專利名稱：單克隆人天然抗體的制作方法
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子包括一組并非由外來抗原誘導(dǎo)的循環(huán)免疫球蛋白，可不同地稱為“自身抗體”或“天然抗體”。長期以來人們已認(rèn)識到這種抗體的存在，并將其多種推測功能歸類為“自身攻擊”或“自身受益”。對于前者，將引起對自身免疫的憂懼，并且習(xí)慣上使用術(shù)語“自身抗體”。對于后者，命名為“天然抗體”，暗含維持穩(wěn)態(tài)之意。
1994年7月5日提出的美國專利No.08/271,210公開了一種可與人魚精蛋白上存在的精氨酸富含表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)的循環(huán)人天然抗體。1997年2月25日授權(quán)的美國專利No.5,606,026公開了在HIV-1的Tat蛋白中具有精氨酸富含表位，并公開了另一種可與HIV-1的Tat蛋白中又一不同表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)的循環(huán)人天然抗體。此外，其中還公開了第三種循環(huán)的人天然抗體，其可與人乳鐵蛋白中存在的一個隱蔽表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
已有顯示，當(dāng)病人感染HIV并發(fā)展成艾滋病(AIDS)時，上述三種循環(huán)的人天然抗體減少并達(dá)到最低水平。這些抗體可在任何年齡組的正常人血清中發(fā)現(xiàn)，從胎兒臍帶血到成年人血清，正是憑借它們普遍存在的特性所以把它們鑒定為天然抗體。
因此，為了在治療和診斷方面的應(yīng)用，本領(lǐng)域急需獲得這些循環(huán)的人天然抗體的單克隆等同物。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了人天然抗體的單克隆形式。
一方面，本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞系RWL-1(ATCC CRL12431)，一種由EB病毒轉(zhuǎn)化的臍帶血細(xì)胞和小鼠人雜合骨髓瘤細(xì)胞HMMA融合的產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明提供了由RWL-1細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆人IgM抗體。
還有另一方面，本發(fā)明提供了另一種雜交瘤細(xì)胞系RWT-4(ATCC CRL 12472)，一種由EB病毒轉(zhuǎn)化的臍帶血細(xì)胞和小鼠人雜合骨髓瘤細(xì)胞SHM-D33(ATCC CRL 1668)融合的產(chǎn)物。
還有另一方面，本發(fā)明提供了由RWT-4細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆人IgM抗體。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞系RWT-12(ATCC CRL12427)，一種由EB病毒轉(zhuǎn)化的人臍帶血細(xì)胞和小鼠人雜合骨髓瘤細(xì)胞HMMA融合的產(chǎn)物。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了由RWT-4細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆人IgM抗體。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種治療患有由HIV-1引起的感染的病人的方法，此方法包括為治療上述感染給需要這種治療的病人施用有效劑量的單克隆抗體，該抗體選自由RWT-4細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體、RWT-12細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體，及其混合物。
更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種增加由HIV-1引起感染的病人的CD4+T細(xì)胞的方法，該方法包括為增加CD4+T細(xì)胞施用一定劑量的抗體，該抗體是由保藏號為ATCC CRL 12472和ATCC CRL 12477的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的及其混合物。
在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物制劑，其包含選自由保藏號為ATCC CRL 12427和ATCC CRL 12477的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體中的分離的人IgM單克隆抗體及其混合物，以及藥學(xué)可接受的載體。
按照本說明書、權(quán)利要求書以及附圖，本發(fā)明以上及其它方面內(nèi)容對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1(A-C)是溴化氰(CNBr)裂解乳鐵蛋白(LF)和SP80的SDS-PAGE。
A.蛋白質(zhì)染色。1分子量標(biāo)記物；2 LF(M)；3堿性PS80；4酸性SP80。所有三種蛋白質(zhì)(2，3，4)顯示了相同的裂解片段1～8。
B.利用SP80(酸性和堿性)免疫的兔血清作免疫轉(zhuǎn)印(immunotransfer)顯示，反應(yīng)位點的多樣性以及LF(M)與SP80在反應(yīng)性上的同源性。
C.利用正常人男性血清作免疫轉(zhuǎn)印顯示，該血清僅與三種蛋白質(zhì)中每一種的片段7發(fā)生反應(yīng)。
圖2(A-C)是Tricine的SDS-PAGE。
A.蛋白質(zhì)染色。1分子量標(biāo)記物。2 LF(M)；3 SP80(酸性和堿性)。解析的片段7顯示出2條不同的帶。
B.利用正常人男性血清作免疫轉(zhuǎn)印顯示出其反應(yīng)性特異定位于片段7B。
C.來自人B細(xì)胞衍生的雜交瘤之單克隆抗體(Mab)IgM與片段7B的免疫反應(yīng)性。
圖3(A和B)通過FITC標(biāo)記的抗-人IgM在原位顯示一種人精子頭部成分與(A)人血清；(B)可同LF片段7B反應(yīng)的Mab的免疫反應(yīng)性。
圖4(A-C)通過ELISA顯示1∶100稀釋的5名男性與5名女性的血清和Mab與A、B、C三種物質(zhì)的反應(yīng)性。(A)10μg/ml精子衣殼蛋白質(zhì)釋放的成分，伴隨誘導(dǎo)游動精子懸液中的頂體反應(yīng)；(B)10μg/ml純化的LF(M)片段7B；(C)10μg/ml天然LF(M)(未變性)。A和B的相關(guān)反應(yīng)性表明血清抗體和Mab是與特定成分反應(yīng)的，并非精子衣殼成分整體。與天然LF(C)不具反應(yīng)性證實，血清中天然抗體和Mab是與LF在天然狀態(tài)下并不顯露的位點反應(yīng)。
圖5、代表HIV-1的Tat蛋白之12氨基酸肽的序列。肽1～7和9～12顯示有5個殘基重疊。包括了肽8在內(nèi)是為提供了精氨酸分布的另一種變體，以確定人血清中可歸因于Tat精氨酸富含區(qū)的最大反應(yīng)性。事實上，用肽8顯示了抗體與精氨酸富含區(qū)(肽7、8、9)反應(yīng)的最大滴度。用肽4顯示了抗體與半胱氨酸富含區(qū)(肽4、5)反應(yīng)的最大滴度。
圖6(A和B)A.IgM
B.IgGHIV+和HIV-(正常)兩組各70份人血清與HIV Tat蛋白反應(yīng)性的分析。HIV+組血清是從1994年以前采集血清中調(diào)集的，因此其特征不會歸因于從那時起抗-HIV藥物的使用。每一檢驗板都同時包含HIV+和HIV-標(biāo)本以及單份正常血清(ST)。每份血清記錄的滴度(X)代表X/ST。
滴度以10為間距分組，使得每組血清份數(shù)分配于每一間距。HIV+血清的IgM和IgG滴度的分布偏向較低值的間距中，特別是IgM的滴度分布。
圖7(A和B)HIV+和HIV-(正常)兩組各70份人血清中與肽8(圖5)反應(yīng)的IgM(A)和IgG(B)的滴度分布。在HIV+血清中低滴度或無滴度的IgM和IgG占較大比重，這一點對IgG尤為顯著，由此表明與Tat精氨酸富含序列反應(yīng)的天然抗體的耗盡和HIV的病理進(jìn)程是相關(guān)的。
