專利名稱：一種融合防齲dna疫苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種PAc和GTFs融合防齲DNA疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
齲病是一種細(xì)菌感染性疾病，許多學(xué)者已證明變形鏈球菌屬(MutansStreptococci)與齲病有高度相關(guān)性，其中Streptococcus mutans和Streptococcussobribus是引起人類齲病最主要的致病菌。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferaesGTFs)和表面蛋白(surface protein antigen PAc)(又稱為抗原B、I/II、IF、P1)是變形鏈球菌的重要致齲毒力因子。GTFs合成葡聚糖并介導(dǎo)變形鏈球菌在牙面的葡聚糖依賴性粘附，PAc參與介導(dǎo)了細(xì)菌與牙面獲得性膜的非葡聚糖依賴性粘附。PAc蛋白中富含丙氨酸的A區(qū)和富含脯氨酸的P區(qū)為主要的粘附功能區(qū)和免疫活性區(qū)；GTFs包含有兩個免疫活性區(qū)和功能區(qū)催化功能區(qū)(catalyticregion CAT)和葡聚糖結(jié)合區(qū)(glucan binding region GLU)。變形鏈球菌主要合成三種GTFsGTF-I、GTF-SI、GTF-S，其中GTF-I主要合成以α-1，3糖苷鍵為主的水不溶性葡聚糖，其編碼基因為gtfB。
Taubman等人將根據(jù)Streptococcus downei的GTF-I催化功能區(qū)的448-457氨基酸序列合成的短肽CAT和葡聚糖結(jié)合功能區(qū)的1303-1324氨基酸序列合成的短肽GLU與完全弗氏佐劑混合后免疫SD大鼠能夠引起明顯的血清和唾液抗Streptococcus sobrinus葡糖基轉(zhuǎn)移酶抗體(Taubman，M.A.，D.J.Smith，C.J.Holmberg，and J.W.Eastcott.2000.Coimmunization with complementaryglucosyltransferase peptides results in enhanced immunogenicity and protectionagainst dental caries.Infect Immun 682698-703.)。Jespersgaard等人將CAT和GLU多肽免疫兔獲得特異性抗體能夠明顯抑制變形鏈球菌的GTF合成葡聚糖。將CAT和GLU多肽以鼻內(nèi)滴注免疫小鼠誘導(dǎo)了明顯的粘膜IgA免疫反應(yīng)(Jespersgaard，C.，G.Hajishengallis，T.E.Greenway，D.J.Smith，M.W.Russell，andS.M.Michalek.1999.Functional and immunogenic characterization of two clonedregions of Streptococcus mutans glucosyltransferase I.Infect Immun 67810-6.)。Saito等學(xué)者采用變形鏈球菌表面蛋白抗原(PAc)和粘膜佐劑霍亂毒素A亞單位突變體(mCT E112K)共同經(jīng)鼻粘膜免疫小鼠，結(jié)果在唾液和鼻腔分泌物中檢測到明顯的特異的分泌型抗PAc抗體，同時在頜下腺和鼻腔中檢測到大量分泌特異分泌型抗PAc抗體的形成細(xì)胞，體外再刺激后發(fā)現(xiàn)頸淋巴結(jié)CD4(+)細(xì)胞明顯增殖。而且免疫小鼠后，可以顯著降低口腔變鏈菌的聚集。說明PAc和mCT E112K復(fù)合體有望成為有效的粘膜防齲疫苗(Saito，M.，S.Otake，et al.(2001).″Protective Immunity to Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccinationwith Surface Protein Antigen and Mutant Cholera Toxin Adjuvant.″J InfectDis 183(5)823-826.)。Oishi等認(rèn)為單獨用一種源于PAc蛋白A區(qū)的13肽免疫動物幾乎不能產(chǎn)生抗體，但是在二聚肽間加入氨基酸殘基，尤其是賴氨酸片段，可以明顯增強(qiáng)PAc蛋白A區(qū)的13肽的抗原性(Oishi，Y.，A.Onozuka，etal.(2001).″The effect of amino acid spacers on the antigenicity ofdimeric peptide-inducing cross-reacting antibodies to a cell surfaceprotein antigen of Streptococcus mutans.″Oral Microbiol Immunol 16(1)40-44.)。Oho等人構(gòu)建了包含變形鏈球菌表面蛋白抗原(PAc)和葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)的GLU區(qū)的融合蛋白疫苗，并免疫奶牛，獲得了含有抗PAc和GTF的特異性抗體，可以抑制Streptococcus mutans與唾液包被的羥基磷灰石珠的粘附。