專利名稱：皮膚基底模形成促進劑、人工皮膚形成促進劑和人工皮膚的制造方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種皮膚基底模穩(wěn)定劑。此外，本發(fā)明涉及人工皮膚形成促進劑和一種人工皮膚的制造方法。
主要關注的是作為這類改變的原因的由皮膚真皮中膠原蛋白、彈性蛋白和葡糖胺聚糖類構(gòu)成的膠原纖維和彈性纖維的功能降低。已經(jīng)在過去提出了羥基羧酸類的應用(例如日本專利號2533339)和溶血磷脂的應用(例如日本未審專利公開號8-67621)或日本脂肪和油協(xié)會雜志第46卷第9期(1997)13-19頁中所述的技術(shù)方案作為預防或修復這類改變的方式。
在前一篇公開文獻中，已經(jīng)提示了角蛋白和皺紋能夠通過防止膠原纖維減少而得到控制。另一方面，在后一篇公開文獻中，提示溶血磷脂通過加速葡糖胺聚糖類(且更具體地說是透明質(zhì)酸)在人成纖維細胞中的生成能力而表現(xiàn)出變白作用。
上述外部環(huán)境對皮膚老化最強的作用由存在于日光中的紫外線產(chǎn)生且已經(jīng)清楚地確定了這些紫外線是促進老化的一個因素。已知紫外線可誘發(fā)稱作以深度皺紋為特征的光老化的皮膚改變(Scharffetter-Kochanek，《藥理學進展》(Advances inPharmacology)1997，58，639-655)。紫外線對皮膚具有不同范圍的作用，包括破壞遺傳性DNA、誘發(fā)產(chǎn)生活性氧且更進一步說是誘發(fā)產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(Fisher等《自然》(Nature)1996，379，335-339)。
由于紫外線多功能的性質(zhì)，所以尚未充分闡明由紫外線誘發(fā)的光老化發(fā)生的機理。已經(jīng)清楚地證實在連續(xù)以不足以產(chǎn)生紅斑的能量水平的紫外線照射后相應于人光破壞皮膚的深度皺紋在無毛發(fā)小鼠背部皮膚上形成。還使用這種小鼠模型評價了對皺紋具有作用的物質(zhì)(Moloney等《光化學和光生物學》(Photochem.Photobiol.)1992，56，495-504)。然而，皺紋形成的機理仍然沒有得到充分闡明且其闡明尚需等待。
另一方面，Koivukangas等在1994年報導了一種分解基底膜的酶明膠酶的水平在用紫外線照射的皮膚中升高(《皮膚性病學學報》(ActaDerm.Venereol.)1994，74，279-282)。此外，還報導了在與日光接觸的皮膚部位上的基底膜表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)上的改變且特別是頻繁觀察到加倍現(xiàn)象(Lavker，J.《皮膚病學研究》(Invest.Dermal.)1979，73，59-66)。這提示日光中含有的紫外線通過增加分解皮膚中產(chǎn)生的酶類的基底膜的量對基底膜結(jié)構(gòu)具有作用的可能性。
然而，沒有已知用于促進和形成皮膚基底膜結(jié)構(gòu)的特殊方式。
作為由某些原因破壞的天然皮膚的另一種選擇或作為測試藥物和化妝品對皮膚的功能和藥理作用的實驗物質(zhì)，人工皮膚是重要的。在這些應用中，需要具有盡可能模擬天然皮膚結(jié)構(gòu)的所結(jié)構(gòu)的人工皮膚。
天然皮膚基本上由表皮、真皮和存在于它們之間的基底膜構(gòu)成。模擬天然皮膚的人工皮膚的已知制造方法的一個實例包括通過在具有與真皮相似結(jié)構(gòu)并含有人成纖維細胞的皺縮I型膠原蛋白凝膠上培養(yǎng)正常人表皮角質(zhì)細胞而形成表皮層的步驟。然而，在這種方法中，存在模擬真皮的膠原蛋白凝膠與模擬表皮的表皮層之間不能充分形成基底膜的難題。
發(fā)明公開內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的提供了一種用于使皮膚基底膜保持穩(wěn)定的新型方式并提供了一種用于使基底膜在制造人工皮膚過程中充分形成的新型方式。
作為解決上述難題的各種研究結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)通過給予基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑或基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑而促進了皮膚基底膜結(jié)構(gòu)的形成，由此使本發(fā)明得到完成。
因此，本發(fā)明提供了一種含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的皮膚基底膜形成促進劑。
此外，本發(fā)明提供了一種含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑的皮膚基底膜形成促進劑。
作為解決上述難題的各種研究結(jié)果，本發(fā)明的本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)中為了制造人工皮膚，可以通過向培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑或基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑來促進基底膜的形成，因此使本發(fā)明得到完成。
因此，本發(fā)明通過了一種含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的人工皮膚形成促進劑。
此外，本發(fā)明提供了一種含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑的人工皮膚形成促進劑。
此外，本發(fā)明提供了一種人工皮膚的制造方法，該方法包括向人工皮膚形成培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的步驟。
此外，本發(fā)明提供了一種人工皮膚的制造方法，該方法包括向人工皮膚形成培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑的步驟。