圖8(A和B)HIV+和HIV-(正常)兩組各70份人血清中與肽4(圖5)反應(yīng)的IgM(A)和IgG(B)的滴度分布，與HIV+血清中總的Tat反應(yīng)性抗體滴度較低的整體趨勢相一致，但不如與肽8反應(yīng)性抗體滴度表明的趨勢那樣嚴(yán)格(圖11)。
圖9(A和B)A.CD4+T細(xì)胞計數(shù)。
B.系列標(biāo)本的與Tat蛋白、肽4和肽8(圖5)之IgM反應(yīng)性的滴度，該系列標(biāo)本來自一位HIV+的男性患者，他診斷為艾滋病后經(jīng)歷五年時間直至死亡。用于CD4+T細(xì)胞計數(shù)的每份標(biāo)本與用于血清分析的每份標(biāo)本同時獲得。CD4+T細(xì)胞數(shù)目減少與天然抗體滴度下降二者之間的關(guān)系在肽8反應(yīng)性抗體的滴度中顯示特別明顯，從而支持了歸因于Tat的天然抗體下降可以允許T細(xì)胞凋亡的假設(shè)。
圖10(A和B)A.CD4+T細(xì)胞計數(shù)。
B.系列血清標(biāo)本中的與Tat蛋白、肽4和肽8(圖5)反應(yīng)的IgM抗體滴度，系列標(biāo)本的收集經(jīng)歷9年時間，來自一位HIV+的男性患者，據(jù)估計他的感染時間超過11年，但并未顯示HIV相關(guān)病理，也沒有進(jìn)行抗-HIV的治療。用于血清分析的每份標(biāo)本與用于CD4+T細(xì)胞計數(shù)的每份標(biāo)本同時獲得。天然抗體的滴度和滴度維持的模式與CD4+T細(xì)胞數(shù)目在正常范圍內(nèi)的維持具有相關(guān)性。
圖11(A和B)A.CD4+T細(xì)胞計數(shù)。
B.一位HIV+的男性患者一系列血清標(biāo)本中與Tat蛋白、肽4和肽8(圖5)反應(yīng)的IgM的滴度。伴隨著記錄CD4+T細(xì)胞數(shù)目顯著下降的標(biāo)本4的報告，開始進(jìn)行抗-HIV的治療。治療6個月之后標(biāo)本5中CD4+T細(xì)胞數(shù)目顯著增長，并且與肽8反應(yīng)的IgM滴度經(jīng)歷了一個超乎尋常的高水平增長。后續(xù)的標(biāo)本表明CD4+T細(xì)胞數(shù)目和天然抗體滴度的維持，伴隨總體良好的臨床狀況。
發(fā)明詳述在這里引用所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)均由此完整引用作為參考。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種可與人乳鐵蛋白上存在的一個隱蔽表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)的人天然IgM抗體的單克隆形式。這種抗體是由雜交瘤RWL-1生產(chǎn)，該雜交瘤于1997年11月14日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)，保藏號ATCC CRL-12431。該雜交瘤如下面實施例1描述，由融合通過EB病毒轉(zhuǎn)化的人臍帶血細(xì)胞與小鼠人雜合骨髓瘤細(xì)胞的方式產(chǎn)生。該雜交瘤生產(chǎn)IgM同型(isotype)的人單克隆抗體?？贵w生產(chǎn)細(xì)胞(人臍帶血細(xì)胞)是新生兒來源的并且抗體是IgM的同型抗體(因而并不穿越胎盤)，這一事實證明此抗體確實為天然抗體。
與乳鐵蛋白有免疫反應(yīng)的IgM抗體已顯示存在于一大群正常人血清中，而且它并沒有明顯的致病作用或與致病有聯(lián)系，因此其特征可鑒定為天然抗體。這種天然抗體的反應(yīng)位點從前已有顯示(3)，并經(jīng)此處證實存在于人精子頭部的漿膜復(fù)合物中。為建立其反應(yīng)位點的分子鑒定而設(shè)計的這些研究證實，精漿中存在約72.6kD蛋白質(zhì)(2)(這里精確測定為80kD)，其同樣存在于精子頭部的蛋白質(zhì)衣殼，并且80kD蛋白質(zhì)與乳鐵蛋白同源，事實上就是乳鐵蛋白。這里表明，與所關(guān)注的天然抗體特異反應(yīng)的乳鐵蛋白質(zhì)其構(gòu)型并非體液中普遍存在的乳鐵蛋白的構(gòu)型。那種構(gòu)型以及天然抗體的反應(yīng)性，在體外(圖2，4)通過變性天然循環(huán)乳鐵蛋白揭示，而在體內(nèi)(圖3)揭示存在于人精子頭部蛋白質(zhì)衣殼中摻入的乳鐵蛋白之構(gòu)型與天然抗體的反應(yīng)性。乳鐵蛋白以天然構(gòu)型存在于精漿中，而當(dāng)它儲存于精子膜/衣殼復(fù)合物時，便以某種尚未證明的機制采取了抗體可識別的形式。轉(zhuǎn)變?yōu)檫@種形式并儲存在精子表面衣殼中，這一過程可假設(shè)發(fā)生在睪丸輸精管中精子形成的成熟期。因此，與此相關(guān)我們注意到，如免疫球蛋白特別是IgM這樣的大分子被排斥在輸精管腔之外(24)，因而阻止了精子形成時IgM與精子成分發(fā)生免疫反應(yīng)。然而這一屏障并不存在于具有全套可循環(huán)抗體的女性生殖道中(23)。因此，這里存在可與LF反應(yīng)的天然抗體，從而在射精至女性生殖道后可與精子衣殼中的LF發(fā)生免疫反應(yīng)。二者的相互作用可如圖3顯示在精子衣殼原位發(fā)生，并且明確地伴隨LF以及其它衣殼和漿膜成分的釋放發(fā)生(圖4)，此時精子依次經(jīng)歷獲能和頂體反應(yīng)；從而為精子穿過卵細(xì)胞周圍透明帶隨后進(jìn)入卵細(xì)胞提供了便利(9，10)。既然頂體反應(yīng)涉及頂體膜與漿膜的融合，蓋在上面的蛋白質(zhì)衣殼成分被解體。因而，要不是受精環(huán)境中存在天然抗體能夠免疫學(xué)消除LF通過卵細(xì)胞膜胞吞，進(jìn)而與配子或原核DNA相互作用的能力，釋放的LF可能早已進(jìn)入卵漿中。
在為LF定義的多種功能和相互作用中，被胞吞并與DNA相互作用的能力越來越引起人們興趣(7，8，27-29)。特別有趣的是最近報道，LF和DNA的相互作用由序列特異性加以表明(7)。該特異性的分子基礎(chǔ)尚未明確，但有理由預(yù)計，如果在體內(nèi)存在LF/DNA相互作用，其是在一明確的操縱體系中發(fā)生的。同樣符合邏輯地假設(shè)，這一體系存在于體細(xì)胞有組織的染色體成分中，但不存在于新生的未分化的原核成分中。因而據(jù)此上下文，在LF和DNA相互作用中假想的序列特異性的控制可能無法操作。天然抗體選擇性地與存在于精子衣殼中(而非普遍的可循環(huán)形式)的特定構(gòu)型之LF反應(yīng)，可能代表一種幸運的自然選擇機制，該機制有兩個基礎(chǔ)(1)抑制LF與受精卵的DNA元件相互作用；(2)限制循環(huán)天然抗體與在其它部位更普遍的行使重要功能形式的LF發(fā)生免疫反應(yīng)。既然用來提供了本研究重要數(shù)據(jù)之分泌Mab的雜交瘤來源于人臍帶血B細(xì)胞，那么可證實天然抗體是與生俱來的。
正如下面實施例2顯示，抗體與人體乳鐵蛋白上存在的一個表位發(fā)生免疫反應(yīng)，特別是存在于人精子頭部蛋白質(zhì)衣殼中的這種形式的乳鐵蛋白。乳鐵蛋白是一種存在于精子頭部的80kD糖蛋白。伴隨受精時誘導(dǎo)的頂體反應(yīng)，乳鐵蛋白(已有顯示可與DNA結(jié)合并相互作用)能夠有效地干擾精子與卵細(xì)胞DNA的相互作用。因此本發(fā)明抗體的一個用途就是作為體外受精反應(yīng)的添加物，以防止乳鐵蛋白在受精前與精子DNA相互作用。
另外，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，提供了可產(chǎn)生與HIV-1 Tab蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)的單克隆IgM抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞系RWT-4和RWT-12分別與圖5中的肽4和肽8發(fā)生免疫反應(yīng)。以RWL-1為例的這些雜交瘤細(xì)胞，通過EBV轉(zhuǎn)化的人臍帶血細(xì)胞與小鼠人雜合骨髓瘤細(xì)胞融合獲得。RWT-4細(xì)胞于1998年2月12日保藏于ATCC并獲得保藏號No.ATCC CRL 12472，RWT-12細(xì)胞于1998年2月25日由ATCC保藏，并獲得保藏號No.ATCC CRL 12477。在下面實施例3中顯示了每種抗體的表位特異性。
