專利名稱：基于巨噬細胞集落刺激因子受體的基因疫苗及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及腫瘤免疫治療領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種基于巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)及其受體(M-CSFR)的腫瘤基因疫苗及其應用。
巨噬細胞集落刺激因子受體是由c-fms原癌基因編碼的跨膜蛋白，屬于受體酪氨酸激酶家族的重要成員(Hamilton JA.J Leukoc Biol1997；62145-155)。本發(fā)明人及其它學者的研究發(fā)現(xiàn)，異型巨噬細胞集落刺激因子及其受體是腫瘤相關(guān)的，例如與肝癌、乳腺癌、卵巢癌等婦科腫瘤、白血病和淋巴瘤等相關(guān)。另外本發(fā)明人及他人的研究亦發(fā)現(xiàn)M-CSFR與一些非腫瘤性疾病如動脈粥樣硬化、部分慢性肝、腎病和特發(fā)性血小板減少性紫癜也相關(guān)，也有提議抗M-CSFR抗體治療艾滋病。因此，M-CSFR有可能成為腫瘤免疫治療和非腫瘤免疫治療的靶點，M-CSFR基因疫苗具有巨大的應用潛力。但是到目前為止，有關(guān)M-CSFR的研究尚停留在實驗室理論研究階段，尚未有應用其制備基因疫苗的任何提示和成功報道。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗與藥物學可接受的載體或佐劑的藥物組合物，所述藥物組合物可給予人以預防和治療巨噬細胞集落刺激因子及其受體相關(guān)的各種腫瘤疾病和非腫瘤疾病。
圖2是用本發(fā)明的基因疫苗pCSFr免疫小鼠后，ELISA法檢測的免疫小鼠血清M-CSFR特異性抗體相對滴度條形圖，實驗如實施例2所示。
圖3是經(jīng)LDH釋放實驗測定的本發(fā)明的基因疫苗pCSFr誘導的CTL反應，實驗如實施例2所示。
圖4示出了用本發(fā)明的基因疫苗pCSFr免疫治療荷瘤小鼠后，小鼠的生存期變化，實驗如實施例3所示。
圖5是用pCSFr免疫和對照質(zhì)粒pCI免疫的荷瘤小鼠腫瘤組織病理切片的光學顯微鏡照片，其中A為pCSFr免疫小鼠的腫瘤組織病理切片，B為pCI免疫小鼠的腫瘤組織病理切片。
圖6是在腫瘤組織中檢測的M-CSFR基因的表達的電泳圖，其中泳道M為分子量標記，泳道1為SP2/CSFr-1來源的腫瘤組織的RT-PCR擴增物，泳道2為SP2/0來源的腫瘤組織的RT-PCR擴增物。
本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗pCSFr可與藥物學可接受的載體或佐劑配制成藥物組合物，這些藥物學可接受的載體或佐劑包括但不限于載體如pCDNA3，pCI，pCMV，佐劑如陽離子脂質(zhì)體，IL-12，GM-CSF，γ-干擾素。所述的藥物組合物可通過常規(guī)的免疫途徑應用于人類，從而引發(fā)免疫應答。所述應用途徑包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、靜脈注射、基因槍轟擊和鼻粘膜滴注等，優(yōu)選肌肉注射和基因槍轟擊。
本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗pCSFr可用于免疫人和哺乳動物以預防和治療各種腫瘤疾病或非腫瘤疾病。在本發(fā)明后述的實施例中表明，用本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗pCSFr免疫的BALB/c小鼠產(chǎn)生了特異性抗體反應且具有刺激特異性CTL的活性。另外，pCSFr免疫BALB/c小鼠后能保護免疫小鼠防御SP2/CSFr-1腫瘤細胞的攻擊，其抗腫瘤免疫保護率為20％；而給荷瘤小鼠肌肉注射M-CSFR基因疫苗，其生存期明顯延長。所有這些實驗結(jié)果提示本發(fā)明的M-CSFr基因疫苗是一種前景良好的腫瘤預防和治療藥物。
以下將以實施例詳細說明本發(fā)明，應理解的是，本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1 M-CSFR基因疫苗的構(gòu)建本例以人白血病細胞系J6-1出發(fā)，從中克隆巨噬細胞集落刺激因子受體cDNA片段，并用此cDNA片段構(gòu)建M-CSFR基因疫苗，命名為pCSFr。