附圖2是表示人工皮膚橫斷面的生物模型的照片，它顯示了在為形成人工皮膚的培養(yǎng)過程中在下列情況中進行蘇木精和伊紅染色(H&E)和免疫染色(檢測層粘連蛋白(LN5))對形成的人工皮膚的結(jié)果向培養(yǎng)基中僅添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A(表示為CGS)的情況、添加CGS和轉(zhuǎn)化生長因子α(即一種基質(zhì)蛋白生成促進劑)(CGS+TGFa)的情況、添加CGS和轉(zhuǎn)化生長因子β1(即一種基質(zhì)蛋白生成促進劑)(CGS+TGFb1)的情況和添加TGFa和TGFb1與CGS(CGS+TGFa+TGFb1)的情況。
附圖3是用于替換表示人工皮膚切塊生物模型的圖形的照片，它顯示了在與附圖2相同的實驗中進行免疫染色(檢測IV型膠原蛋白(IVC)和檢測VII型膠原蛋白(VIIC))的結(jié)果。
附圖4是表示在為形成人工皮膚而培養(yǎng)的過程中向培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A和大豆卵磷脂即一種基質(zhì)蛋白生成促進劑(CGS+大豆卵磷脂)的情況和不向培養(yǎng)基中添加上述物質(zhì)(對照品)的情況中形成的人工皮膚橫斷面的生物模型的照片。
本發(fā)明的實施方式基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑對用于本發(fā)明的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑沒有特定的限制且可以使用任意的物質(zhì)，條件是它具有這類抑制活性?；|(zhì)金屬蛋白酶的實例包括明膠酶、膠原酶、溶基質(zhì)素和matrilysin。因此，可以將諸如明膠酶、膠原酶、溶基質(zhì)素或matrilysin這樣的物質(zhì)(抑制作用)選作基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。
基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的特定實例包括物質(zhì)CGS27023A(N-羥基-2-[[(4-甲氧基苯基)磺酰基]3-吡啶甲基)氨基]-3-甲基丁烷酰胺鹽酸鹽)(《藥物化學雜志》(J.Med.Chem.)1997，第40卷第2525-2532頁)和MMP-抑制劑(p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH(FN-437)(BBRC，1994，第199卷，1442-1446頁)。
此外，可以使用的本發(fā)明金屬蛋白酶抑制劑的特殊實例包括各種植物提取物和獲自其中的純化產(chǎn)物。這類植物的實例包括百里香、闊葉纈草或其它類似植物(敗醬科)、柿(柿樹科)、紫云英(豆科)、野山楂(薔薇科)、牡丹(Poeonia montan Sims)(Paconiaceae)、普洱茶(Thcaccae)、藍桉或其類似植物(桃金娘科)、Potentillatormentilla Schrk(薔薇科)、歐洲小葉椴(Tilia cordaa Mill.)、闊葉椴(Tilia platyphyllus Scop.)、歐洲椴(椴樹科)、Betulaalba Linne(樺木科)、Origanum majorana L.、兒茶鉤藤(Uncariagambir Roxburgh)(茜草科)、Juglans regia Linne var.sinensisDe Candolie或其類似植物(胡桃科)、苦參(豆科)、地榆(薔薇科)、貫葉金絲桃或小連翹(山竹子科)、茶(山茶科)、姜黃(姜科)、包括珠仔樹和香附子在內(nèi)的姜黃的純化提取物、莎草、沙果、Acacia fornensia、訶子、孟加拉榕、臘腸樹、南燭、海棠果和菩提樹。
就草本植物而言，這些植物的提取物獲自根、葉、莖或花；或就木本植物而言，這些植物的提取物獲自根、芽、樹皮、果實、葉或花。
通過根據(jù)需要干燥植物物質(zhì)和根據(jù)需要切割或粉碎、隨后提取入水提取劑或有機溶劑而從這些植物獲得提取物?？梢允褂玫乃崛┑膶嵗ɡ渌?、溫水和沸點或低于沸點下的熱水，而可以使用的有機溶劑的實例包括常溫或加熱的甲醇、乙醇、1，3-T二醇和乙醚。
本發(fā)明中基質(zhì)蛋白的實例包括層粘連蛋白、IV型膠原蛋白、VII型膠原蛋白、parlecan和nidogen，它們是基底膜的組成成分。
基質(zhì)蛋白生成促進劑用于本發(fā)明的基質(zhì)蛋白生成促進劑的實例就促進這些蛋白質(zhì)生成的情況而言包括大豆溶血磷脂、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFa)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFb1)、轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGFb2)、轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFb3)和表皮生長因子(EGF)。
就含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑的本發(fā)明的人工皮膚形成促進劑或皮膚基底膜穩(wěn)定劑的情況而言，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑的比例約為1∶106-106∶1，不過，可以根據(jù)其類型和活性改變。
人工皮膚可以將通常用于基礎培養(yǎng)基的任意培養(yǎng)基用于生產(chǎn)本發(fā)明的人工皮膚且這類培養(yǎng)基的實例包括含有10％胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)；含有10％胎牛血清、5μg/ml運鐵蛋白、5μg/ml胰島素、2nM三碘酪氨酸、0.1nM霍亂毒素和0.4μg/ml氫化可的松的DMEM-Ham’s F12(3∶1)培養(yǎng)基；以及角質(zhì)細胞生長培養(yǎng)基(KGM)和含有按1∶1的比例混合的10％胎牛血清的DMEM。盡管可以根據(jù)特定類型改變，但是添加到這些基礎培養(yǎng)基中的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的量約為1nmol/L-10-2摩爾/L。此外，添加到基礎培養(yǎng)基中的基質(zhì)蛋白生成促進劑的量約為1ng/L-1g/L。