由雜交瘤RWL-1(ATCC CRL 12341)、RWT-4(ATCC CRL 12472)和RWT-12(ATCC CRL 12427)生產(chǎn)的單克隆IgM抗體可以從生產(chǎn)抗體的細(xì)胞培養(yǎng)液中分離，并采用本領(lǐng)域具有常規(guī)技能的技術(shù)人員周知的技術(shù)進(jìn)行純化，例如硫酸銨沉淀、HPLC(高效液相層析)、柱層析等純化方法。
本發(fā)明的抗體是循環(huán)IgM抗體的單克隆等價物，包括在科學(xué)(Science)2281211，1985年鑒定的循環(huán)IgM抗體(RWL-1細(xì)胞)、和1997年2月20日授權(quán)的美國專利No.5,606,026描述的循環(huán)IgM抗體(RWT-4和RWT-12細(xì)胞)。這些循環(huán)抗體在HIV感染個體中缺乏，并且隨艾滋病發(fā)展而減少。因此。由ATCC CRL 12341、ATCCCRL 12477和ATCC CRL 12472生產(chǎn)的單克隆抗體可以用作預(yù)測AIDS發(fā)病實驗中的陽性對照。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，一種治療患有HIV-1引起的感染的病人的方法，包括給病人施用有效量的治療HIV-1的天然人IgM抗體，該抗體選自RWT-4細(xì)胞生產(chǎn)的抗體、RWT-12細(xì)胞生產(chǎn)的抗體，及其混合物。可以想象，給感染HIV-1和患AIDS的病人補充他們所缺乏的天然抗體將對他們具有較好的臨床意義。
如下面實施例5顯示，HIV-1的Tat蛋白在人體并不刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體(見實施例5表1)。這一觀察與另一事實相聯(lián)系長期生存者(LTS)/長期不發(fā)病者(LTNP)這樣的病人雖然HIV-1陽性，卻不表現(xiàn)任何病癥也不發(fā)展為AIDS，他們具有與本發(fā)明雜交瘤生產(chǎn)的IgM抗體相等的正常水平的循環(huán)天然抗體。這就證明施用本發(fā)明的單克隆抗體作為治療疾病的一種療法的實用性。由于HIV-1的Tat蛋白在建立和維持感染中具有重要的作用，并且該蛋白在人體并不表現(xiàn)免疫原性，因此給感染病人施用本發(fā)明的單克隆抗體是一種導(dǎo)入特異性抗Tat蛋白質(zhì)抗體的方法。
圖9、10和11的數(shù)據(jù)清楚地確立了HIV+人群中CD4+T細(xì)胞數(shù)目與兩種可與HIV Tat蛋白反應(yīng)的IgM天然抗體滴度的相關(guān)性，特別是與肽4、肽8所示的蛋白質(zhì)序列反應(yīng)的IgM天然抗體的滴度(圖10)。尤其是與代表Tat蛋白精氨酸富含序列的肽8反應(yīng)的抗體更鮮明地顯示了這種聯(lián)系。
圖9，10和11每幅各展示了相關(guān)的獨特例子。圖9顯示一位診斷為AIDS的死亡前5年的HIV+男性病人的臨床報告CD4+T細(xì)胞計數(shù)和一系列相關(guān)血清標(biāo)本的抗體檢驗數(shù)據(jù)。圖10顯示來自一位HIV+男性患者標(biāo)本的相關(guān)資料，他的感染時間估計超過11年，但他既沒表現(xiàn)出HIV相關(guān)病理也沒進(jìn)行抗-HIV的治療。圖11顯示來自一位HIV+男性患者標(biāo)本的數(shù)據(jù)，表明伴隨抗-HIV藥物治療的建立，CD4+T細(xì)胞數(shù)目和Tat反應(yīng)性抗體(尤其是與肽8反應(yīng)的抗體)的滴度都升高至正常范圍內(nèi)的水平。
既然目前市售的多種靜脈內(nèi)注射用IgG(IVIG)制劑已經(jīng)檢測并證實用于非腸道施用(例如Sandoz Pharmaceuticals或Cutter Biological)，那么本發(fā)明的單克隆IgM抗體的施用可以使用一種IVIG制劑作為載體。這些制劑證明對人體非腸道施用是安全的。
一般來說，施用的藥物劑量當(dāng)然將依賴如受藥者的年齡、健康狀況和體重、當(dāng)前治療的類型、治療的頻率等已知因素的不同而不同。通常，活性成分的劑量為大約每千克體重約0.001至約10毫克。針對每個病人的精確劑量、施藥頻率和治療時間跨度應(yīng)該通過對CD4+T細(xì)胞數(shù)目升高和其他臨床病情減輕指標(biāo)的測定進(jìn)行監(jiān)控。
而在另一優(yōu)選的實施方案中，提供了一種增加病人CD4+T細(xì)胞數(shù)目的方法，其包括為增加CD4+T細(xì)胞數(shù)給需要這種治療的病人施用有效量的抗體，該抗體選自雜交瘤ATCC CRL 124673、ATCC CRL 12477生產(chǎn)的抗體，及其混合物。有效量與上述的有效量相同。
對于非腸道施用，本發(fā)明的抗體可以配成藥物制劑或作為溶液、懸液、乳濁液或結(jié)合一種藥學(xué)可接受的非腸道載體的凍干粉的劑量形式。這種載體的例子有水、鹽溶液、Ringer’s溶液、葡萄糖和5％人血清白蛋白。此外，如上所述的商品化的IVIG制劑可以用作遞送本發(fā)明多種抗體的載體。
本發(fā)明的藥物制劑不必構(gòu)成本發(fā)明抗體的有效劑量，因為這一劑量可以通過施用較大量的此制劑獲得。
本發(fā)明在以下具體的實施例中不意在限定范圍地進(jìn)一步描述。
實施例1分泌與人乳鐵蛋白限定的隱蔽序列反應(yīng)的單克隆人IgM抗體的雜交瘤RWL-1，是通過人臍帶血B細(xì)胞與一種人/小鼠雜合骨髓瘤細(xì)胞系HMMA融合而創(chuàng)建的(Posner MR，Ellorim H，Santos D.(1987).雜交瘤(Hybridoma)6611)，如下闡述。
臍帶血獲自剖腹產(chǎn)的一個正常(但并未鑒定)新生兒，單核細(xì)胞用Ficoll-Paque(Pharmacia)進(jìn)行密度梯度離心分離。收集的細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)清洗，加入含EB病毒(從ATCC CRL 1612細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得)培養(yǎng)物的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃溫育2小時。細(xì)胞離心下來后重懸在RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補充了胎牛血清(FCS)、環(huán)孢菌素A、青霉素/鏈霉素(每毫升10單位青霉素/100mg鏈霉素)，鋪于96孔板(每孔30個細(xì)胞)。定期補充培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)5個星期后，ELISA檢測每孔之培養(yǎng)物與變性乳鐵蛋白片段7B特異反應(yīng)的IgM單克隆抗體(Mab)(Pruslin FH，Winston R，Rodman Tc.(1991)免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meth.)13727)(圖2C)。
所選EBV無限增殖化B細(xì)胞培養(yǎng)物長至細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/孔，然后用5×RPMI-1640(無補充物)沖洗。融合伴侶細(xì)胞(HMMA細(xì)胞，見Posner，M.R.，等在雜交瘤6611，1987中描述)生長于RPMI-1640、FCS、青霉素/鏈霉素和氮雜鳥嘌呤中，并用3×無補充物的RPMI-1640沖洗。106個細(xì)胞與等量的EBV無限增殖化B細(xì)胞混合。離心混合的細(xì)胞培養(yǎng)物，除去上清液并用溫?zé)?37℃)的40％聚乙二醇/RPMI-1640(pH 7.2)重懸，保持1分鐘。離心細(xì)胞，用2×RPMI(pH7.8)沖洗，然后重懸于(106細(xì)胞/毫升)補充有20％FCS、HAT(Sigma)、烏本苷、青霉素/鏈霉素的HY培養(yǎng)基(Sigma)，以105細(xì)胞/孔種板。3星期后檢測生長的陽性細(xì)胞之特異性抗體的存在。陽性抗體孔的內(nèi)容物有限稀釋，以0.5細(xì)胞/孔重鋪于HY/HT(Sigma)培養(yǎng)基，補充20％FCS、SPIT(Sigma)、青霉素/鏈霉素。細(xì)胞于37℃生長5個星期后重新檢測每孔內(nèi)容物的單克隆抗體的特異性。溫育所選培養(yǎng)物，直至生長到濃度為106細(xì)胞/毫升，然后400轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。每種細(xì)胞沉淀物用5毫升80％FCS、10％DMSO和10％RPMI-1640重懸，以2毫升等分量凍存在-70℃。凍存等分物融化后重新檢測存活力和抗體特異性。
