專利名稱：重組黃病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及重組病毒領(lǐng)域，并涉及對(duì)特定免疫力的誘發(fā)，尤其是對(duì)腫瘤-特異性免疫力的誘發(fā)作用。
背景技術(shù)：
腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)可以在一些試驗(yàn)系統(tǒng)和癌癥患者中預(yù)防或消除腫瘤(1-3)。臨床試驗(yàn)表明，35％用特異性腫瘤-反應(yīng)性淋巴細(xì)胞治療的黑色素瘤患者的腫瘤可以部分或完全退化(4)。在有些情況下已鑒定了由T細(xì)胞識(shí)別的抗原(5，6)。雖然癌細(xì)胞可能表達(dá)腫瘤-相關(guān)性抗原(TAA)，但生長(zhǎng)的腫瘤不能有效地引發(fā)指導(dǎo)抗TAA的CTL，故免疫系統(tǒng)不能控制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，看來(lái)腫瘤細(xì)胞既缺乏免疫原性，還可能缺乏激活CTL所需的適當(dāng)?shù)墓餐碳ぷ饔谩?br>
與腫瘤細(xì)胞相反，病毒是細(xì)胞免疫應(yīng)答的一種強(qiáng)誘導(dǎo)因子。因此，通過(guò)用表達(dá)腫瘤相關(guān)性抗原的重組病毒施行免疫接種來(lái)激活腫瘤-指導(dǎo)的CTL的應(yīng)答，是預(yù)防和治療惡性腫瘤有前途的方法。已在實(shí)驗(yàn)性癌癥模型中成功地使用的病毒疫苗載體包括痘病毒、腺病毒、細(xì)小核糖核酸病毒和流感病毒(7-10)。然而，由于各疫苗載體自身可能存在的有益特性和不良副作用，對(duì)新載體的探索依舊是研究的熱門領(lǐng)域。例如，當(dāng)前正在研究的一些載體的臨床用途，還受著它們?cè)诎踩?、有效性、潛在的致瘤性或引發(fā)免疫抑制作用等方面的記錄的限制。另外，原有的對(duì)抗這類載體的免疫作用也會(huì)阻礙治療的效力(8，11)，因此需要另選其它病毒載體。
本領(lǐng)域需要一種可用于誘導(dǎo)針對(duì)廣泛范圍的抗原(包括腫瘤中存在的那些抗原)的免疫力的病毒載體。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這一需求，并可提供一些相關(guān)的益處。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種重組黃病毒，其中包括可編碼外源多肽的外源核酸序列。一般而言，本發(fā)明的重組黃病毒具有復(fù)制能力，即它們是活的減毒病毒。在一些實(shí)施例中，黃病毒是黃熱病病毒。因此，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了重組黃熱病病毒(YFV)，尤其是活的減毒重組YFV，其中包括可編碼外源(即非-YFV)多肽的外源(即非-YFV)的核苷酸序列。這些重組黃病毒包括外源核酸。用重組黃病毒感染宿主細(xì)胞，可使宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源核酸，并產(chǎn)生由該外源核酸編碼的抗原多肽。這種重組黃病毒可用于引發(fā)對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答。
重組活減毒核蛋白可表達(dá)外源核酸序列，該序列可編碼摻入黃病毒多蛋白的外源多肽，如(但不限制于)從黃病毒以外的病原體得到的多肽、腫瘤抗原等。當(dāng)引入到哺乳動(dòng)物對(duì)象時(shí)，這些重組黃病毒可用于引發(fā)針對(duì)該對(duì)象內(nèi)的外源性多肽的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的重組黃病毒可作為免疫作用的載體。
可將多種抗原性氨基酸序列摻入黃病毒多蛋白，包括微生物病原體(如細(xì)菌、寄生蟲、(除黃病毒以外的)病毒、真菌等)的那些多蛋白和各種腫瘤相關(guān)性抗原。通常，在用本發(fā)明的重組病毒感染宿主細(xì)胞后，該外源性多肽可從病毒多蛋白前體經(jīng)蛋白酶解作用切割分離而進(jìn)入其結(jié)合部分。然后該外源多肽可能被輸送到宿主細(xì)胞表面，也可能以具有主要組織相容性抗原的肽存在于細(xì)胞表面，也可能從細(xì)胞分泌出，或存在于細(xì)胞的胞漿中。在腫瘤的免疫治療中，宿主體的外源多肽表達(dá)可引發(fā)對(duì)該腫瘤的免疫應(yīng)答，從而減少腫瘤細(xì)胞的質(zhì)量和/或腫瘤細(xì)胞數(shù)，并可防止或延遲腫瘤的發(fā)展，和/或降低腫瘤發(fā)生的機(jī)會(huì)。
本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的重組黃病毒的藥物組合物。這種組合物可通過(guò)補(bǔ)充宿主的免疫系統(tǒng)，而用于諸如緩解疾病的嚴(yán)重程度、減少臨床發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)、防止疾病發(fā)作和/或改善疾病進(jìn)程。
本發(fā)明還提供了在哺乳動(dòng)物對(duì)象中引發(fā)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法。這類方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象施用本發(fā)明的重組黃病毒，從而引發(fā)對(duì)外源性多肽的免疫應(yīng)答。這種抗原可以是宿主抗原，或是非黃病毒病原體的抗原。
本發(fā)明還提供了可減低或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，和減少腫瘤細(xì)胞質(zhì)量和/或腫瘤細(xì)胞數(shù)量的方法。這些方法包括對(duì)患腫瘤的宿主施用本發(fā)明的重組黃病毒，其中包括可編碼腫瘤相關(guān)性抗原(TAA)/表位的外源序列，從而使該重組黃病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且使外源性TAA多肽或在宿主細(xì)胞表面表達(dá)，或存在于MHC分子中，或從宿主細(xì)胞分泌。在其表面帶有針對(duì)腫瘤可引發(fā)免疫應(yīng)答抗原的，該抗原包括外源性TAA多肽或類似外源性多肽足以引發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。對(duì)表面上攜帶腫瘤相關(guān)性抗原的腫瘤的免疫應(yīng)答，足以減少、抑制或消除該腫瘤。
本發(fā)明還提供了可防止腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法和降低腫瘤形成機(jī)會(huì)的方法，這些方法包括對(duì)未患腫瘤的宿主施用本發(fā)明的重組黃病毒，其包括腫瘤相關(guān)性抗原/可編碼表位的核酸，從而使該重組黃病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞的表面表達(dá)腫瘤相關(guān)性抗原和/或在主要組織相容性(MHC)分子(如MHC I類)中存在腫瘤相關(guān)性抗原，并引發(fā)對(duì)腫瘤相關(guān)性抗原的免疫應(yīng)答。這種對(duì)腫瘤相關(guān)性抗原的免疫應(yīng)答足以防止或降低宿主發(fā)生腫瘤的機(jī)會(huì)。
本發(fā)明的主要目的是提供一種重組黃病毒，提供該病毒用于產(chǎn)生外源性多肽，當(dāng)用重組黃病毒感染宿主后，這種多肽適用于引發(fā)針對(duì)該多肽的免疫應(yīng)答。這種外源性多肽包括(但不限于)由宿主產(chǎn)生的抗原(如腫瘤抗原)或非黃病毒病原體的抗原(如逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的重組黃病毒是減毒活病毒，它會(huì)持續(xù)繁殖直到宿主免疫系統(tǒng)的干預(yù)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種重組黃病毒在該體內(nèi)表現(xiàn)為低毒性。
本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是這種重組黃病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)多肽，因此可以引發(fā)免疫應(yīng)答，尤其是包括如抗原-特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞系列(CTLs)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是用本發(fā)明的重組黃病毒引發(fā)的免疫原性并不限于針對(duì)感染的細(xì)胞，該免疫系統(tǒng)也會(huì)識(shí)別攜帶由重組黃病毒表達(dá)的抗原的細(xì)胞。例如，由重組黃病毒產(chǎn)生腫瘤抗原可以“破壞對(duì)腫瘤抗原的免疫耐受性”，并引發(fā)針對(duì)腫瘤足以例如抑制腫瘤生長(zhǎng)的免疫應(yīng)答，。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從以下更詳細(xì)的描述中理解本發(fā)明的這些以及其他一些目的、優(yōu)點(diǎn)和特征等具體內(nèi)容。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了黃熱病病毒載體YF-pOva的模式圖和表達(dá)雞卵清蛋白的策略。上排表示YF載體基因組RNA。下排框符表示成熟的病毒蛋白質(zhì)。白色箭頭指NS2B/NS3切割位點(diǎn)，黑色三角指細(xì)胞信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)。在N-末端或C-prM與NS2B-NS3之間的連接處(以黑箭頭標(biāo)示)插入可編碼卵清蛋白Kb表位SIINFEKL的核苷酸序列和側(cè)接于病毒蛋白酶切割位點(diǎn)的核苷酸序列。
圖2顯示了親代黃熱病病毒17D毒株(YF-17D)和三種YF病毒載體的單步生長(zhǎng)曲線YF-pOva-1(空心三角)，YF-pOva-2(空心圓圈)和YF-pOva-8(實(shí)心方塊)。用YF-17D、YF-pOva-1、YF-pOva-2或YF-pOva-8感染SW13細(xì)胞單層(MOI＝5)。用空斑試驗(yàn)確定各時(shí)間點(diǎn)的病毒產(chǎn)量(pfu/ml)。