人白血病細胞系J6-1是本發(fā)明人所在實驗室在1976年從AMML建株的粒單型白血病細胞系(Wu KF，et al.Proc CAMS &PUMC 1986；1218-224)。利用人M-CSFR特異性抗體SC-692(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)采用細胞免疫化學方法(Song YH，et al.ProcCAMS & PUMC 1988；333)檢測了M-CSFR在J6-1細胞的表達，實驗結(jié)果顯示J6-1細胞高水平表達M-CSFR，其陽性信號主要分布于細胞膜。由此從J6-1細胞出發(fā)克隆M-CSFR基因。1、M-CSFR基因的克隆1)總RNA提取采用TRIZOLReagent總RNA分離試劑盒(Gibco)根據(jù)廠商指導提取J6-1細胞的總RNA。具體地，離心收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的5-10×106細胞，加1ml TRIZOL提取液，室溫放置5分鐘，之后加入0.2ml氯仿，強烈振蕩15秒，再室溫放置2-3分鐘。4℃、12000g離心15分鐘，取上層水相，置于新的離心管，加0.5ml異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，再次4℃、12000g離心10分鐘。用1ml 75％乙醇洗滌沉淀一次，4℃、8000g離心5分鐘，空氣干燥。加20μl DEPC(Aldrich公司)處理水溶解RNA，最后加1μl RNasin，-70℃貯存?zhèn)溆谩?)cDNA合成20微升反轉(zhuǎn)錄反應包含如下成分6微升(約2微克)上述總RNA，1微升寡(dT)12-18，5微升DEPC-水，5×MML-V反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(Gibco)，2微升dNTPs(10mmol/L)，1微升RNasin(40U/微升)和1微升MML-V反轉(zhuǎn)錄酶(10U/微升)(Gibco)。37℃60分鐘，之后95℃加熱5分鐘以滅活MML-V反轉(zhuǎn)錄酶，將獲得的cDNA于-20℃貯存?zhèn)溆谩?)PCR反應取5微升上述cDNA，分別加入25pmol M-CSFR特異性的上游引物(5’-CC ATG GGC CCA GGA GTT CTG CTG-3’，SEQ IDNO2)和下游引物(5，-A CTG TTG CCC TCA TAG CTC TCG-3’，SEQ ID NO3)，200μM dNTPs和2U的pLATINUM Taq DNA聚合酶(Gibco)，反應體系為50微升，擴增條件為94℃ 30秒、62℃ 50秒、72℃ 1.5分鐘，25個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。PCR擴增反應結(jié)果獲得一條大小為1682bp的MCSFR cDNA片段。其序列如SEQID NO1所示。2、M-CSFR基因疫苗的構(gòu)建用Promega公司的Wizard PCR產(chǎn)物DNA純化試劑盒，按照廠商所述對上述M-CSFR PCR產(chǎn)物進行回收與純化。將回收的M-CSFR cDNA片段直接克隆到真核表達質(zhì)粒pTARGET(Promega)，所得質(zhì)粒命名為pCSFr。pTARGET是真核表達T載體，其來源于pCI真核表達質(zhì)粒，含有CMV真核啟動子和G418選擇基因。用pCSFr轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒以進行限制性內(nèi)切酶分析鑒定，證實插入片段的大小正確。由此，獲得了本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗pCSFr。實施例2 M-CSFR基因疫苗pCSFr誘導的免疫應答用德國Qiagen公司的EndoFree Plasmid Mega 2500去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒從在500ml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)的JM109/pCSFr中純化質(zhì)粒DNA。將pCSFr及對照空載體pCI(Promega)用生理鹽水配制成1μg/μl濃度，將其注射到6-8周雌性BALB/c小鼠(得自中國醫(yī)學科學院血液學研究所動物室)的股四頭肌中，每周注射1次，每次100微升，共注射3次。之后進行如下測試1)血清M-CSFR抗體滴度測定末次免疫后1周，采用ELISA法檢測免疫小鼠血清的M-CSFR特異性抗體滴度。具體方法為(1)包被用包被緩沖液(0.05M碳酸緩沖液，pH9.6)稀釋人重組M-CSFR(10μg/ml，中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所鄭德先教授惠贈)，于96孔板每孔加入100μl此包被液，4℃過夜；(2)棄包被液，每孔加入200μl封閉液(0.01 M PBS，pH7.4)，置37℃ 2小時，棄封閉液，以PBS-T(0.01 M PBS+0.05％Tween-20，pH7.4)洗滌2次；(3)向各孔中加入100μl(1∶50稀釋)待測小鼠血清，設置空白對照和BSA對照加樣孔，37℃保溫2小時，棄去待測液體，以PBS-T洗滌3次；
