專利名稱：低分子量聚甘露糖醛酸的制作方法
背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及低分子量聚甘露糖醛酸，更特別地，涉及從高分子量藻酸鹽中通過分解純化出低分子量聚甘露糖醛酸的方法。
相關(guān)技術(shù)介紹由于含高脂肪和高蛋白的西式飲食方式的過度營養(yǎng)以及缺乏運(yùn)動(dòng)，許多難以治療的心血管疾病如高血壓、動(dòng)脈硬化癥(artheroscelrosis)、心絞痛、心肌梗塞(myocardial infarction)和腦血栓，以及肥胖癥和糖尿病的發(fā)病趨勢正在增高。預(yù)防及治療這些疾病的興趣正在日益增長。以規(guī)定的食品輔以用天然提取物替代化學(xué)合成品，預(yù)防和/或治療這些疾病受到歡迎，因?yàn)檫@種方法是沒有副作用的安全方法，減少了用戶對(duì)使用此類產(chǎn)品的不情愿。
反映這一趨勢，已經(jīng)有許多研究和進(jìn)展集中在食品纖維上。已知食品纖維對(duì)預(yù)防便秘和肥胖癥及預(yù)防老年性疾病如血栓癥、動(dòng)脈硬化癥和高脂血癥具有良好效果(美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志(J.Ame.Clin.Nutr.)48748-753，1988；J.Ame.Clin.Nutr.52495-499，1990；J.Ame.Clin.Nutr.12478-83，1994)。
在飲食纖維中，已知高分子量藻酸鹽，一種在海藻中(例如褐海藻、墨角藻、馬尾藻、hiziki)構(gòu)成20-30％細(xì)胞壁多糖的飲食纖維成分，具在體內(nèi)有降低膽固醇水平和抑制肥胖癥的作用[日本營養(yǎng)學(xué)雜志(J.Jap.Nutr.)26(3)78-83，1974；J.Jap.Nutr.33(6)273-281，1974；日本漁業(yè)雜志(Jap.J.Fisheries)59(5)879-884，1993]。
目前許多與藻酸鹽相關(guān)的產(chǎn)品正在制造和銷售。然而，這些產(chǎn)品中包含的大部分藻酸鹽是通過簡單提取和從原料海藻物質(zhì)中粗加工制備的，而且是高分子量藻酸鹽(超過約400百萬道爾頓)。高分子量藻酸鹽是由聚甘露糖醛酸(M)和古羅糖醛酸(guluronate)(G)單體組成的嵌段共聚物，而且在其高分子量形式具有高粘度和低溶解度。因而，將這種高分子量形式以高濃度加入食品(尤其是飲料)中并不容易。
日本公開專利平成6-7093公開了低分子量化藻酸鹽用作功能飲料的添加劑。本文使用的術(shù)語“低分子量化藻酸鹽”指分子量10-900KDa的聚古羅糖醛酸(polyguluronate)和聚甘露糖醛酸(polymannuronate)混合的狀態(tài)。與高分子量藻酸鹽相比，低分子量化藻酸鹽具有低粘度和高溶解度，在控制膽固醇水平方面具有增強(qiáng)的作用效果。
從高分子量形式制備低分子量化藻酸鹽的傳統(tǒng)方法包括酸堿水解法[Haug，A.，Larsen，B.和Smidsrod.O.，Acta Chem.Scand.，20(1)183-190，1966；Hirst，E.和Rees，D.A.J.Chem.Soc.，91182-1187，1965；Hirst，E.L.，Percival，E.和Wold，J.K.J.Chem.Soc.，81493-1499，1964]，受熱加壓下水解[日本專利公開平成6-7093，1994；Kimura，Y.，Watanabe，K.和Okuda，H.，種族藥理學(xué)雜志(J.Ethnopharmacology)5447-54，1996]和酶解[Doubet，R.S.和Quatrano，R.S.，Appl.Environ.Microbiol.47(4)699-703，1984；Dunne，W.M.和Buckmire，F(xiàn).L.A.，Appl.Environ.Microbiol.50(1)562-567，1985；Hansen，J.B.和Nakamura，L.K.Appl.Environ.Microbiol.49(4)1019-1021，1985；Haug，A.和Larsen.B.，Carbohydr.Res.17297-308，1971；Romeo，T.和Preston，J.F.，生物化學(xué)(Biochemistry)25(26)8385-8391，1986；Yonemoto，Y.，Murata，K.，Kimura，A.，Yamaguchi，H.和Okayama，K.，發(fā)酵和生物工程雜志(J.of Fermen.and Bioengin.)72(3)152-157，1991]。
