾乎不能抑制晚期腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量MMPs的活性，導(dǎo)致III期臨床實驗的停止。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)在我國患病人數(shù)達(dá)300余萬。發(fā)病年齡輕，致殘率高。其臨床特點為累及到周身關(guān)節(jié)的增殖性和侵蝕性滑膜炎，呈進行性病變終生反復(fù)不斷，被認(rèn)為是類似“局限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性病變，自發(fā)性緩解極為罕見。晚期由于關(guān)節(jié)軟骨及骨的損傷而導(dǎo)致關(guān)節(jié)強直、畸形和功能障礙，病變亦可侵犯漿膜、心肺、動脈、神經(jīng)及眼等結(jié)締組織。RA組織病理學(xué)特征是滑膜襯里過度增生和襯里下層大量炎性單個核細(xì)胞浸潤。成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和滑膜組織巨噬細(xì)胞在關(guān)節(jié)損傷中起最重要的作用。這兩種細(xì)胞均能大量產(chǎn)生MMPs。此外，骨關(guān)節(jié)炎與老齡化密切相關(guān)，隨著人類壽命的延長發(fā)病率增高，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs，亦在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用。這些酶以協(xié)同作用方式能夠消化滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的所有主要的細(xì)胞外基質(zhì)組分。RA滑膜中EMMPRIN(CD147)的表達(dá)上調(diào)，可誘導(dǎo)局部產(chǎn)生MMPs1、2、3等蛋白水解酶，且可導(dǎo)致MMPs和TIMPs的不平衡最終引起RA關(guān)節(jié)的破壞。此病至今尚無特效治療。90年代以來，國內(nèi)外學(xué)者采用仿效結(jié)核病和惡性腫瘤的聯(lián)合療法，是此類疾病治療學(xué)上的一大突破，使部分患者病情得到較長期緩解，生活質(zhì)量得到提高，但并未治愈疾病。抑制軟骨和骨侵蝕仍是此病治療亟待解決的問題。但迄今有關(guān)應(yīng)用酶抑制劑抗間質(zhì)降解的臨床實驗結(jié)果與上述抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療一樣令人失望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種具有抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的作用的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑及其制備方法和用途，從高位阻斷效應(yīng)細(xì)胞分泌MMPs，則對腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療可能更為有效。篩選有效的EMMPRIN(CD147)肽類拮抗劑，在高位阻斷效應(yīng)細(xì)胞分泌MMPs，也是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎治療的新途徑和發(fā)展趨勢。
本發(fā)明是以下述方式實現(xiàn)的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑，針對靶抗原HAb18G(/CD147)的肽類拮抗劑的序列如下，(1)Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr Thr(2)Leu His Arg His Ser His Gly His Ser Tyr Lys Ser(3)Gly His Trp His Asn His Arg His Gln Ala Pro Leu(4)Lys Tyr Pro His Gln His Leu His Met His Asp Ser(5)Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gln His Ser(6)Tyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro Asn(7)Ala Asn Ile Val Pro Ile His Ala Asn His Phe Gln(8)Met His Lys His Pro His Gly Ser Gln Gly Pro Thr(9)Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑的制備方法如下所述用人新鮮肝癌組織免疫小鼠而得到鼠源性肝癌高特異性單克隆抗體HAb18，將該單抗交聯(lián)在凝膠顆粒Sepharose-4B上，制成親和層析柱，將大量培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞裂解，裂解液經(jīng)上述的親和層析柱結(jié)合、洗脫、收集過程，得到純的肝癌抗原HAb18G。
肝癌抗原HAb18G經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，為單一條帶，分子量約60kd。
用此單抗從人肝癌組織cDNA文庫中篩選得到其相應(yīng)抗原分子HAb18G，其核苷酸序列與白細(xì)胞分化抗原CD147分子核苷酸序列高度同源。
用HAb18G純抗原篩選噬菌體隨機12肽庫，獲得9條HAb18G結(jié)合肽段序列，通過固相合成法合成這9條多肽。
所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑作為制備抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎治療劑的應(yīng)用。
所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑基礎(chǔ)上根據(jù)三維定量構(gòu)效關(guān)系分析的結(jié)果，將拮抗劑序列中的L-型氨基酸置換為D-型氨基酸，或用納米脂質(zhì)體包裹制備臨床用制劑，作為制備抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移；抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎治療劑的應(yīng)用。