(4)每孔加入100μl辣根過氧化物酶(HRP)綴合的羊抗小鼠IgG(1∶2000，北京中山公司)，37℃保溫1小時，棄抗體，以PBS-T洗滌3次；(5)每孔加入100μl OPD顯色液(5.3mg鄰苯二氨二氫溶于13.2ml檸檬酸/磷酸緩沖液，pH5.0)，室溫避光反應10分鐘；(6)每孔加入50μl終止液(2M H2SO4)，在ELISA檢測儀(SLT，Spectra Classic II)中于492nm測定OD值。
結(jié)果如圖2所示，pCI對照組的平均OD492＝0.21±0.08，pCSFr免疫組的平均OD492＝0.71±0.27。根據(jù)每只小鼠的平均OD492(三孔重復)計算各組免疫小鼠M-CSFR特異性抗體反應的陽性率，結(jié)果顯示pCSFr組5只免疫小鼠中有4只產(chǎn)生了M-CSFR特異性的抗體反應，抗體反應的陽性率為80％。2)CTL活性測定細胞毒T淋巴細胞(CTL)是殺傷腫瘤細胞的重要免疫活性細胞，在腫瘤基因疫苗誘導的抗腫瘤免疫應答中起著關(guān)鍵性作用。本例中應用乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗，測定了不同免疫組小鼠脾臟淋巴細胞的CTL活性。LDH釋放實驗的步驟參見Weidmann等，Ann Hematol 1995；70153。結(jié)果如圖3所示，pCSFr免疫組小鼠的脾臟淋巴細胞對穩(wěn)定表達人源M-CSFR的小鼠骨髓瘤細胞系SP/CSFr-1細胞(本發(fā)明人實驗室建立)的殺傷活性顯著高于pCI對照組。實施例3 M-CSFR基因疫苗對小鼠腫瘤的預防與治療作用1、pCSFr的腫瘤預防作用將6-8周齡雌性BALB/c小鼠(得自中國醫(yī)學科學院血液學研究所動物室)10只隨機分為2組即基因疫苗組和對照組，每組各5只。將M-CSFR基因疫苗pCSFr及對照空載體pCI用無菌NS配制成1μg/μl濃度，將質(zhì)粒DNA直接注射到小鼠股四頭肌?；蛞呙缃M小鼠注射100μl pCSFr/小鼠/次；對照組小鼠注射100μl pCI/小鼠/次。一周后(即第二周)，每只小鼠于對側(cè)股四頭肌再注射100μl基因疫苗或等量對照質(zhì)粒DNA，加強免疫一次。第3周，同樣方法再加強免疫一次，每只小鼠共注射3次。第四周，每只小鼠背部皮下注射1×106個SP2/CSFr-1細胞，15天后，檢查每組小鼠的腫瘤形成率，解剖荷瘤小鼠，完整切取腫瘤組織，稱重后，切取一半腫瘤組織做病理切片分析，另一半凍存于液氮中，以備RT-PCR等其它分析。
小鼠成瘤率和平均瘤重的比較采用配對t檢驗，結(jié)果表明，5只接受了M-CSFR基因疫苗免疫的小鼠中有1只無腫瘤形成，其抗腫瘤免疫保護率為20％，而對照組5只小鼠全部有腫瘤形成，其腫瘤形成率為100％。由此提示本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗能夠一定程度地保護免疫小鼠防御SP2/CSFr-1腫瘤細胞的攻擊，預防免疫小鼠腫瘤的形成。另外，M-CSFR基因疫苗免疫組的平均瘤重為0.372±0.27g，顯著低于對照組平均瘤重1.498±0.92g，兩組比較p＝0.024。
Bronte等(Bronte V，et al.Cancer Res 2000；60253-258)構(gòu)建了黑素瘤TRP-2基因疫苗，其免疫C57/BL/6小鼠后，抗腫瘤免疫保護率為86％。而本發(fā)明的M-CSFR基因疫苗誘導的抗腫瘤免疫保護率為20％(見上述)，這種保護率的差異可能與不同的免疫方法有關(guān)，本發(fā)明是采用直接肌肉注射基因疫苗的方法免疫小鼠，而Bronte等在注射基因疫苗前，先給小鼠肌注了10μM的心肌毒素，心肌毒素可以使肌肉組織壞死進而再生，而再生的肌肉組織對質(zhì)粒DNA的攝取能力明顯增強(Bronte V，et al.Cancer Res 2000；60253-258)，因而獲得了較高的保護率。3、pCSFr的治療作用將20只6-8周齡雌性BALB/c小鼠(得自中國醫(yī)學科學院血液學研究所動物室)隨機分為4組，每組各5只(1)pCSFr組，(2)pCI組，(3)pCSFr+pCI-18組，(4)pCSFr+WT組，其中1-3組每只小鼠腹腔注射2×105個SP2/CSFr-1細胞，第4組每只小鼠腹腔注射2×105個野生型(WT)SP2/0骨髓瘤細胞。接種骨髓瘤細胞2天后，開始用本發(fā)明的基因疫苗pCSFr治療荷瘤小鼠，注射免疫方法同上述腫瘤預防實驗。每組小鼠分別注射下述質(zhì)粒DNA第1組和第4組每只小鼠注射100μl pCSFr；第2組每只小鼠注射100μl對照質(zhì)粒pCI，第3組每只小鼠注射100μl pCSFr+pCI-18。第10天，同樣方法加強免疫1次。最后觀察每組小鼠的腫瘤形成情況，記錄每組小鼠的生存期。