由于產(chǎn)品質(zhì)量低劣、反應(yīng)器侵蝕、中和試劑的需要以及使用強(qiáng)酸的操作不便，酸堿水解法難以推廣至工業(yè)規(guī)模。通過在壓力下加熱至100-200℃，制備Mw 10-900kDa低分子量化藻酸鹽的第二種方法也有缺陷，例如反應(yīng)時(shí)間長和水解需要的高昂費(fèi)用，因?yàn)樵摲椒ㄊ窃诟邏合鲁^100℃的高溫進(jìn)行的。酶解法由于反應(yīng)時(shí)間長也不適于工業(yè)化。
如上所述，與高分子量藻酸鹽相比，低分子量化藻酸鹽在降低膽固醇水平方面具有增強(qiáng)效果，而且具有改進(jìn)的物理性質(zhì)，如溶解度。因此，預(yù)期低分子量化藻酸鹽可用于助健康食品。
低分子量聚甘露糖醛酸本身，作為具有直接降低膽固醇水平效果的實(shí)質(zhì)成分并不被知曉，從天然藻酸鹽中提取高純度、低分子量聚甘露糖醛酸的制備方法以前亦不為人知。
僅知曉聚甘露糖醛酸可作為控制慢性尿毒癥患者毒素成分之水平的物質(zhì)(Kulbe等人，美國專利4,689,322)，或作為細(xì)胞或組織包被物以保護(hù)移植后的移植細(xì)胞或組織(Dorian等，美國專利5,656,468)。
然而，從更長遠(yuǎn)的前景看，非常期望從天然藻酸鹽中鑒別和提取出純凈形式的、對(duì)降低膽固醇水平有直接作用的實(shí)質(zhì)成分。本公開鑒別出以純凈形式存在的實(shí)質(zhì)成分提取物，以致于它們可作為添加劑直接用于食品。因此，本公開使生產(chǎn)含有更高單位和更精確定量的實(shí)質(zhì)成分的功能食品成為可能。在相關(guān)工業(yè)和健康業(yè)取得的效果將令人驚奇。因此，本發(fā)明具如下目的。
發(fā)明概述本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種制備高純度低分子量聚甘露糖醛酸的方法。
本發(fā)明另一目的是用低分子量聚甘露糖醛酸作為血清膽固醇水平的控制利。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供含這種低分子量聚甘露糖醛酸的功能食品和助健康品。
本發(fā)明的綜合目的是通過公開加入功能食品和助健康品的能夠預(yù)防和治療肥胖癥、糖尿病和心血管疾病的物質(zhì)，促進(jìn)健康的生活方式并預(yù)防疾病。
在獲知本公開益處之后，本發(fā)明進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言是明顯的。
本發(fā)明包括一種制備高純度、低分子量聚甘露糖醛酸的方法，及其作為血清脂質(zhì)控制劑的新用途。本發(fā)明還包括含有該低分子量聚甘露糖醛酸的功能食品和助健康品。
本發(fā)明的方法涉及采用有機(jī)酸通過分解，從高分子量藻酸鹽中僅純化出低分子量聚甘露糖醛酸，然后利用基于pH值的溶解度的差別進(jìn)行分離。方法包括將有機(jī)酸加入高分子量藻酸鹽、加熱溶液、調(diào)節(jié)pH至2.5和3.5之間，和回收產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸的步驟。高分子量藻酸鹽由海藻制得。優(yōu)選的有機(jī)酸包括檸檬酸、蘋果酸、草酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸和醋酸。優(yōu)選的pH范圍是在2.8和3.0之間。
