專利名稱：與雌激素聯合的選擇性雌激素受體調節(jié)劑的制作方法
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及生理活性化合物的新組合。具體地說，所述組合包括與一種雌激素聯合的一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)。在某些實施方案中，所述組合包括一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)、一種雌激素和一種性類固醇前體或雄激素化合物。本發(fā)明也提供用于實施上述組合地試劑盒和藥用組合物。將上述組合給予患者以減輕或消除熱潮紅(hot flash)、血管舒縮癥狀、陰道干燥或其它絕經癥狀的發(fā)生。認為接受這種聯合療法的患者患乳癌和/或子宮內膜癌的危險降低。也提供治療骨質疏松、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、早老性癡呆、失眠、心血管疾病、胰島素抵抗、糖尿病和肥胖(尤其是腹部肥胖)或降低患上述病癥的可能性的方法。
背景
已知許多疾病、病癥和不希望有的癥狀對于給予外源性性類固醇或其前體反應良好。例如，據認為雌激素降低骨丟失的速率，而雄激素顯示出通過刺激骨生成建立骨質。激素替代療法(例如給予雌激素)可以用來治療絕經癥狀。孕酮常常用來抵抗子宮內膜增生和雌激素誘發(fā)子宮內膜癌的危險。應用雌激素、雄激素化合物和/或孕酮治療或預防因多種無力而受損害的各種各樣的癥狀和疾病。用雄激素化合物治療女性可能有引起某些男性化副作用的不希望有的副作用。此外，給予患者性類固醇，可能增加患者患某些疾病的危險。例如，女性乳癌由于雌激素活性而惡化。前列腺癌和良性前列腺增生都因雄激素活性而惡化。
需要更為有效的激素療法并且降低副作用和危險。
認為本發(fā)明的聯合療法和可以用于這些療法的藥用組合物和試劑盒可滿足這些需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目的是提供一種治療熱潮紅、血管舒縮癥狀、骨質疏松、心血管疾病、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、胰島素抵抗、糖尿病、肥胖(尤其是腹部肥胖)、不規(guī)則月經和陰道干燥或降低上述疾病的發(fā)病率或患上述疾病危險的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種治療上述疾病或降低患上述疾病危險、而將不希望有的副作用減至最小的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供適用于上述方法的試劑盒和藥用組合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種降低或消除絕經癥狀發(fā)生率的方法，所述方法包括給予需要所述消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種治療骨質疏松、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、早老性癡呆、胰島素抵抗、糖尿病、肌肉質量損失、肥胖、激素替代療法誘發(fā)的陰道出血和激素替代療法誘發(fā)的乳房觸痛或降低患上述病癥的危險的方法，所述方法包括給予需要所述消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種藥用組合物，所述藥用組合物包含
a)一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體；
b)治療有效量的至少一種雌激素或其前藥；和
c)治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，其中所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括一個第一容器，所述第一容器含有一種包含治療有效量的至少一種雌激素或其前藥的藥用制劑；并且所述試劑盒還包括一個第二容器，所述第二容器含有一種包含治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥的藥用制劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療骨質疏松或降低患骨質疏松危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療心血管疾病或降低患心血管疾病危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療血膽固醇過多或降低患血膽固醇過多危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療血脂過多或降低患血脂過多危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療動脈粥樣硬化或降低患動脈粥樣硬化危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療高血壓或降低患高血壓危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療失眠或降低發(fā)生失眠危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療認知功能的喪失或降低發(fā)生認知功能喪失危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療早老性癡呆或降低患早老性癡呆危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療糖尿病或降低患糖尿病危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療絕經癥狀或降低發(fā)生絕經癥狀危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療肥胖(尤其是腹部肥胖)或降低患肥胖(尤其是腹部肥胖)危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療絕經癥狀或降低發(fā)生絕經癥狀危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療由激素替代療法誘發(fā)的乳房觸痛或降低發(fā)生所述乳房觸痛危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療由激素替代療法誘發(fā)的陰道出血或降低發(fā)生所述病癥危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的雌激素，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療骨質疏松或降低骨質疏松發(fā)生率的方法，所述方法包括在需要所述治療或所述降低的患者體內提高選自下列的性類固醇前體的水平脫氫表雄酮(DHEA)、硫酸脫氫表雄酮(DHEA-S)、雄烯二酮和雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-diol)，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)和治療有效量的雌激素作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種治療熱潮紅和出汗或降低熱潮紅和出汗發(fā)生率的方法，所述方法包括在需要所述治療或所述降低的患者體內提高選自下列的性類固醇前體的水平脫氫表雄酮(DHEA)、硫酸脫氫表雄酮(DHEA-S)和雄-5-烯-3β，17β-二醇(5-diol)，還包括給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)和治療有效量的雌激素作為聯合療法的一部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療上述疾病或降低患上述疾病危險的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的激動/拮抗雌激素(混合SERM)，還包括給予所述患者治療有效量的純選擇性雌激素受體調節(jié)劑(純SERM)或雌激素作為聯合療法的一部分。本文所用的“混合SERM”是指所述SERM在乳腺組織和子宮內膜組織中具有某些生理學或藥理學濃度的雌激素活性。本文所用的“純SERM”是指所述SERM在乳腺組織和子宮內膜組織中沒有任何生理學或藥理學濃度的雌激素活性。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括一個含有治療有效量的至少一種雌激素的第一容器，并且還包括一個包含治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑的第二容器。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種藥用組合物，所述藥用組合物包含a)一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體；b)治療有效量的至少一種雌激素；和c)治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑。
如本文所用的，“結合”其它化合物給予患者的化合物的給予與所述其它化合物的給予足夠接近，即使兩種化合物給予的時間并不接近，但也使得患者同時獲得兩種化合物的生理學效應。當作為聯合療法的一部分給予化合物時，將它們相互結合給予。
雌激素替代療法常用于絕經后婦女，以預防和治療由絕經所致的疾病，即骨質疏松、熱潮紅、冠心病(Cummings 1991)，但卻有與長期雌激素給予相關的某些不希望有的效應。特別是，已感覺到的由雌激素引起的子宮癌和/或乳癌危險的增加(Judd，Meldrum等1983；Colditz，Hankinson等1995)是這種療法的主要缺點。本發(fā)明的作者已經發(fā)現，在雌激素給藥中加入選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)，抑制了這些不希望有的效應。