雜交瘤于1997年11月14日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)，保藏號ATCC CRL 12431。
實施例2在以下實施例中采用下面的材料和方法。
LF蛋白從Sigma(L3770)獲得的人乳汁乳鐵蛋白命名為LF(M)。精漿LF是從臨床正常志愿捐獻(xiàn)者庫存精漿標(biāo)本中分離。液化作用后，通過離心獲得無精子胞漿，并經(jīng)DEAE離子交換層析(11)分離成堿性級分和酸性級分。每個級分合并物經(jīng)凝膠過濾(Sephacryl S 300HR，Pharmacia)，其中各個級分合并物中第一級分在80kD解析，分別命名為SP80-堿性和SP80-酸性。
溴化氰(CNBr)裂解和SDS PAGE對堿性SP80、酸性SP80和LF(M)的CNBr處理按照文獻(xiàn)(12)描述的方法進(jìn)行。簡而言之，每種蛋白質(zhì)的10mg/ml 70％甲酸溶液與CNBr(過量200倍摩爾量)室溫下溫育18～24小時。冷凍干燥后，將裂解混合物在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳(圖1)。為了低分子量片段的分辨力加強(圖2)，在16.5％的Tricine凝膠上進(jìn)行電泳(13)。
片段7B的特征描述片段7B從凝膠中切下，用H2O-SDS抽提后加入KCl沉淀，7B的組成肽段經(jīng)過對PBS(pH7.2)透析純化。未處理的無精子精漿蛋白質(zhì)和天然LF制成PBS溶液。LF片段7B由2個肽組成，這是由Rockefeller大學(xué)質(zhì)譜實驗室利用矩陣相關(guān)的激光解吸/離子化質(zhì)譜進(jìn)行確定的(14)。LF片段7B的肽N-末端測序由洛克菲勒大學(xué)的蛋白質(zhì)測序?qū)嶒炇依弥貜?fù)Edman降解的循環(huán)并用microbore HPLC(15)進(jìn)行PTH分析來完成。
免疫反應(yīng)性LF(M)和酸性SP80、堿性SP80之電泳的Western印跡在Immobilon-P(Millipre)轉(zhuǎn)移膜上進(jìn)行，并通過化學(xué)發(fā)光觀察。ELISA按標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)(16～18)進(jìn)行。血清為人LF(M)免疫的兔血清、SP80(酸性的和堿性的結(jié)合)免疫的兔血清，以及從臨床實驗室丟棄血清中隨機選擇的經(jīng)性別、年齡鑒定且“無臨床發(fā)現(xiàn)物”的人血清。與人血清具有反應(yīng)性的僅有PAGE中的片段7(圖1)和解析出的名為7B的清楚條帶(圖2)。
對片段7B特異的單克隆抗體(Mab)
從正常新生兒臍帶血中利用Ficoll-Pague(Pharmacia)密度梯度離心分離出單核細(xì)胞，由EB病毒轉(zhuǎn)化(19)。采用標(biāo)準(zhǔn)步驟(20)與親本細(xì)胞系HMMA融合，產(chǎn)生一套分泌IgM的雜交瘤，并通過有限稀釋法建立雜交瘤的單克隆性。既然血清與變性乳汁LF(M)和SP80的反應(yīng)性局限在單個PAGE級分片段(圖2)，該片段可從凝膠中分離出來，并和一系列與其它人天然抗體建立特異反應(yīng)性的蛋白質(zhì)或肽(16，18)一起得到應(yīng)用，如用作ELISA中的抗原篩選與片段7B特異反應(yīng)的單克隆抗體。
LF/SP80在精子頭部中的細(xì)胞學(xué)定位從自發(fā)液化的精漿中獲得一部分游動的人類精子，用PBS洗3遍后最終重懸在PBS 1∶500稀釋的人血清中，或純化Mab的PBS溶液中，然后40℃溫育過夜。每種懸液經(jīng)PBS洗3次后，收集的精子溫育在FITC標(biāo)記的抗-人IgM(Sigma)中1小時。精子用PBS洗過，取一滴懸液于一載玻片上，用FITC-特異濾膜進(jìn)行檢查并照相(圖3)。
精子衣殼蛋白質(zhì)級分通過誘導(dǎo)精子懸液中的頂體反應(yīng)(21)獲得包含精子衣殼成分的級分游動精子用PBS溫和洗后收集，懸浮于含Ca培養(yǎng)基中2mM CaCl2，10mM離子載體A23187(Calbiochem)，1mM PMSF(Sigma)，室溫溫育4小時。精細(xì)胞通過低速離心沉淀，通過高速離心后40℃透析過夜除去所得上清液的顆粒。ELISA檢測上清液與人血清以及能與LF片段7B反應(yīng)的Mab之間的反應(yīng)性(圖4)。
結(jié)果這里報道的數(shù)據(jù)證實了過去的研究人體精漿中的80kD蛋白質(zhì)與LF同源(1，2)。無精子精漿通過DEAE離子交換層析(未顯示)分級分離，證實80kD蛋白質(zhì)以2種形式存在堿性和酸性，其包含聚糖組分(22)。兩種形式的SP80與來自人乳汁的LF的CNBr裂解片段在SDS凝膠上是相同的(圖1A、2A)。同樣，這些片段與SP80免疫的兔血清(圖1)或者人乳汁LF(未顯示)免疫的兔血清之間免疫反應(yīng)性的模式也是相應(yīng)一致的。相似地，從前的報道(4)獲得證實正常人血清未顯示與乳汁中天然LF以及從精漿中分離或有聯(lián)系的SP80之間的免疫反應(yīng)性(圖4)。特別重要的是證實了(圖1，2)正常人血清中鑒定的天然抗體(3，4)可與LF和SP80中通過變性這些蛋白質(zhì)才能暴露的隱蔽序列發(fā)生反應(yīng)(圖1，2)。存在于片段7B中的該序列可從LF(M)和SP80的CNBr裂解產(chǎn)物之PAGE(圖2)中分離獲得。天然抗體的固有存在可憑借一種來自臍帶血細(xì)胞的雜交瘤之衍生物來證實，該雜交瘤分泌一種與片段7B成分特異性反應(yīng)的IgM/K(圖2，4)。
質(zhì)譜顯示片段7B包含10kD和9kD的2種肽。N末端測序鑒定上樣的主要肽序列為DKVER，9kD肽序列為SLDGG。依據(jù)LF的CNBr裂解位于甲硫氨酸殘基的假設(shè)，并參考LF公開的結(jié)構(gòu)(12)，推出兩種肽各自的序列，并定位于C葉。建立了一套包含兩種肽之衍生線性序列并具有5個殘基重疊的12殘基肽(表1)。因而，經(jīng)鑒定人血清IgM與單獨檢測的任何一條肽沒有特異的反應(yīng)性，這表明天然抗體的基礎(chǔ)表位盡管包含在LF片段7B中，但是構(gòu)象依賴性的。
表位在精子頭部的原位定位，通過人血清的細(xì)胞免疫反應(yīng)和與LF(M)/PS80片段7B(圖3)特異反應(yīng)的Mab獲得證實。圖4提供了進(jìn)一步的證據(jù)，LF以暴露天然抗體表位的構(gòu)型存在于精子衣殼蛋白質(zhì)中。頂體反應(yīng)的誘導(dǎo)后(21)，導(dǎo)致精子頭部頂體區(qū)表面的蛋白質(zhì)衣殼/漿膜分散，圖4顯示了衣殼成分與人血清IgM和Mab之間的反應(yīng)性。因而圖3、4提供證據(jù)，體內(nèi)依次獲能和頂體反應(yīng)后，從精子衣殼中流出的LF可能用于進(jìn)入精子穿透的卵細(xì)胞。然而，既然女性生殖道中存在一整套完整的血漿免疫球蛋白(23)，那么天然抗體將抑制這種LF的可得。
A.表I包含LF片段7B成分的具有重疊的十二肽。
A. Seq.ID No.B. Seq.ID NoD K V E R L K Q V L L H1S L D G G Y V Y T A C K15K Q V L L H Q Q A K F G2V Y T A C K C G L V P V16Q Q A K F G R N G S D C3C G L V P V L A E N Y K17R N G S D C P D K F C L4L A E N Y K S Q Q S S D18P D K F C L F Q S E T K5S Q Q S S D P D P N C V19F Q S E T K N L L F N D6P D P N C V D R P V E G20N L L F N D N T E C L A7D R P V E G Y L A V A V21N T E C L A R L H G K T8Y L A V A V V R R S D T22R L H G K T T Y E K Y L9V R R S D T S L T W N S23T Y E K Y L G P Q Y V A10 S L T W N S V K G K K S24G P Q Y V A G I T N L K11G I T N L K K C S T S P12K C S T S P L L E A C E13S P L L E A C E F L R K14由此顯示(結(jié)果)人血清IgM或Mab并未展示與任何肽段的反應(yīng)性，表明其表位為構(gòu)象型。