結(jié)果如圖4所示，可以看出，M-CSFR基因疫苗pCSFr不能使BALB/c荷瘤小鼠腫瘤消除，但是能夠延長荷瘤小鼠的生存期(p＝0.0143)；另外pCSFr對注射野生型SP2/0骨髓瘤細胞的荷瘤小鼠的生存期無明顯影響(p＝0.652)，提示M-CSFR基因疫苗對荷瘤小鼠的治療作用具有SP2/CSFr-1腫瘤細胞特異性。4、病理切片分析將在上述pCSFr腫瘤預防實驗中切取的腫瘤組織迅速置于Bouin′s固定液(75ml苦味酸飽和水溶液+25ml 40％甲醛+5ml冰醋酸)中固定1-2天，石蠟包埋，每塊腫瘤組織從5個不同層面分別切片，常規(guī)方法制作病理切片，用光學顯微鏡進行形態(tài)學觀察。
結(jié)果如圖5所示，可以看出M-CSFR基因疫苗pCSFr免疫組的腫瘤組織病理切片中可見較多的凋亡細胞(圖5A)，而對照組腫瘤組織病理切片中的凋亡細胞較少(圖5B)。5、人M-CSFR基因在腫瘤組織中的表達從上述腫瘤預防實驗中切取并凍存于液氮中的來源于SP2/CSFr-1細胞的腫瘤組織以及野生型SP2/0細胞來源的腫瘤組織按常規(guī)方法提取RNA，并以2微克提取的RNA為模板，以Oligo(dT)12-18為引物在MML-V逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco)作用下合成cDNA。取5微升上述cDNA，進行PCR擴增檢測人M-CSFR基因在腫瘤組織中的表達，PCR反應以小鼠GAPDH cDNA擴增產(chǎn)物為內(nèi)標。結(jié)果如圖6所示，由圖中可以看出SP2/CSFr-1細胞來源的腫瘤組織中有人M-CSFR mRNA的表達，而野生型SP2/0細胞來源的腫瘤組織中未檢測到M-CSFR mRNA的表達。
序列表<110>中國醫(yī)學科學院血液學研究所<120>基于巨噬細胞集落刺激因子受體的基因疫苗及其應用<130>I01837CB<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1682<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ccatgggccc aggagttctg ctgctcctgc tggtggccac agcttggcac ggccagggaa 60tcccagtgat agagcccagt gtccctgagc tggtcgtgaa gccagaagca acggtgacct 120tgcgatgtgt gggcaatggc agcgtggaat gggatggccc cccatcacct cactggaccc 180tgtactctga tggctccagc agcatcctca gcaccaacaa cgctaccttc caaaacacgg 240ggacctatcg ctgcactgag cctggagacc ccctgggagg cagcgccgcc atccacctct 300gattcaaaga ccctgcccgg ccctggaacg tgctagcaca ggaggtggtc gtgttcgagg 360accaggacgc actactgccc tgtctgctca cagacccggt gctggaagca ggcgtctcgc 420tggtgcgtgt gcgtggccgg cccctcatgc gccacaccaa ctactccttc tcgccctggc 480atggcttcac catccacagg gccaagttca ttcagagcca ggactatcaa tgcagtgccc 540tgatgggtgg caggaaggtg atgtccatca gcatccggct gaaagtgcag aaagtcatcc 600cagggccccc agccttgaca ctggtgcctg cagagctggt gcggattcga ggggaggctg 660cccagatcgt gtgctcagcc agcagcgttg atgttaactt