本發(fā)明也包括預(yù)防肥胖癥、控制血脂、增強(qiáng)肝功能和從體內(nèi)排出重金屬的組合物，包含以重量計(jì)0.01至100％的低分子量(M.W.)聚甘露糖醛酸。本發(fā)明還包括能夠控制血脂和預(yù)防高血脂、肥胖癥和糖尿病的功能食品，含有以重量計(jì)0.01至100％的低M.W.聚甘露糖醛酸。這樣的功能食品可以是食用飲料或固體食品。一種預(yù)防和治療肥胖癥、糖尿病和心血管疾病如高血壓、動(dòng)脈硬化、心絞痛(steniocardiac)、心肌梗死和腦血栓形成的，包含以重量計(jì)0.01至100％的低M.W.聚甘露糖醛酸的助健康品，也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
發(fā)明詳述按照本方法，高分子量藻酸鹽被有機(jī)酸部分水解，產(chǎn)生低分子量化藻酸鹽，一種聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸的混合物，其中只有聚甘露糖醛酸能夠被基于pH的沉淀作用分離出來。
用作本發(fā)明起始原料的高分子量藻酸鹽可以從天然褐藻中獲得或者用本領(lǐng)域公知的適當(dāng)方法制備后，即提取、中和、脫水和減壓干燥，從天然褐藻的干粉樣品獲得。
可用于本發(fā)明的有機(jī)酸包括，但不限制，檸檬酸、蘋果酸、乳酸、草酸、琥珀酸、酒石酸和醋酸。任何能夠?qū)⒏叻肿恿吭逅猁}水解為低分子量藻酸鹽的有機(jī)酸均可用于本發(fā)明。根據(jù)選擇的有機(jī)酸的不同，低分子量化的程度亦有差別，但可以通過控制使用的有機(jī)酸的濃度或水解的時(shí)間來調(diào)節(jié)。如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例所示，在相同濃度條件的各種有機(jī)酸中，醋酸顯示出最大程度的低分子量化。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，有機(jī)酸的適宜濃度在0.2摩爾和1摩爾之間，更優(yōu)選在0.2摩爾和1摩爾之間。
以有機(jī)酸水解高分子量藻酸鹽可以在80至120℃進(jìn)行，更優(yōu)選在95至105℃。
在本發(fā)明制備低分子量聚甘露糖醛酸方法的第二個(gè)步驟中，調(diào)節(jié)制得的溶液pH在2.5和3.5之間，更優(yōu)選在2.8和3.0之間。如果調(diào)節(jié)的pH低于2.5，獲得的聚甘露糖醛酸純度會(huì)升高但產(chǎn)率降低，如果pH高于3.5，聚甘露糖醛酸的純度會(huì)降低。由于需要協(xié)調(diào)考慮產(chǎn)品的純度和收率，選擇了已指明的pH范圍。
按照本發(fā)明的方法得到的低分子量聚甘露糖醛酸具有超過90％的高純度。本文使用的術(shù)語“低分子量”聚甘露糖醛酸意指平均分子量在1和100kDa之間的聚甘露糖醛酸。按照本發(fā)明制備的低分子量的聚甘露糖醛酸在30和50kDa之間，更優(yōu)選地，在35至45kDa之間。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在控制血清脂質(zhì)水平方面，這樣得到的低分子量聚甘露糖醛酸優(yōu)于一些物質(zhì)，如高分子量藻酸鹽、低分子量化藻酸鹽或低分子量古羅糖醛酸。本文使用的術(shù)語“控制血清脂質(zhì)水平”意指包括多種功能如降低總膽固醇水平、增加有益的高密度脂蛋白(HDL)水平，降低低密度脂蛋白(LDL)水平和控制血液和肝臟中甘油三酯和磷酯水平，以及降低GOT和GPT值。
GOT和GPT值是分別測定谷氨酸草酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性的結(jié)果。在所有類型的肝臟損傷中GOT和GPT活性增強(qiáng)，GOT和GPT增高使得對(duì)一切損害非常敏感，降低GOT和GPT值的能力意味著肝功能增強(qiáng)。