在制造本發(fā)明的人工皮膚的過程中，首先使含有人成纖維細胞的皺縮I型膠原蛋白在金屬篩網(wǎng)上以原樣保持穩(wěn)定。例如，可以按照下述方式制備含有人成纖維細胞的皺縮I型膠原蛋白。在制備了成纖維細胞懸浮在冰上的膠原蛋白溶液后，使該膠原蛋白在培養(yǎng)皿上膠凝。接下來從培養(yǎng)皿的壁上剝離該凝膠并使該膠原蛋白凝膠在CO2培養(yǎng)箱中皺縮。
下一步將諸如正常人表皮角質(zhì)細胞這樣的表皮細胞在上述膠原蛋白凝膠上培養(yǎng)以便形成表皮?？梢园凑障铝蟹绞酵ㄟ^培養(yǎng)表皮細胞形成表皮層。將皺縮的膠原蛋白凝膠置于金屬篩網(wǎng)上并將玻璃環(huán)置于該凝膠上。將來源于人包皮的表皮角質(zhì)細胞混懸液置于玻璃環(huán)內(nèi)，同時防止液體滲漏。使角質(zhì)細胞在CO2培養(yǎng)箱中粘著，隨后取出所述環(huán)。將上述培養(yǎng)基充填至表皮層邊界并通過持續(xù)進行培養(yǎng)、同時使表皮層與空氣接觸而形成具角化層。
根據(jù)這種方法，獲得了接近天然皮膚的人工皮膚，其中在真皮層與表皮層之間形成了由含有成纖維細胞的皺縮I型膠原蛋白凝膠構(gòu)成的充分的基底膜。
皮膚基底膜形成促進劑對化妝品主要施用于的面部皮膚基底膜結(jié)構(gòu)改變的研究集中在對以伴隨老化的基底膜復制作為伴隨老化的改變之一為特征的結(jié)構(gòu)改變的報導(Lavker，《皮膚病學研究雜志》(J.Invest.Dermal.)1979，73，59-66)，根據(jù)這些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基底膜結(jié)構(gòu)的改變在二十歲后開始發(fā)生且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它們隨年齡累積。這些基底膜結(jié)構(gòu)的改變是在伴隨諸如皺紋形成、硬化或彈性降低這樣的老化的皮膚改變之前的皮膚改變。
因此，表皮基底細胞牢固地與基底膜結(jié)合的正常皮膚功能表現(xiàn)是必不可少的且將基底膜形成的促進看作對這種表現(xiàn)是重要的。作為使用基于日常紫外線推測的紫外線照射老齡小鼠模型研究皺紋形成抑制劑的結(jié)果，在能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的藥物中發(fā)現(xiàn)了抑制皺紋形成的活性。因此，促進皮膚中基底膜再生和修復的活性劑可有效地作為皮膚老化的抑制劑。
因此，根據(jù)本發(fā)明，新近制成了促進人工皮膚培養(yǎng)液體的皮膚活化組合物或基底膜形成促進劑，它含有一種類型或兩種或多種類型的上述基質(zhì)金屬蛋白酶抑制性化合物的混合物、或一種類型或兩種或多種類型的這種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制性化合物的混合物和一種類型或兩種或多種類型的顯示出增加基質(zhì)蛋白生成的活性的化合物的混合物，它們的濃度足以促進皮膚基底膜的再生、修復和形成。這種皮膚活化例如指的是預防或改善伴隨由老化等導致的基底膜結(jié)構(gòu)改變的皮膚功能降低且更具體地說是預防或改善皮膚的起皺和硬化。
足以顯示出促進皮膚基底膜再生、涉及它們的修復和形成的作用的上述濃度可以根據(jù)所用化合物的類型、用于制備所述組合物的所用其它成分或載體和使用期限來改變。
本發(fā)明的皮膚基底膜形成促進劑可以含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、或基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑形式的活性組分，它們的含量占該組合物的0.000001-60wt％且優(yōu)選0.00001-60wt％。
本發(fā)明的皮膚基底膜穩(wěn)定劑可以是水溶液、油、其它溶液、乳液、霜劑、凝膠、混懸液、微囊、粉末、顆粒、膠囊或固體形式，而在根據(jù)本身是公知的方法制備成任意的這些形式后，可以將它們包入、粘入、噴入、注入、消耗或插入下列形式的制劑中洗劑、乳液、霜劑、軟膏劑、糊劑、泥敷劑、氣溶膠、注射劑、藥物(包括片劑、粉劑、顆粒劑、丸劑、糖漿劑和錠劑)或栓劑。在這些劑型中，將諸如洗劑、乳液、霜劑、軟膏劑、糊劑、泥敷劑和氣溶膠這樣的局部用皮膚制劑看作是適合于本發(fā)明組合物的劑型。這里描述的局部用皮膚制劑包括處方藥、非處方藥和化妝品且按照與下文相同的含義使用。
當制備這類組合物時，可以將通常使用的載體和香料以及油、表面活性劑、防腐劑、螯合劑、水溶性聚合物、增稠劑、粉末組分、紫外線防護劑、增濕劑、藥理有效組分、抗氧化劑、pH調(diào)節(jié)劑、清潔劑、干燥劑、乳化劑等適當混入本發(fā)明的組合物。就將這些組分中的每一種混入本發(fā)明的皮膚活化組合物中的情況而言，在不影響本發(fā)明的所需作用的范圍內(nèi)混合它們是必要的。
上述油的實例包括液體油、固體油、蠟類、烴油、高級脂肪酸、高級醇類、合成酯油和硅氧烷。
更特別地，液體油的實例包括鱷梨油、山茶皂甙油、櫻草油、鱉油、胡桃油(macadamia nut oil)、玉米油、貂油、橄欖油、菜油、蛋黃油、芝麻油、桃仁油、麥胚油、山茶花油、蓖麻油、亞麻子油、紅花油、棉子油、紫蘇子油、大豆油、花生油、茶堿油、椰子油、米糠油、桐油、日本桐油、hohoba oil、胚芽油(germ oil)、三甘油、三辛酸甘油和三異棕櫚酸甘油；固體油的實例包括可可脂、椰子油、馬油(horse tallow)、硬化椰子油、棕櫚油、牛油、山羊脂、硬化牛油、棕櫚心油(palm heart oil)、豬油、牛骨油、漆心脂、硬化油、牛腿油、漆脂和硬化蓖麻油；蠟類的實例包括蜂蠟、小燭樹蠟、棉蠟、巴西棕櫚蠟、月桂子蠟、樹蠟、鯨蠟、褐煤蠟、糠蠟、羊毛脂、爪哇木棉蠟、羊毛脂乙酸酯、液體羊毛脂、甘蔗蠟、異丙基羊毛脂脂肪酸、月桂酸己酯、還原的羊毛脂、西蒙得木蠟、硬羊毛脂、紫膠蠟、POE羊毛脂醇醚、POE羊毛脂醇乙酸酯、POE膽固醇醚、羊毛脂脂肪酸聚醫(yī)二醇和POE氫化羊毛脂醇醚；且烴油的實例包括液體石蠟、地蠟、角鯊烯、姥鮫烷、石蠟、地蠟、角鯊烯、凡士林和微晶蠟。