本發(fā)明人在長期從事肝癌免疫導(dǎo)向藥物研究的基礎(chǔ)上，獲得肝癌高親和力單抗HAb18的相應(yīng)膜抗原HAb18G的cDNA全長序列，發(fā)現(xiàn)其與CD147的序列高度同源，通過基底膜侵襲實驗和明膠酶譜實驗分析，體外實驗表明HAb18G(/CD147)與其效應(yīng)細(xì)胞(癌周成纖維細(xì)胞)結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生MMPs，使腫瘤組織中MMPs含量及活性顯著提高，間質(zhì)成分和血管基底膜的膠原蛋白過度降解，癌細(xì)胞穿過基底膜及結(jié)締組織屏障不斷侵襲擴散，證實HAb18G分子在肝癌中發(fā)揮的作用同CD147分子在其它腫瘤上發(fā)揮的作用相同，可大大促進肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，以及HAb18G在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，在肝癌上為高表達(dá)的特點，故可通過阻斷HAb18G(/CD147)分子的作用來抑制肝癌轉(zhuǎn)移。本發(fā)明首次以肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子HAb18G為靶向分子，設(shè)計、篩選并合成它的肽類拮抗劑；阻斷效應(yīng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞)誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能；減少腫瘤組織間質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成；達(dá)到治療肝癌等腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的目的。明膠酶譜實驗結(jié)果與細(xì)胞侵襲力抑制實驗結(jié)果相符。體內(nèi)功能實驗用合成多肽對荷人肝細(xì)胞癌裸鼠進行治療，發(fā)現(xiàn)其中1號和6號多肽對肝癌成瘤性有明顯抑制作用。經(jīng)體內(nèi)外實驗證明，這類肽類拮抗劑對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制率為4.35％～65.22％，因此，該類肽類拮抗劑極具新藥開發(fā)的前景。
鑒于MMPs通過直接降解軟骨、骨組織和間接促進血管形成而參與RA關(guān)節(jié)破壞。因此抑制MMPs是治療RA的基本途徑之一。我們經(jīng)免疫組化法證明HAb18G(/CD147)分子在滑膜細(xì)胞上有明確定位。所以，該拮抗劑可能在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療中具有潛在的應(yīng)用價值。


附圖為HAb18G核苷酸序列和CD147核苷酸序列。
具體實施例方式
1。制備HAb18G純抗原(1)將用人新鮮肝癌組織免疫小鼠而得到鼠源性肝癌高特異性單克隆抗體HAb18交聯(lián)在Sepharose-4B凝膠介質(zhì)上，制成親和層析柱；(2)將大量培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞(HHCC)裂解，經(jīng)離心、透析后，上親和層析柱，結(jié)合、洗脫、收集，得到HAb18G純抗原。
2。肝癌抗原HAb18G經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，為單一條帶，分子量約60kd。
3。用單克隆抗體HAb18篩選肝癌細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫，得到HAb18G的cDNA序列，其序列與Genbank中CD147分子的序列高度同源，參見附圖。
4。用HAb18G純抗原篩選噬菌體隨機12肽庫，獲得9條HAb18G結(jié)合肽段，它們的序列如下Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr ThrLeu His Arg His Ser His Gly His Ser Tyr Lys SerGly His Trp His Asn His Arg His Gln Ala Pro LeuLys Tyr Pro His Gln His Leu His Met His Asp SerIle Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gln His SerTyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro AsnAla Asn Ile Val Pro Ile His Ala Asn His Phe GlnMet His Lys His Pro His Gly Ser Gln Gly Pro ThrTyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro5。將這9條肽進行體外化學(xué)合成、純化，經(jīng)FPLC鑒定純度達(dá)99％以上。
6。體外功能實驗采用細(xì)胞侵襲力抑制實驗，即將待驗證的肽類拮抗劑加入到底層鋪有Matrigel膠的肝癌細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)物中，經(jīng)過20h左右的培養(yǎng)后，檢測穿過Matrigel膠的肝癌細(xì)胞較對照是否有減少，并計算肽類拮抗劑對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制率。結(jié)果如下組別 穿過細(xì)胞數(shù) 抑制率(％)對照組231號肽 1439.134號肽 1343.486號肽 8 65.227號肽 224.359號肽 1056.52這些肽類拮抗劑中4條肽具有明顯抑制肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的功能，最高抑制率可達(dá)65.22％。我們還采用了明膠酶譜方法結(jié)果與細(xì)胞侵襲力抑制實驗一致。