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)低分子量聚甘露糖醛酸在控制血脂水平的作用方面，優(yōu)于低分子量化藻酸鹽和低分子量聚古羅糖醛酸。進(jìn)一步地，還發(fā)現(xiàn)持續(xù)和連續(xù)服用低分子量聚甘露糖醛酸的動(dòng)物肝臟未受損傷(參見以下實(shí)施例3)。根據(jù)本發(fā)明低分子量聚甘露糖醛酸的新功能不僅可降低總膽固醇水平，而且可有益地控制每種類型膽固醇載體的組成比例。進(jìn)一步地，低分子量聚甘露糖醛酸可降低GOT和GPT值，因而有助于肝功能的增強(qiáng)。
此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的低分子量聚甘露糖醛酸可與許多有害重金屬如Cd、Pb、Hg結(jié)合，然后從體內(nèi)清除它們。與高分子量藻酸鹽相比，聚甘露糖醛酸與有害重金屬的親合力大大增強(qiáng)。
此外，基本上，由于聚甘露糖醛酸與水的結(jié)合能力以及保水性能高，預(yù)期聚甘露糖醛酸有益于解除便秘。
如本文聲明的，由本發(fā)明獲得的低分子量聚甘露糖醛酸純度高并具有與控制血脂水平相關(guān)的功能。同樣，其物理性質(zhì)如水溶解度和粘度非常好。此外，它沒有保留天然褐藻奇特的氣味和味道。因而，為了有利調(diào)節(jié)血脂水平以及預(yù)防和/或治療肥胖癥、糖尿病之目的，低分子量聚甘露糖醛酸可用作各種食品的功能添加劑或者單獨(dú)的低-聚甘露糖醛酸粉末。
根據(jù)本發(fā)明制備的低分子量聚甘露糖醛酸還可用作控制慢性尿毒癥患者毒素水平的物質(zhì)，或者作為細(xì)胞或組織包被物質(zhì)，保護(hù)移植中的移植細(xì)胞或組織免受免疫攻擊。
根據(jù)本發(fā)明制備的低分子量聚甘露糖醛酸在生產(chǎn)各種助健康食品和/或功能食品時(shí)，可用作主要成分或添加劑或補(bǔ)充劑。
本文使用的術(shù)語“功能食品”意指功能強(qiáng)化的特殊食品，其普通食品的功能性被添加的聚甘露糖醛酸增強(qiáng)。功能性通常包括物理性質(zhì)和生理功能。本發(fā)明的聚甘露糖醛酸，在物理性質(zhì)上具有特殊的粘度以及對(duì)重金屬有結(jié)合親和力，而且在生理功能上，具有預(yù)防高血脂(由降低膽固醇水平產(chǎn)生)、增強(qiáng)肝功能的功能等等。因此，如果在制備常用食品時(shí)加入本發(fā)明的聚甘露糖醛酸，將會(huì)增強(qiáng)常用食品的物理和生理功能。如本文使用的，術(shù)語“功能食品”被定義為包括所有這樣功能上增強(qiáng)的食品，不僅包括物理性質(zhì)而且包括生理學(xué)功能。例如，可以將本發(fā)明的聚甘露糖醛酸加入二次加工食品，如火腿，以增強(qiáng)食品粘度和/或防止高血脂/肥胖癥。因而，這種添加本發(fā)明聚甘露糖醛酸的二次加工食品一般指本文的功能食品。
區(qū)別于以上功能食品的定義，術(shù)語“助健康食品”或“營養(yǎng)特殊食品”意指保健食品，其通過將聚甘露糖醛酸加入常用食品制成或?qū)⒕鄹事短侨┧釂为?dú)制成可消化的載體。患病可能性高的患者或人群通常尋求這類保健食品，以獲得特別的保健效果。當(dāng)在延長期使用本發(fā)明進(jìn)行治療時(shí)，助健康食品同藥物一樣產(chǎn)生特別的藥理作用，但與常用藥品相比，因?yàn)樗怯商烊皇称分瞥傻?，故不引發(fā)副作用。
例如，通過利用本發(fā)明聚甘露糖醛酸對(duì)飲食功效的作用，我們能夠生產(chǎn)用于飲食的功能食品。此外，通過利用其增強(qiáng)肝功能的功能，我們能夠生產(chǎn)功能強(qiáng)化的食品或飲料。
同樣，根據(jù)本發(fā)明的聚甘露糖醛酸可用于制備助健康食品，助健康食品可被用于飲食療法，降低和/或調(diào)節(jié)高血脂病人的膽固醇水平或者預(yù)防高血脂。
其它的應(yīng)用實(shí)例包括預(yù)防便秘的飲食纖維飲料、有降低膽固醇功能的面包、面條和magarine。