本發(fā)明提供一種治療由激素替代療法(HRT)誘發(fā)的乳房觸痛或降低患所述乳房觸痛危險的方法，因為所述SERM會引起乳腺上皮萎縮，而不是HRT引起的刺激，所以乳房觸痛將被減輕或消除。
本發(fā)明也提供一種預防和治療由激素替代療法(HRT)誘發(fā)的陰道出血的方法。因為所述SERM將引起子宮內膜萎縮，所以不會發(fā)生陰道出血。
另一方面，單獨的SERM對某些絕經癥狀如熱潮紅和出汗的有益效應很少或沒有。本申請人認為，將雌激素加入絕經癥狀的SERM治療中，減輕或甚至消除熱潮紅和出汗。重要的是注意到，熱潮紅和出汗是絕經的最先表現，而患者接受或不接受絕經治療常常取決于熱潮紅和出汗減輕的成功與否。
如本文所用的，選擇性雌激素受體調節(jié)劑(SERM)是這樣的化合物，它們在乳腺組織中或者直接或者通過其活性代謝物作為雌激素受體拮抗劑(“抗雌激素”)起作用，還對骨組織和血清膽固醇水平提供雌激素或雌激素樣效應(即通過降低血清膽固醇)。在體外或在人類或大鼠乳腺組織中作為雌激素受體拮抗劑非類固醇化合物(尤其是當所述化合物對人類乳癌細胞用作抗雌激素時)有可能作為SERM起作用。相反，類固醇抗雌激素往往不作為SERM起作用，因為它們往往不顯示出對血清膽固醇的任何有益效應。我們已經測試和發(fā)現作為SERM起作用的非膽固醇抗雌激素包括EM-800、EM-652.HCl、雷洛昔芬、他莫昔芬、4-羥基-他莫昔芬、托瑞米芬、4-羥基-托瑞米芬、屈洛昔芬、LY 353 381、LY 335 563、GW-5638、Lasofoxifene、TSE 424和艾多昔芬，但不限于這些化合物。
但我們也發(fā)現，不是所有的SERM都以相同方式反應，可以將它們分為兩個亞類“純SERM”和“混合SERM”。因此，某些SERM如EM-800和EM-652.HCl在乳腺組織和子宮內膜組織中沒有任何生理學或藥理學濃度的雌激素活性，而在大鼠中具有降低血中膽固醇和降低血甘油三酯的效應。這些SERM可以被稱為“純SERM”。理想的SERM是EM-652.HCl類型的純SERM，因為它在乳腺中有有效的純抗雌激素活性。其它的SERM，如雷洛昔芬、他莫昔芬、屈洛昔芬、4-羥基-他莫昔芬(1-(4-二甲氨基乙氧基苯基)-1-(4-羥基苯基)-2-苯基-丁-1-烯)、托瑞米芬、4-羥基-托瑞米芬[(Z)-(2)-2-[4-(4-氯-1-(4-羥基苯基)-2-苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺)、LY 353 381、LY 335 563、GW-5638和艾多昔芬在乳腺和子宮內膜中具有某些雌激素活性。這種第二類SERM可以被稱為“混合SERM”。這些“混合SERM”的不想要的雌激素活性可以如圖6和圖7中的乳癌體外試驗以及圖9中的乳癌體內試驗所示，通過加入純“SERM”來加以抑制。由于裸鼠中的人類乳癌異種移植物是最接近的可利用的人類乳癌模型，因此，我們已經比較了單獨的和聯合的EM-800和他莫昔芬對裸鼠體內ZR-75-1乳癌異種移植物生長的影響。
對于本文所述的所有組合，考慮了給予所述組合每個部分的單獨化合物，除非另有陳述。因此，例如，給予SERM和雌激素是指給予兩種不同的化合物，而不是指給予具有某些雌激素特性的SERM的單一化合物。
本申請人認為，非常重要的是，本發(fā)明的SERM在乳腺組織、子宮組織和子宮內膜組織中起純抗雌激素的作用，因為SERM必須抵抗雌激素的可能增加這些組織中癌癥危險的潛在副作用。特別是，本申請人認為，在2位具有絕對構型2S的本發(fā)明的苯并吡喃衍生物比其外消旋混合物更合適。因此，在US 6,060,503中，公開了用以治療雌激素惡化的乳癌和子宮內膜癌的具有2S構型的旋光性苯并吡喃抗雌激素，并且這些化合物顯示出比外消旋混合物顯著更為有效(參見US6,060,503的

圖1-5)。
2S構型的對映體在工業(yè)上難以作為純狀態(tài)獲得，本申請人認為，5R對映體的污染最好低于10％、優(yōu)選低于5％、更優(yōu)選低于2％(重量)。
附圖簡述
圖1顯示了用單獨的DHEA(10mg，經皮，每日一次)或EM-800(75μg，口服，每日一次)治療或聯合治療9個月對大鼠體內血清甘油三酯(A)和膽固醇(B)水平的影響。數據以均數±SEM表示。**P＜0.01實驗相對于相應的對照。
圖2顯示A)每日兩次經皮給予增加劑量的DHEA(0.3mg、1.0mg或3.0mg)對補充雌酮的卵巢切除的(OVX)裸鼠體內ZR-75-1腫瘤平均大小的影響。僅接受溶媒的對照OVX小鼠用作另外的對照。將原始腫瘤大小作為100％。DHEA在0.02ml 50％乙醇-50％丙二醇的溶液中經皮(p.c)應用于背側皮膚。B)用增加劑量的單獨的DHEA或EM-800治療或聯合治療9.5個月對補充雌酮的OVX裸鼠體內ZR-75-1腫瘤重量的影響。**，p＜0.01，經治療的小鼠相對于補充雌酮的對照OVX小鼠。
圖3顯示了口服增加劑量的抗雌激素EM-800(15μg、50μg或100μg)(B)或經皮給予增加劑量的DHEA(0.3、1.0或3.0mg)聯合EM-800(15μg)或單獨的EM-800(A)9.5個月對補充雌酮的卵巢切除(OVX)裸鼠體內ZR-75-1腫瘤平均大小的影響。將原始腫瘤大小作為100％。僅接受溶媒的對照OVX小鼠用作另外的對照。雌酮以0.5μg的劑量每日皮下給予一次，而DHEA溶于50％乙醇-50％丙二醇中，每日兩次以0.02ml的體積應用于背側皮膚區(qū)。也與僅接受溶媒的OVX動物進行比較。
圖4顯示了用抗雌激素EM-800以0.25mg/Kg體重和2.5mg/Kg體重的劑量治療65天(口服，每日一次)或用醋酸甲羥孕酮(MPA，1mgs.c.，每日兩次)治療65天或用EM-800(0.25mg/Kg體重)和MPA聯合治療65天對卵巢切除的大鼠體內E1(1.0μg，s.c.，每日兩次)刺激的DMBA誘發(fā)性乳癌的生長的影響。腫瘤大小的改變以原始腫瘤大小的百分率表示。數據以均數±SEM表示。
圖5顯示了用給予的增加劑量(0.01、0.03、0.1、0.3和1mg/kg)的EM-800或雷洛昔芬治療37周對卵巢切除的大鼠體內總血清膽固醇水平的影響。將帶有17β-雌二醇(E2)植入物的無傷大鼠和卵巢切除大鼠進行比較；**p＜0.01，實驗大鼠相對于OVX對照大鼠。
圖6顯示了增加濃度的EM-800、(Z)-4-OH-他莫昔芬、(Z)-4-OH-托瑞米芬和雷洛昔芬對人Ishikawa細胞中堿性磷酸酶活性的影響。在存在或缺乏1.0nM E2的情況下暴露于增加濃度的指定化合物5天后，測量堿性磷酸酶的活性。數據以4個孔的均數±SEM表示。當SEM與所用的符號重疊時，僅顯示所述符號(Simard，Sanchez等，1997)。
圖7顯示了在人Ishikawa癌細胞中抗雌激素EM-800阻斷(Z)-4-OH-他莫昔芬、(Z)-4-OH-托瑞米芬、屈洛昔芬和雷洛昔芬對堿性磷酸酶活性的刺激效應。在存在或缺乏30nM或100nM EM-800的情況下暴露于3nM或10nM指定化合物5天后，測量堿性磷酸酶活性。數據以8個孔的均數±SD表示，對照組除外，對照組的數據得自16個孔(Simard，Sanchez等，1997)。
圖8顯示了標準HRT(雌激素)和SERM(EM-652)對絕經參數影響的比較。將SERM加入標準HRT中，將抵抗雌激素的潛在副作用。
圖9顯示了他莫昔芬對人乳癌ZR-75-1異種移植物生長的刺激效應因同時給予EM-652.HCl而被完全阻斷。EM-652.HCl本身根據純抗雌激素活性，在缺乏他莫昔芬的情況下對腫瘤生長無影響。
圖10顯示了大鼠乳腺的切片。
A.未經治療的動物。小葉(L)由幾個小泡組成。插入.高放大倍數顯示的小泡。
B.用EM-800(0.5mg/kg，bw/日)治療12周的動物。小葉(L)的大小減小。插入.高放大倍數顯示的萎縮小泡細胞。
圖11顯示了大鼠子宮內膜的切片。
A.未經治療的動物。腔上皮(LE)的特征為柱狀上皮細胞，而腺上皮(GE)呈立方形?；|含有幾種細胞組分和膠原纖維。
B.在12周內用EM-800(0.5mg/kg，b w per day)治療的動物。腔上皮的高度顯著減少。腺上皮細胞具有不染色的胞質，且無活性的跡象?；|由于基質的胞間組分減少而呈高度細胞性的。
圖12顯示了給同時用雌酮治療的卵巢切除小鼠口服9天增加濃度的EM-652.HCl、lasofoxifene(游離堿；活性和無活性對映體)和雷洛昔芬對子宮重量的影響。*p＜0.05，**p＜0.01，相對于E1治療的對照。
圖13顯示了給同時用雌酮治療的卵巢切除小鼠口服9天增加濃度的EM-652.HCl、lasofoxifene(游離堿；活性和無活性對映體)和雷洛昔芬對陰道重量的影響。**p＜0.01，相對于E1治療的對照。
圖14顯示了給卵巢切除小鼠口服9天1μg和10μg EM-652.HCl、lasofoxifene(游離堿；活性和無活性對映體)和雷洛昔芬對子宮重量的影響。**p＜0.01，相對于OVX對照。
圖15顯示了給卵巢切除小鼠口服9天1μg和10μg EM-652.HCl、lasofoxifene(游離堿；活性和無活性對映體)和雷洛昔芬對陰道重量的影響。**p＜0.01，相對于OVX對照。
圖16顯示了用E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA、DHEA+EM-652.HCl和DHEA+EM-652.HCl+E2治療26周對已確立骨質減少的OVX大鼠腰椎BMD的影響。對照組包括無傷的對照和OVX對照動物。
圖17顯示了用E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA、DHEA+EM-652.HCl和DHEA+EM-652.HCl+E2治療26周對已確立骨質減少的OVX大鼠股骨BMD的影響。對照組包括無傷的對照和OVX對照動物。
圖18顯示了用E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA、DHEA+EM-652.HCl和DHEA+EM-652.HCl+E2治療26周對已確立骨質減少的OVX大鼠總機體脂肪的影響。對照組包括無傷的對照和OVX對照動物。