高級脂肪酸的實例包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、山萮酸、油酸、12-羥基硬脂酸、十一烯酸、tolic acid、異硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳五烯酸(eicosapentanoic acid)(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。
高級醇類的實例包括月桂醇；鯨蠟醇；十八烷醇；山萮醇；肉豆蔻醇；油醇；十六醇十八醇混合物和其它直鏈醇類；以及單硬脂酰甘油醚(vatyl alcohol)、2-癸基十四烯醇(2-decyltetradecinol)、羊毛脂醇、膽甾醇、植物甾醇、己基十二烷醇、異十八烷醇、辛基癸醇和其它支鏈醇類。
合成酯油的實例包括肉豆蔻酸異丙酯、辛酸鯨蠟酯、肉豆蔻酸辛基十二烷酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、二甲基辛酸己基癸酯、硬脂酸丁酯、乳酸鯨蠟酯、乳酸肉豆蔻酯、羊毛脂乙酸酯、硬脂酸異鯨蠟酯、異硬脂酸異鯨蠟酯、12-羥基硬脂酸膽甾醇酯、二-2-乙基己酸乙二醇酯、二季戊四醇脂肪酸酯、單異硬脂酸正烷基乙二醇酯、二-2-庚基十一酸甘油酯、三-2-乙基己酸三羥甲基丙烷醇、四-2-乙基己酸季戊四醇酯、三-2-乙基己酸甘油酯、三異硬脂酸三羥甲基丙烷酯、己酸鯨蠟基-2-乙酯、棕櫚酸2-乙基己酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三-2-庚基十一酸甘油酯、蓖麻油脂肪酸甲酯、油酸油、十六醇十八醇混合物、乙酰甘油、棕櫚酸2-庚基十一酯、己二酸二異丁酯、N-月桂酰-L-谷氨酸-2-辛基十二烷基酯、己二酸二-2-庚基十一酯、月桂酸乙酯、癸二酸二-2-乙基己酯、肉豆蔻酸2-己基癸酯、棕櫚酸2-己基癸酯、己二酸2-己基癸酯、癸二酸二異丙酯、琥珀酸2-乙基己酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯和檸檬酸三乙酯。
硅氧烷類的實例包括二甲基聚硅氧烷、甲基苯基聚硅氧烷、甲基氫聚硅氧烷和其它直鏈聚硅氧烷類、十甲基聚硅氧烷、十二甲基聚硅氧烷、四甲基四氫聚硅氧烷和其它環(huán)聚硅氧烷類以及形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機硅樹脂和硅橡膠。
本發(fā)明的皮膚基底膜穩(wěn)定劑可以含有單一或組合形式的陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、兩性表面活性劑或非離子型表面活性劑等。
陰離子型表面活性劑的實例包括脂肪酸皂類，諸如皂坯、月桂酸鈉和棕櫚酸鉀；高級烷基硫酸酯類，諸如月桂基硫酸鈉和月桂基硫酸鉀；烷基醚硫酸酯鹽，諸如POE三乙醇胺月桂基硫酸鹽和POE月桂基硫酸鈉；N-?；“彼?，諸如月桂酰肌氨酸鈉；高級脂肪酸酰胺磺酸鹽，諸如N-肉豆蔻酰-N-?；撬徕c、椰子油脂肪酸甲基氨基乙酸鈉和月桂基甲基氨基乙酸鈉；磷酸酯類，諸如POE油醚磷酸鈉和POE硬脂酰醚磷酸鹽；磺基琥珀酸鹽，諸如二-2-乙基己基磺基琥珀酸鈉、單月桂酰單乙醇胺聚氧乙烯磺基琥珀酸鈉和月桂基聚丙二醇磺基琥珀酸鈉；烷基苯磺酸鹽，諸如直鏈十二烷基苯磺酸鈉、直鏈十二烷基苯磺酸三乙醇胺和直鏈十二烷基苯磺酸鹽；N-酰基谷氨酸鹽，諸如N-月桂酰谷氨酸一鈉、N-硬脂酰谷氨酸二鈉和N-肉豆蔻酰-L-谷氨酸一鈉；高級脂肪酸酯硫酸酯類，諸如硬化椰子油脂肪酸甘油硫酸鈉；磺化油，諸如土耳其紅油；以及POE烷基醚羧酸、POE烷基芳基醚羧酸、α-烯屬磺酸酯、高級脂肪酸酯磺酸酯、仲醇硫酸酯、高級脂肪酸烷基醇酰胺、月桂酰單乙醇酰胺琥珀酸鈉、N-棕櫚酰天冬氨酸二三乙醇胺和酪蛋白鈉。
陽離子型表面活性劑的實例包括烷基三甲基銨鹽，諸如硬脂酰三甲基氯化銨和月桂基三甲基氯化銨；二烷基二甲基銨鹽，諸如二硬脂酰二甲基氯化銨；烷基吡啶鎓鹽，諸如(N，N’-二甲基-3，5-亞甲基哌啶鎓)氯化物和鯨蠟基氯化哌啶鎓；烷基季銨鹽；烷基二甲基芐基銨鹽；烷基異喹啉鎓鹽；二烷基嗎啉鎓鹽；POE烷基胺類；烷基胺鹽；多胺脂肪酸衍生物；戊醇脂肪酸衍生物；苯扎氯銨；和芐索氯銨(benzetonium chloride)。
兩性表面活性劑的實例包括以咪唑啉為基礎的兩性表面活性劑，諸如2-十一基-N，N，N-(羥乙基羧甲基)-2-咪唑啉鈉和2-椰油基-2-咪唑鎓羥基-1-羧乙基氧基-2-鈉鹽；和以甜菜堿為基礎的兩性表面活性劑，諸如2-十七烷基-N-羧甲基-N-羥乙基咪唑啉甜菜堿、月桂基二甲氨基乙酸甜菜堿、烷基甜菜堿、酰氨基甜菜堿和磺基甜菜堿。
親油的非離子型表面活性劑的實例包括脫水山梨糖醇脂肪酸酯類，諸如脫水山梨糖醇單油酸酯、脫水山梨糖醇單異硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、脫水山梨糖醇硬脂酸酯、脫水山梨糖醇倍半油酸酯、脫水山梨糖醇三油酸酯、五-2-乙基己酸雙甘油脫水山梨糖醇和四-2-乙基己酸雙甘油脫水山梨糖醇；甘油聚甘油脂肪酸，諸如甘油單棉子油脂肪酸、單芥酸(erucate)甘油酯、倍半油酸(sesquiolate)甘油酯、單硬脂酸甘油酯、α，α’-油酸焦谷氨酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯和蘋果酸；諸如丙二醇單硬脂酸酯這樣的丙二醇脂肪酸酯類；硬化蓖麻油衍生物；甘油烷基醚和聚氧乙烯-甲基聚硅氧烷共聚物。
親水非離子型表面活性劑的實例包括POE脫水山梨糖醇脂肪酸酯類，諸如POE脫水山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、POE脫水山梨糖醇單油酸酯和POE脫水山梨糖醇四油酸酯；POE脫水山梨糖醇脂肪酸酯類，諸如POE脫水山梨糖醇單月桂酸酯、POE脫水山梨糖醇單油酸酯、POE脫水山梨糖醇五油酸酯和POE脫水山梨糖醇單硬脂酸酯；POE甘油脂肪酸酯類，諸如POE甘油單硬脂酸酯、POE甘油單異硬脂酸酯和POE甘油三異硬脂酸酯；POE脂肪酸酯類，諸如POE單油酸酯、POE二硬脂酸酯、POE單二油酸酯和二硬脂酸乙二醇酯；POE烷基醚類，諸如POE月桂基醚、POE油醚、POE(POL)硬脂酰醚、POE山萮醚、POE 2-辛基十二烷基醚和POE膽甾烷醇醚；POE烷基苯基醚類，諸如POE辛基苯基醚、POE烷基壬基苯基醚和POE二壬基苯基醚；plurallonics，諸如泊洛沙姆；POE-POP烷基醚類，諸如POE-POP鯨蠟基醚、POE-POP 2-癸基十四烷基醚、POE-POP一丁基醚、POE-POP氫化羊毛脂和POE-POP甘油醚；諸如特窗酸這樣的四POE-四POP乙二胺縮合產(chǎn)物；POE蓖麻油/硬化蓖麻油衍生物，諸如POE蓖麻油、POE硬化蓖麻油POE硬化蓖麻油單異硬脂酸酯、POE硬化蓖麻油三異硬脂酸酯、POE硬化蓖麻油單焦谷氨酸單異硬脂酸二酯和POE硬化蓖麻油蘋果酸酯；POE蜂蠟-羊毛脂衍生物，諸如POE脫水山梨糖醇蜂蠟；鏈烷醇酰胺類，諸如椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、月桂酸一乙醇酰胺和脂肪酸異丙醇酰胺；POE丙二醇脂肪酸酯類；POE烷基胺類脂肪酸酰胺類；蔗糖脂肪酸酯類；POE壬基苯基甲醛化合物；烷基乙氧基二甲基胺氧化物；和磷酸三油酯。