根據(jù)本發(fā)明低分子量聚甘露糖醛酸優(yōu)選地以占最終食品0.01-100％的比率，包含在最終的功能食品或助健康食品中。更優(yōu)選的比例常取決于食品的分組，即對(duì)于飲料多或少于0.01-5％，對(duì)于面條多或少于10-50％，對(duì)于助健康食品多或少于40-100％。
可以以1至50％低分子量聚甘露糖醛酸的比例，將本發(fā)明粉狀聚甘露糖醛酸與常規(guī)面粉混合，然后用常規(guī)方法從混合粉末中制備最終的面條和制面包的生面團(tuán)，從而制備含有低分子量聚甘露糖醛酸的源自面粉的功能食品，如面條和面包。如本文使用的，術(shù)語“固體食品產(chǎn)品”包括這樣的功能食品例如面條和面包，但不限于此。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員在獲知本公開的益處后，能夠輕易地以其它的食物替換舉出的例子。
含有根據(jù)本發(fā)明的低分子量聚甘露糖醛酸作為主要成分和可選擇添加的普通添加劑的膠囊或片劑形式的食用食品，可以用常規(guī)的本領(lǐng)域公知的方法制備。
包括以上應(yīng)用，本發(fā)明低分子量聚甘露糖醛酸可以以其最初的粉末形式或根據(jù)需要溶解成溶液，用于食品工業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域。例如，它可加入常規(guī)飲料以制造功能飲料，可加入高脂肪/膽固醇食品，如火腿或香腸以降低膽固醇水平，也可加入肉或鹽的調(diào)味劑中。
通過下列實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，實(shí)施例對(duì)本發(fā)明沒有限制意義。實(shí)施例11.低分子量聚甘露糖醛酸的制備約60g藻酸鹽(分子量約1300kDa)與600ml如下表1至表6所示的每一濃度的每種有機(jī)酸溶液混合。攪拌混合物并于約100℃按照表格每一欄目列明的時(shí)間進(jìn)行水解(由于有機(jī)酸的濃度與水解時(shí)間成反比，有機(jī)酸的濃度越濃，水解時(shí)間越短)。通過添加同種有機(jī)酸，調(diào)節(jié)得到的以低分子量聚甘露糖醛酸和低分子量聚古羅糖醛酸混合狀態(tài)存在的低分子量化藻酸鹽溶液至pH 2.8-3.0，然后離心分離(上部液體部分是聚甘露糖醛酸，下部沉淀部分是聚古羅糖醛酸)。收集上清液，加入碳酸鈉(1M)進(jìn)行中和，加入乙醇至終濃度50％以產(chǎn)生沉淀，離心得到沉淀。
獲得的沉淀溶解在最少量的蒸餾水中(約200ml)。用同種有機(jī)酸調(diào)節(jié)獲得的溶液至pH 2.8-3.0并離心分離。加入碳酸鈉(1M)中和上清液，如上所述加入同樣體積的乙醇以產(chǎn)生沉淀，通過離心分離沉淀，得到低分子量聚甘露糖醛酸。
2.獲得的聚甘露糖醛酸的分子量測定用瓊脂糖凝膠CL-4B和瓊脂糖凝膠CL-6B柱色譜(12mm×97.6cm)和支鏈淀粉(Shodex標(biāo)準(zhǔn)P-82)作為標(biāo)準(zhǔn)，測定獲得的聚甘露糖醛酸的分子量。按照本發(fā)明制備的聚甘露糖醛酸的平均分子量是46.1kDa。
3.獲得的聚甘露糖醛酸的純度分析在1％的三乙胺溶液中溶解獲得的低分子量聚甘露糖醛酸后，通過HPLC采用Partisil 10-SAX離子交換柱(250×4.6mm內(nèi)徑)和含5％甲醇的0.02摩爾磷酸鉀緩沖液(pH4.6)分析獲得的低分子量聚甘露糖醛酸的純度和組成。按照標(biāo)準(zhǔn)，用同試樣分析一樣的HPLC進(jìn)行古羅糖醛酸內(nèi)酯和葡萄糖醛酸內(nèi)酯(Sigma公司)的色譜分析，與每個(gè)試樣的每一洗脫模式進(jìn)行比較以確定純度。根據(jù)水解時(shí)間，按照本發(fā)明制備的聚甘露糖醛酸的平均純度是水解1小時(shí)91％，3小時(shí)93％，5小時(shí)96％。