圖19A顯示了抗雌激素對ZR-75-1腫瘤生長的影響。用7種抗雌激素治療161天對卵巢切除裸鼠體內雌酮誘發(fā)的人ZR-75-1乳房腫瘤生長的影響。腫瘤大小以原始腫瘤面積的百分率表示(第1天＝100％)。數據以均數±SEM表示(n＝18-30個腫瘤/組)；##p＜0.01，相對于EM-652.HCl；**p＜0.01相對于OVX。在通過用含有1∶25比率的雌酮和膽固醇的皮下0.5cm硅橡膠植入物獲得的雌酮刺激下，抗雌激素以50μg/小鼠的劑量每日口服一次。
圖19B顯示了抗雌激素對AR-75-1腫瘤生長的影響。用7種抗雌激素治療161天對卵巢切除裸鼠體內人ZR-75-1乳房腫瘤生長的影響。腫瘤大小以原始腫瘤面積的百分率表示(第1天＝100％)。數據以均數±SEM表示(n＝18-30個腫瘤/組)；##p＜0.01，相對于EM-652.HCl；**p＜0.01相對于OVX。在無雌激素刺激下，抗雌激素以100μg/小鼠的劑量每日口服一次。
圖19B顯示了抗雌激素對ZR-75-1腫瘤生長的影響。用7種抗雌激素治療161天對卵巢切除裸鼠體內人ZR-75-1乳房腫瘤生長的影響。腫瘤大小以原始腫瘤面積的百分率表示(第1天＝100％)。數據以均數±SEM表示(n＝18-30個腫瘤/組)；##p＜0.01，相對于EM-652.HCl；**p＜0.01相對于OVX。在無雌激素刺激下，抗雌激素以200μg/小鼠的劑量每日口服一次。
圖20A顯示了抗雌激素對反應類別的影響。給予7種抗雌激素161天對卵巢切除裸鼠體內人ZR-75-1乳房腫瘤反應類別的影響。完全消退確定了在治療結束時檢測不到的那些腫瘤；部分消退相當于其原始大小消退≥50％的腫瘤；穩(wěn)定的反應是指消退＜50％或發(fā)展≤50％的腫瘤；而發(fā)展是指與其原始大小相比，腫瘤發(fā)展超過50％。在通過用含有1∶25比率的雌酮和膽固醇的皮下0.5cm硅橡膠植入物獲得的雌酮刺激下，抗雌激素以50μg/小鼠的劑量每日口服一次。
圖20B顯示了抗雌激素對反應類別的影響。給予7種抗雌激素161天對卵巢切除裸鼠體內人ZR-75-1乳房腫瘤反應類別的影響。完全消退確定了在治療結束時檢測不到的那些腫瘤；部分消退相當于其原始大小消退≥50％的腫瘤；穩(wěn)定的反應是指消退＜50％或發(fā)展≤50％的腫瘤；而發(fā)展是指與其原始大小相比，腫瘤發(fā)展超過50％。在無雌激素刺激下，抗雌激素以200μg/小鼠的劑量每日口服一次。
圖20C顯示了抗雌激素對反應類別的影響。給予7種抗雌激素161天對卵巢切除裸鼠體內人ZR-75-1乳房腫瘤反應類別的影響。完全消退確定了在治療結束時檢測不到的那些腫瘤；部分消退相當于其原始大小消退≥50％的腫瘤；穩(wěn)定的反應是指消退＜50％或發(fā)展≤50％的腫瘤；而發(fā)展是指與其原始大小相比，腫瘤發(fā)展超過50％。在無雌激素刺激下，抗雌激素以200μg/小鼠的劑量每日口服一次。
圖21顯示了在每日口服補充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠體內以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日劑量范圍給予EM-652.HCl2周對子宮重量的影響。無傷的動物用作另外的對照。
圖22顯示了在每日口服補充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠體內以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日劑量范圍給予EM-652.HCl2周對子宮內膜上皮高度的影響。無傷的動物用作另外的對照。
圖23.大鼠子宮的蘇木精和曙紅染色切片，顯示了得自無傷對照(A)、OVX對照(B)、OVX+E2(2mg/kg)(C)和OVX+E2+EM-652.HCl(3mg/kg)治療14天的大鼠的上皮襯細胞。雌二醇對子宮內膜上皮細胞的刺激效應因同時給予EM-652.HCl而被逆轉。(放大倍數×700)。BM基底膜。
圖24顯示了在每日口服補充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠體內以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日劑量范圍給予EM-652.HCl2周對陰道重量的影響。無傷的動物用作另外的對照。
圖25顯示了在每日口服補充17β-雌二醇(2mg/kg)的卵巢切除大鼠體內以0.01mg/kg至10mg/kg的增加的日劑量范圍給予EM-652.HCl2周對血清膽固醇的影響。無傷的動物用作另外的對照。
發(fā)明詳述
在圖9中可以看出，他莫昔芬對腫瘤生長的約100％刺激效應因用EM-652.HCl同時治療而被完全阻斷。EM-652.HCl根據其純的抗雌激素活性，對裸鼠體內人乳癌ZR-75-1異種移植物的生長不會施加任何刺激效應(圖9)。
我們已經測試了類固醇抗雌激素ICI 182,780，發(fā)現它不起SERM的作用。按照本發(fā)明的SERM甚至在本領域將其用作代替SERM的抗雌激素的情況下，也可以以本領域已知的相同劑量給予。
我們也注意到，SERM對血清膽固醇的有益效應和對骨的雌激素或雌激素樣效應之間有相關性。SERM對高血壓、胰島素抵抗、糖尿病和肥胖(尤其是腹部肥胖)也有有益效應。雖然不希望受理論的束縛，但認為SERM中的許多最好具有1-2個碳原子連接的兩個芳環(huán)，預期SERM借助所述分子中被雌激素受體最佳識別的上述部分而與雌激素受體相互作用。優(yōu)選的SERM具有側鏈，所述側鏈可以選擇性地在乳腺組織和通常的子宮組織中引起拮抗劑特性，而在其它組織中沒有顯著的拮抗劑特性。因此，所述SERM可能理想地在乳腺中起抗雌激素的作用，而在骨和血液(其中脂質和膽固醇的濃度受有利的影響)中意外和理想地起雌激素的作用(或提供雌激素樣活性)。對膽固醇和脂質的有利效應轉變?yōu)閷用}粥樣硬化的有利效應，動脈粥樣硬化已知受膽固醇和脂質水平不當的不利影響。
另一方面，骨質疏松、血膽固醇過多、血脂過多、認知和動脈粥樣硬化對雌激素活性或雌激素樣活性有利地反應。通過按照本發(fā)明將雌激素與SERM聯合應用，在靶組織中提供所需效應，而在某些其它組織中無不希望有的效應。例如，雌激素和SERM的組合可以在骨(或對脂質或膽固醇)有有利的雌激素效應，而在乳腺和子宮中避免了不利的雌激素效應，因為所述SERM將充當雌激素拮抗劑，有效地阻斷了雌激素在乳腺和子宮內膜中的效應，如圖10和圖11中可以看到的。
如圖10中所表明的，雖然17β-雌二醇的循環(huán)水平從無傷動物的95.9±32.4pg/ml升至用每日口服0.5mg/kg EM-800達12周治療的動物中的143.5±7.8pg/ml(50％升高)，但觀察到乳腺顯著萎縮。同樣，在圖11中，在接受EM-800(0.5mg/kg)的動物中觀察到子宮內膜顯著萎縮。在接受純抗雌激素EM-800的這些無傷動物中，消除了雌激素在下丘腦-腦垂體水平的抑制效應，因此引起LH增加，然后繼發(fā)引起卵巢的17β-雌二醇分泌增加。
在每日接受相同的0.5mg/kg劑量的EM-652的無傷大鼠中進行6個月的研究中，測量到抗雌激素EM-652的循環(huán)濃度為0.4ng/ml(URMA-05-011-94)。因為在接受每日20mg口服劑量的EM-800的婦女體內的EM-652平均血清濃度測量為7.3±0.77ng/ml，所以顯然在絕經后婦女中給予雌激素替代療法，不會影響EM-652的有效抑制效應及其預防乳癌和子宮內膜癌的能力。I期研究已經表明，EM-800和EM-652.HCl給出了幾乎重疊的EM-652的血清水平。
通過本發(fā)明中使用的組合，也以協同方式減輕了不希望有的效應。對于本文討論的所有疾病而言，在其它情況下可能由以替代劑量的雌激素所致的對乳腺組織的任何其它效應，都被所述SERM在乳腺組織中的抗雌激素效應有效地阻斷，正如在圖2和圖3中所見的。從圖10中可以得出同樣的結論。
在優(yōu)選實施方案中，加入性類固醇前體(脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、4-雄烯-3，17-二酮和其前藥)或雄激素類藥，以提供有益的雄激素效應，尤其是在降低患骨病危險或治療骨病方面有益的雄激素效應。SERM和雌激素聯合用于治療骨質疏松，減少或甚至停止了骨的降解。而進一步加入雄激素或DHEA(和性類固醇的其它前體)允許重建受損傷的骨組織，但在血膽固醇過多、血脂過多、絕經癥狀、早老性癡呆、心血管疾病、乳癌、子宮癌和卵巢癌的治療方面有其它有益效應的性類固醇前體，可以與SERM和雌激素組合協同作用，以更好地治療上述疾病。這種協同效應是由于雄激素(或在外周組織中代謝為雄激素的性類固醇前體)和雌激素或SERM通過不同機制起作用的事實所致。
在某些實施方案中，加入孕酮以提供其它雄激素效應。孕酮可以以本領域已知的低劑量使用，而不會不利地影響所述雄激素受體以外的受體(例如糖皮質激素受體)。它們也相對無不想要的雄激素副作用(例如女性患者面部的毛)。
熱潮紅、心血管癥狀、早老性癡呆、認知功能的喪失和失眠肯定涉及位于中樞神經系統的雌激素受體。腦中低水平的雌激素可能至少部分解釋這些病癥。外源雌激素、尤其是雌二醇可能穿過腦屏障，并與所述雌激素受體結合，以恢復正常的雌激素作用。另一方面，如實施例9中所示，本發(fā)明的SERM、更優(yōu)選EM-652.HCl類的SERM不能穿過腦屏障。因此，它們不能拮抗雌激素在腦中的正效應，但它們拮抗雌激素在乳腺、子宮和子宮內膜組織中的負效應，使得這一組合(SERM+雌激素)對于治療上述病癥或降低患上述病癥危險而言特別有吸引力。聯合雌激素和SERM的總體相加益處
婦女絕經時請教其醫(yī)師的主要原因是發(fā)生熱潮紅，這是眾所周知可由雌激素替代療法消除的問題。因為引起熱潮紅的部位是中樞神經系統(CNS)，并且EM-652對于CNS的可及性非常差(數據已包括)，所以預期給予雌激素將控制熱潮紅，而不受所述SERM的干擾。另一方面，所述SERM將消除雌激素在其它部位的所有負效應，尤其是乳癌和子宮癌的危險。事實上，將EM-652加入雌激素，阻斷了雌激素對乳腺和子宮的刺激效應，而在其它組織中，EM-652將發(fā)揮其自身的有益效應，例如對骨的有益效應，在骨中它部分逆轉卵巢切除對骨鹽密度的效應。