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用于RWT-4的融合骨髓瘤伴侶是一種由小鼠和人骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜合骨髓瘤，獲自ATCC5HMD33。
用于RWT-12的融合骨髓瘤伴侶是HMMA(Posner，M.R.等人，雜交瘤6611，1987)。
對于每種雜交瘤，臍帶血B細(xì)胞的獲得和無限增殖化見以上實施例1中的描述。
五星期之后，每孔培養(yǎng)液經(jīng)ELISA檢測其與Tat蛋白的反應(yīng)性。所選培養(yǎng)的EBV無限增殖化細(xì)胞的培養(yǎng)液用每種肽進(jìn)行檢測(實施例5顯示，圖5)。其中，顯示只與肽4反應(yīng)的3份(與肽5低水平反應(yīng))和顯示只與肽8反應(yīng)的3份(與肽7、9低水平反應(yīng))EBV無限增殖化細(xì)胞被選擇與各自融合用的骨髓瘤伴侶進(jìn)行融合，如以上實施例1描述。注意方法步驟的修改融合細(xì)胞(代表雜交瘤)以每孔0.5個細(xì)胞鋪板，確保每孔接種不超過1個細(xì)胞，從而保證其單克隆性。
細(xì)胞在補充有20％胎牛血清、SPIT(Sigma)和青霉素/鏈霉素的NY/HT培養(yǎng)基(Sigma)中長至濃度為106細(xì)胞/毫升，400轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。
每份細(xì)胞沉淀懸浮于包含80％胎牛血清、10％DMSO和10％RPMI-1640的培養(yǎng)基，分為2ml一份貯存于-70℃或液氮中。那些代表雜交瘤RWT-4和RWT-12的部分凍存細(xì)胞分別于1998年2月12日和1998年2月25日保藏于ATCC。
實施例4雜交瘤細(xì)胞系RWT-4和RWT-12特異反應(yīng)性的檢測將每種包含雜交瘤分泌的特異IgM單克隆抗體的培養(yǎng)液進(jìn)行處理，回收抗體。
培養(yǎng)液在Centricon C-100柱中濃縮除去鹽和所有分子量小于100kD的蛋白質(zhì)。然后濃縮液通過Pharmacia S-300柱中體積排阻凝膠。洗脫液的第一峰經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠以檢測純度，顯示代表特定IgM的輕鏈和重鏈的2條帶，無其它帶。洗脫物在一新柱中再濃縮至200μg/ml。
每種單克隆抗體的輕鏈用過氧化物酶標(biāo)記的抗-γ和抗-κ抗體進(jìn)行ELISA鑒定。
每種單克隆抗體的重鏈(表位特異性)用一組肽進(jìn)行ELISA鑒定。
輕鏈鑒定ELISA1.未標(biāo)記的rb＞IgM2.Mab或總?cè)薎gM(Sigma)3.過氧化物酶標(biāo)記的抗-κ或抗-λ過氧化物酶標(biāo)記 抗-λ0ab 總IgM RWT-4 Mab1∶4k01 0.24 0.73
1∶6k 010.160.541∶10k0 0.120.37抗-κ1∶4k 040.550.061∶6k 010.360.041∶10k0 0.230.02結(jié)論RWT-4輕鏈為λ抗-λ 0ab總IgM RWT-12Mab1∶4k 02 0.89 0.031∶6k 01 0.65 0.021∶10k07 0.45 0.01抗-κ1∶4k 04＞1.000.801∶6k 030.83 0.571∶10k020.56 0.39結(jié)論RWT-12輕鏈為κ按照TAT肽特異性確定表位ST RWT-4 Mab RWT-12 MabPep 1.01 .03 .052.02 .02 .043.03 .01 04.48 .94 .025.20 .35 .126.07 .01 .07
7.16 .07 .368.12 .07 .429 0.02 .01100.01 .03110 0012 .33 .16 .72總Tat蛋白.49 .55 .44這里肽12在實施例5、圖6中命名為肽8。
因此這里 圖27 71288 99 1010111112128稀釋度ST血清1∶100Mab 1μl/1ml雜交瘤細(xì)胞這些數(shù)據(jù)代表每一抗原抗體反應(yīng)20次獨立檢驗的平均值。
實施例5在本實施例中使用以下材料和方法。
血清人圖6中報告的70份HIV+和70份HIV-血清于1994年以前收集，并用來檢驗與Tat蛋白的反應(yīng)性。因此HIV+血樣組的特征不能歸因于從1994年開始的抗-HIV治療的應(yīng)用。70份HIV+血清中有52份用于表I的表位分析，其中還包括了另外8份HIV+血清，也就是總共有60份來自未經(jīng)治療的HIV+病人血清用于表I的表位分析。圖9、10、11中系列HIV+血清是具有臨床資料和相應(yīng)治療記錄的用于臨床檢驗的標(biāo)本之等分樣品。表I中80份正常(HIV-)血清是從用于預(yù)先檢查僅做年齡、性別和“無臨床發(fā)現(xiàn)物”鑒定的標(biāo)本，以及實驗室人員捐獻(xiàn)標(biāo)本中收集的。
黑猩猩獲得的總共22份血清來自成年黑猩猩，證實為正常血清16(7份雄性，9份雌性)份來自YERKES地區(qū)靈長類中心(Emory大學(xué))；6(2份雌性，4份雄性)份來自LEMSIP(NYU醫(yī)學(xué)中心)。后面一組中1份雄性和1份雌性血清分別在接種HIV感染的細(xì)胞后22個月和10個月收集。
猴從正常猴獲得共32份血清20份來自YERKES的恒河猴，1份來自LEMSIP，2份來自LARC(實驗動物研究中心，洛克菲勒大學(xué))，4份豬尾恒河猴(pig tail macaques)血清和5份狒狒血清來自LARC。還有血清從接種SIV(Mac 239)感染的細(xì)胞的恒河猴獲得，并且從LingiZhong博士(Aaron Diamond AIDS研究中心，洛克菲勒大學(xué))那里獲得由SIV Mac 239培養(yǎng)物無細(xì)胞上清液接種恒河猴6個月后的2份血漿標(biāo)本。
兔20份(10份雄性，10份雌性)新西蘭白兔(此前未經(jīng)任何處理)血清由James Nolan(紐約，特殊手術(shù)醫(yī)院)提供，10份獲自LARC。1份由HIV Tat蛋白免疫后的兔血清標(biāo)本獲自Intracel Corp(Isaquah，WA.)小鼠30只正常成年小鼠12只Balb/C，6只C57black，2只MRL-1pr和10只Swiss Webster的血清獲自LARC。對1只Balb/c和1只Swiss Webster用HIV Tat蛋白/佐劑施加3次系列免疫，僅用佐劑對1只Balb/c和1只Swiss Webster施加免疫。表I數(shù)據(jù)中包括的血清表示每只小鼠末次免疫接種16星期后收集的標(biāo)本。
抗原凍干形式的重組Tat蛋白獲自Intracel公司。每小瓶蛋白的反應(yīng)性和工作稀釋度按照單份(標(biāo)準(zhǔn))人血清(16)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。Tat肽(圖5)顯示了與發(fā)表的HIV Tat氨基酸線性排列(17)相一致的重疊序列，并按照過去描述的方法(14)制備。最近的綜述(26)確證Tat是一種高度保守的HIV蛋白質(zhì)，與多種HIV分化體展示的序列只有較小偏差。
ELISA所有血清均等量分裝凍存于-70℃以減小反復(fù)凍融的影響。ELISA流程經(jīng)過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計學(xué)評估(例如15，16)。每份血清/抗原最少經(jīng)3次獨立試驗檢測。對每份抗原的校正血清O.D.值表示，血清/抗原讀出的O.D.值減去血清背景(無抗原)的O.D.值。校正O.D.值0.10可認(rèn)為陽性。如果校正O.D.值為0.08～0.15，另外重復(fù)3次試驗。對于人和黑猩猩血清檢測，每一滴度板條包含單份標(biāo)準(zhǔn)血清(ST)，最終滴度按X/ST計算。過氧化物酶標(biāo)記的抗-人IgG或IgM(KPL)用于全部的人和黑猩猩血清。發(fā)現(xiàn)抗猴IgM或IgG(KPL)與黑猩猩血清不反應(yīng)，但依據(jù)所有特異性標(biāo)準(zhǔn)和比例對不同猴血清檢測的血清稀釋度是合適的。類似地，抗小鼠IgM或IgG(Sigma)和抗免IgM或IgG(KPL)篩選了特異性和稀釋度相關(guān)的反應(yīng)性梯度。既然針對每一物種的過氧化物酶標(biāo)記抗體來自山羊血清，ELISA包含一個額外的封閉步驟，即在洗滌抗原之后、使用種特異性待檢血清之前用1％正常山羊血清來封閉，以確保沒有表現(xiàn)出的反應(yīng)性的部分可歸因于山羊血清。