(Oho，T.，Y.Shimazaki，M.Mitoma，M.Yoshimura，Y.Yamashita，K.Okano，Y.Nakano，H.Kawagoe，M.Fukuyama，N.Fujihara，and T.Koga.1999.Bovine milkantibodies against cell surface protein antigen PAc-glucosyltransferase fusion proteinsuppress cell adhesion and alter glucan synthesis of Streptococcus mutans.J Nutr1291836-41.)然而以上的各種防齲多肽疫苗存在許多不足之處，首先是這些多肽制備純化困難，一般需耗時數(shù)周且費用昂貴，保存需要特殊條件；其次，多肽防齲疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)的能力較差，常需添加各種對人體有害的免疫佐劑；多肽防齲疫苗與其它多肽疫苗一樣，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的持續(xù)時間一般較短，需反復(fù)多次接種才能達(dá)到較滿意的結(jié)果；另外多肽疫苗一般不能誘導(dǎo)嬰幼兒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNA vaccines.CMLS，Cell.Mol.Life Sci.，55751-770)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種融合防齲DNA疫苗，將擴(kuò)增出的編碼變形鏈球菌GS-5株葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I的基因gtfB的葡聚糖結(jié)合區(qū)的序列GLU克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pCIA-P中獲得pGLUA-P融合防齲DNA疫苗。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備融合防齲DNA疫苗的制備方法，生產(chǎn)方法簡便，成本低廉，純化簡單且產(chǎn)物純度高。
本發(fā)明所提供的大腸桿菌(Escherichia coli)JM109/pGLUA-P，CCTCC NOM201042。其特征在于運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，采用正鏈引物5’TCACTCGAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAA3’；負(fù)鏈引物5’CCCGGGTTAGTCGACAATCCGAACTCGTTC3’，從攜帶有變形鏈球菌GS-5株葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I的基因gtfB的質(zhì)粒pYNB13中擴(kuò)增出編碼葡聚糖結(jié)合區(qū)的序列GLU，并克隆到真核載體pCI中，構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pGLU。經(jīng)DNA序列測定，證實其插入序列的正確性。再將pCIA-P質(zhì)粒中的變形鏈球菌表面蛋白PAc的A區(qū)和P區(qū)的A-P片段序列與pGLU質(zhì)粒連接，構(gòu)建出GTF-PAc融合防齲DNA疫苗pGLUA-P。與其它DNA疫苗相比，pGLUA-P具有巨細(xì)胞病毒CMV的早期啟動子/增強(qiáng)子(CMV IE Pro/En)，該啟動子增強(qiáng)表達(dá)的能力顯著高于其它如勞斯肉瘤病毒啟動子LTR、猴病毒40(SV40)等啟動子。另外，pGLUA-P的輔助增強(qiáng)表達(dá)成分中還含有人β球蛋白基因內(nèi)含子序列，細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)實驗表明，該內(nèi)含子序列可顯著增加基因表達(dá)，較之僅有CMV啟動子而無此內(nèi)含子的另一個優(yōu)秀真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(Invitrogen公司)，pCI的表達(dá)能力要強(qiáng)10到40倍。pGLUA-P質(zhì)粒中的氨芐青霉素抗性基因(AmpR)內(nèi)含有兩個5’-AACGTT-3’拷貝，該拷貝屬于免疫刺激DNA序列(ImmunostimulatoryDNA sequence，ISS)具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN等細(xì)胞因子，促進(jìn)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答的作用。