觀察到EM-652對任何參數均無不利影響，而對于預防和治療乳癌和子宮癌而言，它應該發(fā)揮顯著的有益效應。
本發(fā)明數據表明，加入EM-652阻斷了雌激素對乳腺和子宮的刺激效應(實施例4、8和10)，而在其它組織中，EM-652.HCl發(fā)揮其自身的有益效應。例如，在骨中(實施例5)，EM-652部分逆轉了卵巢切除對骨鹽密度的效應。這樣一種效應已經導致用于治療絕經后婦女骨質疏松的雷洛昔芬的商業(yè)化。事實上，已經發(fā)現雷洛昔芬預防大鼠體內BMD喪失的效力比EM-652效力低3-10倍(Martel等，J SteroidBiochem Molec Biol 200074，第45-56頁)。雖然SERM對BMD的效應正如其它SERM如雷洛昔芬所示的，沒有用雌激素獲得的效應完全，但已經發(fā)現，在絕經后婦女中觀察到的對骨折的效應與雌激素和SERM雷洛昔芬相同。因此，預期雖然EM-652或其它SERM不完全逆轉BMD，但作為反應的最為重要的參數-對骨折的效應，與應用雌激素后觀察到的一樣重要。此外，正如所提出的，非常有可能BMD的測量不能提供一種化合物對骨生理學效應的完整的說明。
重要的方面是，雖然用SERM治療對骨發(fā)揮有益效應，但主要用以阻斷熱潮紅的它與雌激素的組合，使得可以降低與僅應用雌激素相關的乳癌和子宮癌的危險。
本文討論的優(yōu)選的SERM涉及(1)對本發(fā)明敏感的所有所述疾病；(2)治療和預防應用；和(3)優(yōu)選的藥用組合物和試劑盒。
需要治療特定疾病或降低發(fā)生特定疾病危險的患者是或者診斷有這種疾病的患者，或者是易患這種疾病的患者。
除非另有說明，本發(fā)明活性混合物的優(yōu)選劑量(濃度和給藥模式對于治療和預防目的而言是相同的。本文所述每種活性組分的劑量是相同的，與待治療的疾病(或待降低發(fā)病可能性的疾病)無關。
除非另有說明或從正文中明顯看出，本文所述的劑量是指不受藥用賦形劑、稀釋劑、載體或其它組分影響的活性化合物的重量，雖然理想的是包括這類其它成分，正如本文的實施例中所示。通常用于制藥業(yè)的任何劑型(膠囊、片劑、注射液等)適用于此，并且術語“賦形劑”、“稀釋劑”或“載體”包括諸如在制藥業(yè)中通常與這類劑型中與有效成分一起包括的這些非有效成分。例如，可以包括典型的膠囊、丸劑、腸衣片、固體或液體稀釋劑或賦形劑、調味劑、防腐劑等。
用于本文所述任一療法的所有有效成分均可以配制在藥用組合物中，所述藥用組合物也包括一種或多種所述其它有效成分?；蛘撸梢詫⑺鼈兠糠N分別給予或在時間上足夠同時給予，使得患者的血液水平最終提高，或者使得患者同時享受每種所述有效成分(或策略)的益處。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，例如，將一種或多種有效成分配制在單一的藥用組合物中。在本發(fā)明的其它實施方案中，提供包括至少兩個單獨容器的試劑盒，其中至少一個容器中的內容物與至少一個其它容器中的內容物在其中所含的有效成分方面完全或部分不同。
本文所述聯合療法也包括應用一種有效成分(組合)生產治療所述疾病(或降低其危險)的藥物，其中所述治療或預防還包括按照本發(fā)明的組合的另一有效成分。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供應用SERM制備與雌激素及其體內轉變?yōu)榇萍に氐那八幝摵蠎玫乃幬?，來治療本發(fā)明的聯合療法認為對其有效的任一疾病(即骨質疏松、心血管疾病、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、胰島素抵抗、糖尿病、肥胖、熱潮紅、出汗、不規(guī)則月經、早老性癡呆、認知問題、與絕經有關的任何癥狀以及陰道干燥)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供應用選自下列的雌激素以制備與SERM聯合用于治療任何所述疾病的藥物17β-雌二醇、17β-雌二醇酯(即苯甲酸酯、環(huán)戊丙酸酯(cypionate)、dienanthate、戊酸酯等)、17α-雌二醇、17α-雌二醇酯、雌三醇、雌三醇酯、雌酮、雌酮酯、結合雌激素、馬烯雌酮、馬烯雌酮酯、17α-乙炔基雌二醇、17α-乙炔基雌二醇酯、己二烯雌酚、美雌醇、美雌醇酯、DES、植物雌激素、替勃龍、炔諾醇。
眾所周知，雌激素刺激乳腺上皮細胞增生，細胞增生本身被認為通過積累可能導致瘤形成的隨機遺傳錯誤而增加了癌癥的危險(Preston Martin等，Cancer.Res.507415-21，1990)?；谶@一概念，已經引入了抗雌激素，以預防乳癌，目的是降低雌激素刺激的細胞分裂速率。
在雌性Sprague-Dawley大鼠10月齡后發(fā)現的卵巢周期性的喪失，伴隨有血清雌激素和催乳激素水平的增加和血清雄激素和孕激素濃度的降低(Lu等，61st Annual Meeting of the Endocrine Society 106(摘要第134號)，1979；Tang等，Biol.Reprod.31399-413，1984；Russo等，Monographs on Pathology of Laboratory AnimalsIntegument andMammary Glands 252-266，1989；Sortino和Wise，Endocrinology 12490-96，1989；Cardy，Vet.Pathol.28139-145，1991)。在衰老中的雌性大鼠中自發(fā)發(fā)生的這些激素的改變，與多灶性增生和腺泡/小泡組織分泌活性增加以及乳腺腺管擴張和囊腫形成有關(Boorman等，433，1990；Cardy，Vet.Pathol.28139-145，1991)。應該提到，大鼠乳腺增生和瘤形成改變通常伴有雌激素和催乳激素水平的增加(Meites，J.Neural.Transm.4825-42，1980)。用本發(fā)明的一個SERM-EM-800治療，誘發(fā)特征為小葉結構大小和數目減少的乳腺萎縮，并且無分泌活性的證據，顯示出EM-800在乳腺中的有效抗雌激素活性(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
已知雌激素降低血清膽固醇水平，但增加血清甘油三酯水平或對血清甘油三酯水平無影響(Love等，Ann.Intern.Med.115860-864，1991；Walsh等，New Engl.J.Med.3251196-1204，1991；Barrett-ConnorAm.J.Med.95(增刊5A)40S-43S，1993；Russell等，Atherosclerosis 100113-122，1993；Black等，J.Clin.Invest.9363-69，1994；Dipippo等，Endocrinology 1361020-1033，1995；Ke等，Endocrinology 1362435-2441，1995)。圖3顯示，EM-800在大鼠中既有降低血中膽固醇的效應，又有降低血甘油三酯的效應，因此表現出其對血清脂質分布型的特有作用，其作用顯然不同于其它SERM例如他莫昔芬(Bruning等，Br.J.Cancer 58497-499，1988；Love等，J.Natl.Cancer Inst.821327-1332，1990；Dipippo等，Endocrinology 1361020-1033，1995；Ke等，Endocrinology 1362435-2441，1995)、屈洛昔芬(Ke等，Endocrinology1362435-2441，1995)和雷洛昔芬(Black等，J.Clin.Invest.9363-69，1994)。因此，認為雌激素和EM-800的組合應該保持EM-800的降低血中膽固醇和降低血甘油三酯的效應，因此，提示這樣一種組合可能對血清脂質發(fā)揮有益作用。
應該提到，血清脂質分布型在大鼠和人類之間顯著不同。然而，由于雌激素受體介導的機制涉及雌激素以及抗雌激素的降低膽固醇的效應(Lundeen等，Endocrinology 1381552-1558，1997)，所述大鼠仍是用于研究雌激素和“抗雌激素”在人體中的降低膽固醇效應的有用模型。
我們也通過聯合給予所述新的抗雌激素(EM-800)和性類固醇前體(DHEA)，研究了EM-800的抑制效應和DHEA對裸鼠體內人ZR-75-1乳癌異種移植物生長的抑制效應的潛在相互作用。圖2和圖3顯示，DHEA本身在所用的劑量下，引起對腫瘤生長的50-80％抑制，而DHEA不影響用低劑量的所述抗雌激素達到的對腫瘤生長的近完全抑制。如圖4所示，用EM-800和孕激素MPA在卵巢切除大鼠中觀察到相似的對DMBA誘發(fā)性乳癌的E2刺激生長的影響。
骨鹽密度(BMD)測量的基線是眾所周知的。作為一個實例，BMD測量在用類固醇抗雌激素ICI 182780治療的大鼠中顯示出沒有變化(Wakeling，Breast Cancer Res.Treat.251-9，1993)，而通過組織形態(tài)計量法觀察到抑制性改變(Gallagher等，Endocrinology 1332787-2791，1993)。用他莫昔芬報道了相似的差異(Jordan等，Breast Cancer Res.Treat.1031-35，1987；Sibonga等，Breast Cancer Res.Treatm.4171-79，1996)。
應該指出，骨鹽密度降低不是與骨強度降低相關的唯一的異常(Guidelines for preclinical and clinical evaluation of agents used in theprevention or treatment of postmenopausal osteoporosis，Division ofMetabolism and Endocrine Drug Products，FDA，1994年5月)。因此，重要的是分析由各種化合物和療法誘發(fā)的骨代謝的生化參數的改變，以便獲得對其作用的更好的了解。
特別重要的是指出，DHEA和EM-800的組合對骨代謝重要的生化參數發(fā)揮出乎意料的有益效應。事實上，單獨的DHEA不影響骨吸收的標志-尿羥脯氨酸/肌酸酐之比。而且，對每日尿鈣或磷的排泄，不能檢測到DHEA的影響(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。EM-800將尿羥脯氨酸/肌酸酐之比降低48％，而與DHEA相似，沒有觀測到EM-800對尿鈣或磷排泄的影響。此外，EM-800對骨生成的標記-血清堿性磷酸酶活性沒有影響，而DHEA將該參數的數值提高約75％(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