表1
結(jié)果人圖6呈現(xiàn)的實驗資料為IgM和IgG與HIV+和HIV-(正常)血清的Tat蛋白的反應(yīng)性。如方法部分中所述，那些HIV+血清是從不同于在1994年中期以前普遍運用的藥物(如AZT)的、未接受任何抗-HIV藥物治療的病人中采集的。對兩組70份血清各自滴度集合的比較表明，HIV+組的IgM滴度明顯地低于HIV-組的水平(圖6A)。然而，無論是有關(guān)比較的兩組血清還是未顯示的單份血清中，同一份血清的Tat-反應(yīng)性IgG滴度的分布與Tat-反應(yīng)性IgM滴度相比呈現(xiàn)出隨機性。那些IgG滴度可能代表天然抗體的成熟形式(27，28)，或者是由具有與Tat蛋白區(qū)域充分一致的序列而反映為Tat-反應(yīng)性的無關(guān)抗原獨立誘導(dǎo)的抗體。
兩組人群血清的表位分析顯示(表1)，與Tat蛋白的全部IgM反應(yīng)性局限于2個不相鄰序列一個包括擁有半胱氨酸富含區(qū)的肽4、肽5，另一個包括精氨酸富含區(qū)的肽7、肽8、肽9(圖1)。與表1數(shù)據(jù)相一致，所有(80份)HIV-(正常)男性和女性血清都具有可與Tat蛋白以及肽4所示表位反應(yīng)的顯著的IgM滴度，而除2份以外所有其他HIV-血清具有與肽8所示表位反應(yīng)的顯著的IgM滴度。所有60份HIV+血清都具有與Tat蛋白和肽4所示序列反應(yīng)的較低但顯著的IgM抗體滴度，而60份中只有46份具有與肽8所示的精氨酸富含序列反應(yīng)的IgM。即使對于陽性范圍內(nèi)的HIV+血清，與肽8反應(yīng)的IgM水平較低(圖7)，明顯表明其耗盡的趨勢比與肽4反應(yīng)的IgM更甚(圖8)。可以認(rèn)為IgG抗體(表I)代表了IgM天然抗體的成熟形式(27，28)和/或那些由某種外來抗原因子獨立誘導(dǎo)的抗體。后者可能適用于與肽1反應(yīng)的IgG(圖5)，存在于HIV-血清中，而不存在于Tat誘導(dǎo)的和HIV+血清中(表1)。圖7和圖8資料證實，與肽8反應(yīng)的天然抗體(圖7)比與肽4反應(yīng)的天然抗體(圖8)更嚴(yán)格地反映出與Tat反應(yīng)的天然抗體的下降趨勢。圖9、10、11顯示出與Tat反應(yīng)的IgM天然抗體滴度與HIV的致病進(jìn)程，以及建立的病程指標(biāo)CD4+T細(xì)胞數(shù)目是相關(guān)的(29)。每張圖顯示了從單個病人的系列標(biāo)本獲得的數(shù)據(jù)，包括與Tat蛋白、肽4和肽8反應(yīng)的IgM檢測滴度以及CD4+T細(xì)胞數(shù)目的臨床實驗報告。圖9的系列標(biāo)本從一位診斷為AIDS的HIV+男性收集，經(jīng)歷5年多時間直至他死亡。每一個與Tat蛋白反應(yīng)的IgM滴度值反映出同一份標(biāo)本與肽4和肽8反應(yīng)的IgM滴度值的綜合。尤為突出的是，與肽8的反應(yīng)性急劇上升之后驟然下降，同時，在死亡前8個月收集的標(biāo)本事實上CD4+T細(xì)胞已完全消失。圖10顯示一位HIV+男性病人系列標(biāo)本的資料，該病人感染時間據(jù)估計長達(dá)11年以上，并且未經(jīng)抗-HIV藥物治療也無HIV發(fā)病癥狀，因而符合長期生存者(LTS)或長期不發(fā)病者(LTNP)的標(biāo)準(zhǔn)(12，13)。與Tat蛋白、肽4和肽8反應(yīng)的IgM天然抗體滴度的維持模式類似于正常(HIV-)人的該種模式(14，16)。高水平IgM滴度，特別是與肽8反應(yīng)的IgM滴度，與CD4+T細(xì)胞數(shù)目維持在正常范圍內(nèi)相關(guān)。一位HIV+病人在報告CD4+T細(xì)胞數(shù)目下降之后開始抗病毒治療(圖11)，他的系列標(biāo)本顯示出類似的相關(guān)性。經(jīng)過一段時期的治療，CD4+T細(xì)胞數(shù)目和天然抗體滴度尤其是與肽8反應(yīng)的抗體滴度開始上升。此后的連續(xù)標(biāo)本表明CD4+T細(xì)胞數(shù)目和抗體滴度維持在正常范圍內(nèi)，伴隨病人總體上健康的狀態(tài)。
黑猩猩所有22份正常黑猩猩血清(表1)具有與Tat蛋白和肽4反應(yīng)的IgM和IgG抗體的顯著滴度。對于肽8，其中21份血清顯示明顯的IgM反應(yīng)性，17份血清顯示顯著的IgG反應(yīng)性。2只HIV接種的黑猩猩血清顯示出與Tat蛋白、肽4和肽8所示序列反應(yīng)的顯著的IgG和IgM反應(yīng)性，而不與其他肽反應(yīng)。因此，黑猩猩的天然抗體群與人類相似。
猴32份正常血清中未檢測到與Tat蛋白或其任何組成肽反應(yīng)的IgM(表1)。3只SIV感染猴中一只顯示了與Tat蛋白的反應(yīng)性。然而所有32份血清顯示了與肽4的IgG反應(yīng)性，21份血清顯示了與Tat蛋白的IgG反應(yīng)性。2份正常恒河猴血清與所有3份SIV感染的恒河猴血清顯示了與肽8的IgG反應(yīng)性。
兔30份正常兔血清中，2份顯示了與肽4的IgM反應(yīng)性，然而未伴有可檢測的與Tat蛋白反應(yīng)的IgM。這2份與另外1份正常兔血清顯示了與肽4的IgG反應(yīng)性，但同樣未檢測到與Tat蛋白的反應(yīng)性。Tat免疫的兔血清顯示了與肽1和Tat蛋白的IgM反應(yīng)性，以及與肽4、肽1和Tat蛋白的IgG反應(yīng)性。這種分布提示，在正常的和Tat免疫的兔血清中都有與肽4反應(yīng)的IgM和IgG，反映出一種在裝配型Tat蛋白中檢測不到的外來抗原的反應(yīng)。Tat免疫的兔血清中表現(xiàn)的與肽1的IgM和IgG反應(yīng)性可歸因于免疫原的誘導(dǎo)，因為反映出的肽1的反應(yīng)性與Tat蛋白高的反應(yīng)性類似。
小鼠血清獲自30只正常小鼠，2只Tat/佐劑免疫的小鼠和2只僅用佐劑免疫的小鼠，其中沒有一份血清顯示與Tat蛋白或任何肽的IgM反應(yīng)性(表1)。30份正常小鼠血清中，2份顯示與肽4的IgG反應(yīng)性，另外一份顯示與Tat蛋白的IgG反應(yīng)性。2份僅用佐劑免疫的小鼠血清未顯示任何反應(yīng)性，而2份Tat/佐劑免疫的小鼠血清卻顯示出與肽1和Tat蛋白相當(dāng)高的反應(yīng)性(＞1.0)。顯然，對于兔和小鼠，Tat蛋白是一種誘導(dǎo)特異針對肽1所示序列的抗體反應(yīng)的有力誘導(dǎo)物。
討論Tat蛋白的重要性早在HIV感染的致病序列中通過其在細(xì)胞附著和病毒進(jìn)入過程中所起作用顯示出來。體外研究的事實表明，Tat參與了主要由Tat肽7、8、9(圖5)所示的堿性結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的內(nèi)化作用(30，31)。病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖也依賴于Tat，通過Tat與病毒RNA的Tar區(qū)域相互作用導(dǎo)致反式激活(18，19)。由Tat肽4、5(圖5)所示的半胱氨酸區(qū)域在Tat/Tar結(jié)合和隨后的HIV復(fù)制過程中發(fā)揮了重要的作用(18，19)。因此，由Tat介導(dǎo)的病毒進(jìn)入和激活內(nèi)化病毒復(fù)制這兩種活性依賴于Tat的序列，該序列包含兩種天然IgM抗體的表位，這兩種天然抗體存在于本研究檢驗的所有人和黑猩猩血清中，而在其他哺乳動物如猴、兔、小鼠的血清中(表1)并不存在。
根據(jù)表位特異性，我們提出，那些天然抗體在HIV感染后的早期提供了或貢獻(xiàn)了人體宿主耐受HIV致病性的一種機制。通過人體宿主的天然抗體阻滯病毒進(jìn)入和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，而SIV感染的恒河猴卻缺乏這種阻滯作用，這種現(xiàn)象可對以下現(xiàn)象作出解釋在SIV感染的恒河猴中T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)換率遠(yuǎn)高于HIV感染中人的轉(zhuǎn)換率(32，33)。盡管HIV+人外周血細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞群體的耗盡的準(zhǔn)確機制尚未專門建立，本研究的圖9、10、11的系列標(biāo)本中卻證明了CD4+T細(xì)胞數(shù)目與Tat-反應(yīng)性天然抗體滴度之間的關(guān)系。在每一系列標(biāo)本中，CD4+T細(xì)胞數(shù)目與抗體滴度的維持和下降平行。