上述防腐劑的實例包括羥苯甲酸甲酯(methyl parabenzene)、羥苯甲酸乙酯(ethyl parabenzene)和羥苯甲酸丁酯(butylparabenzene)。
上述螯合劑的實例包括乙二胺四乙酸鈉和EDTA。
上述水溶性聚合物的實例包括天然聚合物、半合成聚合物、合成聚合物和無機聚合物。
天然水溶性聚合物的實例包括植物聚合物，諸如阿拉伯樹膠、黃蓍膠、半乳聚糖、瓜耳木膠(gua gum)、角豆樹膠(carob gum)、刺梧桐樹膠、鹿角菜膠、羅望子膠(tamarind gum)、黃原酸膠、果膠、瓊脂、queenseed marmelo、藻類(algea)膠體(褐藻提取物)、淀粉(稻米、玉米、馬鈴薯、小麥)和甘草酸；微生物聚合物，諸如黃原酸膠、葡聚糖琥珀酰葡聚糖和pluran；以及動物聚合物，諸如膠原蛋白、酪蛋白、清蛋白和明膠。
半合成水溶性聚合物的實例包括以淀粉為基礎的聚合物，諸如糊精、羧甲基淀粉和甲基羥丙基淀粉；以纖維素為基礎的聚合物，諸如甲基纖維素、硝基纖維素、乙基纖維素、甲基羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、二甲基二烷基(12-20)硫酸銨纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉(CMC)、結(jié)晶纖維素和粉狀纖維素；以藻酸鹽為基礎的聚合物，諸如藻酸鈉和丙二醇藻酸酯。
合成的水溶性聚合物的實例包括以乙烯基為基礎的聚合物，諸如聚乙烯醇、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物和烷基變性的羧乙烯基聚合物；以聚乙烯聚氧乙烯共聚物為基礎的聚合物，諸如聚乙二醇2000、4000和6000；以聚氧乙烯聚氧化丙烯共聚物為基礎的聚合物；丙烯酸聚合物，諸如聚丙烯酸鈉、丙烯酸聚乙烯酯和聚丙烯酰胺；聚乙烯亞胺類；和陽離子型聚合物。
無機水溶性聚合物的實例包括膨潤土、硅酸鋁鎂、raponite、鋰蒙脫石(hectrite)和硅酸酐。
上述粉末成分的實例包括無機粉末，諸如滑石、高嶺土、云母、絲云母、白云母、金云母、合成云母、鱗云母、黑云母、鋰云母、蛭石、碳酸鎂、碳酸鈣、硅酸鋁、硅酸鋇、硅酸鈣、硅酸鎂、硅酸鍶、金屬鎢酸鹽、鎂、硅石、沸石、硫酸鋇、烘干的硫酸鈣(烘干的石膏)、磷酸鈣、氟磷石灰、羥基磷石灰、陶瓷粉、金屬皂(肉豆蔻酸鋅、棕櫚酸鈣、硬脂酸鋁)和一氮化硼；有機粉末，諸如聚酰胺樹脂粉末(耐綸粉末)、聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯粉末、聚苯乙烯粉末、苯乙烯和丙烯酸共聚物樹脂粉末、苯胍胺樹脂粉末、聚四氟乙烯粉末和纖維素粉末；無機白色色素，諸如二氧化鈦和氧化鋅；無機紅色色素，諸如氧化鐵(紅鐵粉)和鈦酸鐵；無機褐色色素，諸如γ-氧化鐵；無機黃色色素，諸如黃色氧化鐵和赭石；無機黑色色素，諸如黑色氧化鐵、碳黑和低級二氧化鈦；無機紫色色素，諸如芒果紫和鈷紫；無機綠色色素，諸如三氧化二鉻、氫氧化鉻和鈦酸鈷；無機藍色色素，諸如群青和普魯士藍；珠光顏料，諸如二氧化鈦包裹的云母、二氧化鈦包裹的氯氧化鉍、二氧化鈦包裹的滑石、著色的二氧化鈦包裹的云母、氯氧化鉍和魚鱗油；金屬粉末色素，諸如鋁粉末和銅粉末、鋯、鋇或鋁色淀；有機色素，諸如紅色201號、紅色202號、紅色204號、紅色205號、紅色220號、紅色226號、紅色228號、紅色405號、橙色203號、橙色204號、黃色205號、黃色401號、黃色404號、紅色3號、紅色104號、紅色106號、紅色227號、紅色230號、紅色401號、紅色505號、橙色205號、黃色4號、黃色5號、黃色202號、黃色203號、綠色3號和藍色1號；天然色素，諸如葉綠素和β-胡蘿卜素；和著色劑，諸如鈦黃、carsamine和藏紅花色。
上述紫外線防護劑的實例既包括屬于以化學方式吸收紫外線的物質(zhì)的“紫外線吸收劑”又包括屬于通過物理作用散射和反射紫外線的物質(zhì)的“紫外線阻斷劑”。
即長波長紫外線(UVA)吸收劑的實例包括以鄰氨基苯甲酸為基礎的紫外線吸收劑，諸如氨茴酸甲酯和高基-N-乙?；避钏狨ィ灰远酵獮榛A的紫外線吸收劑，諸如2，4-二羥基二苯酮、2，2-二羥基-4-甲氧基二苯酮、2，2’-二羥基-4，4’-二甲氧基二苯酮、2，2，4，4’-四羥基二苯酮、2-羥基-4-甲氧基-4’-甲基二苯酮、2-羥基-4-甲氧基二苯酮-5-磺酸、4-苯基二苯酮、2-乙基己基-4’-苯基-二苯酮-2-羧酸酯、2-羥基-4-正辛氧基二苯酮和4-羥基-3-羧基二苯酮；以苯并三唑為基礎的紫外線吸收劑，諸如2，2’-羥基-5-甲基苯基苯并三唑、2-(2’-羥基-5’-叔辛基苯基)苯并三唑和2-(2’-羥基-5’-甲基苯基)苯并三唑；二茴香基甲烷和4-甲氧基-4’-叔丁基二苯甲?；淄?。
在這些長波長的紫外線吸收劑中，優(yōu)選4-甲氧基-4’-叔丁基二苯甲?；淄椤?-羥基-4-甲氧基二苯酮和諸如2-羥基-4-甲氧基二苯酮-5-磺酸酯這樣的2-羥基-4-甲氧基二苯酮衍生物，因為它們是具有優(yōu)良的安全性和有效性的長波長紫外線吸收劑。
此外，中波長紫外線(UVB)吸收劑的實例包括以苯甲酸為基礎的紫外線吸收劑，諸如對氨基苯甲酸(縮寫為PABA)、PABA單甘油酯、N，N-二丙氧基PABA乙酯、N，N-二乙氧基PABA乙酯、N，N-二甲基PABA乙酯、N，N-二甲基PABA丁酯和N，N-二甲基PABA戊酯；以水楊酸為基礎的紫外線吸收劑，諸如水楊酸二丙二醇酯、水楊酸乙二醇酯、水楊酸肉豆蔻酯、水楊酸甲酯、水楊酸戊酯、水楊酸酯、水楊酸高酯、水楊酸辛酯、水楊酸苯酯、水楊酸芐酯和對異丙醇水楊酸苯酯；以肉桂酸為基礎的紫外線吸收劑，諸如肉桂酸辛酯、肉桂酸乙基-4-異丙酯、肉桂酸甲基-2，5-二異丙酯、肉桂酸乙基-2，4-二異丙酯、肉桂酸甲基-2，4-二異丙酯、丙基對甲氧基肉桂酸酯、異丙基對甲氧基肉桂酸酯(2-乙基己基對甲氧基肉桂酸酯)、異戊基對甲氧基肉桂酸酯、2-乙氧基甲基對甲氧基肉桂酸酯、環(huán)己基對甲氧基肉桂酸酯、乙基-α-氰基-β-苯基肉桂酸酯、2-乙基己基-α-氰基-β-苯基肉桂酸酯、甘油基單-2-乙基己?；?二對甲氧基肉桂酸酯、甲氧基肉桂酸辛酯、3，4，5-三甲氧基肉桂酸-3-甲基-4-[甲基雙(三甲基甲硅烷氧基)甲硅烷基]丁基和對二甲氧基肉桂酸單乙酯；樟腦衍生物，諸如3-(4’-甲基亞芐基)-d，1-樟腦、3-亞芐基-d，1-樟腦和5-(3，3-二甲基-2-norvolnilidene)-3-戊-2-酮；尿刊酸；尿刊酸乙酯；2-苯基-5-甲基苯并噁唑和dibenzaladine。