tgatgtcttc ctccaacaca 720acaacaccaa gctcgcaatc cctcaacaat ctgactttca taataaccgt taccaaaaag 780tcctgaccct caacctcgat caagtagatt tccaacatgc cggcaactac tcctgcgtgg 840ccagcaacgt gcagggcaag cactccacct ccatgttctt cagggtggta gagagtgcct 900acttgaactt gagctctgag cagaacctca tccaggaggt gaccgtgggg gaggggctca 960acctcaaagt catggtggag gcctacccag gcctgcaagg ttttaactgg acctacctgg 1020gacccttttc tgaccaccag cctgagccca agcttgctaa tgctaccacc aaggacacat 1080acaggcgcac cttcaccctc tctctgcccc gcctgaagcc ctctgaggct ggccgctact 1140ccttcctggc cagaaaccca ggaggctgga gagctctgac gtttgagctc acccttcgat 1200accccccaga ggtaagcgtc atatggacat tcatcaacgg ctctggcacc cttttgtgtg 1260ctgcctctgg gtacccccag cccaacgtga catggctgca gtgcagtggc cacactgata 1320ggtgtgatga ggcccaagtg ctgcaggtct gggatgaccc ataccccgag gtcctgagcc 1380aggagccctt ccacaaggtg acggtgcaga gcctgctgac tgttgagacc ttagagcaca 1440accaaaccta cgagtgcagg acccacaaca gcgtggggag tggctcctgg gccttcatac 500ccatctctgc aggagcccac acgcatcccc cggatgagtt cctcttcaca ccagtggtgg 1560tcgcctgcat gtccatcatg gccttgctgc tgctgctgct cctgctgcta ttgtacaagt 1620ataagcggaa gcccaagtac caggtccgct ggaagatcat cgagagctat gagggcaaca 1680gt 1682<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2ccatgggccc aggagttctg ctg 23<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3actgttgccc tcatagctct cg 2權(quán)利要求
1.一種基于巨噬細胞集落刺激因子受體的基因疫苗，其包含1682bp的巨噬細胞集落刺激因子受體cDNA片段，所述片段的序列如SEQ ID NO1所述。
2.如權(quán)利要求1所述的基因疫苗，其為pCSFr，其通過將所述巨噬細胞集落刺激因子受體cDNA片段插入真核表達載體pTARGET的CMV啟動子下游而構(gòu)建。
3.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1或2所述的基因疫苗及一種藥學可接受的載體或佐劑。
4.權(quán)利要求1或2的基因疫苗在制備用于預防或治療腫瘤疾病的藥物中的應用，所述腫瘤疾病選自肝癌、乳腺癌、卵巢癌、白血病和淋巴瘤。
5.權(quán)利要求1或2的基因疫苗在制備用于預防或治療非腫瘤疾病的藥物中的應用，所述非腫瘤疾病選自動脈粥樣硬化、部分慢性肝、腎病和特發(fā)性血小板減少性紫癜。
全文摘要
本發(fā)明公開了基于巨噬細胞集落刺激因子及其受體(M－CSFR)的基因疫苗及其應用。所述的基因疫苗例如為pCSFr，其是通過將1682bp M－CSFR cDNA片段連接到真核表達載體pTARGET的CMV啟動子下游而構(gòu)建。本發(fā)明的基因疫苗可用于預防和治療巨噬細胞集落刺激因子及其受體相關(guān)的各種腫瘤疾病，也可用于預防和治療各種相關(guān)的非腫瘤疾病。
文檔編號A61P7/00GK1408438SQ0114217
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者吳克復, 王勇, 鄭國光, 李戈 申請人:中國醫(yī)學科學院血液學研究所