然而，那些天然抗體偶然性地阻滯Tat-相關(guān)的致病過程，有可能因免疫系統(tǒng)將抗體反應(yīng)的Tat序列識別為自身抗原從而誘導(dǎo)耐受而受到限制(21，22)。
天然免疫和適應(yīng)性免疫各自獨立對等的原理最近獲得許多關(guān)注(6，7，8)，其有希望進(jìn)一步澄清自我識別進(jìn)而耐受的機制和事件。因此，自我耐受之基本的和起作用的事件似乎為涉及天然抗體產(chǎn)生的T和/或B細(xì)胞的去除或關(guān)閉(23)。因此，當(dāng)Tat抗原負(fù)荷增加，可能抑制了Tat-反應(yīng)性天然抗體的產(chǎn)生，喪失抗體介導(dǎo)的對Tat攻擊性的限制，從而終止了發(fā)病潛伏期。體外實驗描述的Tat的一種致病活性為誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡(29)。Tat-反應(yīng)性天然抗體可能阻礙Tat作用，因此有助于維持HIV感染后早期的表現(xiàn)潛伏性，這種假設(shè)被以下觀察所支持定義為LTS(長期生存者)(12)或LTNP(長期不發(fā)病者)(13)的人極少顯示T細(xì)胞編程性死亡的跡象(21)，并且如我們證實(圖10)，保持正常水平的天然抗體。與此相關(guān)的報道(34)為黑猩猩對AIDS病程的耐受伴隨T細(xì)胞水平的維持，極其少見Tat誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。
盡管T細(xì)胞以編程性死亡耗盡的機制尚未完全理解，但最近研究表明Fas/Fas配體系統(tǒng)在HIV誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞編程性死亡過程中并非調(diào)節(jié)因子(35，36)。然而尤其引起爭論的是，最近報道SIV(mac239)體外誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞編程性死亡由Fas/Fas配體系統(tǒng)所介導(dǎo)(37)。SIV和HIV在編程性細(xì)胞死亡介導(dǎo)的機制之間的差異與本研究的主題十分相關(guān)，即HIV與人體免疫系統(tǒng)的相互作用顯然是獨特的。體外研究干擾素對病毒復(fù)制的干擾效果表明了HIV和SIV另一顯著差異。干擾效果似乎為在SIV感染細(xì)胞中主要與干擾素阻礙病毒DNA合成有關(guān)，但在HIV感染細(xì)胞中卻不是如此(38)。
B細(xì)胞和T細(xì)胞的編程性死亡可歸因于Tat的作用(29)。更為引人注目的是越來越多的文獻(xiàn)報道Tat參與導(dǎo)致癡呆的神經(jīng)變性(24)。報道包括Tat劑量依賴的人胚胎神經(jīng)元培養(yǎng)物編程性細(xì)胞死亡(39)，以及從死于AIDS的病人腦組織中檢出神經(jīng)元的編程性死亡(40)。Tat透過血腦屏障的潛在能力支持了體外證實的Tat神經(jīng)毒效應(yīng)可在體內(nèi)發(fā)生的可能性。通過對精子染色體蛋白質(zhì)魚精蛋白的血管滲透能力和血腦屏障穿透能力的多種分析，我們將這種功能歸于魚精蛋白的精氨酸富含區(qū)(41)。Tat的精氨酸富含序列，此處由肽7、8、9(圖5)所示，同樣天然存在這種能力。特別相關(guān)的是，與Tat肽8反應(yīng)的天然抗體的表位分析表明(16)，與天然抗體反應(yīng)的表位存在于魚精蛋白和HIV Tat蛋白特定的精氨酸富含序列中。
兩種人天然抗體IgM和IgG的表位相似性表明每種代表同一種抗體的一對同種型。過去我們主張，正常人群中每個人系列標(biāo)本的兩種天然抗體中IgM滴度而非IgG滴度保持穩(wěn)定，表明IgM為維持穩(wěn)態(tài)型同種型(16)。目前尚未很好理解天然抗體種類轉(zhuǎn)換的機制和效用，并且也并非顯而易見，但有希望的是，目前對天然免疫和適應(yīng)性免疫同種型轉(zhuǎn)換的分子機制和功能方面的研究過程將澄清這種機制和效用(42)。
因此，目前對人Tat反應(yīng)性天然抗體的同種型抗體IgM和IgG的單獨作用進(jìn)行確定并不可行。然而，顯而易見的是HIV+人群中并不發(fā)生由免疫原誘導(dǎo)的Tat反應(yīng)性抗體(表1)。既然猴子、兔和小鼠中可誘導(dǎo)產(chǎn)生Tat反應(yīng)性抗體(表1)，表明只有人免疫系統(tǒng)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生該抗體是獨特的。由于假設(shè)黑猩猩與人具有高水平的遺傳同源性(20)，那么黑猩猩與人具有高水平的遺傳同源性(20)，那么黑猩猩血清中與Tat反應(yīng)的抗體的分布支持了這種遺傳特異性的唯一屬性(表1)。與人血清平行的證據(jù)HIV感染前后的黑猩猩都具有與Tat肽4和肽8(圖5)反應(yīng)的IgG和IgM抗體，不具有與其它肽反應(yīng)的抗體(表1)。然而，黑猩猩比HIV+病人對病情發(fā)展為AIDS明顯地具有更大的天然耐受力(10，11)，這可能違背了某些參與耐受誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)組分的遺傳一致性(21，22)。隨之產(chǎn)生一個問題是否是相同的遺傳特征與LTS/LTNP患者所賦予的針對HIV損傷的保護(hù)作用有關(guān)(12，13)？實施例5的參考文獻(xiàn)1.McCune，J.M.HIV-I疾病的動物模型，1997，科學(xué)(Science)2792141。
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序列表<110>Institute for Human Genetics and and Biochemistry<120>單克隆人天然抗體<130>4436/2C074-EP<140>98961805.3<141>1998-11-24<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>12<212>PRT<213>人<400>1Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>人<400>2Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>人<400>3Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人<400>4Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>人<400>5Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>人<400>6Val Cys Phe Ile Thr Cys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>人<400>7Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>人<400>8Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>人<400>9Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Arg Arg Pro Gln Gly1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>人
<400>10Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>人<400>11Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>人<400>12Lys Gln Pro Thr Ser Gln Arg Gly Asp Pro Thr Glu1 5 10<210>13<211>12<212>PRT<213>人<400>13Asp Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>人<400>14Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe Gly1 5 10<210>15<211>12<212>PRT<213>人<400>15Gln Gln Ala Lys Phe Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys1 5 10<210>16<211>12<212>PRT