此外，紫外線阻斷劑的實例包括二氧化鈦(TiO2)、滑石(MgSiO2)、胭脂紅(FeO2)、膨潤土、高嶺土和氧化鋅(ZnO)。
上述增濕劑的實例包括聚乙二醇、丙二醇、甘油、1，3-丁二醇、己二醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、硫酸粘多糖、charoninic acid、atherocollagen、膽甾烷基-12-羥基硬脂酸酯、乳酸鈉、膽汁酸鹽、dl-吡咯烷酮羧酸酯、短鏈可溶性膠原蛋白、雙甘油(EO)PO加成產(chǎn)物、板栗玫瑰果實提取物、蓍草提取物和草木犀提取物。
上述藥理上有效的組分的實例包括增白劑，諸如人血白蛋白(albutin)、維生素C及其衍生物、曲酸胎盤提取物、谷胱甘肽和虎耳草提取物；抗炎藥，諸如甘草酸衍生物、甘草亭酸衍生物、水楊酸衍生物、4-異丙基環(huán)庚二烯酚酮、氧化鋅和尿囊素；活化劑，諸如峰王膠、陽起石、膽甾醇衍生物和牛血提取物；循環(huán)促進劑，諸如nonylic urenylamide、煙酸芐酯、煙酸β-丁氧基乙酯、capsisin、姜油酮、斑蝥素、魚石脂、咖啡堿、單寧酸、α-冰片、煙酸生育酚、六煙酸肌醇酯、環(huán)扁桃酯、桂利嗪、妥拉唑林、乙酰膽堿、維拉帕米、頂花防己堿和γ-olizanol；抗皮脂溢藥，諸如硫和二甲硫蒽；以及用于不同目的的黃柏屬樹皮提取物、黃連提取物成分、紫草根提取物成分、芍藥提取物成分、黃龍膽提取物成分、樺木提取物成分、一串紅提取物成分、枇杷提取物成分、胡蘿卜提取物成分、蘆薈提取物成分、錦葵提取物成分、鳶尾屬提取物成分、葡萄提取物成分、薏苡仁提取物成分、海綿狀黃瓜提取物成分、百合提取物成分、藏花提取物成分、川芎根提取物成分、姜根提取物成分、稻子草(Saint John’s-wort)提取物成分、葡萄芒柄花根提取物成分、迷迭香提取物成分、大蒜提取物成分、辣椒提取物成分、干桔皮、日本當歸根等；維生素A物質(zhì)，諸如視黃醇和乙酸視黃醇酯；維生素B2物質(zhì)，諸如核黃素丁酸和核黃素腺苷酸；維生素B2物質(zhì)，諸如鹽酸吡哆素和二辛酸吡哆醇酯(pyridoxine dioctanoate)；維生素C物質(zhì)，諸如L-抗壞血酸、L-抗壞血酸二棕櫚酸酯、L-抗壞血酸-2-硫酸鈉、L-抗壞血酸磷酸酯和DL-α-生育酚-L-抗壞血酸硫酸二酯二鉀；泛酸，諸如泛酸鈣、D-泛醇、泛醚酯和乙酰基泛酰乙醚(acetylpentothenyl ethyl ether)；維生素D物質(zhì)，諸如麥角鈣化醇和膽鈣化醇；煙酸類，諸如煙酸、煙酰胺和煙酸芐酯；維生素E物質(zhì)，諸如α-生育酚和DL-α-生育酚琥珀酸酯；和其它維生素，諸如維生素P和生物素。
此外，可以將一定范圍內(nèi)的這些藥理成分充分混合，其中本發(fā)明的所需藥理作用并不受這種混合步驟的影響。
以這種方式制備的本發(fā)明組合物防止了伴隨基底膜結(jié)構(gòu)改變而導致的功能降低并促進了皮膚的活化。
實施例1.使用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑制造人工皮膚通過在冰上制備10ml來源于人真皮(將Koken Co.Ltd.的產(chǎn)品I-AC用作膠原蛋白)懸浮成纖維細胞(0.3-1×105個細胞/ml)的膠原蛋白溶液、隨后在37℃下使該膠原蛋白在60mm培養(yǎng)皿上膠凝而獲得膠原蛋白凝膠。下一步將該凝膠從培養(yǎng)皿的壁上剝離并使該膠原蛋白凝膠在CO2培養(yǎng)箱中皺縮。
將等同于真皮的這種皺縮膠原蛋白凝膠置于金屬網(wǎng)上并將玻璃環(huán)(內(nèi)徑12mm)放置在該凝膠上。將0.4ml表皮角質(zhì)細胞混懸液(1×106/ml)(含有5％胎牛血清(1∶1)的KGM-DMEM混合培養(yǎng)基)置于玻璃環(huán)內(nèi)以便防止液體滲漏。在角質(zhì)細胞在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)粘著過夜后，在第2天將該環(huán)取出。將上述培養(yǎng)基充填至表皮層邊界并持續(xù)進行培養(yǎng)，同時使表皮層與空氣接觸以便產(chǎn)生具有顯示出角膜層形成的復層表皮的皮膚模型。
在接種表皮細胞后，從第1周開始將所述培養(yǎng)基改變成含有(1)10μM CGS27023A(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)或(2)300μM MMP-抑制劑(p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Ala NHOH(FN-437)BBRC，1994，199，1442-1446頁)(獲自Cabbiochem.Novabiochem Corporation)(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑)的培養(yǎng)基，且然后在此后每隔2-3天將該培養(yǎng)基用含有相同類型和相同濃度的基質(zhì)蛋白酶抑制劑的培養(yǎng)基替換并培養(yǎng)2周。此外，(3)進行相似的培養(yǎng)而不添加基質(zhì)蛋白酶抑制劑用作對照。
這些結(jié)果如附

圖1中所示。正如從該附圖中清楚地觀察到的，盡管沒有在對照組(3)中的表皮基底細胞下直接觀察到基底膜樣結(jié)構(gòu)，但是就添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(1)CGS27023A化合物或(2)MMP-抑制劑而言，清楚地觀察到了基底膜的形成得到促進。
使用下列指定的植物提取物而非上述基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑化合物進行相似的實驗以便證實基底膜的形成得到了促進。