圖3A-3C顯示了在活體內(nèi)活化CD8+T細(xì)胞至Ova肽。四合體SIINFEKL/小鼠MHC I類分子H-2 Kb復(fù)合物結(jié)合于CD8+脾細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)法的統(tǒng)計(jì)圖表明與清白小鼠或用親代YF-17D或重組YF-pOva-8感染的小鼠的受控的(gated)CD8+T淋巴細(xì)胞相結(jié)合的四合體。用表達(dá)SIINFEKL的EL4細(xì)胞(EL4-SL8)共同培養(yǎng)5天，以激發(fā)脾細(xì)胞。數(shù)值表明與四合體相結(jié)合的CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比。
圖4A-D和5A-D表明用YF載體免疫接種的結(jié)果，引發(fā)了針對(duì)表達(dá)Ova的黑色素瘤B16的保護(hù)性和抗原-特異性免疫力。通過(guò)靜脈內(nèi)(i.v.，圖4A和5A)、腹腔內(nèi)(i.p.，圖4B和5B)、皮下(s.c.，圖4C和5C)或肌內(nèi)(i.m.，圖4D和5D)用YF-pOva-8(3×105pfu/小鼠)(實(shí)心方塊)，每2周2次免疫接種C57BL/6小鼠。將接種親代YF-17D(空心方塊)或鹽水(空白)(實(shí)心圓圈)的小鼠作為對(duì)照。在第一次免疫接種(第0天)30天后，用5×104B16-Ova攻擊動(dòng)物。圖4A-D局部腫瘤生長(zhǎng)。每5天測(cè)定腫瘤的大小，并以平均腫瘤大小±標(biāo)準(zhǔn)偏差(cm2)與攻擊后的時(shí)間(天)相比繪制曲線圖。圖5A-D以存活動(dòng)物的百分比與時(shí)間相比繪制存活曲線圖。所有試驗(yàn)包括每組10只小鼠，并重復(fù)3次。
圖6A-F顯示用YF-pOva-8接種已形成B16的小鼠的結(jié)果。在第0天(移植腫瘤)用黑色素瘤B16-Ova(5×103細(xì)胞/小鼠(圖6A-6C)或5×104(圖6D-6F)皮下注射C57BL/6小鼠。動(dòng)物每3天接受3次皮下接種PBS(空白)(實(shí)心圓圈)、或親代17D(YF-17D)(空心方塊)或YF-pOva-8(4×105pfu/小鼠)(實(shí)心方塊)。在移值腫瘤的當(dāng)天(第0天，圖6A和6D)、第5天(第5天，圖6B和6E)或第10天(第10天，圖6C和6F)，施用疫苗接種。每周2次觸摸檢查小鼠以確證腫瘤生長(zhǎng)。
圖7顯示了接種腫瘤后30天，用編碼的盲試方式評(píng)估接受治療后的小鼠肺部轉(zhuǎn)移情況。顯示了每個(gè)小鼠的肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量。
圖8顯示了接種腫瘤后30天，用YF-pOva-8或YF-17D治療后的肺部照片。
圖9A和9B顯示了在移植5×104細(xì)胞(圖9A)或1×106細(xì)胞(圖9B)后，以存活動(dòng)物百分比與時(shí)間相比所繪制的存活圖?？瞻讓?shí)心圓圈；YF-17D，空心方塊；YF-pOva-8，實(shí)心方塊所有各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)都是每組10只小鼠。
優(yōu)選實(shí)施例詳述在描述本發(fā)明之前，應(yīng)該明確本發(fā)明不受所述的具體實(shí)施例的限制，而是可以變化的。還須理解本文所用的術(shù)語(yǔ)僅是為了說(shuō)明所述的具體實(shí)施例，而不是對(duì)其進(jìn)行限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附的權(quán)利要求書的限制。
除非特別指出，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所知的含義相同。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐和測(cè)試中可以使用任何與本發(fā)明所述的相類似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧希诖嗣枋龅膭t是優(yōu)選的方法和材料。本文將所述的所有出版物都全部納入作為參考，以公開(kāi)和描述與所引用的這些出版物相關(guān)的方法和/或材料。
必需注意到，除非特別指出，本文及所附權(quán)利要求中的單數(shù)形式“一”、“和”和“該”也包括復(fù)數(shù)的論述對(duì)象。所以，例如“一種重組黃病毒”也包括許多這種表達(dá)，而“病毒”包括一個(gè)或多個(gè)表位以及與本領(lǐng)域技術(shù)人員所知相當(dāng)?shù)母拍畹取?br>
本文中所論述的出版物都是在本申請(qǐng)書歸檔日期之前它們單獨(dú)提供所公開(kāi)的內(nèi)容。在此并不能意味著發(fā)明者無(wú)權(quán)在發(fā)明之前超前使用這類出版物。另外，所提供的出版物的日期可能與實(shí)際出版日期不同，這就需要單獨(dú)予以確定。
定義本文交替使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”指聚合形式的任何長(zhǎng)度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括(但不限制于)單-、雙-、或多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體、或聚合體(包括嘌呤和嘧啶的堿基或其它天然的、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的非天然的或衍生的核苷酸堿基)。
本文交替使用的術(shù)語(yǔ)“肽”、“寡肽”、“多肽”“多蛋白”和“蛋白質(zhì)”，它們指聚合體形式的任何長(zhǎng)度的氨基酸，包括編碼的和不編碼的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生的氨基酸、和具有修飾的肽主干的多肽。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組體”指經(jīng)過(guò)克隆、限制和/或連接等步驟的各種組合過(guò)程而產(chǎn)生的特定的DNA序列，可形成具有與天然系統(tǒng)中所發(fā)現(xiàn)的同源序列不同的結(jié)構(gòu)編碼序列的構(gòu)建物。通常，可編碼結(jié)構(gòu)編碼序列的DNA序列可以由cDNA片段和短的寡核苷酸接頭裝配而成，或由一系列寡核苷酸裝配而成，以提供能在重組體轉(zhuǎn)錄單元中表達(dá)的合成的基因。這種序列能夠以未受內(nèi)部未翻譯序列干擾的開(kāi)放讀數(shù)框形式或內(nèi)含子(通常存在于真核基因中)形式提供。也可以使用包括相關(guān)序列的基因組DNA。在開(kāi)放讀數(shù)框的5’或3’可能存在未翻譯的DNA的序列，在那里這種序列并不干擾編碼區(qū)域的操作或表達(dá)。因此，例如術(shù)語(yǔ)“重組體”多核苷酸或核酸指不是天然形成的或由人工結(jié)合兩個(gè)按其他方式分離的序列片段得到的多核苷酸或核酸。人工結(jié)合通常由化學(xué)合成方法，或以人工操作核酸的分離片段，如通過(guò)基因工程方法完成。這通常是用可編碼相同或保留的氨基酸的多余的密碼子來(lái)替代一個(gè)密碼子，一般要引入或除去一個(gè)序列識(shí)別位點(diǎn)。另外，也可將具有所需功能的核酸片段連接在一起，產(chǎn)生所需的若干功能的組合。
“構(gòu)建物”指重組核酸(通常為重組DNA)，其目的是表達(dá)特定的核苷酸序列(類)或用于構(gòu)建其它重組核苷酸序列。
類似地，“重組多肽”或“重組多蛋白”指非天然形成的或由人工組合氨基酸序列的兩個(gè)按不同方式分離的片段所產(chǎn)生的多肽或多蛋白。這種人工組合物可由重組DNA工藝的標(biāo)準(zhǔn)方法完成，如上所述，即可能由重組多核苷酸編碼重組多肽或重組多蛋白。因此，重組多肽或重組多蛋白是由全部或部分重組多核苷酸編碼的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“外源多肽”指通常不與天然親代黃病毒結(jié)合的多肽。
術(shù)語(yǔ)“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重組或合成的肽誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的特異性體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原性氨基酸序列”、“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引發(fā)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的氨基酸序列，無(wú)論是單獨(dú)或與輔助分子結(jié)合(如I或II類主要組織相容性抗原分子)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”包括細(xì)胞性和/或體液性免疫應(yīng)答，它們足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)導(dǎo)致的疾病的發(fā)作；和/或抑制、減少或防止腫瘤細(xì)胞的增生；和/或降低腫瘤細(xì)胞的數(shù)量或腫瘤的質(zhì)量；和/或降低腫瘤性形成的可能性。
術(shù)語(yǔ)“腫瘤相關(guān)性抗原”是本領(lǐng)域所熟知的，指相對(duì)于同種細(xì)胞類型的非癌癥細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞差級(jí)表達(dá)的表面分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤相關(guān)性抗原”不僅僅包括完整的腫瘤相關(guān)性抗原，還包括其含部分(片段)的表位。腫瘤相關(guān)性抗原(TAA)抗原可以是天然發(fā)現(xiàn)的，也可以是天然發(fā)現(xiàn)的TAA的合成形式或天然存在的TAA的變體(如免疫原特性增強(qiáng)的變體)。