DHEA和EM-800組合出乎意料的效應之一涉及尿羥脯氨酸/肌酸酐之比，這是骨吸收的標記，當DHEA和EM-800組合時將其降低69％，這一數值與用單獨的EM-800達到的48％抑制在統計學上有差異(p＜0.01)，而單獨的DHEA不顯示出任何的效應。因此，將DHEA加入EM-800將EM-800對骨重吸收的抑制效應提高50％。最為重要的是，將DHEA加入EM-800的另一出乎意料的效應是尿鈣降低約84％(從23.17±1.55降至3.71±0.75μmol/24h/100g(p＜0.01)并且尿磷降低55％(從132.72±6.08降至59.06±4.76μmol/24h/100g(p＜0.01)(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
表1
此外，有意義的是注意到，用DHEA同時治療不妨礙EM-800對血清膽固醇的有效抑制效應(Luo等，Endocrinology 1384435-4444，1997)。
雖然雷洛昔芬和相似化合物防止骨丟失并降低血清膽固醇(同雌激素一樣)，但應該提到，當比較雷洛昔芬與Premarin對BMD的效應時，雷洛昔芬對BMD的效應的效力低于Premarin的效應(Minutes of theEndocrinology and Metabolism Drugs Advisory Committee，FDA Thursday，Meeting #68，1997年11月20日)。
認為在婦女絕經時觀察到的骨丟失與骨吸收速率增加有關，繼發(fā)的骨生成增加不可完全補償骨吸收。事實上，骨生成和骨吸收的參數在骨質疏松中增加，而骨吸收和骨生成都被雌激素替代療法所抑制。因而，認為雌激素替代對骨生成的抑制效應是由骨吸收和骨生成之間偶聯的機制所致，使得最初的雌激素誘發(fā)的骨吸收的減少，導致骨生成的減少(parfitt，Calcified Tissue International 36增刊1S37-S45，1984)。松質骨強度和隨后的對骨折的抗性不僅僅取決于松質骨的總量，也取決于小梁微觀結構，正如根據小梁的數目、大小和分布測定的。絕經后婦女卵巢功能的喪失伴隨有小梁骨總體積的顯著減少(Melsen等，Acta Pathologica & Microbiologica Scandinavia 8670-81，1978；Vakamatsou等，Calcified Tissue International 37594-597，1985)，主要與小梁數目的減少、程度降低以及寬度減少有關(Weinstein和Hutson，Bone 8137-142，1987)。
為了推進本發(fā)明的聯合療法方面，對于本文討論的任何適應征而言，本發(fā)明均考慮了在單一組合物中包含所述SERM和所述雌激素用于同時給藥的藥用組合物。所述組合物可以適用于以任何傳統方式給藥，包括但不限于口服、皮下注射、肌內注射或經皮給藥。在其它實施方案中，提供一種試劑盒，其中所述試劑盒包含在分開的容器中或在一個容器中的一種或多種SERM和雌激素。上述藥用組合物和試劑盒當用于治療或預防骨質疏松時，可以還包含一種二膦酸鹽化合物。所述試劑盒可以包含用于口服的合適材料(例如片劑、膠囊、糖漿劑等)和用于經皮給藥的合適材料(例如軟膏、洗劑、凝膠劑、乳油、緩釋貼劑等)。
申請人認為，給予雌激素、SERM和性類固醇前體，在骨質疏松發(fā)生、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、胰島素抵抗、糖尿病、肥胖、早老性癡呆以及在治療熱潮紅和出汗和/或降低熱潮紅和出汗的發(fā)生率方面有功效。本發(fā)明的有效成分(無論是雌激素、SERM或前體還是其它的)可以以多種方式配制和給予。當按照本發(fā)明一起給予時，所述有效成分可以同時或分開給予。
用于經皮或經粘膜給藥的有效成分最好是相對于所述藥用組合物總重量的0.01％-20％(重量)，更優(yōu)選為2％和10％之間。用于經皮給藥的17β-雌二醇、雌酮、結合雌激素的濃度應該為0.01％-1％，DHEA或5-diol的濃度應該為至少7％。或者，可以將所述有效成分置于具有本領域已知結構的經皮貼劑中，所述結構例如為歐洲專利第0279982號中所述的結構。
當配制為軟膏、洗劑、凝膠劑或乳油等時，將所述有效成分與同人皮膚或粘膜相容并且增強所述化合物經皮透過所述皮膚或粘膜的合適的載體混合。合適的載體是本領域已知的，包括但不限于Klucel HF和Glaxal基質。某些是市售的，例如Glaxal基質可得自Glaxal CanadaLimited Company。其它合適的載體可以在Koller和Buri，S.T.P.Pharma3(2)，115-124，1987中找到。所述載體最好是所述有效成分于周圍溫度下可以使用的有效成分濃度溶于其中的載體。所述載體應該具有足夠的粘度，以保持所述抑制劑在所述藥用組合物施用的皮膚或粘膜局部區(qū)域上，而不會流出或蒸發(fā)，其保持時間足以允許所述前體基本透過皮膚或粘膜的所述局部區(qū)域而進入血流中，在血流中引起所需要的臨床效應。所述載體通常是幾種組分(例如藥學上可接受的溶劑和增稠劑)的混合物。有機溶劑和無機溶劑的混合物可以有助于親水和親脂的溶解性，例如水和醇例如乙醇。
優(yōu)選的性類固醇前體是脫氫表雄酮(DHEA)(可得自Diosynth Inc.，Chicago，Illinois，USA)。
所述載體也可以包括在化妝品和醫(yī)藥領域眾所周知、并且通常用于軟膏和洗劑中的各種添加劑。例如可以存在日用香料(fragrance)、抗氧化劑、香料、膠凝劑、增稠劑例如羧甲基纖維素、表面活性劑、穩(wěn)定劑、潤膚劑、著色劑和其它類似的藥劑。當用于治療系統性疾病時，應用于皮膚的部位應該改變，以便避免有效成分的局部濃度過高和可能的所述有效成分對皮膚的過度刺激。
按照本發(fā)明的治療適用于不確定的情況。所述雌激素化合物、SERM化合物和/或所述性類固醇前體和/或二膦酸鹽也可以經口途徑給予，并且可以與常規(guī)的藥用賦形劑例如噴干乳糖、微晶纖維素和硬脂酸鎂一起配制為片劑或膠囊，以用于口服。
所述活性物質可以通過與固體粉狀載體物質(例如檸檬酸鈉、碳酸鈣或磷酸二鈣)和粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠或纖維素衍生物)、可能也加入潤滑劑(例如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、“Carbowax”或聚乙二醇)混合，制成片劑或錠劑核心。當然，在口服形式的情況下，可以加入味道改進物質。
作為其它形式，人們可以使用插入式膠囊(plug capsule)，例如硬明膠插入式膠囊以及包含軟化劑或增塑劑(例如甘油)的封閉式軟明膠膠囊。插入式膠囊含有優(yōu)選為顆粒形式的所述活性物質，例如為與填料例如乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉如馬鈴薯淀粉或支鏈淀粉、纖維素衍生物或高度分散的硅酸的混合物。在軟明膠膠囊中，所述活性物質優(yōu)選溶于或懸浮于合適的液體例如植物油或液態(tài)聚乙二醇中。
所述洗劑、軟膏、凝膠劑或乳油應該充分擦入皮膚中，使得不會過分清楚可見，并且皮膚的該區(qū)域不應該洗，直至大部分經皮透入至少4小時，更優(yōu)選至少6小時。
經皮貼劑可以用來按照已知的技術來傳遞前體。通常應用長得多的時間，例如1-4天，但通常使有效成分與較小的表面積接觸，使得緩慢而恒定的傳遞有效成分。
已經開發(fā)并且正在使用的許多經皮給藥系統適合于傳遞本發(fā)明的有效成分。釋放速率通常通過基質擴散或所述有效成分通過控制膜來控制。
經皮裝置的機械方面是本領域眾所周知的，例如在美國專利5,162,037、5,154,922、5,135,480、4,666,441、4,624,665、3,742,951、3,797,444、4,568,343、5,064,654、5,071,644、5,071,657中有解釋，上述專利的公開內容通過引用結合到本文中。在歐洲專利0279982和英國專利申請2185187中提供了另外的背景。
所述裝置可以是本領域已知的一般類型的任一種，包括粘膠骨架型和貯庫型經皮給藥裝置。所述裝置可以包括摻入纖維、吸收所述有效成分和/或載體的含藥物骨架。在貯庫型裝置中，所述貯庫可以通過所述載體和所述有效成分不可透過的聚合物膜來限定。
在經皮裝置中，所述裝置本身保持將有效成分與所需的局部皮膚表面接觸。在這種裝置中，對于有效成分的載體的粘度的關注不如乳油或凝膠劑。經皮裝置的溶劑體系可以包括例如油酸、直鏈醇乳酸酯和一縮二丙二醇，或包括本領域已知的其它溶劑體系。所述有效成分可以溶于或懸浮于所述載體中。
就貼附于皮膚而言，經皮貼劑可以固定在中間有穿孔的外科膠帶上。所述膠帶最好被一個釋放襯墊覆蓋，以在使用之前保護它。適用于釋放的典型材料包括聚乙烯和聚乙烯涂布紙、最好涂有硅氧烷以便于除去。為了應用所述裝置，簡單地將所述釋放襯墊剝去，將粘膠貼到患者的皮膚上。在美國專利5,135,480(其公開內容通過引用結合到本文中)中，Bannon等描述了一種具有非粘膠裝置、用于保證所述裝置接觸皮膚的替代裝置。
唯一必不可少的是，SERM、雌激素和最后的性類固醇前體給予的方式和劑量，要足以使得每種的血清濃度達到所需水平。按照本發(fā)明的聯合療法，所述SERM的濃度維持在所需的參數內，同時雌激素的濃度維持在所需參數內。
當使用雌二醇時，血清雌二醇濃度通常應該維持在每升50納克和300納克之間，優(yōu)選在每升100納克和200納克之間，最優(yōu)選在每升150納克和175納克之間。當使用另一種雌激素時，為了顧及相對于雌二醇的雌激素活性的差異以及為了達到正常的絕經前(per-menopausal)雌激素水平，血清濃度可以按已知方式改變。例如，如果使用美雌醇，則需要較低的濃度。也可以根據絕經癥狀的消失，評估合適的血清雌激素水平。所述聯合療法的第二種化合物(例如EM-652.HCl)的血清濃度通常維持在每升1微克和15微克之間，或在某些實施方案中，為維持在每升2微克和10微克之間，或每升5微克和10微克之間。