與多肽防齲疫苗相比，pGLUA-P DNA防齲疫苗具有以下優(yōu)點①pGLUA-P質(zhì)粒物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，常溫下即可保存，便于運(yùn)輸使用，而多肽疫苗一般需要低溫冷藏保存等特殊條件；②pGLUA-P簡化了疫苗的生產(chǎn)步驟，僅需完成基因工程的上游部分，省卻了下游重組多肽的表達(dá)和純化過程，短時間內(nèi)可以得到大量的質(zhì)粒，而且pGLUA-P質(zhì)粒的純化方法較為簡單且產(chǎn)物純度很高，而多肽疫苗制備純化相對困難復(fù)雜，一般需耗時數(shù)周；③多肽防齲疫苗激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力較差，需要添加各種免疫佐劑，但這些佐劑經(jīng)常引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，大大限制了多肽疫苗的應(yīng)用，而pGLUA-P質(zhì)粒DNA疫苗本身含有CpG免疫刺激序列可以作為免疫佐劑顯著提高機(jī)體對pGLUA-P的免疫反應(yīng)，避免使用各種對人體有害的佐劑；④多肽疫苗一般不能誘導(dǎo)嬰幼兒產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但pGLUA-P疫苗可以接種乳鼠誘導(dǎo)特異性抗PAc抗體，該特點十分有利于保護(hù)兒童中的齲病易感人群；⑤pGLUA-P如同其他DNA疫苗一樣在被以任何途徑輸入體內(nèi)后，都可能在被轉(zhuǎn)染的少量細(xì)胞中長期表達(dá)GLUA-P融合蛋白，不斷地刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)長時間的免疫反應(yīng)。相反多肽疫苗在體內(nèi)很不穩(wěn)定易被蛋白酶降解，因而要接種較大量才能引起明顯的免疫反應(yīng)，且要多次接種以維持效果。另外，pGLUA-P能夠表達(dá)變形鏈球菌的兩種重要毒力因子，細(xì)胞和動物實驗已證明pGLUA-P能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體和抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展，其防齲效果比僅攜帶A-P片段的DNA疫苗為佳。


圖1 為PAc和GTFs融合防齲DNA疫苗結(jié)構(gòu)示意圖CMV immediate-early enhancer/promoter巨細(xì)胞病毒早期啟動子/增強(qiáng)子Chimeric intron 人β球蛋白基因內(nèi)含子序列T7promoter T7噬菌體啟動子GLUA-P fragment GLUA-P重組DNA片段SV40 late polyA signal SV40病毒晚期加尾信號Phage f1 region 絲狀噬菌體f1復(fù)制子AmpR 氨芐青霉素抗性基因SalI(1957) 限制性內(nèi)切酶SalI的酶切位點XhoI(1964) 限制性內(nèi)切酶XhoI的酶切位點KpnI(1075) 限制性內(nèi)切酶KpnI的酶切位點HindIII(748) 限制性內(nèi)切酶HindIII的酶切位點PAc和GTFs融合防齲DNA疫苗pGLUA-P攜帶有變形鏈球菌兩個重要毒力因子的免疫活性區(qū)和功能區(qū)基因序列即葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I中葡聚糖結(jié)合區(qū)(GLU)序列以及表面蛋白PAc編碼A區(qū)和P區(qū)(A-P)序列，并有能夠啟動和增強(qiáng)基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的多種控制元件包括巨細(xì)胞病毒早期啟動子/增強(qiáng)子、人β球蛋白基因內(nèi)含子序列、SV40病毒晚期加尾信號。巨細(xì)胞病毒CMV的早期啟動子/增強(qiáng)子(CMV immediate-early ehancer/promoter)增強(qiáng)表達(dá)的能力顯著高于其它如勞斯肉瘤病毒啟動子LTR、猴病毒40(SV40)等啟動子；人β球蛋白基因內(nèi)含子序列有輔助增強(qiáng)表達(dá)作用，氨芐青霉素抗性基因(AmpR)內(nèi)含有兩個5’-AACGTT-3’拷貝，該拷貝屬于免疫刺激DNA序列(Immunostimulatory DNAsequence，ISS)，具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN等細(xì)胞因子，促進(jìn)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答的作用。SV40晚期polyA信號能在RNA多聚酶II的作用下終止轉(zhuǎn)錄，并在RNA轉(zhuǎn)錄體的3’端加上約200至250個腺嘌呤殘基。這種polyA結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定與其后的翻譯。f1復(fù)制子為絲狀噬菌體f1的復(fù)制源，便于質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制。T7噬菌體啟動子為一優(yōu)良的原核啟動子，可以調(diào)控A-P片段的表達(dá)。