對下列植物來說證實了相似的作用百里香、闊葉纈草或其它類似植物(敗醬科)、柿(柿樹科)、紫云英(豆科)、野山楂(薔薇科)、牡丹(Poeonia montan Sims)(Paconiaceae)、普洱茶(Thcaccae)、藍桉或其類似植物(桃金娘科)、Potentillatormentilla Schrk(薔薇科)、歐洲小葉椴(Tilia cordaa Mill.)、闊葉椴(Tilia platyphyllus Scop.)、歐洲椴(椴樹科)、Betulaalba Linne(樺木科)、Origanum majorana L.、兒茶鉤藤(Uncariagambir Roxburgh)(茜草科)、Juglans regia Linne var.sinensisDe Candolie或其類似植物(胡桃科)、苦參(豆科)、地榆(薔薇科)、貫葉金絲桃或小連翹(山竹子科)、茶(山茶科)、姜黃(姜科)、包括珠仔樹和香附子在內(nèi)的姜黃的純化提取物、莎草、沙果、Acacia fornensia、訶子、孟加拉榕、臘腸樹、南燭、海棠果和菩提樹。實施例2使用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑制造人工皮膚盡管重復如與實施例1相同的方法，但是使用下列物質(zhì)作為測試物質(zhì)。
(1)僅使用10μM基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A(2)10μM基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A和10ng/ml基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白產(chǎn)生促進劑轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)；(3)10μM基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A和10ng/ml基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白產(chǎn)生促進劑轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFb1)；(4)10μM基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A、10ng/ml基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白產(chǎn)生促進劑轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)和10ng/ml基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白產(chǎn)生促進劑轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFb1)；和(5)不添加上述任意一種物質(zhì)而培養(yǎng)的對照品。
通過蘇木精-伊紅(H & E)和免疫染色(使用抗層粘連蛋白5(LN5)抗體、抗IV型膠原蛋白(IVC)抗體和抗VII型膠原蛋白(VIIV)抗體)對形成的人工皮膚進行染色。這些結(jié)果如附圖2、附圖3和表1中所示。此外，H & E和LN5的結(jié)果如附圖2中所示，而IVC和VIIC的結(jié)果如附圖3中所示。
在對照組中，表皮/真皮連接部分的粘合較弱，可輕易地將表皮從真皮上剝離且存在組織中觀察到的空隙。相反，在用基質(zhì)蛋白酶抑制劑CGS27023A處理的組中，表皮與真皮之間的粘合是顯著的。此外，就添加包括基質(zhì)蛋白酶抑制劑CGS27023A在內(nèi)的基質(zhì)蛋白生成促進劑轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)、轉(zhuǎn)化生長因子β1或兩者(TGFα+TGFβ1)的情況而言，特別對VII型膠原蛋白的染色得到了顯著促進，由此證實表皮與真皮之間的粘合進一步得到了促進。
表1不同藥物對皮膚模型中基底膜形成的作用
在與上述相同的條件下使用下列植物提取物而非上述基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A進行培養(yǎng)百里香、闊葉纈草或其它類似植物(敗醬科)、柿(柿樹科)、紫云英(豆科)、野山楂(薔薇科)、牡丹(Poeonia montan Sims)(Paconiaceae)、普洱茶(Thcaccae)、藍桉或其類似植物(桃金娘科)、Potentilla tormentilla Schrk(薔薇科)、歐洲小葉椴(Tiliacordaa Mill.)、闊葉椴(Tilia platyphyllus Scop.)、歐洲椴(椴樹科)、Betula alba Linne(樺木科)、Origanum majorana L.、兒茶鉤藤(Uncaria gambir Roxburgh)(茜草科)、Juglans regiaLinne var.sinensis De Candolie或其類似植物(胡桃科)、苦參(豆科)、地榆(薔薇科)、貫葉金絲桃或小連翹(山竹子科)、茶(山茶科)、姜黃(姜科)、包括珠仔樹和香附子在內(nèi)的姜黃的純化提取物、莎草、沙果、Acacia fornensia、訶子、孟加拉榕、臘腸樹、南燭、海棠果和菩提樹。
作為結(jié)果，獲得了與使用CGS27023A作為基質(zhì)蛋白酶抑制劑的情況中相似的結(jié)果。此外，使用珠仔樹即一種姜黃的純化提取物也獲得了相似的結(jié)果。
此外，在使用30μg/ml大豆卵磷脂而非用于基質(zhì)蛋白生成促進劑的轉(zhuǎn)化生長因子的情況中，在基底細胞下持續(xù)直接觀察到了與基底膜相似的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果如附圖4中所示。