所述雌激素最好是雌二醇，但可以是硫酸雌酮鈉或起雌激素受體激動劑作用的任何其它化合物。當分開給予時，可以使用市售的雌激素增補劑，例如可得自Ayerst(St-Laurent，Québec，Canada)的“PREMARIN”。一種優(yōu)選的性類固醇前體是DHEA，雖然DHEA-S和以下討論的類似物由于以下所述的原因也是特別有效的。對于典型的患者，當口服時，達到所需血清濃度的雌激素的合適劑量在每天每50kg體重0.3毫克和2.5毫克PREMARIN之間。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述雌激素可以是在貼劑中經皮給予的17β-雌二醇，可得自CIBA，名稱為“ESTRADERM”，其中日劑量在每天每50kg體重0.05毫克和0.2毫克之間?？傻米許quibb、商品名為“DELESTOGEN”的戊酸17β-雌二醇通過注射給予。
其它優(yōu)選的本發(fā)明雌激素藥品是含有17β-雌二醇的貼劑，可得自Berlex Canada，商品名為CLIMARA，或可得自Novartis Pharma，商品名為VIVELLE；含有17β-雌二醇的陰道裝置，可得自Pharmacia &Upjohn，商品名為ESTRING；含有17β-雌二醇的凝膠劑，可得自Schering，商品名為ESTROGEL；含有己二烯雌酚的乳油，可得自JANSSEN-ORTHO，商品名為ORTHO DINESTROL。
在某些實施方案中，口服給予所述優(yōu)選的雌激素。例如微粉化17β-雌二醇，可得自Roberts，商品名為ESTRACE；乙炔基雌二醇，可得自Schering Canada，商品名為ESTINYL；硫酸雌酮(estropipate)，可得自PHARMACIA UPJOHN，商品名為OGEN。
在某些實施方案中，優(yōu)選使用混合的雌激素/雄激素化合物來代替雌激素。所述化合物之一是替勃龍[(7α，(7α)-17-羥基-7-甲基-19-去甲孕-5(10)-烯-20-炔-3-酮(-19-norpregn-5(10)-en-20-yn-3-one)；專利號U.S.3,340,279(1967)；U.S.3,475,465(1969)和J.de Visser等描述的內分泌學分布型，Arzneimittel-Forsch，34，1010，1984)，可得自ORGANON(荷蘭)，商品名為LIVIAL。
也優(yōu)選含有雌激素和孕酮或雄激素的混合物的藥品。所述藥物可得自Novartis Pharma，商品名為ESTRACOM；得自Sabex，商品名為CLIMACTERON。
本發(fā)明的經皮或經粘膜給藥系統也可以用作預防和/或治療骨質疏松或其它疾病的新型的改進給藥系統。
可以使用任何雌激素，所述雌激素按照生產商的建議，根據功效需要使用。合適的劑量是本領域已知的。具有雌激素活性或類似活性或對雌激素受體具有激動劑活性或類似活性的任何化合物或化合物的混合物可以按照本發(fā)明使用(植物雌激素、合成雌激素等)。
本發(fā)明的選擇性雌激素受體調節(jié)劑的分子式具有以下特征a)由1-2個間插碳原子間隔的兩個芳環(huán)，兩個芳環(huán)或者是未取代的，或者被一個羥基或一個在體內轉變?yōu)榱u基的基團取代；和b)具有一個芳環(huán)和一個叔胺官能或其鹽的側鏈。
一種優(yōu)選的本發(fā)明SERM是PCT/CA96/00097(WO 96/26201)中報道的EM-800。EM-800的分子結構是
另一種優(yōu)選的本發(fā)明SERM是EM-01538
EM-1538(也稱為EM-652.HCl)是與EM-800相比為有效的抗雌激素EM-652的鹽酸鹽，EM-1538是一種更為簡單、更易于合成的鹽。它也容易分離、純化、可結晶和顯示出良好的固態(tài)穩(wěn)定性。當給予或者EM-800或者EM-1538時，認為在體內產生相同的活性化合物。
其它優(yōu)選的本發(fā)明SERM包括他莫昔芬((Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺)(可得自Zeneca，UK)；托瑞米芬((Z)-2-[4-(4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺)(可得自Orion-Farmos Pharmaceuticla，Finland，或可得自Schering-Plough)；屈洛昔芬((E)-3-[1-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2-苯基-1-丁烯基]苯酚)和CP-336，156(Lasofoxifene)(順式-1R[4’-吡咯烷基-乙氧基苯基]-2S-苯基-6-羥基-1，2，3，4-四氫化萘D-(-)-酒石酸鹽)(Pfizer Inc.，USA)；雷洛昔芬([2-(4-羥基苯基)-6-羥基苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-甲酮鹽酸鹽)(Eli Lilly and Co.，USA)、LY 335563(6-羥基-3-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯氧基]-2-(4-羥基苯基)苯并[b]噻吩鹽酸鹽)和LY353381(Arzoxifene，6-羥基-3-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯氧基]-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩鹽酸鹽)(Eli Lilly and Co.，USA)；艾多昔芬((E)-1-[2-[4-[1-(4-碘苯基)-2-苯基-1-丁烯基]苯氧基]乙基]吡咯烷)(SmithKline Beecham，USA)；Levormeloxifene(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基]-7-甲氧基苯并二氫吡喃)(Novo Nordisk，A/S，Denmark)，它公開于Shalmi等WO 97/25034，WO97/25035，WO 97/25037，WO 97/25038；和Korsgaard等WO97/25036)；GW5638(由Willson等描述，Endocrinology，138(9)，3901-3911，1997)和吲哚衍生物(由Miller等描述，EP 0802183A1)；和TSE424，由Wyeth Ayers(USA)研制，公開于JP10036347(American homeproducts corporation)；和WO 97/32837中描述的非類固醇雌激素衍生物。也包括得自Taiho(日本)的Iproxifen(TAT 59；磷酸二氫(E)-4-[1-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-2-[4-(1-甲基乙基)苯基]-1-丁烯基]苯酚)、得自Orion(芬蘭)的FC 1271((Z)-2-[4-(4-氯-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]乙醇)、得自Hoechst Marion Roussel的HMR 3339和HMR3656、得自德國Schering AG的SH 646、得自Wyeth Ayerst(USA)的ERA 923、得自Eli Lilly(USA)的LY 335124和LY 326315。
可以使用根據功效需要使用的任何SERM，按照生產商的建議使用。合適的劑量是本領域已知的?？梢园凑毡景l(fā)明使用任何其它的市售非類固醇抗雌激素?？梢允褂镁哂蓄愃芐ERM活性的任何化合物(例如雷洛昔芬)。
按照本發(fā)明給予的SERM最好以下述劑量范圍使用對于平均體重的人而言，當口服時，優(yōu)選為0.01-10mg/kg體重/天(優(yōu)選0.05-1.0mg/kg)、每天5mg，尤其是每天10mg，分為兩個等分劑量；對于平均體重的人而言，當胃腸外給予(即肌內、皮下或經皮給藥)時，優(yōu)選為0.003-3.0mg/kg體重/天(優(yōu)選0.015-0.3mg/ml)、每天1.5mg，尤其是每天3.0mg，分為兩個等分劑量。最好是如下所述將所述SERM與藥學上可接受的稀釋劑或載體一起給予。
在用于治療骨質疏松的聯合療法中作為有效成分給予的本發(fā)明的優(yōu)選二膦酸鹽包括阿侖膦酸鹽[(4-氨基-1-羥基亞丁基)二膦酸二鈉鹽水合物，可得自Merck Shape and Dohme，商品名為Fosamax；依替膦酸鹽[(1-羥基亞乙基)二膦酸，2，2’-亞氨基二乙醇]，可得自Procter andGamble，商品名為Didrocal和Didronel；氯膦酸[(二氯亞甲基)二膦酸二鈉鹽]，可得自Rhne-Poulenc Rorer，商品名為Bonefos，或可得自Boehringer Mannheim，商品名為Ostac；和帕米膦酸鹽(3-氨基-1-羥基亞丙基)二膦酸二鈉鹽)，可得自Geigy，商品名為Aredia。利塞膦酸鹽(1-羥基-2-(3-吡啶基)亞乙基二膦酸一鈉鹽)正在臨床研制中?？梢园凑毡景l(fā)明使用任何其它的市售二膦酸鹽，所有均按生產商建議的劑量使用。同樣，可以以現有技術建議的劑量使用性類固醇前體，其劑量優(yōu)選將循環(huán)水平恢復20-30歲健康男性水平或絕經前成年婦女的水平。
關于本文建議的所有劑量，主治醫(yī)師應該監(jiān)測各個患者的反應并據此調節(jié)劑量。
實施例
實施例1
在乳腺中，雄激素由前體類固醇脫氫表雄酮(DHEA)生成。臨床證據表明，雄激素對乳癌有抑制效應。另一方面，雌激素刺激乳癌的發(fā)生和生長。我們研究了單獨DHEA或與新近描述的純抗雌激素EM-800聯合的DHEA對卵巢切除裸鼠中由人乳癌細胞系ZR-75-1形成的腫瘤異種移植物生長的影響。
小鼠在卵巢切除后立即每日接受皮下注射的0.5μg雌酮(一種雌激素類激素)。每日口服1次EM-800(15、50或100μg)。DHEA或者單獨或者結合15μg每日口服劑量的EM-800每日兩次應用(總劑量0.3、1.0或3.0mg)于背側皮膚上。定期評價相對于第一天測量結果的對所述治療反應的腫瘤大小的變化。實驗結束時，解剖腫瘤并將其稱重。
