專利名稱：一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)用蠶幼蟲和蛹制備人白細(xì)胞介素(IL-11)的方法，本發(fā)明還涉及用蠶幼蟲和蛹生產(chǎn)人白細(xì)胞介素(IL-11)制備抗血栓藥物的方法。
本發(fā)明提供了含有人白介素11的大腸桿菌質(zhì)粒pUCIL-11，以人骨髓組織細(xì)胞mRNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增，在5’端引物引進(jìn)Xho I酶切位點，在3’端引入BamHI位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平克隆進(jìn)入pUC19的SmaI位點(寶靈曼公司)，構(gòu)建質(zhì)粒pUCIL-11。
本發(fā)明還提供了含人白介素11基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacIL-11。從pUCIL-11質(zhì)粒用XhoI和BamHI酶切，將目的片段連在同樣被Xho I和Bgl II酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司)，構(gòu)建含人白介素11基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacIL-11(

圖1)。
本發(fā)明還提供了含人白細(xì)胞介素11基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacIL11。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacIL-11與家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染家蠶(Bombyx mori)細(xì)胞BmN，進(jìn)行8輪空斑篩選和Southern點雜交篩選含人白介素11基因的重組桿狀病毒BmBacIL11，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年8月6日，保藏編號為GMCC NO0602。
本發(fā)明還提供了人白細(xì)胞介素11基因在家蠶細(xì)胞、五齡幼蟲和蛹中的表達(dá)產(chǎn)物。將重組桿狀病毒BmBaclL11感染BmN家蠶細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmBac IL11注射至五齡家蠶幼蟲和蛹體內(nèi)，分別取24、48、72、96、120小時的家蠶幼蟲和蛹淋巴血，經(jīng)5000rpm 5分鐘離心后取上清，稀釋10倍后加等體積的2×蛋白上樣緩沖液，取20ul進(jìn)行12％的SDS-PAGE分析。用考馬斯亮藍(lán)R250染色，結(jié)果見圖2，結(jié)果在家蠶細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞樣品、幼蟲和蛹中血液樣品中都能檢測得到表達(dá)產(chǎn)物的條帶，其分子量大小與天然hIL-11的分子量相符，約為19ku。
本發(fā)明還對人白介素11的的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物活性的鑒定。B9-11細(xì)胞經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液洗滌2次，用全培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液含10％FBS)調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/L，每孔100μl，加入96孔培養(yǎng)板，分別加入不同稀釋的IL-11標(biāo)準(zhǔn)品和待測表達(dá)樣品，設(shè)B9-11細(xì)胞加全培養(yǎng)液做陰性對照。細(xì)胞置37℃、5％CO2下培養(yǎng)三天，在培養(yǎng)終止前4小時加濃度為5mg/ml的MTT溶液，每孔100μl，培養(yǎng)終止后輕輕棄上清，每孔加入酸化異丙醇100μl溶解甲簪顆粒。用酶標(biāo)儀測定OD值，比色波長為570nm。結(jié)果顯示，將50ul重組桿狀病毒BmBacIL11感染BmN家蠶細(xì)胞感染后不同時間測培養(yǎng)上清中的IL11活性，在感染的第3天達(dá)到8×104IU/106細(xì)胞。用BmBacIL11穿刺接種五齡家蠶幼蟲和蛹體，于感染后不同時間收集蠶血淋巴，高速離心后測血淋巴中的IL11的活性，在感染的120小時血淋巴中的IL11活性達(dá)到5.2×105IU/ml，在感染120小時蛹血淋巴的IL11活性達(dá)到8.0×105IU/ml。
本發(fā)明還提供了在家蠶幼蟲表達(dá)的人白介素11進(jìn)行純化。發(fā)病3天后收集家蠶細(xì)胞，發(fā)病5天后收集家蠶幼蟲和蛹血清，先經(jīng)離心和硫酸銨沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分離，每次收集樣品均經(jīng)測活，確定其活性存在，進(jìn)一步用HPLC陽離子交換柱和陰離子交換柱純化，獲得純度為99％的重組蛋白。
本發(fā)明還將家蠶幼蟲和蛹體表達(dá)人白介素11制成口服藥物。在家蠶細(xì)胞、幼蟲和蛹體表達(dá)人白介素11，經(jīng)過過濾(100 KD超濾)，30000rmp離心后經(jīng)冷凍干燥后，以家蠶幼蟲和家蠶蛹為填充料配制成口服藥物。
本發(fā)明還對用家蠶幼蟲和蠶蛹表達(dá)的人白介素11進(jìn)行動物試驗。取四周齡Balb/c小鼠(由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供)，♀♂各80只，體重均在16-18g左右，腹腔注射抗血小板抗體(購自浙江醫(yī)科大學(xué)平喘藥教研室)，劑量為3ml/kg，使小鼠血小板下降，腹腔注射抗血小板抗體24小時后開始給藥，第一組每天每只注射0.5mg/kg純化的人白介素11，每天給藥一次，連續(xù)給藥3天，第二組經(jīng)口給藥人白介素11口服藥物，給藥量為每20mg/kg，每天給藥一次，連續(xù)給藥7-10天，每天測定血小板變化(具體操作參照衛(wèi)生部《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則》)，結(jié)果表明所給藥物都具有明確的升血小板作用。