術(shù)語(yǔ)“抗原”和“表位”是本領(lǐng)域熟知的，指可由免疫系統(tǒng)的一種成分(如抗體或T細(xì)胞抗原受體)特異性識(shí)別的大分子的一部分。表位可由溶液中的抗體識(shí)別，如與其它分子相對(duì)游離。當(dāng)表位與I或II類主要組織相容性復(fù)合物分子結(jié)合時(shí)，就可由T-細(xì)胞抗原受體識(shí)別表位。“CTL表位”就是當(dāng)表位存在于與MHC I類分子結(jié)合的細(xì)胞表面上時(shí)，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(通常為CD8+細(xì)胞)識(shí)別的表位。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“分離的”指描述處于與一種化合物的天然形成環(huán)境所不同的條件下的有關(guān)化合物(如重組病毒、肽等)?！胺蛛x的”包括在樣本中一種有關(guān)化合物基本處于富集狀態(tài)和/或在其中一種有關(guān)化合物有部分或基本上達(dá)到純化的各種化合物。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本純的”指從其天然環(huán)境取出的化合物，且是至少60％(較佳地為75％，更佳地為90％)無(wú)與之天然結(jié)合的其它成分。
本文交替使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”或“個(gè)體”或“患者”指需要進(jìn)行診斷或治療的任何目標(biāo)，尤其是哺乳動(dòng)物對(duì)象，特別是人，其它對(duì)象包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。特別受關(guān)注的是那些易受黃病毒(如黃熱病病毒)感染的對(duì)象，如可以支持黃病毒復(fù)制的對(duì)象。
“生物樣品”包括從生物體得到，且可用于診斷或監(jiān)測(cè)分析的各種樣品類型。該術(shù)語(yǔ)包括血樣和其它生物性液體樣品、固態(tài)組織樣品(如活組織檢查樣品或組織培養(yǎng)物或由其衍生的細(xì)胞及它的子代)。該術(shù)語(yǔ)包括在購(gòu)置后以任何方法操作的樣品，如用試劑處理、溶液化或富集其某些成分。該術(shù)語(yǔ)包括臨床樣品，還包括細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞上清液、細(xì)胞溶解產(chǎn)物、血清、血漿、生物液體和組織樣品。
本文交替使用的術(shù)語(yǔ)“處理”、“治療”等通常指獲得理想的藥理或生理效果。這種效果可以是完全或部分防止疾病或其癥狀的預(yù)防性效果，和/或部分或完全治愈疾病或其癥狀和/或?qū)膊≡斐刹焕饔玫闹委熜孕Ч?。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括對(duì)哺乳動(dòng)物(如人)的疾病的任何治療措施，且包括(a)防止具有患病傾向但至今還未診斷出患病的對(duì)象患該病，如降低個(gè)體患該病的風(fēng)險(xiǎn)性，降低疾病癥狀的嚴(yán)重程度；(b)抑制疾病，即制止其發(fā)展；和(c)減輕疾病，即使疾病消退。在有些實(shí)施例中，本發(fā)明人著眼于處置癌癥口才。在這些實(shí)施例中，“治療”可治療包括降低或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，消除腫瘤、減少轉(zhuǎn)移、減少或抑制腫瘤細(xì)胞的增生，減少腫瘤細(xì)胞實(shí)體的大小，減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和降低腫瘤形成的可能性。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”、“贅生物”、“腫瘤”和“癌瘤”在本文中交替使用，它們指表現(xiàn)相對(duì)自主生長(zhǎng)的細(xì)胞，因此它們表現(xiàn)出細(xì)胞增生明顯失控特征的異常生長(zhǎng)表型。癌性細(xì)胞可以是良性或惡性。
重組黃病毒本發(fā)明提供重組黃病毒，尤其是活的減毒重組黃病毒，包括可編碼外源氨基酸序列(即親代黃病毒以外的氨基酸序列)的外源核苷酸序列(即親代黃病毒以外的核苷酸序列)。這種重組黃病毒可用于引發(fā)對(duì)外源肽的免疫應(yīng)答。為了簡(jiǎn)化，在所有這些序列的示例中都可使用術(shù)語(yǔ)“外源性”，但并無(wú)對(duì)其限制的意圖。
黃熱病病毒(YFV)是黃病毒的一種非限制性的示例。以下對(duì)YFV的描述通常也可用于其它黃病毒。黃熱病病毒是有包膜的正分股的RNA病毒，是黃病毒屬的成員。其基因組長(zhǎng)度約為11kb，可編碼單個(gè)多肽(16)。在翻譯期間和之后，可經(jīng)蛋白酶解作用加工此多肽前體，而產(chǎn)生病毒復(fù)制所需的功能性蛋白質(zhì)。該加工過(guò)程受細(xì)胞性和病毒性蛋白酶的介導(dǎo)，這些蛋白酶可識(shí)別與病毒蛋白質(zhì)相連接處存在的特異性短氨基酸序列。病毒蛋白酶NS2B/NS3可介導(dǎo)被感染的細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)中大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)切割(17-19)。
本發(fā)明的重組黃病毒包括可編碼外源多肽的核酸。在正常病毒蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程中表達(dá)的所編碼的外源多肽，優(yōu)選作為重組或融合前體多肽的成分。重組多蛋白通常包括外源多肽和病毒多肽，且較佳地還含有人工蛋白水解識(shí)別的若干位點(diǎn)。這種蛋白水解識(shí)別位點(diǎn)可以位于重組前體多肽中，從而可用病毒性或細(xì)胞性蛋白酶類來(lái)對(duì)前體多蛋白進(jìn)行蛋白水解加工，從病毒蛋白質(zhì)釋放出游離的外源蛋白質(zhì)。
將隨后修飾成含有外源序列的啟動(dòng)黃病毒稱為“親代”黃病毒，它可以是本源性黃病毒(可以是病原性的，最好是非病原性的)、減毒的黃病毒、疫苗黃病毒毒株或重組黃病毒。各種黃病毒毒株都可用于生成本發(fā)明所述的重組黃病毒。
適用于生成本發(fā)明的重組黃病毒的黃病毒類包括(但不限制于)黃熱病病毒(YFV)；登革熱病毒，包括1-4型登革熱病毒；日本腦炎病毒；墨累溪谷腦炎病毒；圣路易斯腦炎病毒；西尼羅河熱(West Nile)病毒；蜱媒腦炎病毒；丙型肝炎病毒；孔吉氏病毒；中歐腦炎病毒；俄羅斯春-夏腦炎病毒；龐沃桑病毒；凱薩納森林病病毒；和歐姆斯克出血熱病毒。在許多實(shí)施例中，用作啟動(dòng)黃病毒以產(chǎn)生重組黃病毒的黃病毒是YFV。
可從公用數(shù)據(jù)庫(kù)(包括，如GenBank)獲得若干YFV毒株的核苷酸序列。示范毒株是“YFV 17D”?？稍贕enBank登記號(hào)X03700獲得YFV基因組的核苷酸序列以及可編碼病毒多蛋白的氨基酸序列，Rice等人((1985)Science229726-733)也對(duì)其有描述，本文將它們都全部納入用于參考其中所公開(kāi)的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。黃熱病病毒子(病毒顆粒)的生產(chǎn)是本領(lǐng)域所熟知的。
在多數(shù)實(shí)施例中，重組黃病毒的黃病毒核苷酸序列都是野生型的，即它們是在天然條件下發(fā)現(xiàn)的序列。在其它一些實(shí)施例中，與野生型黃病毒相比，黃病毒核苷酸序列含有一個(gè)或多個(gè)突變體。在還有一些實(shí)施例中，重組黃病毒的黃病毒部分是從兩種或多種不同的黃病毒衍生的，即用于構(gòu)建重組黃病毒的黃病毒是嵌合型黃病毒。
通常，插入到黃病毒基因組的外源核酸包括可編碼外源多肽的核苷酸序列和至少一個(gè)可編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核苷酸序列。可編碼外源多肽的核苷酸序列可能側(cè)接于可編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核苷酸序列。另外，可編碼外源多肽的核苷酸序列可能僅連接于可編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核苷酸序列的一側(cè)。在后一種實(shí)例中，插入位點(diǎn)的選擇是根據(jù)在插入后可編碼外源多肽的核苷酸序列的兩側(cè)都有可編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核苷酸序列側(cè)接，其中一個(gè)核苷酸序列存在于緊鄰插入位點(diǎn)的親代黃病毒基因組中。
可編碼外源多肽的外源核酸序列和可編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核酸序列都可以位于黃病毒基因組的不同位點(diǎn)。作為非限制性實(shí)施例，可將外源核酸序列插入以下的一個(gè)或多個(gè)位置(1)病毒多肽的N-末端；(2)病毒蛋白質(zhì)C和prM之間；(3)病毒蛋白質(zhì)NS2A和NS2B之間；(4)病毒蛋白質(zhì)NS2B和NS3之間；(5)病毒蛋白質(zhì)NS3和NS4A之間；和(5)NS4A和NS4B之間。外源核酸可插入黃病毒基因組的其它位點(diǎn)。最好是，外源核酸的插入不致破壞黃病毒蛋白質(zhì)的功能、和/或病毒多肽的蛋白水解加工、和/或病毒的復(fù)制。病毒的復(fù)制是否會(huì)受到不良的影響，可用早已建立的各種方法來(lái)檢測(cè)，包括(但不限制于)蝕斑測(cè)定和單步生長(zhǎng)曲線測(cè)定(如實(shí)施例1所述)。
與僅可產(chǎn)生一輪抗原病毒表達(dá)的其它載體和/或會(huì)停止表達(dá)而不干擾宿主免疫系統(tǒng)的其它載體不同，本發(fā)明的活性重組病毒會(huì)持續(xù)繁殖直到免疫系統(tǒng)被充分活化到制止感染。與用常規(guī)表達(dá)載體(如病毒復(fù)制子)所引發(fā)的免疫應(yīng)答相比，這樣就會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的(針對(duì)黃病毒產(chǎn)生的外源抗原性肽)的免疫應(yīng)答。
重組黃病毒在感染宿主后也表現(xiàn)出低毒性。例如，YF-17D是非常安全和有效的活病毒疫苗，是用世界衛(wèi)生組織(WHO)開(kāi)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)方法從受感染的雞胚制備的。免疫接種后，有95％以上的疫苗可在10天內(nèi)引發(fā)免疫力(12)，且可檢測(cè)抗病毒的中和抗體的期限超過(guò)35年(13)。疫苗的安全性記錄是優(yōu)異的嚴(yán)重的對(duì)YF-17D的副作用是特別罕有的，且實(shí)際上不存在回復(fù)成野生型的情況(14，15)。