7。體內(nèi)功能實驗將肝癌細(xì)胞HHCC接種到裸鼠雙側(cè)脅部，接種后立即經(jīng)尾靜脈注入HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑(2.5mg/kg)，同時設(shè)立對照。實驗證明，其中1號和6號肽類拮抗劑對肝癌成瘤性有明顯抑制作用。當(dāng)對照組在第11天每只裸鼠都成瘤時，其中6號肽類拮抗劑試驗組裸鼠均未成瘤。此外，治療組平均生存期比對照組延長一倍以上。
8。免疫組化法證明HAb18G(/CD147)在滑膜中表達(dá)將HAb18G(/CD147)單抗與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織經(jīng)免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞有HAb18G(/CD147)分子的表達(dá)。
9。新型制劑的研究對HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑進行改造根據(jù)三維定量構(gòu)效關(guān)系分析的結(jié)果，將拮抗劑序列中的L-型氨基酸置換為D-型氨基酸，或用納米脂質(zhì)體包裹制備制劑，以延長其半衰期，增加其在體內(nèi)的生物利用度及其活性。
權(quán)利要求
1.HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑，其特征在于針對靶抗原HAb18G的肽類拮抗劑的序列如下，(1)Met Thr His Asp Pro Val Ile Ser Leu Pro Thr Thr(2)Leu His Arg His Ser His Gly His Ser Tyr Lys Ser(3)Gly His Trp His Asn His Arg His Gln Ala Pro Leu(4)Lys Tyr Pro His Gln His Leu His Met His Asp Ser(5)Ile Gly Trp His Tyr Tyr Leu Arg Thr Gln His Ser(6)Tyr Pro Phe His His Lys His Trp His Arg Pro Asn(7)Ala Asn Ile Val Pro Ile His Ala Asn His Phe Gln(8)Met His Lys His Pro His Gly Ser Gln Gly Pro Thr(9)Tyr Lys Leu Pro Gly His His His His Tyr Arg Pro
2.制備如權(quán)利要求1所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑的方法，其特征在于用人新鮮肝癌組織免疫小鼠而得到鼠源性肝癌高特異性單克隆抗體HAb18，將該單抗交聯(lián)在凝膠顆粒Sepharose-4B上，制成親和層析柱，將大量培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞裂解，裂解液經(jīng)上述的親和層析柱結(jié)合、洗脫、收集過程，獲得HAb18G純抗原；HAb18G抗原經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測，為單一條帶，分子量約60kd；用肝癌單抗HAb18從人肝癌組織cDNA文庫中篩選得到其相應(yīng)抗原分子HAb18G，其核苷酸序列與白細(xì)胞分化抗原CD147分子核苷酸序列高度同源；用HAb18G純抗原篩選噬菌體隨機12肽庫，獲得9條HAb18G結(jié)合肽序列，用固相合成法合成這9條短肽。
3.如權(quán)利要求1所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑，其特征在于所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑作為制備抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎治療劑的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑，其特征在于所述的HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑基礎(chǔ)上，根據(jù)三維定量構(gòu)效關(guān)系分析的結(jié)果，將拮抗劑序列中的L-型氨基酸置換為D-型氨基酸，或用納米脂質(zhì)體包裹制備臨床使用制劑，作為制備抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎治療劑的應(yīng)用。
全文摘要
HAb18G(/CD147)肽類拮抗劑及其制備方法和用途涉及生物技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明是能抗間質(zhì)降解和抗炎的一組多肽類物質(zhì)。本發(fā)明首次以肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子HAb18G為靶向分子,設(shè)計、篩選并合成它的肽類拮抗劑;阻斷效應(yīng)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞)誘導(dǎo)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的功能;減少腫瘤組織間質(zhì)的降解、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、新生血管(血管翳)的形成;達(dá)到治療肝癌等腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的目的。經(jīng)體內(nèi)外實驗證明,這類肽類拮抗劑對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制率為4.35%～65.22%,HAb18G(/CD147)分子在滑膜細(xì)胞上有明確定位。因此,該類肽類拮抗劑極具新藥開發(fā)的前景。
文檔編號A61P19/02GK1374320SQ0113173
公開日2002年10月16日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者陳志南, 黃寶成, 商澎, 騫愛榮, 朱平 申請人:陳志南