實施例3.人工皮膚培養(yǎng)基的制備向基礎培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑CGS27023A或MMP-抑制劑至濃度為10μM，其中所述的基礎培養(yǎng)基包括一般用于培養(yǎng)表皮細胞的KGM(角質(zhì)細胞生長培養(yǎng)基)和一般用于培養(yǎng)成纖維細胞的含有10％胎牛血清的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基的1∶1混合物。此外，通過下列步驟制備KGM向MCDB153培養(yǎng)基(10.93g/L)中添加HEPES(6.7g/L)、NaHCO3(1.2g/L)、胰島素(5mg/L)、運鐵蛋白(10mg/L)、氫化可的松(0.5mg/L)和磷酸乙醇胺(14.1mg/L)并將pH調(diào)節(jié)至7.4，隨后添加20g的牛垂體提取物(Far EastPharmaceutical)。
實施例4.人工皮膚培養(yǎng)基的制備向?qū)嵤├?中的人工皮膚培養(yǎng)基中添加至少一種類型的作為基質(zhì)蛋白生成促進劑的轉(zhuǎn)化生長因子(TGFa)或轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFb1)至濃度為10ng/ml。
此外，以30μg/ml添加大豆卵磷脂以取代上述TGFa或TGFb1。
制備實施例1霜劑聚氧乙烯(添加20摩爾)鯨蠟醇醚 1.0甲基苯基聚硅氧烷(20cs) 2.0液體石蠟 3.02-羥基-4-甲氧基二苯酮 5.0活性組分 0.2
丙二醇 5.0甘油 2.0乙醇 15.0羧基乙烯基聚合物 0.3羥丙基纖維素 0.12-氨基甲基丙醇 0.1防腐劑 適量香料 適量離子交換水適量(制備方法)將丙二醇、甘油、乙醇、羧基乙烯基聚合物、羥丙基纖維素和2-氨基甲基丙醇加入到離子交換水中，隨后加熱至70℃(水相)。
將甲基苯基聚硅氧烷、液體石蠟、聚氧乙烯鯨蠟醇醚、防腐劑、2-羥基-4-甲氧基二苯酮、活性組分(諸如lipidure和/或CGS27023A)和香料混合并制備至70℃(油相)。
在向油相中逐步添加水相后，使用均相混合機預乳化并獲得均勻乳化的顆粒，給該乳劑脫氣并冷卻至獲得一種霜劑。
制備實施例2霜劑聚氧乙烯(添加20摩爾)鯨蠟醇醚1.0甲基苯基聚硅氧烷(20cs) 2.0液體石蠟 3.02-羥基-4-甲氧基二苯酮 5.0活性組分 0.2丙二醇 5.0甘油 2.0乙醇 15.0羧基乙烯基聚合物 0.3羥丙基纖維素 0.12-氨基甲基丙醇 0.1
防腐劑 適量香料 適量離子交換水適量(制備方法)將丙二醇、甘油、乙醇、羧基乙烯基聚合物、羥丙基纖維素和2-氨基甲基丙醇加入到離子交換水中，隨后加熱至70℃(水相)。
將甲基苯基聚硅氧烷、液體石蠟、聚氧乙烯鯨蠟醇醚、防腐劑、2-羥基-4-甲氧基二苯酮、活性組分(諸如lipidure和/或CGS27023A)和香料混合并制備至70℃(油相)。
制備實施例3乳液Wt％鯨蠟醇 1.0蜂蠟 0.5凡士林 2.0角鯊烯 6.0二甲基聚硅氧烷 2.0乙醇 5.0甘油 4.01，3-丁二醇4.0活性組分 0.1凝血酸 1.0聚氧乙烯(10)單油酸酯1.0甘油單硬脂酸酯 1.0Queenseed提取物(5％水溶液) 20.0防腐劑 適量香料 適量離子交換水 適量(制備方法)
將甘油和1，3-丁二醇加入到離子交換水中、混合并加熱至70℃(水相)。將鯨蠟醇、蜂蠟、凡士林、角鯊烯、二甲基聚硅氧烷、活性組分(諸如lipidure和/或CGS27023A)、凝血酸、聚氧乙烯(10)單油酸酯和防腐劑制備成混合物的形式并加熱至70℃(油相)。在向油相中逐步添加水相并進行預乳化后，添加并攪拌queenseed提取物和乙醇并使用均相混合機獲得均勻乳化的顆粒，給該乳劑脫氣、過濾并冷卻至獲得一種乳液。
制備實施例4乳液Wt％鯨蠟醇 1.0蜂蠟0.5凡士林 2.0角鯊烯 6.0二甲基聚硅氧烷 2.0乙醇5.0甘油4.01，3-丁二醇 4.0活性組分 0.1凝血酸 1.0聚氧乙烯(10)單油酸酯1.0甘油單硬脂酸酯 1.0Queenseed提取物(5％水溶液) 20.0防腐劑 適量香料適量離子交換水 適量(制備方法)將甘油和1，3-丁二醇加入到離子交換水中、混合并加熱至70℃(水相)。將鯨蠟醇、蜂蠟、凡士林、角鯊烯、二甲基聚硅氧烷、活性組分(諸如lipidure和/或CGS27023A)、凝血酸、聚氧乙烯(10)單油酸酯和防腐劑制備成混合物的形式并加熱至70℃(油相)。在向油相中逐步添加水相并進行預乳化后，添加并攪拌queenseed提取物和乙醇并使用均相混合機獲得均勻乳化的顆粒，給該乳劑脫氣、過濾并冷卻至獲得一種乳液。
在向油相中逐步添加水相后，使用均相混合機進行預乳化并獲得均勻乳化的顆粒，給該乳劑脫氣并冷卻至獲得一種霜劑。
權(quán)利要求
1.一種皮膚基底膜形成促進劑，它包括一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。
2.一種皮膚基底膜形成促進劑，它包括基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑。
3.一種人工皮膚形成促進劑，它包括一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。
4.一種人工皮膚形成促進劑，它包括基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑。
5.一種人工皮膚的制造方法，該方法包括向人工皮膚形成培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的步驟。
6.一種人工皮膚的制造方法，該方法包括向人工皮膚形成培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和基質(zhì)蛋白生成促進劑的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及促進人工皮膚形成的活性劑和使皮膚基底膜保持穩(wěn)定的活性劑,它們含有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑以及選擇性地一種基質(zhì)蛋白生成促進劑;且本發(fā)明還涉及一種人工皮膚的制造方法,其特征在于向形成人工皮膚的培養(yǎng)基中添加基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑以及選擇性地一種基質(zhì)蛋白生成促進劑。
文檔編號A61K36/00GK1365293SQ01800673
公開日2002年8月21日 申請日期2001年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月27日
發(fā)明者天野聰, 松永由紀子, 豬股慎二 申請人:株式會社資生堂