可將其它特征結(jié)合入有復(fù)制活性的重組黃病毒的設(shè)計(jì)中，如多接頭序列(如EcoR1、Not1、BssH2和Xhol)以協(xié)助所需的外源序列使之容易插入到重組載體中。同樣，各種突變體(如多甘氨酸序列)可與插入的序列相鄰地插入，從而增進(jìn)該區(qū)域的結(jié)構(gòu)靈活性并大大提高蛋白水解加工的效率。
在重組的復(fù)制-活性黃病毒中可包括可編碼要產(chǎn)生的外源蛋白或多肽的一個(gè)以上的核酸序列，結(jié)果這種病毒可產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的外源蛋白質(zhì)或多肽。兩個(gè)或多個(gè)核酸序列可以分別編碼不同的產(chǎn)物也能編碼同一種產(chǎn)物(如，如果希望提高蛋白質(zhì)或多肽的產(chǎn)量)。
可用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行外源核酸的插入，如在多種標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程都有論述，包括如“分子生物學(xué)通用規(guī)程”(F.M.Ausubel等人編輯，1987)及修訂本。實(shí)施例1提供了如何完成具體插入的進(jìn)一步指導(dǎo)。用這些指南材料，可將任何品種的外源核酸插入到黃病毒基因組中。
外源核酸的長(zhǎng)度可以為約12-18，15-24，21-30，30-60，60-90，90-120，120-150，150-180，180-240，240-300，300-600，600-1200，1200-1500，1500-2100，2100-2400，10-1000，20-500或2400-3000個(gè)核苷酸。
可將本文所述的重組黃病毒用于在個(gè)體中引發(fā)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，和如提供保護(hù)作用以對(duì)抗可產(chǎn)生抗原的外源病原體(細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲)的攻擊或感染。因此，它們可用作提供抗這些病原體的免疫保護(hù)作用的疫苗。
任何可編碼多肽或蛋白質(zhì)的DNA序列，都可視為用于本發(fā)明目的的外源核酸，當(dāng)表達(dá)這種多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，就可產(chǎn)生針對(duì)如病原微生物或與抗原存在相關(guān)或由抗原產(chǎn)生的疾病或紊亂的保護(hù)性免疫力。本發(fā)明的疫苗中可包括可編碼一種或多種相關(guān)的外源多肽(如抗原或表位)的核酸序列。如果外源核酸序列編碼多個(gè)相關(guān)的外源抗原或表位，它們可以是單個(gè)病原體的抗原或表位或多個(gè)(不同)病原體的抗原或表位。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，這種生物是一種病原性微生物。例如，這種外源表位可以從作為疾病或紊亂的致病因子的細(xì)菌、寄生蟲、病毒或真菌中發(fā)現(xiàn)。另外，可以使用變應(yīng)原、精液和癌細(xì)胞等的表位。因此，在有些實(shí)施例中，當(dāng)外源核酸序列編碼一個(gè)以上的外源肽時(shí)，這種外源肽可以是在單個(gè)TAA上發(fā)現(xiàn)的不同表位。
本發(fā)明的疫苗制劑中的各種外源蛋白質(zhì)，還可包括外源生物的表位。當(dāng)在脊椎動(dòng)物宿主中表達(dá)外源多肽時(shí)，可以引發(fā)免疫應(yīng)答，以防護(hù)由表達(dá)或宿主中的存在含該表位的抗原而引起的或與之相關(guān)的疾病或紊亂。例如，在本發(fā)明的實(shí)施例中，可以使用包含蛇毒、蜂毒、激素、精液(用于避孕)，變應(yīng)原引發(fā)的抗原或免疫應(yīng)答所需其它抗原外源蛋白質(zhì)等的表位或蛋白質(zhì)的。在另一實(shí)施例中，腫瘤-特異性抗原可以重組外源蛋白質(zhì)的形式表達(dá)，以引發(fā)對(duì)癌癥的保護(hù)性或治療性免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的由重組病毒表達(dá)的可編碼外源蛋白質(zhì)的基因序列，可用本領(lǐng)域已知的方法獲得，包括(但不限制于)化學(xué)或酶促合成法、從微生物的基因組DNA純化法，從可編碼TAA的cDNA純化或分離法，從微生物的RNA進(jìn)行cDNA合成法，或重組DNA法(Maniatis等人，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，1982，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
當(dāng)用作疫苗時(shí)，可用已知的方法將本發(fā)明的重組黃病毒施用于個(gè)體。通常采用與常規(guī)(目前可得的)疫苗相同的施用途徑和/或模擬相關(guān)的病原體發(fā)生感染的路徑施用這些疫苗。可以采用疫苗組合物的形式給予其中除有復(fù)制流行性重組病毒以外，還可包括生理學(xué)方面可接受的載體。這種組合物還可包括免疫發(fā)因子或佐劑、矯味劑或穩(wěn)定劑。
給藥的常規(guī)和藥學(xué)上可接受的途徑包括鼻內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、經(jīng)陰道、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)口服或其它腸胃外給藥途徑。如果需要可以組合給藥途徑，或按抗原肽或疾病情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。疫苗組合物可以單劑量或多劑量給予，且可以包括給予加強(qiáng)劑量以引發(fā)和/或維持免疫力。
應(yīng)以“有效量”給予重組黃病毒疫苗，即重組黃病毒的量在所選用的給藥路徑中足以引發(fā)免疫應(yīng)答，能有效地促使保護(hù)宿主抵抗病原性生物感染或與病原性生物感染相關(guān)的癥狀。在有些實(shí)施例中，“有效量”的重組黃病毒疫苗是指重組黃病毒的量在給藥的路徑中能足以引發(fā)免疫應(yīng)答，以有效地降低或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、減少腫瘤細(xì)胞的質(zhì)量或腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，或降低腫瘤形成的可能性。
在各疫苗劑份中所選用的重組黃病毒的量，是按可引發(fā)免疫保護(hù)性或其它免疫治療性應(yīng)答而無(wú)明顯的通常與常用的疫苗相關(guān)的副作用的量而定。該用量的變動(dòng)是根據(jù)所用的特定免疫原；疫苗制劑中是否包括佐劑；和各種宿主一依賴性因素。通常期望的是在感染宿主細(xì)胞后，各劑份的疫苗足以產(chǎn)生約1-1000μg蛋白質(zhì)，通常為1-200μg，一般為10-100μg。以重組黃病毒核酸為基礎(chǔ)的疫苗的有效劑量，通常包括給予約1-1000μg核酸。另外，重組黃病毒疫苗的有效劑量的一般范圍為約102-107，103-106或104-105空斑形成單位(PFU)?？捎冒ㄓ^察對(duì)象中的抗體滴定度和其它反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法來(lái)確定具體疫苗的最佳用量可通過(guò)。監(jiān)控疫苗提供的免疫力水平來(lái)確定是否需要增強(qiáng)劑量。在評(píng)估了血清中的抗體滴定度后，可能需要選用增強(qiáng)劑量免疫接種。施用佐劑和/或免疫刺激劑就可提高對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的重組黃病毒還可用在宿主細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物，尤其是人)或其它類型細(xì)胞中形成可產(chǎn)生外源多肽的系統(tǒng)。然后可來(lái)用各種標(biāo)準(zhǔn)方法分離該外源蛋白質(zhì)。
在兩種用途(即免疫接種或組織培養(yǎng)生產(chǎn))中，引入到黃病毒中的外源核酸序列可以從其天然形成的來(lái)源獲得，或是用基因工程方法生產(chǎn)，或是用化學(xué)法或酶促法進(jìn)行合成。引入到病毒中的外源核酸序列可以編碼免疫應(yīng)答所需的完整抗原或抗原性表位或其部分，如約4-1000、10-500、15-250、20-100、25-50個(gè)氨基酸的免疫原性片段。期望插入的序列存在于宿主的免疫系統(tǒng)(抗原性結(jié)構(gòu)由主序列和結(jié)構(gòu)形態(tài)兩者來(lái)確定)中。
包含本發(fā)明的重組黃病毒的各種組合物本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的重組黃病毒的各種組合物(包括藥用組合物)。
包含本發(fā)明的重組黃病毒的各種組合物可以包含按重組黃病毒的實(shí)際用途所選用的緩沖劑；還可包含適用于預(yù)定用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員都善于選擇的緩沖劑，本領(lǐng)域已知有多種緩沖劑適用于預(yù)定用途。在有些實(shí)例中，該組合物可含有藥學(xué)上可接受的賦形劑，本領(lǐng)域已知有多種而無(wú)需在此詳細(xì)討論。藥學(xué)上可接受的各種賦形劑在多種出版物已有詳述，包括如“Remington藥學(xué)和藥學(xué)實(shí)踐”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可將藥用組合物制備成各種劑型，如粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、懸浮液、噴霧、栓劑、透皮藥物(如貼片等)、油膏、洗劑等。適用于口服或局部使用的藥用級(jí)別的有機(jī)或無(wú)機(jī)載體和/或稀釋劑，可用于配制包含治療活性化合物的各種組合物。本領(lǐng)域已知的稀釋劑包括水性介質(zhì)、植物性和動(dòng)物性油和脂肪。還可用穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和乳化劑、改變滲透壓的鹽類或維持合適pH值的各種緩沖劑、和皮膚滲透增強(qiáng)劑等作為輔助性材料。