圖2 pGLUA-P的酶切鑒定示意圖1 GeneRuler 1Kb DNA Ladder2 pGLUA-P經(jīng)MluI酶切3 pCI經(jīng)SalI酶切4 pGLUA-P經(jīng)SalI和XhoI雙酶切5 pGLUA-P經(jīng)SalI酶切6 Lambda DNA/HindIII Marker圖3 GLUA-P片段在大腸桿菌BL-21(DE3)中的表達(dá)示意圖1.蛋白質(zhì)分子量Marker2.含pGLUA-P的BL-21(IPTG誘導(dǎo))3.含pGLUA-P的BL-21(IPTG誘導(dǎo))4.含pGLUA-P的BL-21(未作誘導(dǎo))5.含pCI的BL-21(IPTG誘導(dǎo))6.BL-21(IPTG誘導(dǎo))圖4 重組質(zhì)粒pGLUA-P轉(zhuǎn)染大鼠原代肌母細(xì)胞示意圖(SABC法，蘇木素襯染，×100)圖5 ELISA檢測抗PAc特異性抗體水平結(jié)果示意圖seraIgG 血清抗PAc的IgG抗體sera IgA血清抗PAc的IgA抗體saliva IgG 唾液抗PAc的IgG抗體saliva IgA 唾液抗PAc的IgA抗體分組說明見附表1圖6 齲齒記分分析結(jié)果示意圖E為釉質(zhì)齲，Ds為輕度牙本質(zhì)齲，Dm為中度牙本質(zhì)齲附表1定菌鼠的分組和免疫途徑具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述根據(jù)圖1-6可知運(yùn)用分子生物學(xué)專業(yè)軟件DNASIS綜合DNA序列分析軟件、Gene Construction kit 2.0基因模擬克隆軟件、Omiga綜合分子生物分析軟件、BLAST同源序列分析軟件、Oligo引物設(shè)計分析軟件等軟件分析和設(shè)計GTF-PAc融合防齲DNA疫苗并模擬克隆全過程。GLU區(qū)的引物設(shè)計如下正鏈引物5’TCACTCGAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAA3’；負(fù)鏈引物5’CCCGGGTTAGTCGACAATCCGAACTCGTTC3’在正鏈和負(fù)鏈引物的5’端分別引入KpnI和SalI限制性酶切位點。運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，從攜帶有變形鏈球菌GS-5株葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I的基因gtfB的質(zhì)粒pYNB13(紐約州立大學(xué)Kuramitsu惠贈)中擴(kuò)增出編碼葡聚糖結(jié)合區(qū)的序列GLU，并通過KpnI和SalI多克隆位點克隆到真核載體pCI(Promega公司)中，構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pGLU。經(jīng)DNA序列測定，證實了插入序列的正確性。再將攜帶有變形鏈球菌表面蛋白PAc的A區(qū)和P區(qū)的A-P片段序列的pCIA-P質(zhì)粒以XhoI酶切后將末端以DNA聚合酶Klenow大片段和dNTPs補(bǔ)平，經(jīng)HindIII酶切后獲得了切掉了部分載體序列的線性化pCIA-P質(zhì)粒；而pGLU經(jīng)HindIII和SmaI酶切獲得了包含部分載體序列和全部GLU序列的粘平末端片段；將兩個片段以T4DAN連接酶連接構(gòu)建出GTF-PAc融合防齲DNA疫苗pGLUA-P(見圖1)。酶切分析pGLUA-P經(jīng)Mlu I單酶切后呈單一條帶，分子量為7.1kb；經(jīng)Sal I單酶切后呈兩條帶，分子量分別為4.9kb與2.2kb，經(jīng)SalI和XhoI雙酶切后呈三條帶，分子量分別為4.0kb、2.2kb和0.9kb，與預(yù)期結(jié)果相符，證實重組質(zhì)粒pGLUA-P攜帶有GLU和A-P片段(圖2)。由于SmaI的5’平端和填平后的XhoI的切端的連接，具有完全正確的閱讀框架，保證了A-P片段和GLU片段均可被正確地表達(dá)，產(chǎn)生正確的GLUA-P融合蛋白。
將含pGLUA-P的BL-21(DE3)大腸桿菌接種于含Amp的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。次日將50μl飽和培養(yǎng)物接種于5ml同樣的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2小時，加入IPTG(終濃度為1mM)后置37℃搖床5小時進(jìn)行誘導(dǎo)，12000rpm離心1分鐘，將沉淀重懸于40μl的2×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱3分鐘，另取只含空白載體pCI經(jīng)過誘導(dǎo)的BL-21(DE3)、未誘導(dǎo)的BL-21(DE3)/pCIA-P培養(yǎng)物、BL-21(DE3)菌液作為對照。配制15％的分離膠和5％的濃縮膠，依次進(jìn)行加樣，四個樣品各加15μl，標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker加20μl。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染液浸泡凝膠染色，甲醇/醋酸溶液脫色，最后作攝影記錄。結(jié)果顯示在Marker的175KDa和83KDa之間出現(xiàn)一條約為115KDa左右的蛋白帶，與克隆片段(3129bp，編碼含1043個氨基酸的蛋白質(zhì))預(yù)期表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物分子量相符，證實了融合蛋白GLUA-P的表達(dá)(圖3)。