與沒有接受雌酮的小鼠相比，在僅接受雌酮的卵巢切除小鼠中觀察到9.5個月內腫瘤大小增加9.4倍。在補充雌酮的卵巢切除小鼠中給予15、50或100μg EM-800，導致對腫瘤大小的抑制分別為88％、93％和94％。另一方面，0.3、1.0或3.0mg劑量的DHEA將終末腫瘤重量分別抑制67％、82％和85％。用每日15μg口服劑量的EM-800并且給予或不給予不同劑量的經皮DHEA，獲得相當的對腫瘤大小的抑制作用。
DHEA和EM-800獨立地抑制雌酮刺激的ZR-75-1小鼠異種移植腫瘤在裸鼠體內的生長。給予所述特定劑量的DHEA不改變EM-800的抑制效應。材料和方法ZR-75-1細胞
ZR-75-1人乳癌細胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)，常規(guī)按照已描述的方法(Poulin和Labrie，Cancer Res.464933-4937，1986；Poulin等，Breast Cancer Res.Treat.12213-225，1988)，在95％空氣/5％CO2的潮濕環(huán)境中、于37℃在補充2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100IU青霉素/ml、100μg鏈霉素/ml和10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中作為單層培養(yǎng)。用0.05％胰蛋白酶0.02％EDTA(w/v)處理之后，將細胞每周傳代。用于該報道中所述實驗的細胞培養(yǎng)物得自細胞系ZR-75-1的第93代。動物
雌性純合Harlan Sprague-Dawley(nu/nu)無胸腺小鼠(28-42日齡)得自HSD(Indianapolis，Indiana，USA)。小鼠關養(yǎng)在空氣層流罩超凈臺中具有空氣過濾罩的乙烯籠子中，并且在限制病原體的條件下維持?；\子、褥草和食物在使用之前進行高壓滅菌。將水高壓滅菌，酸化至pH2.8，任意供應。細胞接種
將小鼠兩側卵巢切除(OVX)，一周后在麻醉條件下，通過腹膜內注射0.25ml/只動物的三溴乙醇(戊醇0.8g/100ml 0.9％NaCl；和三溴乙醇2g/100ml 0.9％NaCl)實現腫瘤細胞的接種。在用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA(w/v)處理單層后，收獲對數生長期的1.5×106 ZR-75-1細胞，將所述細胞懸浮于0.1ml含有25％Matrigel的培養(yǎng)基中，用1英寸長的20號針頭，如先前描述的方法(Dauvois等，Cancer Res.513131-3135，1991)，皮下接種到動物的兩側脅腹。為了促進腫瘤的生長，每只動物每日接受皮下注射由0.9％NaCl 5％乙醇1％明膠組成的溶媒中的10μg雌二醇(E2)，注射5周。出現觸知的ZR-75-1腫瘤后，用測徑規(guī)測量腫瘤的直徑，選擇腫瘤直徑在0.2cm和0.7cm之間的小鼠進行該項研究。激素治療
除對照OVX組動物外，所有動物每日接受皮下注射0.2ml 0.9％NaCl 5％乙醇1％明膠中的0.5μg雌酮(E1)。在指定組中，每日兩次經皮給予0.3、1.0或3.0mg/只動物DHEA，將0.02ml體積的DHEA應用于腫瘤生長區(qū)之外的背側皮膚區(qū)。將DHEA溶于50％乙醇50％丙二醇中。如先前所描述(Gauthier等，J.Med.Chem.402117-2122，1997)，在Laboratory of Molecular Endocrinology of the CHUL Research Center的醫(yī)藥化學部，合成EM-800，即((+)-7-新戊酰氧基-3-(4’-新戊酰氧基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2’”-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-苯并吡喃)。將EM-800溶于4％(v/v)乙醇4％(v/v)聚乙二醇(PEG)600 1％(w/v)明膠0.9％(w/v)NaCl中。指定組的動物接受口服日劑量為15μg、50μg或100μg單獨的EM-800或聯合DHEA，而OVX組的動物僅接受溶媒(0.2ml 4％乙醇4％PEG 600 1％明膠0.9％NaCl)。每周一次用Vernier測徑規(guī)測量腫瘤。記錄以cm計的兩個垂直的直徑(L和W)，用以下公式計算腫瘤面積(cm2)L/2×W/2×π(Dauvois等，Cancer Res.513131-3135，1991)。將治療的第一天測量的面積作為100％，以原始腫瘤面積的百分率表示腫瘤大小的變化。一般在皮下腫瘤的情況下，不可能精確地獲得腫瘤的三維體積，因此，僅測量腫瘤的面積。治療291天(或9.5個月)之后，處死所述動物。
按照已描述的方法(Dauvois等，Breast Cancer Res.Treat.14299-306，1989；Dauvois等，Eur.J.Cancer.Clin.Oncol.25891-897，1989；Labrie等，Breast Cancer Res.Treat.33237-244，1995)，評估反應的類別。簡而言之，部分消退對應于消退等于或大于其原始大小的50％的腫瘤；穩(wěn)定的反應是指消退小于原始大小的50％或發(fā)展小于其原始大小的50％的腫瘤，而完全消退是指在治療結束時檢測不到的腫瘤。發(fā)展是指與其原始大小相比發(fā)展超過50％的腫瘤。在實驗結束時，通過斷頭術殺死所有動物。立即取出腫瘤、子宮和陰道，去除結締組織和脂肪組織，并稱重。統計學分析
用評估由DHEA、EM-800和時間所致效應的方差分析(ANOVA)，評價治療對腫瘤大小影響的統計學顯著性，在治療開始和結束時在相同的動物中進行重復測定(組內受治療者因素)。0時和治療9.5個月后的重復度量構成動物的隨機區(qū)組。因此，將時間作為區(qū)組內影響來分析，而將兩種治療作為區(qū)組間影響來評價。主要影響之間的所有相互作用都包括在該模型中。采用組內受治療者作為誤差項，分析治療因素及其相互作用的顯著性。將數據轉化為log。構成所述ANOVA基礎的假設，假設殘差正態(tài)性和方差齊性。
對于最小顯著差數，采用費歇耳檢驗進行后驗配對比較(posterioripairwise comparison)。治療對體重和器官重量的主要影響和相互作用采用標準兩因素ANOVA與相互作用來分析。所有的ANOVA均采用SAS程序(SAS Institute，Cary，NC，USA)來進行。采用雙尾檢驗，以5％的總體水平宣布差異的顯著性。
對于有序聚類(ordered categorical)反應變量(完全反應、部分反應、穩(wěn)定反應和腫瘤發(fā)展)，用Kruskall-Wallis檢驗分析聚類數據。在對治療效應進行總體評價后，調節(jié)多重比較的p界值，分析表4所示結果的亞組(subset)。采用StatXact程序(Cytel，Cambridge，MA，USA)，計算p精確值。
數據以每組12-15只小鼠的均數±均數的標準誤(SEM)表示。結果
如圖2A所示，在用皮下給予的0.5μg日劑量雌酮治療的卵巢切除裸鼠中，在291天(9.5個月)內人ZR-75-1腫瘤增加9.4倍，而在僅接受溶媒的對照OVX小鼠中，在該項研究期間腫瘤大小降至原始數值的36.9％。
用增加劑量的經皮DHEA治療，導致對E1刺激的ZR-75-1腫瘤生長的進行性抑制。用每只動物0.3mg、1.0mg和3.0mg日劑量的DHEA治療9.5個月時，分別達到50.4％、76.8％和80.0％的抑制(圖2A)。與總腫瘤荷載減少一致，用DHEA治療導致在實驗結束時腫瘤平均重量的顯著降低。事實上，平均腫瘤重量從對照補充E1的卵巢切除裸鼠的1.12±0.26g降至分別接受0.3mg、1.0mg和3.0mg日劑量DHEA的動物組中的0.37±0.12g(P＝.005)、0.20±0.06g(P＝.001)和0.17±0.06g(P＝.0009)(圖2B)。
當與對照動物9.5個月時的腫瘤大小比較時，抗雌激素EM-800在15μg、50μg和100μg的日劑量下，對雌激素刺激的腫瘤大小分別抑制87.5％(P＜.0001)、93.5％(P＜.0001)和94.0％(P＝.0003)(圖3A)。用三種EM-800劑量達到的腫瘤大小的減少，在相互之間沒有顯著性差異。如圖2B所示，9.5個月的研究結束時腫瘤的重量從對照補充E1的OVX小鼠的1.12±0.26g降至分別用15μg、50μg和100μg日劑量的EM-800治療動物的0.08±0.03g、0.03±0.01g和0.04±0.03g(在所有劑量下的EM-800相對于補充E1的OVX，P＜.0001)。
如上所述，15μg口服日劑量的抗雌激素EM-800引起在9.5個月時測量的對雌酮刺激的腫瘤生長的87.5％的抑制。加入所用的三種劑量的DHEA，對用15μg日劑量的抗雌激素EM-800達到的對腫瘤大小的已經顯著的抑制作用沒有顯著影響(圖5B)。因此，平均腫瘤重量從補充雌酮的對照小鼠中的1.12±0.26g分別顯著降至在接受單獨的或與0.3mg、1.0mg和3.0mg劑量的DHEA聯合的15μg日劑量的所述抗雌激素的動物中的0.08±0.03g(P＜.0001)、0.11±0.04g(P＝.0002)、0.13±0.07g(P＝.0004)和0.08±0.05g(P＜.0001)(注意到在所述4組之間沒有顯著性差異)(圖2B)。
也有興趣地研究了用上述治療達到的反應類別。因此，用增加劑量的DHEA的治療雖然沒有將進行性腫瘤的數目降至統計學顯著性的水平(P＝.088)，但將進行性腫瘤的數目從補充雌酮的對照OVX動物中的87.5％降至用0.3mg、1.0mg和3.0mg日劑量的DHEA治療動物中的50.0％、53.3％和66.7％(表4)。另一方面，完全反應從補充雌酮的小鼠中的0％提高至接受0.3mg、1.0mg和3.0mg日劑量的經皮DHEA的動物中的28.6％、26.7％和20.0％。另一方面，在補充E1的對照小鼠和接受上述劑量的DHEA的三組動物中，穩(wěn)定反應分別測定為12.5％、21.4％、20.0％和13.3％。在對照卵巢切除小鼠中，完全反應率、部分反應率和穩(wěn)定反應率分別測量為68.8％、6.2％和18.8％，而僅在6.2％的腫瘤中觀察到發(fā)展(表2)。