當(dāng)用作疫苗時(shí)，本發(fā)明的重組黃病毒可采用各種方法進(jìn)行配制。通常，按本領(lǐng)域熟知的各種方法，用合適的藥用載體和/或運(yùn)載體配制本發(fā)明的疫苗。合適的載體是無(wú)菌鹽水。為此也可使用其它水性和非水性等滲無(wú)菌注射液以及水性和非水性無(wú)菌懸浮液(已知都是藥學(xué)上可接受的載體，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的)。
另外，本發(fā)明的疫苗組合物的配制還可含有其它成分，包括如佐劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等。這些成分是疫苗領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。佐劑類包括(但不限制于)鋁鹽佐劑(Nickals(1992)Res.Immunol.143489-493)；皂苷佐劑；Ribi佐劑(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；MontanideISA佐劑(Seppic，Paris，F(xiàn)rance)；Hunter’s TiterMax佐劑(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐劑(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)；和硝化纖維(Nilsson和Larsson(1992)Res.Immunol.143553-557)。另外，在制劑中也可包含調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的其它成分，包括(但不限制于)各種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素；各種集落-刺激因子(如GM-CSF，CSF等)；和腫瘤壞死因子。
本發(fā)明的重組黃病毒的使用方法本發(fā)明提供了可引發(fā)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的各種方法，該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象施用本發(fā)明的重組黃病毒，其中黃病毒進(jìn)入細(xì)胞，由蛋白水解切割釋放外源多肽，并對(duì)此外源多肽引發(fā)免疫應(yīng)答。
在一些實(shí)施例中，如本文所述將在特定腫瘤細(xì)胞(如腫瘤相關(guān)性抗原，“TAA”)上表達(dá)的多肽抗原插入到本發(fā)明的重組黃病毒中。這種重組黃病毒就適用于患有或懷疑患有腫瘤的個(gè)體。有時(shí)，可將這種重組黃病毒給予未患腫瘤但希望獲得保護(hù)性免疫力個(gè)體。免疫系統(tǒng)往往不會(huì)提高有效抑制或壓制腫瘤生長(zhǎng)或完全消除腫瘤的免疫應(yīng)答。腫瘤相關(guān)性抗原的免疫原性通常很弱，也許是由于有活動(dòng)性和進(jìn)行中的免疫抑制過(guò)程在起作用。另外，癌癥患者都具有被免疫抑制的傾向，且僅對(duì)某些T-依賴性抗原有應(yīng)答。在這種情況下，在宿主中引入本發(fā)明的重組黃病毒(可表達(dá)與腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的抗原相應(yīng)的外源肽)，可以在宿主中引發(fā)對(duì)腫瘤的免疫抑制作用。如一些實(shí)施例所示，在小鼠中引入含有可編碼序列SIINFEKL(“Ova”)(SEQ ID NO1)的插入片段的重組YFV，當(dāng)與I類MHC分子一起在細(xì)胞表面上存在時(shí)，可特異性地由CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識(shí)別。隨后當(dāng)用在其表面上表達(dá)Ova的腫瘤攻擊小鼠時(shí)，就可產(chǎn)生對(duì)腫瘤的強(qiáng)CTL應(yīng)答。
可將任何已知的腫瘤相關(guān)性抗原(TAA)插入到本發(fā)明的黃病毒中?？梢?但并非必須)插入完整的TAA。也可插入一部分TAA(如用其表位)，尤其是可由CTL識(shí)別的表位?？刹迦氲近S病毒的腫瘤相關(guān)性抗原(或其含有表位的片段)包括(但不限制于)MAGE-2、MAGE-3、MUC-1、MUC-2、HER-2、大分子量的黑色素瘤-相關(guān)性抗原MAA、GD2、癌胚抗原(CEA)、TAG-72、卵巢相關(guān)性抗原OV-TL3和MOV18、TUAN、甲胎蛋白(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、腎腫瘤相關(guān)性抗原G250、EGP-40(也稱為EpCAM)、S100(惡性黑色素瘤相關(guān)性抗原)、p53、前列腺腫瘤相關(guān)性抗原(如PSA和PSMA)和p21ras。
如上所述，可將包含TAA的重組黃病毒給予個(gè)體。是否針對(duì)特定的腫瘤引發(fā)的免疫應(yīng)答可由本領(lǐng)域的各種標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定，這些方法包括(但不限制于)測(cè)定從個(gè)體取得的生物樣品中TAA-特異性抗體情況存在和/或其含量，如通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)、放射免疫試驗(yàn)法(RIA)等；測(cè)定CTL特異性在TAA是否存在和/或其含量；等。關(guān)于測(cè)定是否存在CTL特異性TAA和/或其含量的實(shí)施例可見(jiàn)本文以下的實(shí)施例部分?？梢允褂每蓮母鞣N課本中檢索的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方案，其中包括如“免疫學(xué)現(xiàn)代記錄”(J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober編輯，1991)。
在其它一些實(shí)施例中，外源多肽是微生物病原體的抗原性多肽。然后可將這種重組黃病毒施予宿主，以預(yù)防或治療由該病原體引起的感染，或者預(yù)防或治療由這種病原性感染引起的癥狀。特別值得關(guān)注的是，預(yù)防或治療在感染過(guò)程中由細(xì)胞內(nèi)存在的微生物病原體(例如，病毒(如HIV)、細(xì)菌(如志賀氏菌、利斯特氏菌等)、寄生蟲(如瘧原蟲(如惡性瘧疾(Falciparum)、錐蟲等)等導(dǎo)致的感染或疾病的預(yù)防和治療。這些微生物病原體的抗原性多肽是本領(lǐng)域已熟知的，且易于由普通技術(shù)人員選擇用于本發(fā)明的重組黃病毒疫苗。
另外，本發(fā)明的重組黃病毒可用作發(fā)送載體，將任何抗原送遞給個(gè)體，以引發(fā)對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的重組黃病毒可用作雙價(jià)或多價(jià)疫苗，來(lái)治療由感染性病原體(尤其是病毒、細(xì)菌和寄生蟲)引起的人或動(dòng)物的疾病。在本發(fā)明的一種多價(jià)黃病毒疫苗中可向宿主送遞的表位的例子包括B類鏈球菌的各種血清型的多種表位；流感病毒的多種表位；輪狀病毒的多種表位，和已知天然以多形式或血清型存在的其它病原性微生物；兩種或多種不同病原性微生物的表位等。
用已知的各種方法可以(定量地，如通過(guò)測(cè)定參數(shù)；或定性地，如通過(guò)評(píng)估癥狀的嚴(yán)重程度，或通過(guò)檢測(cè)定特定參數(shù)的存在與否)確定是否引發(fā)了對(duì)病原性微生物的免疫應(yīng)答。測(cè)定免疫應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)，檢測(cè)和/或測(cè)定特定病原性生物的特異性抗體；在活體外測(cè)定細(xì)胞免疫應(yīng)答(如，用細(xì)胞表面上表達(dá)表位的標(biāo)記的、失活的細(xì)胞與I類MHC分子進(jìn)行的CTL)試驗(yàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用各種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，如測(cè)定宿主中病原性生物的數(shù)量(如測(cè)定病毒量等)、測(cè)定宿主中存在的病原性生物所引起的癥狀(如體溫、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)等)，輕易地確定免疫應(yīng)答是否能有效地促進(jìn)保護(hù)宿主抵抗由病原性生物引起的感染或與感染相關(guān)的癥狀。
免疫應(yīng)答是否能有效減少個(gè)體中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，可由各種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法來(lái)確定，包括(但不限制于)測(cè)定個(gè)體中腫瘤細(xì)胞的質(zhì)量、測(cè)定個(gè)體中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，和測(cè)定腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在以下的實(shí)施例部分描述了這些測(cè)定法。
用本文在主題發(fā)明方面所述的各種方法和組合物，可在易受微生物病原體感染的任何對(duì)象，人或其他動(dòng)物中引發(fā)對(duì)微生物感染的免疫防護(hù)性應(yīng)答。當(dāng)重組黃病毒含有可編碼TAA的外源核酸序列時(shí)，對(duì)象可以是已知患有癌癥的、懷疑患有癌癥的，或未患癌癥但可引發(fā)對(duì)癌癥免疫的對(duì)象。