用不同濃度的醋酸(0.2-1.0M)進(jìn)行水解，結(jié)果如下表2所示。由表2可見，藻酸鹽低分子量化的程度隨有機(jī)酸濃度的升高而升高。就醋酸而言，低至0.2M的濃度足以產(chǎn)生40kDa的低分子量聚甘露糖醛酸。[表2]醋酸濃度和產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸之間的關(guān)系
*反應(yīng)在100℃恒溫下進(jìn)行改變水解時(shí)間，用不改變濃度的醋酸、蘋果酸、草酸和檸檬酸進(jìn)行高分子量藻酸鹽的部分水解，結(jié)果分別如表3至6所示。低分子量化程度隨著反應(yīng)時(shí)間從10分鐘延伸至240分鐘而升高。特別地，在反應(yīng)開始(10-60分鐘)獲得更快速的水解(低分子量化)。[表3]水解時(shí)間和產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸分子量之間的關(guān)系(用醋酸)
*反應(yīng)在100℃恒溫下進(jìn)行。[表4]水解時(shí)間和產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸分子量之間的關(guān)系(用蘋果酸)
*反應(yīng)在100℃恒溫下進(jìn)行。[表5]水解時(shí)間和產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸之間的關(guān)系(用草酸)
*反應(yīng)在100℃恒溫下進(jìn)行。[表6]水解時(shí)間和產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸分子量之間的關(guān)系(用檸檬酸)
*反應(yīng)在100℃恒溫下進(jìn)行。
試驗(yàn)動(dòng)物的生活條件是室溫22±2℃，濕度65±3％，室溫和濕度自動(dòng)調(diào)整。喂食五周后，收集試驗(yàn)動(dòng)物血液，從中分離出血清，檢測血清和肝臟樣品中膽固醇、甘油三酯、磷酯和低密度脂蛋白的水平。
用試劑盒試劑(Shin-yang化學(xué)有限公司生產(chǎn))進(jìn)行膽固醇、甘油三酯、磷酯和低密度脂蛋白水平的測試，用食品級(jí)食物飼養(yǎng)試驗(yàn)動(dòng)物。(3)總膽固醇水平和游離膽固醇水平為了檢測血清和肝臟提取樣品中的總膽固醇和游離膽固醇水平，100μl血清和肝臟提取樣品用于檢測，通過膽固醇CII-檢測試劑盒和游離膽固醇C-檢測試劑盒(Shin-yang化學(xué)有限公司生產(chǎn))進(jìn)行檢測。(4)甘油三酯和磷酸水平為了檢測甘油三酯和磷酸水平，100μl血清和肝臟提取樣品用于檢測，通過甘油三酯G-檢測試劑盒和磷酯C-檢測試劑盒(Shin-yang化學(xué)有限公司生產(chǎn))進(jìn)行檢測。(5)高密度脂蛋白和低密度脂蛋白膽固醇水平通過使用高密度脂蛋白膽固醇C-檢測試劑盒(韓國Shin-yang化學(xué)有限公司生產(chǎn))，檢測100μl血清和肝臟提取樣品中的高密度脂蛋白膽固醇水平。低密度脂蛋白膽固醇水平通過從總膽固醇水平中減去高密度脂蛋白水平計(jì)算。(6)谷氨酸草酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的活性用GOT和GPT活性檢測試劑盒測定每個(gè)采集到的100μl血清樣品的活性。(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估通過計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用鄧肯多重差距檢測(Duncan’s multiple test)評(píng)價(jià)每個(gè)試驗(yàn)組的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P＜0.01)。