綜合所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人白介素11具有表達(dá)效率高、表達(dá)后加工較完善等特點，因家蠶容易大量飼養(yǎng)、蠶體大，比其他昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有更大的優(yōu)越性，可以避免直接從動物體內(nèi)純化存在的操作煩瑣、產(chǎn)率底、生產(chǎn)成本高等缺點，不會造成公害；家蠶是可以無菌大規(guī)模飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)昆蟲，可以低成本地大規(guī)模飼養(yǎng)；蠶體中有多種天然蛋白質(zhì)保護(hù)劑，對表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物十分穩(wěn)定；家蠶生產(chǎn)的蛋白可以口服，為患者解除了注射的痛苦和被感染的威脅，成為一條高效表達(dá)生產(chǎn)人IL-11的有效途徑。
權(quán)利要求
1.一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于通過基因工程方法獲得重組的帶白細(xì)胞介素(IL-11)基因的家蠶(Bombyx mori)重組桿狀病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年8月6日，保藏編號為GMCC NO0602，并用該病毒接種家蠶細(xì)胞、幼蟲和蛹進(jìn)行表達(dá)人白細(xì)胞介素11。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于所述的基因工程方法獲得重組的帶白細(xì)胞介素(IL-11)基因的家蠶(Bombyx mori)重組桿狀病毒包括人白細(xì)胞介素11基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBac IL-11的構(gòu)建是通過RT-PCR方法合成的人白細(xì)胞介素11基因片段，克隆進(jìn)入經(jīng)SmaI酶切的pUC19位點，將人白細(xì)胞介素11基因片段克隆進(jìn)入轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-8中，獲得的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBac IL-11。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于所述的基因工程方法獲得重組的帶白細(xì)胞介素(IL-11)基因的家蠶(Bombyx mori)重組桿狀病毒包括人白細(xì)胞介素11基因的重組家蠶桿狀病毒BmBacIL11的構(gòu)建是通過重組轉(zhuǎn)移載體pBac IL-11 DNA與家蠶核型多角體病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞經(jīng)8輪空斑篩選和Southern雜交斑篩選獲得重組病毒BmBacIL11。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于所述的人白細(xì)胞介素11基因在家蠶細(xì)胞、幼蟲和蛹中的表達(dá)是通過重組桿狀病毒BmBacIL11感染家蠶細(xì)胞、五齡家蠶幼蟲和蛹體表達(dá)產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于還包括分離，純化家蠶表達(dá)的人白細(xì)胞介素11的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于還包括以家蠶為填充劑制備口服藥物的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，其特征在于還包括將表達(dá)人白細(xì)胞介素11的家蠶幼蟲和蛹經(jīng)冷凍干燥后制成口服藥物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用蠶表達(dá)人白細(xì)胞介素11生產(chǎn)藥物的方法，屬于生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類藥物技術(shù)領(lǐng)域。通過家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus)重組帶有人白介素11基因，獲得重組病毒，該病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，地址在北京中關(guān)村，保藏日期為2001年8月6日，保藏編號為GMCC NO0602，將該重組病毒接種家蠶細(xì)胞、幼蟲、蛹進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)分離純化，冷凍干燥，制成注射和口服藥物，經(jīng)動物試驗，均具有顯著的增加小鼠血小板作用，成為一種制備增加血小板藥物的新型方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，原料易得，生產(chǎn)成本低，治療效果良好。
文檔編號A61P7/00GK1408372SQ0114218
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月17日
發(fā)明者張耀洲, 金勇豐, 吳祥甫, 郭錫杰 申請人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司