實(shí)施例現(xiàn)列述以下一些實(shí)施例為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供完全公開(kāi)描述如何制備和使用本發(fā)明，但并不限制發(fā)明人對(duì)其發(fā)明所認(rèn)定的范圍，他們也并無(wú)意于認(rèn)為以下的試驗(yàn)是所有或僅有的已完成的試驗(yàn)。已盡量確保所用數(shù)據(jù)(如數(shù)量、溫度等)的精確性，但也考慮到了一些試驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差。除非特別指出，部份是以重量表示，分子量是指平均分子質(zhì)量，溫度為攝氏度，壓力為或接近大氣壓。
實(shí)施例1制備重組黃熱病病毒材料和方法質(zhì)粒和PCR片段由Dr.Charles Rice提供可編碼完整YFV-17D序列的質(zhì)粒pYF5’3’和pYFM5.2。用在活體外連接的方法用這些質(zhì)粒產(chǎn)生全長(zhǎng)的病毒RNA(20)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，我們插入一個(gè)PCR產(chǎn)生的DNA片段，可編碼側(cè)接BssHII和BstEII或ClaI和NdeI限制酶位點(diǎn)的小雞卵清蛋白的13氨基酸肽，然后再側(cè)接病毒性肽酶(NS2B-NS3復(fù)合物)識(shí)別位點(diǎn)。我們將該片段插入如下的病毒的各cDNA位點(diǎn)病毒多肽的N末端，或蛋白質(zhì)C-prM、NS2A-NS2B、NS2B-NS3、NS3-NS4A和NS4A-NS4B之間。為了在基因組的結(jié)構(gòu)區(qū)域插入各外源序列，將包含各該外源序列的PCR片段在不同位置克隆入質(zhì)粒p5’3’。為了在基因組的非結(jié)構(gòu)部分產(chǎn)生各重組體，產(chǎn)生了相應(yīng)于pyFM5.2的各YFV序列且含有相關(guān)的各插入序列的各種8kb PCR片段。用這些PCR片段作為以下所述的在活體外連接反應(yīng)中的質(zhì)粒pYFM5.2的各替代物。
從質(zhì)粒產(chǎn)生病毒用與Rice及其合作者最初發(fā)表的方法相類似的方法，生產(chǎn)YFV-17D分子克隆體(20)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用限制酶Aat II和Apa I消化各5μg質(zhì)粒(或用PCR產(chǎn)生的相應(yīng)的各種序列)。消化處理后，用低熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠電泳純化含有病毒基因組的5’和3’端的質(zhì)粒和相應(yīng)于中間區(qū)域的YFM5.2的片段，并在16℃用分級(jí)的等摩爾濃度處理4小時(shí)進(jìn)行連接。在60℃培養(yǎng)20分鐘使連接酶失活。用Xho I消化處理連接的DNA，在m7GpppAmp(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)存在時(shí)，用作SP 6 RNA聚合酶(Promega，Madison，WI)的活體外轉(zhuǎn)錄的模板。無(wú)需進(jìn)一步純化處理，就可通過(guò)電穿孔(BTX電動(dòng)細(xì)胞操作器600，San Diego，CA)將合成的RNA轉(zhuǎn)染入BHK-21細(xì)胞。
病毒原液在轉(zhuǎn)染后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)3-5天。從BHK-21細(xì)胞產(chǎn)生的各空斑分別克隆出病毒。病毒原液的制備，將克隆的病毒在SW13細(xì)胞中繁殖；澄清受感染細(xì)胞的上清液，等分樣品、滴定并存儲(chǔ)于-70℃。
單步生長(zhǎng)曲線用PBS沖洗接近融合狀態(tài)的SW13細(xì)胞單層1次，以5pfu/細(xì)胞的感染量重復(fù)感染。在37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，用PBS沖洗細(xì)胞2次，然后用補(bǔ)充有10％FCS的L-15培養(yǎng)基覆蓋。在37℃培養(yǎng)這些感染的細(xì)胞培養(yǎng)物若干天，每6小時(shí)回收100μl份，共6天或直到充分發(fā)生CPE。用空斑試驗(yàn)法確定滴定度。
用RT-PCR法分析病毒RNA在SW13細(xì)胞上數(shù)次傳代繁殖重組病毒后，按(21)的方法從感染的細(xì)胞獲得全部胞質(zhì)RNA。使用隨機(jī)的各種六聚物和特異性引物(ATCGCGGACCGAGTGGTTTTGTGTTTGTCATCCAAAGGTCTGCT TATTCTTGAGC(SEQ IDNO2))并按照制造商的推薦流程，用Superscript(Dibco-BRL)進(jìn)行逆向轉(zhuǎn)錄。在42℃培養(yǎng)1小時(shí)后，將2μl各反應(yīng)產(chǎn)物用作PCR反應(yīng)的模板，其中使用RtTH(Perkin-Elmer)和側(cè)接于待研究的序列(CAATGAGGCACTCGCAGCAGCTGG(SEQID NO3)和TGCCCTAGCTCTGT GCGCTGCCCYF-pOva-8(SEQ ID NO4))的特異性引物。用限制酶消化處理和/或DNA測(cè)序來(lái)分析擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。
結(jié)果表達(dá)小雞卵清蛋白T-細(xì)胞表位的YFV17D重組體的制備將各外源序列(側(cè)接蛋白酶識(shí)別位點(diǎn))插入到Y(jié)F多蛋白前體中不同位置上的結(jié)構(gòu)內(nèi)。病毒蛋白酶就可據(jù)以識(shí)別和切割側(cè)接的各蛋白水解位點(diǎn)，從剩余的YF多蛋白游離出各外源抗原性序列，以正確地產(chǎn)生所有YF蛋白質(zhì)，使病毒復(fù)制正常進(jìn)行(圖1)。在病毒基因組的一些位點(diǎn)上，我們引入了可編碼小雞卵清蛋白CTL表位的各序列，隨后引入了病毒蛋白酶NS2B/NS3的8個(gè)氨基酸切割位點(diǎn)(圖1)。插入的片段可編碼限制小鼠I類MHC分子H-2Kb的氨基酸序列SIINFEKL(SEQ ID NO1)表位(25)。
用在活體外合成的RNA轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞而回收重組活黃熱病病毒。在基因組的3個(gè)位點(diǎn)插入各外源序列可得到活的重組病毒其氨基末端C-prM和NS2B-NS3相銜接(將得到的病毒分別命名為YF-pOva-1、YF-pOva-2和YF-pOva-8)。從各空斑分離出病毒，并在SW13細(xì)胞中連續(xù)傳代繁殖2次以制備病毒原液。
在另一系列試驗(yàn)中，用如上所述各種方法，引入若干不同的抗原。用于制備重組黃病毒的那些序列都是從流感病毒衍生的序列(如流感病毒核蛋白的片段，如來(lái)自毒株N1H1的NP147-155)；呼吸道合胞體病毒(RSV，A毒株)的G蛋白質(zhì)(144-159)；以及人和小鼠的黑色素瘤的腫瘤相關(guān)性抗原(如TRP)。
各項(xiàng)空斑試驗(yàn)和單步生長(zhǎng)曲線顯示重組體YF-pOva-1、YF-pOva-2和YF-pOva-8以及所有攜帶其它外源抗原(如流感、RSV或黑色素瘤抗原)的病毒重組體，以與親代17D毒株十分類似的速度復(fù)制(圖2)。重組體YF-pOva-8和所有經(jīng)測(cè)試的在基因組位點(diǎn)帶有插入序列的其他重組體都以與17D相同的動(dòng)力學(xué)復(fù)制，并達(dá)到相同的滴定度。重組體YF-pOva-1和YF-pOva-2的復(fù)制比親代17D慢，顯示出復(fù)制過(guò)程滯后，且在感染后3天滴定度僅為17D的10-20％(圖2)。從YF-pOva-8較好的復(fù)制特性來(lái)看，此重組體可用于所有以后的研究，以對(duì)黃熱病載體的免疫原性進(jìn)一步鑒定。
已報(bào)道了一些正鏈病毒載體的遺傳穩(wěn)定性問(wèn)題(26，27)。因此，用我們?cè)\斷限制酶消化的RT-PCR法和擴(kuò)增片段的編序法驗(yàn)證了存在的插入片段。在BHK-21細(xì)胞傳代6次后依舊保留著YF-pOva-8的原初遺傳結(jié)構(gòu)。因此，可以在黃熱病病毒基因組的NS2B和NS3編碼序列中引入各種外源肽，而不會(huì)過(guò)于危及病毒的復(fù)制。
實(shí)施例2用YF-pOva-8感染的細(xì)胞以I類MHC限制的形式表現(xiàn)Ova-肽SIINFEKL材料和方法細(xì)胞系除已描述過(guò)的BHK-21和SW13細(xì)胞以外，將以下各細(xì)胞系用于抗原表現(xiàn)試驗(yàn)或腫瘤排斥攻擊處理B3Z(T-細(xì)胞雜交瘤)、EL-4(胸腺瘤)和EL4-SL8細(xì)胞。承Nilabh Shastri，University of California，Berkeley惠予提供B3Z細(xì)胞和EL4-SL8。EL4-SL8細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)并呈現(xiàn)Ova CTL表位(SIINFEKL(SEQ ID NO1))。B3Z是對(duì)Kb+SIINFEKL(SEQ ID NO1)特異性的小鼠T細(xì)胞雜交瘤，是在IL-2增強(qiáng)子元件的轉(zhuǎn)錄控制下已有LacZ報(bào)道基因轉(zhuǎn)染。因此，易由β-半乳糖苷酶的表達(dá)檢測(cè)B3Z細(xì)胞的活化(22)。C57BL/6衍生的黑色素瘤B16FO和B16-OVA是由Kenneth Rock，University of Massachusetts的惠贈(zèng)。B16-Ova(Mo5.20.10)是穩(wěn)定表達(dá)由質(zhì)粒pAc-neo-Ova轉(zhuǎn)染B16FO而構(gòu)建的卵清蛋白的細(xì)胞系。
抗原傳遞試驗(yàn)以10pfu/細(xì)胞，在MOI用YF-17D和重組病毒模擬感染或感染EL4細(xì)胞。在37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，將感染的細(xì)胞或相同數(shù)量的B16-Ova對(duì)照細(xì)胞與5×104個(gè)B3Z細(xì)胞在37℃共培養(yǎng)16小時(shí)。為了確定β-半乳糖苷酶的表達(dá)，用PBS沖洗培養(yǎng)物，然后用1％甲醛/0.2％戊二醛在4℃固定5分鐘。再次沖洗這些細(xì)胞，用由1mg/ml X-Gal、5mM亞鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化鉀和2mM MgCl2構(gòu)成的PBS溶液培養(yǎng)。然后在37℃培養(yǎng)過(guò)夜，在顯微鏡下檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性的存在(藍(lán)色細(xì)胞)。