1.低分子量聚甘露糖醛酸的抑制肥胖作用觀察到五個(gè)測試組的動(dòng)物重量增加，結(jié)果如表8所示。由表可見，喂食5％低分子量聚甘露糖醛酸五周的試驗(yàn)組動(dòng)物與對(duì)照組比較，產(chǎn)生重量增加的有效抑制。[表8]飼喂5周期間的食物效率
*1飼喂基本食物+1％膽固醇的試驗(yàn)組。*2飼喂基本食物+1％膽固醇+5％聚甘露糖醛酸的試驗(yàn)組。*3飼喂基本食物+1％膽固醇+2.5％甘露糖醛酸+2.5％聚古羅糖醛酸的試驗(yàn)組。*4飼喂基本食物+1％膽固醇+5％聚古羅糖醛酸的試驗(yàn)組。
2.對(duì)膽固醇水平的作用在觀察的5組試驗(yàn)組動(dòng)物中，結(jié)果如表9所示。由表可見，飼喂5％低分子量聚甘露糖醛酸或飼喂5％聚古羅糖醛酸或飼喂兩種物質(zhì)5周后的試驗(yàn)組動(dòng)物，與對(duì)照組相比能夠有效降低膽固醇水平。特別地，在飼喂按照本發(fā)明低分子量聚甘露糖醛酸的組，膽固醇水平的降低程度最大。同樣，飼喂聚甘露糖醛酸+聚古羅糖醛酸混合食物的組，降低效果比僅食用古羅糖醛酸的組高。從這些結(jié)果，推測降低血清和肝臟中膽固醇水平的低分子量藻酸鹽(即聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸混合物)中的實(shí)質(zhì)成分是本發(fā)明的低分子量聚甘露糖醛酸成分。按照本試驗(yàn)的結(jié)果，與對(duì)照組的水平相比，本發(fā)明低分子量聚甘露糖醛酸食物降低血清膽固醇的水平達(dá)46％、肝臟膽固醇的水平達(dá)59％。[表9]飼喂實(shí)驗(yàn)食物的大鼠血清和肝臟中的膽固醇水平
*1，*2，*3和*4參照表8的腳注3.對(duì)甘油三酯和磷酯的作用觀察五個(gè)試驗(yàn)組動(dòng)物的血清和肝臟中甘油三酯和磷酯的水平，結(jié)果分別如表10和11所示。
由表10可見，血清中甘油三酯水平在膽固醇食物組最高，在聚甘露糖醛酸食物組最低。其它兩試驗(yàn)飼養(yǎng)組的甘油三酯水平(即混合物喂養(yǎng)組和polyG喂養(yǎng)組)類似于基本食物組。類似地，肝臟提取物中甘油三酯水平在膽固醇食物組最高，在聚甘露糖醛酸食物組最低。
由表11可見，血清和肝臟中的磷酸水平在膽固醇食物組最高，在基本食物組最低。所有三個(gè)試驗(yàn)飼養(yǎng)組的磷酯水平低于膽固醇食物組。并且特別地，在聚甘露糖醛酸組水平最低。
與對(duì)照組相比，隨著服用本發(fā)明的低分子量聚甘露糖醛酸，血清中甘油三酯和磷酯水平分別下降42％和48％，肝臟中的水平分別下降35％和40％。[表10]喂食實(shí)驗(yàn)食物的大鼠血清和肝臟中的甘油三酯水平(平均值±S.E.)
*1，*2，*3和*參照表8的腳注[表11]喂食實(shí)驗(yàn)食物的大鼠血清和肝臟中的磷酯水平(平均值±S.E.)
*1，*2，*3和*參照表8的腳注4.對(duì)高密度脂蛋白和低密度脂蛋白膽固醇的作用在五組動(dòng)物中觀察血清和肝臟中高密度和低密度脂蛋白膽固醇的水平，結(jié)果如表12和13所示。
血清中的高密度脂蛋白水平在膽固醇組最低，在聚甘露糖醛酸食物組最高，而肝臟中的水平在基本食物組最低，在聚甘露糖醛酸食物組最高(見表12)。
血清和肝臟中的低密度脂蛋白水平在膽固醇組最高，在基本食物組最低(見表13)。與膽固醇組相比(對(duì)照)，在喂食polyM和/或polyG食物的三個(gè)試驗(yàn)組中，低密度脂蛋白水平顯著降低，在低分子量聚甘露糖醛酸食物組降低最顯著。
與對(duì)照組(膽固醇食物)相比，食用按照本發(fā)明具有低分子量聚甘露糖醛酸的食物，血清高密度脂蛋白膽固醇水平升高4.5倍，血清低密度脂蛋白膽固醇水平降低59％。進(jìn)一步地，肝臟中高密度脂蛋白膽固醇水平升高1.2倍，低密度脂蛋白膽固醇水平降低47％。[表12]喂食實(shí)驗(yàn)食物的大鼠血清和肝臟中的HDL-膽固醇水平(平均值±S.E.)
*1，*2，*3和*參照表8的腳注[表13]喂食實(shí)驗(yàn)食物的大鼠血清和肝臟中的LDL-膽固醇水平(平均值±S.E.)