取適量純化的重組質(zhì)粒pGLUA-P稀釋于200μl無血清的DMEM培養(yǎng)基(以下簡稱DMEM-SF)中，另取陽離子脂質(zhì)體DOSPER 12μl稀釋于188μl DMEM-SF中，將兩者輕輕混合，室溫下放置15分鐘后逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時后，重新加入含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24-48小時后，細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。轉(zhuǎn)染及免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示約10％的細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)特異性棕色顆粒，證實了GLUA-P融合蛋白可以被在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。(圖4)。
將pGLUA-P以股四頭肌和頜下腺周圍皮下注射接種SD定菌大鼠，并與頜下腺周圍皮下注射pCIA-P的免疫效果進(jìn)行比較，實驗分組見附表1。
附表1定菌鼠的分組和免疫途徑分組疫苗 接種途徑免疫劑量A pGLUA-P 頜下腺周圍區(qū)域皮下注射 100μg/只B pCIA-P頜下腺周圍區(qū)域皮下注射 100μg/只C pGLUA-P 股四頭肌注射100μg/只D pCI 股四頭肌注射100μg/只E 生理鹽水 股四頭肌注射100μl/只70天鼠齡時分別采集唾液、血清和糞便標(biāo)本，處理后-20°保存待測。將10μg/ml PAc標(biāo)準(zhǔn)凍干品(日本Kyushu大學(xué)牙學(xué)院Takahiko Oho教授贈)包被96孔酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃過夜洗滌，載體封閉后，將待測血清、唾液、糞便分別按1∶10，1∶5，1∶1的濃度稀釋，每孔加樣100μl。加入羊抗大鼠IgA、IgG(美國Sigma公司)的濃度為1∶1000和5μg/ml，溫育2小時，分別加入1∶5000的堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗IgG(美國Sigma公司)，溫育5小時后顯色。酶聯(lián)檢測儀記錄波長405nm處的樣本OD值。ELISA法檢測抗體水平結(jié)果A、B、C組的血清抗PAc的IgG抗體水平明顯高于對照組(P＜0.05)，而三組間沒有顯著差別(P＞0.05)；A、B組的唾液抗PAc的IgA抗體水平明顯高于C、D、E組(P＜0.05)，說明pGLUA-P能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液和粘膜免疫反應(yīng)(圖5)。
大白鼠處死后、斷顱，然后將其頭顱置于高壓蒸汽鍋中，10Ib/in2處理5分鐘，去除軟組織，分離上下頜骨，清洗干凈，室溫干燥。將干燥的頜骨置于0.4％紫脲酸銨染液中浸泡12h，取出后沖洗干凈，用厚0.1mm、直徑25mm的金鋼砂片沿上下頜磨牙牙合面近遠(yuǎn)中向矢狀半切，清洗干燥后，在體視顯微鏡下根據(jù)Keyes經(jīng)典評估齲齒的方法觀察、評估鼠磨牙患齲情況。Keyes齲齒記分結(jié)果顯示A組的釉質(zhì)齲和牙本質(zhì)淺齲記分最低(P＜0.05)，說明頜下腺周圍皮下注射接種pGLUA-P的防齲效果最好(圖6)。
序列表pGLUA-P融合防齲DNA疫苗的基因序列如下TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAAGCCAAAGGAAAATTTGTAACAACTGCCGATGGTAAAATAAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTACCGTAATCGTTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATCTCGGTGAAGATGGTGCAGCAGTGACAGGATCTCAAACCATTAACGGTCAACACCTGTACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCACCACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACTCCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCCACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGGAGAACGAGTTCGGATTGTCGACCCTCGAGAAATGGCTGCCAATCAAGCAGCCTATCAAAAAGCCCTTGCTGCTTATCAGGCTGAACTGAAACGTGTTCAGGAAGCTAATGCAGCCGCCAAAGCCGCTTATGATACTGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATACAGAAATTGCCGCTGCCAATGAAGAAATTAGAAAACGCAATGCAACGGCCAAAGCTGAATATGAGACTAAGTTAGCTCAATATCAAGCTGAACTAAAGCGTGTTCAGGAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTTGCTCGTGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGACCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATGCGGCACTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGCAACGCAATGAGAATGCTAAGGCGACTTATGAAGCTGCACTCAAGCAATATGAGGCCGATTTGGCAGCGGTGAAAAAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTCGCTCGCGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGGCCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCGCAAATGCAGCGCTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGAAGCGCAATGCGGATGCTAAAGCTGATTACGAAGCAAAACTTGCTAAGTATCAAGCAGATCTTGCCAAATATCAAAAAGATTTAGCAGACTATCCAGTTAAGTTAAAGGCATACGAAGATGAACAAACTTCTATTAAAGCTGCACTGGCAGAACTTGAAAAACATAAAAATGAAGACGGAAACTTAACAGAACCATCTGCTCAAAATTTGGTCTATGATCTTGAGCCAAATGCGAACTTATCTTTGACAACAGATGGGAAGTTCCTTAAGGCTTCTGCTGTGGATGATGCTTTTAGCAAAAGCACTTCAAAAGCAAAATATGACCAAAAAATTCTTCAATTAGATGATCTAGATATCACTAACTTAGAACAATCTAATGATGTTGCTTCTTCTATGGAGCTTTATGGGAATTTTGGTGATAAAGCTGGCTGGTCAACGACAGTAAGCAATAACTCACAGGTTAAATGGGGATCGGTACTTTTAGAGCGCGGTCAAAGCGCAACAGCTACATACACTAACCTGCAGAATTCTTATTACAATGGTAAAAAGATTTCTAAAATTGTCTACAAGTATACAGTGGACCCTAAGTCCAAGTTTCAAGGTCAAAAGGTTTGGTTAGGTATTTTTACCGATCCAACTTTAGGTGTTTTTGCTTCTGCTTATACAGGTCAAGTTGAAAAAAACACTTCTATTTTTATTAAAAATGAATTCACTTTCTATCACGAAGATGAAAAACCAATTAATTTTGATAATGCCCTTCTCTCAGTGACTTCTCTTAACCGTGAACATAACTCTATTGAGATGGCTAAAGATTATAGTGGTAAATTTGTCAAAATCTCTGGTTCATCTATTGGTGAAAAGAATGGCATGATTTATGCTACAGATACTCTTAACTTTAAACAGGGTGAAGGTGGCTCTCGCTGGACTATGTATAAAAATAGTCAAGCTGGTTCAGGATGGGATAGTTCAGATGCGCCGAATTCTTGGTATGGAGCAGGGGCTATTAAAATGTCTGGTCCGAATAACCATGTTACTGTAGGAGCAACTTCTGCAACAAATGTAATGCCAGTTTCTGACATGCCTGTTGTTCCTGGTAAGGACAATACTGATGGCAAAAAACCAAATATTTGGTATTCTTTAAATGGTAAAATCCGTGCGGTTAATGTTCCTAAAGTTACTAAGGAAAAACCCACACCTCCGGTTAAACCAACAGCTCCAACTAAACCAACTTATGAAACAGAAAAGCCATTAAAACCGGCACCAGTAGCTCCAAATTATGAAAAGGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAAGCAGAGCCAAACAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAGGCAGAGCCAAATAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACGCCACCGACACCAACACCAGATCAACCAGAACCAAACAAACCTGTTGAGCCAACTTATGAGTAAGTCGACCCCGGGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTA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權(quán)利要求