結(jié)果用YF-pOva-8感染的細(xì)胞以I類MHC限制方式表現(xiàn)Ova-肽SIINFEKL為了確定用重組黃熱病病毒感染的細(xì)胞是否能以I類MHC限制方式表達(dá)和傳遞表現(xiàn)各種抗原，我們用YF-pOva-8感染EL4細(xì)胞，并將感染的細(xì)胞與(識(shí)別在I類KbMHC分子中存在的SIINFEKL的T細(xì)胞一起共培養(yǎng)?？乖畛踉谑芨腥炯?xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，但它會(huì)通過(guò)I類MHC途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面并在其上表現(xiàn)。我們使用攜帶受白細(xì)胞介素-2增強(qiáng)劑元件NF-AT轉(zhuǎn)錄控制的lacZ報(bào)道基因的T-細(xì)胞雜交瘤B3Z(22)。因此，通過(guò)β-半乳糖苷酶活性的產(chǎn)生就可測(cè)定B3Z細(xì)胞的TCR-特異性激發(fā)作用。
在共培養(yǎng)12-16小時(shí)后，被YF-pOva-8感染的EL4細(xì)胞就可活化10％雜交瘤T細(xì)胞。相反，與未感染的EL4細(xì)胞共培養(yǎng)的雜交瘤B3Z或單獨(dú)培養(yǎng)的雜交瘤B3Z則沒(méi)有產(chǎn)生β-半乳糖苷酶活性。與穩(wěn)定表達(dá)卵清蛋白的細(xì)胞系共培養(yǎng)可強(qiáng)烈引發(fā)β-半乳糖苷酶的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，以I類MHC限制方式加工并表現(xiàn)的黃熱病病毒重組體可表達(dá)各種多肽。另外，用抗病毒蛋白質(zhì)的Western印跡法表明，所有黃熱病病毒蛋白質(zhì)在YF-pOva-8感染的細(xì)胞中都可正確產(chǎn)生和加工的情況，提示從病毒多蛋白上已適當(dāng)?shù)厍谐送庠纯乖?br>
實(shí)施例3用重組YF-pOva-8誘導(dǎo)Ova-特異性CD8+T細(xì)胞材料和方法CD8+T細(xì)胞應(yīng)答免疫處理。以107pfu/小鼠的劑量，用YFV 17D或重組病毒YF-pOva-8模擬感染或免疫接種(靜脈內(nèi))若干3只一組的C57BL/6小鼠。在感染后第21天，用相同的劑量腹腔內(nèi)給所有組加接種。7天后，處死所有小鼠，取出它們的脾，并制成單細(xì)胞懸浮液。
激發(fā)作用和四聚體結(jié)合試驗(yàn)將3×106個(gè)脾細(xì)胞與經(jīng)6000拉得(rads)處理的105個(gè)表達(dá)SIINFEKL的FL4細(xì)胞共培養(yǎng)4天，進(jìn)行再次激發(fā)。I類SIINFEKL-MHC四聚體承蒙John Altman博士(Emory University，Atlanta，GA)惠贈(zèng)。在第4天，按Atman等人(23)提供的方法染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
免疫接種和腫瘤攻擊從Jackson實(shí)驗(yàn)室購(gòu)得C57BL/6小鼠(H-2b)，并在6-8周齡使用。用3×105pfu/小鼠劑量的YF 17D或YF-pOva-8(表達(dá)Ova的17D重組病毒)腹腔內(nèi)(i.p.)、皮下(s.c.)、肌內(nèi)(i.m.)或靜脈內(nèi)(i.v.)免疫接種小鼠，每組5-10只小鼠。2周后用相同的劑量給所有各組加強(qiáng)接種。將未免疫接種的小鼠作為空白對(duì)照。在無(wú)Ca++、Mg++的PBS中培養(yǎng)5分鐘，回收黑色素瘤細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，并在感染30天后，s.c.注射5×104B16-OVA或B16F0黑色素瘤細(xì)胞攻擊所有小鼠。每周2次測(cè)定腫瘤的尺寸，并以相應(yīng)于最大垂直直徑的腫瘤面積表示(cm2)。將腫瘤發(fā)育大于2.0cm2的動(dòng)物處死。
實(shí)體瘤的免疫治療用5×104B16-OVA細(xì)胞s.c.注射小鼠。在腫瘤移植后第0、5或10天開(kāi)始治療，包括3次s.c.注射4×105pfu YF-pOVA-8或17D(間隔為5天)。而對(duì)照組不進(jìn)行治療。每3天觀察小鼠腫瘤的發(fā)展，將大于0.3cm2的腫瘤計(jì)為陽(yáng)性。
試驗(yàn)性肺部轉(zhuǎn)移的免疫治療用5×104或1×105B16-OVA細(xì)胞i.v.注射小鼠。如對(duì)實(shí)體瘤所述進(jìn)行免疫治療。在第30天，處死各組10只小鼠，然后取出肺，置于3％H2O2的H2O中5分鐘，然后在Bouin溶液(Sigmadiagnostics，St.Louis，MO，USA)中固定。H2O2處理通過(guò)膨脹肺和漂白溢血而有利于在解剖顯微鏡下對(duì)癌轉(zhuǎn)移的分析，否則會(huì)錯(cuò)誤判斷成癌轉(zhuǎn)移。
結(jié)果為了確定重組黃熱病病毒是否能引發(fā)特異性CD8+T-淋巴細(xì)胞，用YF-pOva-8、親代YF-17D或PBS(空白)接種小鼠。用從免疫接種的小鼠取出的脾細(xì)胞監(jiān)測(cè)結(jié)合MHC I類SIINFEKL四聚物體的CD8+T-淋巴細(xì)胞群(圖3A-3C)?？瞻捉M小鼠或用YF-17D免疫接種的小鼠的脾細(xì)胞都不能產(chǎn)生SIINFEKL特異性T細(xì)胞。經(jīng)用YF-pOva-8免疫的小鼠的新鮮分離的脾細(xì)胞和在活體外激發(fā)的脾細(xì)胞制定四聚物結(jié)合情況。新鮮分離的淋巴細(xì)胞顯示在一次接種(0.5％CD8+T細(xì)胞)后四聚物結(jié)合最少。然而，經(jīng)在活體外激發(fā)后，從YF-pOva-8免疫接種的小鼠得到CD8+T細(xì)胞有明顯的百分比(8.75％)對(duì)SIINFEKL具有特異性。
活體內(nèi)的保護(hù)性免疫為了評(píng)估載體是否引發(fā)保護(hù)性CTL免疫力，我們使用了已確立的腫瘤模型，在其中CTL對(duì)于保護(hù)宿主免受致命劑量的惡性黑色素瘤細(xì)胞的攻擊起著關(guān)鍵性作用(1)。用YF-pOva-8或YF-17D免疫接種小鼠2次，30天后用黑色素瘤衍生的C57BL/6中的一種進(jìn)行攻擊親代B16-F0腫瘤細(xì)胞系或穩(wěn)定表達(dá)小雞卵清蛋白的B16-Ova。用B16-Ova細(xì)胞或親代B16-F0黑色素瘤細(xì)胞皮下接種的空白組小鼠以類似的動(dòng)力學(xué)生長(zhǎng)了腫瘤，并在數(shù)周內(nèi)殺死空白組動(dòng)物(圖4A-4D和5A-5D，僅顯示了B16-Ova的數(shù)據(jù))。用YF-pOva-8免疫接種，保護(hù)動(dòng)物抵抗B16-Ova的攻擊(其劑量為L(zhǎng)D50的10倍)。免疫接種保護(hù)的小鼠不會(huì)局部生長(zhǎng)腫瘤(圖4A-4D)也不會(huì)死亡(圖5A-D)。
我們用四種不同的路徑-皮下(s.c.)、肌內(nèi)(i.m.)、腹腔內(nèi)(i.p.)和靜脈內(nèi)(i.v.)施用重組YF-pOva-8，以比較它們的保護(hù)性免疫應(yīng)答的效力。皮下和靜脈內(nèi)接種可引發(fā)強(qiáng)力的應(yīng)答。所有用YF-pOva-8免疫接種的動(dòng)物都受到了保護(hù)，而對(duì)照小鼠則100％死亡。腹腔內(nèi)和肌內(nèi)接種的效力略低，在這些組中10-20％小鼠生長(zhǎng)了腫瘤而死亡。疫苗的效力對(duì)SIINFEKL是特異性的，因?yàn)橛肶F-pOva-8免疫接種的小鼠對(duì)于親代其不表達(dá)Ova的B16黑色素瘤細(xì)胞的攻擊未能保護(hù)。然而，我們觀察到當(dāng)腹腔內(nèi)、皮下或肌內(nèi)施用病毒時(shí)，用YF-17D免疫接種的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有略微的滯后，雖然不很明顯。這種效力可能是由于由黃熱病病毒復(fù)制引發(fā)的細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加或其它免疫應(yīng)答所造成的。這與文獻(xiàn)并非不一致，因?yàn)檫^(guò)去曾顯示，IFN-γ和IFN-α在B16黑色素瘤細(xì)胞上有抗腫瘤和抗細(xì)胞活性(28-30)。
對(duì)已形成的腫瘤的有效免疫治療其次，我們確定了用YF重組體免疫接種是否能引發(fā)使已形成的腫瘤消退。用5×103或5×104B16-Ova腫瘤細(xì)胞皮下接種小鼠，然后在移植腫瘤的當(dāng)天(第0天)、移植腫瘤后的第5天(第5天)或移植腫瘤后第10天(第10天)，用YF-pOva-8感染。接種數(shù)量較少的B16-Ova腫瘤細(xì)胞(5×103)的小鼠，即使腫瘤是在移植腫瘤后第10天開(kāi)始治療，瘤約為未接受疫苗的小鼠約有60％生成的腫而經(jīng)免疫接種后則完全受到保護(hù)(圖6A-6F)。用較高劑量腫瘤細(xì)胞(5×104)接種的動(dòng)物，在第0天用YF-pOva-8免疫接種的動(dòng)物有80％在移植腫瘤后的45天依舊未生腫瘤，而注射親代YF-17D或鹽水的動(dòng)物則長(zhǎng)出腫瘤并在3-4周內(nèi)死亡(圖6A-6F)。與鹽水相比，用YF-17D免疫接種略可延緩腫瘤的生長(zhǎng)，但其效果極小，且90％動(dòng)物在移植腫瘤后30天長(zhǎng)出腫瘤。在移植腫瘤后5天用重組YF-pOva-8免疫接種，起到部分保護(hù)作用(60％小鼠保持未患腫瘤)。在第10天免疫接種對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)僅有極小或沒(méi)有作用。這些結(jié)果表明，用黃熱病病毒重組體施行免疫接種，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)已形成的腫瘤的治療。