*1，*2，*3和*參照表8的腳注5.低分子量聚甘露糖醛酸對(duì)血清GOT和GPT值的作用觀察5個(gè)試驗(yàn)組中血清GOP和GPT的活性，結(jié)果如表14所示。如表14所示，在低分子量聚甘露糖醛酸食物組，降低GOT和GPT活性的作用最高，即與對(duì)照組相比，GOT降低38％，GPT降低30％。[表14]喂食實(shí)驗(yàn)食物的大鼠血清中的GOT和GPT活性(平均值±S.E.)
*1，*2，*3和*參照表8的腳注6.急性毒性試驗(yàn)對(duì)每只4周齡的ICR小鼠(80只雄性)，本發(fā)明的低分子量聚甘露糖醛酸以單一劑量2g/kg口服給藥。給藥后，在最初6個(gè)小時(shí)期間的每個(gè)小時(shí)，在整體狀況、運(yùn)動(dòng)性、體重、外形和自主神經(jīng)系統(tǒng)癥狀方面仔細(xì)觀察每只小鼠，觀察2周。口服給藥后每日觀察達(dá)2周的時(shí)間，未觀察到運(yùn)動(dòng)性、體重、震顫和反射反應(yīng)的異常。作為結(jié)果，此急性毒性試驗(yàn)的LD50超過2000mg/kg。
如以上本文充分說明的，本發(fā)明具有特別的優(yōu)點(diǎn)。制備按照本發(fā)明的低分子量聚甘露糖醛酸的方法優(yōu)于現(xiàn)有的采用無機(jī)酸如HCl或硫酸的方法，體現(xiàn)在其消除了一些問題，如由于強(qiáng)無機(jī)酸和中和反應(yīng)后處理造成的包括腐蝕反應(yīng)器在內(nèi)的機(jī)械腐蝕。在水解時(shí)間和費(fèi)用方面，本方法也優(yōu)于現(xiàn)有的用酶或高壓/溫的方法。
按照本方法，可以制備逐步低分子量化至所需程度的高純度(90％或更高)聚甘露糖醛酸。
按照本發(fā)明制備的低分子量聚甘露糖醛酸是高純度高溶解度的單一物質(zhì)，具有增強(qiáng)的功能效果，如作為降低膽固醇的有效物質(zhì)，作為天然藻酸鹽的有效成分，并且未保留天然藻酸鹽特異的氣味和味道。因而，當(dāng)用作功能食品和助健康食品的添加劑時(shí)，少量使用即可更準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)食品功能，得到理想的功能效果。相應(yīng)地，它是制備功能食品和助健康食品的最佳選擇。
******已經(jīng)參照各個(gè)具體實(shí)施例描述了本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言不背離本發(fā)明精神的多種變化和修正是可能的，所有的這樣的變化和修正被包含在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從高分子量藻酸鹽制備低分子量聚甘露糖醛酸的方法，包括如下步驟(1)將一種有機(jī)酸加入高分子量藻酸鹽并加熱；(2)調(diào)節(jié)pH至2.5和3.5之間；和(3)回收產(chǎn)生的聚甘露糖醛酸。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中高分子量藻酸鹽由海產(chǎn)藻類制備。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中有機(jī)酸選自由檸檬酸、蘋果酸、草酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸和醋酸組成的組。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中pH在2.8和3.0之間。
5.一種預(yù)防肥胖癥、控制血清脂質(zhì)、增強(qiáng)肝功能和從體內(nèi)驅(qū)除重金屬的組合物，含有以重量計(jì)0.01-100％的低分子量聚甘露糖醛酸。
6.一種能夠控制血清脂質(zhì)和預(yù)防高血脂、肥胖癥和糖尿病的功能食品，含有以重量計(jì)0.01-100％的低分子量聚甘露糖醛酸。
7.按照權(quán)利要求6的功能食品，該功能食品是食用飲料。
8.按照權(quán)利要求6的功能食品，該功能食品是固體食品。
9.一種預(yù)防和治療肥胖癥、糖尿病和心血管疾病如高血壓、動(dòng)脈硬化癥、心絞痛、心肌梗塞和腦血栓的助健康品，含有以重量計(jì)0.01-100％的低分子量聚甘露糖醛酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備平均分子量在10
文檔編號(hào)A61P1/16GK1362860SQ01800186
公開日2002年8月7日 申請(qǐng)日期2001年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月3日
發(fā)明者卞在亨, 李珍雨, 李東秀, 南澤正 申請(qǐng)人:韓國生物高分子株式會(huì)社