1.一種融合防齲DNA疫苗，其特征在于大腸桿菌Esherichia coliJM109/pGLUA-P，CCTCC NOM201042。
2.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種融合防齲DNA疫苗的制備方法，其特征在于采用正鏈引物、負(fù)鏈引物；從攜帶有變形鏈球菌GS-5株葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF-I的基因gtfB質(zhì)粒pYNB13中擴(kuò)增出編碼葡聚糖結(jié)合區(qū)的序列GLU，并克隆到真核載體pCI中，構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pGLU，再將pCIA-P質(zhì)粒中的變形鏈球菌表面蛋白PAc的A區(qū)和P區(qū)的A-P片段序列與pGLU質(zhì)粒連接，構(gòu)建出GTF-PAc融合防齲DNA疫苗pGLUA-P。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合防齲DNA疫苗，其特征在于融合防齲DNA疫苗pGLUA-P的正鏈和負(fù)鏈引物正鏈引物5’TCACTCGAGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAA3’負(fù)鏈引物5’CCCGGGTTAGTCGACAATCCGAACTCGTTC3’
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合防齲DNA疫苗，其特征在于融合防齲DNA疫苗pGLUA-P的基因序列是TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCGGAGAAATGGGCTATCAAGCCAAAGGAAAATTTGTAACAACTGCCGATGGTAAAATAAGATATTTTGATAAGCAATCTGGGAACATGTACCGTAATCGTTTTATTGAAAACGAAGAAGGTAAATGGCTGTATCTCGGTGAAGATGGTGCAGCAGTGACAGGATCTCAAACCATTAACGGTCAACACCTGTACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCACCACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACTCCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCCACGGCCGTATCAGCTATTACGACGGCAATTCAGGGGATCAAATCCGCAACCGCTTTGTCCGCAATGCTCAGGGTCAATGGTTCTACTTTGATAACAATGGCTATGCCGTAACCGGTGCCAGAACCATTAACGGTCAACACCTATACTTTAGAGCAAACGGTGTTCAGGTCAAGGGTGAATTTGTCACTGACCGCTACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGGAGAACGAGTTCGGATTGTCGACCCTCGAGAAATGGCTGCCAATCAAGCAGCCTATCAAAAAGCCCTTGCTGCTTATCAGGCTGAACTGAAACGTGTTCAGGAAGCTAATGCAGCCGCCAAAGCCGCTTATGATACTGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATACAGAAATTGCCGCTGCCAATGAAGAAATTAGAAAACGCAATGCAACGGCCAAAGCTGAATATGAGACTAAGTTAGCTCAATATCAAGCTGAACTAAAGCGTGTTCAGGAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTTGCTCGTGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGACCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATGCGGCACTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGCAACGCAATGAGAATGCTAAGGCGACTTATGAAGCTGCACTCAAGCAATATGAGGCCGATTTGGCAGCGGTGAAAAAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTCGCTCGCGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGGCCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCGCAAATGCAGCGCTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGAAGCGCAATGCGGATGCTAAAGCTGATTACGAAGCAAAACTTGCTAAGTATCAAGCAGATCTTGCCAAATATCAAAAAGATTTAGCAGACTATCCAGTTAAGTTAAAGGCATACGAAGATGAACAAACTTCTATTAAAGCTGCACTGGCAGAACTTGAAAAACATAAAAATGAAGACGGAAACTTAACAGAACCATCTGCTCAAAATTTGGTCTATGATCTTGAGCCAAATGCGAACTTATCTTTGACAACAGATGGGAAGTTCCTTAAGGCTTCTGCTGTGGATGATGCTTTTAGCAAAAGCACTTCAAAAGCAAAATATGACCAAAAAATTCTTCAATTAGATGATCTAGATATCACTAACTTAGAACAATCTAATGATGTTGCTTCTTCTATGGAGCTTTATGGGAATTTTGGTGATAAAGCTGGCTGGTCAACGACAGTAAGCAATAACTCACAGGTTAAATGGGGATCGGTACTTTTAGAGCGCGGTCAAAGCGCAACAGCTACATACACTAACCTGCAGAATTCTTATTACAATGGTAAAAAGATTTCTAAAATTGTCTACAAGTATACAGTGGACCCTAAGTCCAAGTTTCAAGGTCAAAAGGTTTGGTTAGGTATTTTTACCGATCCAACTTTAGGTGTTTTTGCTTCTGCTTATACAGGTCAAGTTGAAAAAAACACTTCTATTTTTATTAAAAATGAATTCACTTTCTATCACGAAGATGAAAAACCAATTAATTTTGATAATGCCCTTCTCTCAGTGACTTCTCTTAACCGTGAACATAACTCTATTGAGATGGCTAAAGATTATAGTGGTAAATTTGTCAAAATCTCTGGTTCATCTATTGGTGAAAAGAATGGCATGATTTATGCTACAGATACTCTTAACTTTAAACAGGGTGAAGGTGGCTCTCGCTGGACTATGTATAAAAATAGTCAAGCTGGTTCAGGATGGGATAGTTCAGATGCGCCGAATTCTTGGTATGGAGCAGGGGCTATTAAAATGTCTGGTCCGAATAACCATGTTACTGTAGGAGCAACTTCTGCAACAAATGTAATGCCAGTTTCTGACATGCCTGTTGTTCCTGGTAAGGACAATACTGATGGCAAAAAACCAAATATTTGGTATTCTTTAAATGGTAAAATCCGTGCGGTTAATGTTCCTAAAGTTACTAAGGAAAAACCCACACCTCCGGTTAAACCAACAGCTCCAACTAAACCAACTTATGAAACAGAAAAGCCATTAAAACCGGCACCAGTAGCTCCAAATTATGAAAAGGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAAGCAGAGCCAAACAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAGGCAGAGCCAAATAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACGCCACCGACACCAACACCAGATCAACCAGAACCAAACAAACCTGTTGAGCCAACTTATGAGTAAGTCGACCCCGGGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTA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全文摘要
本發(fā)明公開了一種融合防齲DNA疫苗及制備方法，大腸桿菌(Esherichiacoli)JM109/pGLUA－P CCTCC NOM201042。采用PCR方法，從攜帶有變形鏈球菌GS－5株葡糖基轉(zhuǎn)移酶GTF－I的基因gtfB的質(zhì)粒pYNB13中擴(kuò)增出編碼葡聚糖結(jié)合區(qū)的序列GLU，并克隆到真核載體pCI中，構(gòu)建出真核表達(dá)質(zhì)粒pGLU。經(jīng)DNA序列測定，證實其插入序列的正確性。再將pCIA－P質(zhì)粒中的變形鏈球菌表面蛋白PAc的A區(qū)和P區(qū)的A－P片段序列與pGLU質(zhì)粒連接，構(gòu)建出GTF－PAc融合防齲DNA疫苗pGLUA－P。本發(fā)明方法簡單，安全性高，生產(chǎn)成本低廉，免疫應(yīng)答持久，有效防齲。
文檔編號A61P1/02GK1419938SQ0113369
公開日2003年5月28日 申請日期2001年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日
發(fā)明者樊明文, 邊專, 賈榮, 郭繼華, 陳智, 彭彬, 范兵 申請人:武漢大學(xué)