肺部轉(zhuǎn)移的有效免疫治療當(dāng)注射入同系小鼠的尾靜脈時(shí)，B16黑色素瘤細(xì)胞可再生地轉(zhuǎn)移到肺(31)。這就提供了一種模型來(lái)評(píng)估黃熱病病毒重組體是否能引發(fā)有效的抗癌轉(zhuǎn)移的應(yīng)答。用5×104或1×105B16-Ova細(xì)胞靜脈內(nèi)接種小鼠，在動(dòng)物移植腫瘤后第0、5或10天，皮下免疫接種YF-pOva-8或?qū)φ詹《?。用載體治療可防止死亡(圖9A-9B)，且基本減少肺部轉(zhuǎn)移的大小和數(shù)量(圖7和8)。在用5×104細(xì)胞移植腫瘤后10周，在第0天免疫接種的動(dòng)物100％健康(圖9A-9B)。而當(dāng)免疫接種是在第5天進(jìn)行時(shí)，保護(hù)率下降至80％，若在第10天免疫接種則對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效果進(jìn)一步降至20％。用YF-17D接種則毫無(wú)保護(hù)效果，且轉(zhuǎn)移以與用鹽水接種動(dòng)物相同的動(dòng)力學(xué)而發(fā)展(圖7和8)。當(dāng)用1×105腫瘤細(xì)胞接種小鼠時(shí)，在第0天接受治療的小鼠僅有40％受到保護(hù)。這些結(jié)果更強(qiáng)調(diào)了，在低腫瘤負(fù)荷量時(shí)開(kāi)始免疫治療的重要性。盡管如此，這些結(jié)果還是顯示，表達(dá)單種抗原性表位的重組黃熱病病毒能在小鼠中引發(fā)治療性抗腫瘤應(yīng)答。
雖然本發(fā)明已參考上述各具體實(shí)例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)精神和范圍時(shí)，還存在著各種改變和相當(dāng)?shù)膯?wèn)題。另外，根據(jù)具體的情況、材料、組合物、加工、加工步驟、本發(fā)明的精神和范圍等還要作出有許多改進(jìn)。所有這類改進(jìn)都應(yīng)當(dāng)受限于本文附帶的權(quán)利要求書。
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1.一種包含插入到親代黃病毒中的外源核酸的具有復(fù)制能力的重組黃病毒，所述的外源核酸含有編碼外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的重組黃病毒編碼重組多蛋白前體，該重組多蛋白前體包括所述的外源多肽，且通過(guò)蛋白酶解加工從該重組多蛋白前體釋放出該外源多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的重組黃病毒，其特征在于，所述的外源多肽是與腫瘤相關(guān)性抗原。
3.如權(quán)利要求1所述的重組黃病毒，其特征在于，所述的外源多肽是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別的表位。
4.如權(quán)利要求1所述的重組黃病毒，其特征在于，所述的外源多肽是細(xì)菌性、病毒性、真菌性或寄生蟲性抗原。
5.如權(quán)利要求1所述的重組黃病毒，其特征在于，所述的親代黃病毒是黃熱病病毒。
6.一種含有插入到親代黃病毒的外源核酸的重組黃病毒，且所述的外源核酸含有編碼外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的外源核酸與編碼蛋白酶解切割位點(diǎn)的核苷酸序列側(cè)接。
7.一種在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述的方法包括給予宿主含有插入到親代黃病毒的外源核酸的重組黃病毒，所述的外源核酸包含編碼外源多肽的核苷酸序列，所述的重組黃病毒編碼重組多蛋白前體，所述的重組多蛋白前體包含所述的外源多肽，且通過(guò)蛋白酶解加工從所述的重組多蛋白前體釋放出該外源多肽。
8.一種在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述的方法包括給予宿主含有插入到親代黃病毒的外源核酸的重組黃病毒，所述的外源核酸包含編碼外源多肽的核苷酸序列，所述的外源核酸與編碼蛋白酶解切割位點(diǎn)的核苷酸序列側(cè)接。
9.一種減少宿主中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述的方法包括給予宿主含有插入到親代黃病毒的外源核酸的重組黃病毒，所述的外源核酸包含編碼腫瘤相關(guān)性抗原的核苷酸序列，所述的重組黃病毒編碼重組多蛋白前體，所述的重組多蛋白前體包含所述的腫瘤相關(guān)性抗原，且通過(guò)蛋白酶解加工從所述的重組多蛋白前體釋放出該腫瘤相關(guān)性抗原。
10.一種減少宿主中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述的方法包括給予宿主含有插入到親代黃病毒的外源核酸的重組黃病毒，所述的外源核酸包含編碼腫瘤相關(guān)性抗原的核苷酸序列，所述的外源核酸與編碼蛋白酶解切割位點(diǎn)的核苷酸序列側(cè)接。
11.含有權(quán)利要求1或6所述的重組黃病毒的組合物。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有藥學(xué)上的賦形劑。
13.一種含有插入到親代黃熱病病毒(YFV)中的外源核酸的具有復(fù)制能力的重組黃熱病病毒，所述的外源核酸包含編碼外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的重組YFV編碼重組多蛋白前體，所述的重組多蛋白前體包含所述的外源多肽且耐蛋白酶解加工從該重組多蛋白前體釋放出該外源多肽。
14.一種含有插入到親代黃熱病病毒(YFV)中的外源核酸的具有復(fù)制能力的重組黃熱病病毒，所述的外源核酸包含編碼外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的重組YFV編碼重組多蛋白前體，所述的重組多蛋白前體包含所述的外源多肽，且通過(guò)蛋白酶解加工從該重組多蛋白前體釋放出該外源多肽，當(dāng)用所述的重組YFV感染宿主時(shí)，宿主細(xì)胞表達(dá)該外源多肽并在宿主體內(nèi)引發(fā)對(duì)該外源多肽的免疫應(yīng)答。
15.一種含有插入到親代黃熱病病毒(YFV)中的外源核酸的具有復(fù)制能力的重組黃熱病病毒，所述的外源核酸包含編碼外源多肽的核苷酸序列，其特征在于，所述的外源核酸側(cè)接于編碼蛋白酶解位點(diǎn)的核苷酸序列，從而在蛋白酶解加工后釋放出該外源多肽，所述的重組YFV編碼重組多蛋白前體，所述的重組多蛋白前體包含所述的外源多肽，且通過(guò)蛋白酶解加工從該重組多蛋白前體釋放出該外源多肽。
16.如權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒，其特征在于，所述的外源多肽是腫瘤相關(guān)性抗原。
17.如權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒，其特征在于，所述的外源多肽是除黃熱病病毒以外的病毒的多肽。
18.如權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒，其特征在于，所述的外源多肽是除黃熱病病毒以外的微生物病原體的多肽。
19.如權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒，其特征在于，所述的病毒是活的減毒病毒。
20.如權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒，其特征在于，感染后在宿主細(xì)胞的表面上表達(dá)所述的外源多肽。
21.如權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒，其特征在于，在感染后從宿主細(xì)胞分泌出所述的外源多肽。
22.分離的用權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒感染的宿主細(xì)胞。
23.一種組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求13-15任一所述的重?zé)峤M黃病毒和緩沖液。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，其特征在于，所述的組合物還含有藥學(xué)上的賦形劑。
25.一種引發(fā)哺乳動(dòng)物宿主對(duì)抗原性多肽產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟將權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒給予哺乳動(dòng)物宿主，其中所述的外源多肽是抗原性多肽，所述的給予使宿主細(xì)胞被感染和抗原性多肽被表達(dá)；所述的外源多肽的表達(dá)在宿主中引發(fā)了對(duì)抗原性多肽的免疫應(yīng)答。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述的抗原性多肽是腫瘤相關(guān)性抗原的多肽。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述的抗原性多肽是微生物病原體的多肽。
28.一種減少宿主中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟將權(quán)利要求13-15任一所述的重組黃熱病病毒給予患腫瘤的宿主，其中所述的外源多肽是在宿主的腫瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)性抗原的多肽；所述的腫瘤相關(guān)性抗原的表達(dá)在宿主引發(fā)有效減少宿主中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明提供重組黃病毒，尤其是活的減毒重組黃病毒，其中包括可編碼外源氨基酸序列的外源核苷酸序列。這些重組黃病毒包括外源核酸。用重組黃病毒感染宿主細(xì)胞，可提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源核酸，并產(chǎn)生由外源核酸編碼的抗原性多肽。這種重組黃病毒可用于引發(fā)對(duì)外源多肽的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1398297SQ01803881
公開(kāi)日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
發(fā)明者R·安迪諾-帕夫盧諾夫斯基, A·麥考利斯特-莫雷諾 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)