<213>人<400>16Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu1 5 10<210>17<211>12<212>PRT<213>人<400>17Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser Glu Thr Lys1 5 10<210>18<211>12<212>PRT<213>人<400>18Phe Gln Ser Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp1 5 10<210>19<211>12<212>PRT<213>人<400>19Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala1 5 10<210>20<211>12<212>PRT<213>人<400>20Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg Leu His Gly Lys Thr1 5 10<210>21<211>12<212>PRT<213>人<400>21Arg Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu1 5 10<210>22
<211>12<212>PRT<213>人<400>22Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val Ala1 5 10<210>23<211>12<212>PRT<213>人<400>23Gly Pro Gln Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys1 5 10<210>24<211>12<212>PRT<213>人<400>24Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro1 5 10<210>25<211>12<212>PRT<213>人<400>25Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Glu1 5 10<210>26<211>12<212>PRT<213>人<400>26Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys1 5 10<210>27<211>12<212>PRT<213>人<400>27Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Cys Lys1 5 10
<210>28<211>12<212>PRT<213>人<400>28Val Tyr Thr Ala Cys Lys Cys Gly Leu Val Pro Val1 5 10<210>29<211>12<212>PRT<213>人<400>29Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Lys1 5 10<210>30<211>12<212>PRT<213>人<400>30Leu Ala Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp1 5 10<210>31<211>12<212>PRT<213>人<400>31Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val1 5 10<210>32<211>12<212>PRT<213>人<400>32Pro Asp Pro Asn Cys Val Asp Arg Pro Val Glu Gly1 5 10<210>33<211>12<212>PRT<213>人<400>33Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val1 5 10<210>34<211>12<212>PRT<213>人<400>34Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser Asp Thr1 5 10<210>35<211>12<212>PRT<213>人<400>35Val Arg Arg Ser Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser1 5 10<210>36<211>12<212>PRT<213>人<400>36Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser1 5 10
權(quán)利要求
1.一種保藏號為ATCC CRL-12431的雜交瘤細(xì)胞系。
2.一種由權(quán)利要求1的雜交瘤生產(chǎn)的人IgM單克隆抗體，該抗體可與人精子頭部存在的乳鐵蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。
3.一種保藏號為ATCC CRL 12477的雜交瘤細(xì)胞系。
4.一種由權(quán)利要求3的雜交瘤生產(chǎn)的分離的人IgM單克隆抗體。
5.一種保藏號為ATCC CRL 12472的雜交瘤細(xì)胞系。
6.一種由權(quán)利要求5的雜交瘤生產(chǎn)的分離的人IgM抗體。
7.一種治療患有由HIV-1引起的感染的病人的方法，包括為治療所述感染給需要這種治療的病人施用有效量的分離的人單克隆IgM抗體，該抗體選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)TCC CRL 12477、ATCC CRL 12472生產(chǎn)的抗體，及其混合物。
8.一種增加患有由HIV-1引起的感染的病人中CD4+T細(xì)胞的方法，包括施用增加CD4+T細(xì)胞有效量的抗體，該抗體選自由保藏號為ATCC CRL 12472、ATCC CRL 12477的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的抗體，及其混合物。
9.一種藥物制劑，其包含分離的人單克隆IgM抗體，以及藥學(xué)可接受的載體，其中的抗體選自由保藏號為ATCC CRL 12472、ATCCCRL 12477的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的抗體，及其混合物。
10.權(quán)利要求9的藥物制劑，其中所述的藥學(xué)可接受的載體是一種IVIG制品。
11.一種制備分泌所產(chǎn)生的單克隆人天然IgM抗體之人雜交瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟融合EB病毒無限增殖化的臍帶血細(xì)胞與小鼠人雜交骨髓瘤細(xì)胞；分離融合細(xì)胞；在限定的條件下將所述融合細(xì)胞鋪板，且分離雜交瘤細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述單克隆人天然抗體可與人乳鐵蛋白免疫反應(yīng)。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述單克隆人天然抗體可與HIV-1的Tat蛋白免疫反應(yīng)。
14.一種分泌由權(quán)利要求11的方法產(chǎn)生的人天然IgM抗體的人雜交瘤細(xì)胞。
15.一種通過感染EB病毒無限增殖化的分離的人臍帶血細(xì)胞。
全文摘要
在這里公開的是產(chǎn)生單克隆人天然IgM抗體的雜交瘤細(xì)胞系及其使用方法。該抗體是循環(huán)人天然抗體的單克隆等價物。在這里同樣公開了藥物制劑以及使用單克隆人天然抗體治療感染HIV－1的病人的方法。
文檔編號A61P31/18GK1492040SQ0114079
公開日2004年4月28日 申請日期1998年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月24日
發(fā)明者T·C·羅德曼, T C 羅德曼 申請人:人類遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究所