在接受單獨的(15μg)抗雌激素EM-800(P＝.0006)或與0.3mg、1.0mg和3.0mg的DHEA聯合的所述動物中，分別在29.4％、33.3％、26.7％和35.3％的腫瘤中達到完全反應或腫瘤消失(表4)。另一方面，在上述組的動物中，分別在35.3％、44.4％、53.3％和17.6％的腫瘤中觀察到發(fā)展。在用單獨或與DHEA聯合的EM-800治療的組之間，沒有顯著性差異。
對于根據腫瘤重量調節(jié)的體重，沒有觀察到DHEA或EM-800治療的顯著性效應。用雌酮治療OVX小鼠，子宮重量從OVX對照小鼠的28±5mg增加至132±8mg(P＜.01)，而增加劑量的DHEA引起對雌酮刺激效應的進行性的但卻相對小的抑制，所述抑制在所用的最高劑量DHEA下達到26％(P＝.0008)。在同一圖中可以觀察到，雌酮刺激的子宮重量從補充雌酮的對照小鼠中的132±8mg分別降至使用15μg、50μg或100μg口服日劑量的EM-800的49±3mg、36±2mg和32±1mg(在所有劑量下，相對于對照，P＜.0001)(總體上P＜.0001)。與0.3mg、1.0mg和3.0mg日劑量的DHEA聯合的15微克(15μg)EM-800，測量到子宮重量分別為49±3mg、59±5mg和69±3mg。
另一方面，用雌酮治療，將陰道重量從OVX動物的14±2mg增加至31±2mg(P＜.01)，而加入DHEA沒有顯著性效應。在用15μg、50μg或100μg日劑量的EM-800治療后，陰道重量則分別降低23±1mg、15±1mg和11±1mg(在所有劑量下，相對于對照而言，總體p和配對P＜.0001)。將0.3mg、1.0mg和3.0mg劑量的DHEA與EM-800聯合，陰道重量分別測量為22±1mg、25±2mg和23±1mg(相對于15μg EM-800，所有的組均為N.S.)。應該提到，在所用的最高劑量即100μg日劑量下，EM-800將補充雌酮的OVX動物中的子宮重量降至不是與OVX對照有差異的數值，而將陰道重量降低至在OVX對照中所測量數值以下(P＜.05)。DHEA可能由于其雄激素效應，部分抵消EM-800對子宮重量和陰道重量的影響。表2.經皮給予DHEA或口服單獨的或聯合的EM-800達9.5個月對裸鼠中人ZR-75-1乳房腫瘤異種移植物反應(完全、部分、穩(wěn)定和發(fā)展)的影響。E1＝雌酮；DHEA＝脫氫表雄酮；OVX＝卵巢切除的
實施例2
雄烯-3β，17β-二醇(5-diol)具有固有的雌激素活性。另外，作為前體性類固醇，它在外周顱內組織中可以轉化為活性雄激素和/或其它雌激素。為了評價5-diol對骨質作用的雄激素組分和雌激素組分的相對重要性，將21周齡大鼠卵巢切除，用每日經皮1次單獨的2、5或12.5mg 5-diol或與抗雄激素氟他胺(FLU，10mg，s.c，每日一次)和/或抗雌激素EM-800(100μg，s.c.，每日一次)聯合的2、5或12.5mg 5-diol治療12個月。治療11個月后，測量骨鹽密度(BMD)。卵巢切除(OVX)導致股骨BMD降低12.8％(p＜0.01)，而用最高劑量的5-diol治療，在OVX后11個月期間恢復34.3％的損失的股骨BMD(p＜0.01)。與單獨的5-diol的效應相比，同時給予FLU完全防止了5-diol對股骨BMD的刺激效應，而加入EM-800導致附加的28.4％的刺激。同時給予5-diol、FLU和EM-800，僅顯示出EM-800(27％)的效應，因為5-diol的效應被FLU完全阻斷。對腰椎BMD獲得相當的結果，雖然接受12.5mg單獨的5-diol、12.5mg 5-diol+EM-800或5-diol+FLU+EM-800的OVX大鼠中，腰椎BMD恢復至與無傷動物無顯著性差異的數值。組織形態(tài)計量分析表明，5-diol對骨體積、小梁數目的刺激效應和對近端脛骨干骺端區(qū)的繼發(fā)松質骨的小梁分離的抑制效應，被FLU消除，但被EM-800進一步增強。在用5-diol治療后獲得的血清堿性磷酸酶活性的顯著刺激被同時給予FLU逆轉57％(p＜0.01，相對于12.5mg單獨的5-diol)。用5-diol治療對尿鈣與肌酸酐之比沒有統計學顯著性抑制效應。最高劑量的5-diol引起血清膽固醇顯著降低23％(p＜0.01)，而加入EM-800將血清膽固醇降低62％(p＜0.01)。本發(fā)明的數據清楚地顯示出5-diol對骨生成的刺激效應，并且提示，雖然5-diol是一種弱雌激素，但它對骨生成的刺激效應主要由雄激素效應介導。此外，EM-800和5-diol對骨質的相加刺激效應證明了抗雌激素EM-800在大鼠中節(jié)約骨(bone-sparing)的效應。5-diol和EM-800兩者降低膽固醇的活性可能在心血管疾病預防方面有有趣的效用。
實施例3
本發(fā)明優(yōu)選化合物的合成實施例(S)-(+)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2’”-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃鹽酸鹽EM-01538(EM-652，HCl)的合成
方案1
步驟ABF3·Et2O，甲苯；100℃，1小時。
步驟C3，4-二氫吡喃，對甲苯磺酸一水合物，乙酸乙酯；25℃氮氣下，16小時，然后在異丙醇中結晶。
步驟D、E和F
(1)哌啶，甲苯，Dean & Stark儀器，氮氣下回流；(2)1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯、DMF，回流3小時；
(3)CH3MgCl、THF，-20至0℃，然后室溫24小時；
步驟G、H(1S)-(+)-10-樟腦磺酸，丙酮，水，甲苯，室溫，48小時。
步驟HH95％乙醇，70℃，然后室溫3天。
步驟HHR母液和步驟HH洗滌液的再循環(huán)
(S)-10-樟腦磺酸，回流；36小時，然后室溫16小時。
步驟I
(1)DMF水溶液，Na2CO3，乙酸乙酯；
(2)乙醇，稀鹽酸；
(3)水。
2-四氫吡喃氧基-4-羥基-2’-(4”-四氫吡喃氧基苯基)苯乙酮(4)的合成。將3，4-二氫吡喃(218ml，3.39mole)和乙酸乙酯(520ml)中的2，4-二羥基-2’-(4”-羥基苯基)苯乙酮3(97.6g，0.4mole)(可得自ChemsynScience Laboratories，Lenexa，Kansas)的懸浮液用對甲苯磺酸一水合物(0.03g，0.158mmole)于約25℃處理。將反應混合物在氮氣、無外部加熱下攪拌約16小時。然后用碳酸氫鈉(1g)和氯化鈉(5g)的水(100ml)溶液洗滌混合物。分離各相，有機相用鹽水(20ml)洗滌。每次的洗滌液用50ml乙酸乙酯反萃取。合并所有的有機相，并通過硫酸鈉過濾。
在大氣壓下經蒸餾除去溶劑(約600ml)，并加入異丙醇(250ml)。在大氣壓下蒸餾出額外的溶劑(約300ml)，加入異丙醇(250ml)。在大氣壓下蒸餾出額外的溶劑(約275ml)，加入異丙醇(250ml)。約12小時后，將溶液于約25℃在攪拌下冷卻，濾出結晶固體，用異丙醇洗滌并干燥(116.5g，70％)。
4-羥基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]乙氧基)苯基-3-(4’”-四氫吡喃氧基)苯基-7-四氫吡喃氧基-苯并二氫吡喃(10)的合成。用Dean &Stark裝置，將2-四氫吡喃氧基-4-羥基-2’-(4”-四氫吡喃氧基苯基)苯乙酮4(1kg，2.42mole)、4-[2-(1-哌啶子基)乙氧基]苯甲醛5(594g，2.55mole)(可得自Chemsyn Science Laboratories，Lenexa，Kansas)和哌啶(82.4g，0.97mole)(可得自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis)在甲苯(8L)中的溶液在氮氣下回流，直至收集到一個相當量的水(44ml)。
通過在大氣壓下蒸餾，除去溶液中的甲苯(6.5L)。加入二甲基甲酰胺(6.5L)和1，8-二氮雜二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯(110.5g，0.726mole)。將溶液于室溫攪拌約8小時，以將查耳酮8異構化為苯并二氫吡喃-4-酮9，然后將其加入到水和冰(8L)和甲苯(4L)的混合物中。分離各相，甲苯層用水(5L)洗滌。合并的水性洗滌液用甲苯(3×4L)萃取。合并的甲苯萃取液最后用鹽水(3×4L)洗滌，在大氣壓下濃縮至5.5L，然后冷卻至-10℃。
繼續(xù)外部冷卻并在氮氣下攪拌，加入3M氯化甲基鎂的THF溶液(2.5L，7.5mole)(可得自Aldrich Chemical Company Inc.，Milwaukee，Wis.)，將溫度維持低于0℃。加入所有的格氏試劑后，除去外部冷卻，讓混合物溫至室溫。將混合物在該溫度下攪拌約24小時。
將混合物再次冷卻至約-20℃，繼續(xù)外部冷卻和攪拌，緩慢加入飽和氯化銨溶液(200ml)，將溫度維持低于20℃。將混合物攪拌2小時，然后加入飽和氯化銨溶液(2L)和甲苯(4L)，攪拌5分鐘。分離各相，水層用甲苯(2×4L)萃取。合并的甲苯萃取液用稀鹽酸洗滌，直至溶液變?yōu)榫唬缓笥名}水(3×4L)洗滌。甲苯溶液最終于大氣壓下濃縮至2L。該溶液直接用于下一步驟。
(2R，S)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟腦磺酸鹽(±12)的合成。向4-羥基-4-甲基-2-(4’-[2”-哌啶子基]乙氧基)苯基-3-(4’”-四氫吡喃氧基)苯基-7-四氫吡喃氧基苯并二氫吡喃(10)的甲苯溶液中加入丙酮(6L)、水(0.3L)和(S)-10-樟腦磺酸(561g，2.42mole)(可得自Aldrich Chemical CompanyInc.，Milwaukee，Wis.)。在氮氣下將混合物攪拌48小時，此后過濾出固體(2R，S)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟腦磺酸鹽(12)，用丙酮洗滌并干燥(883g)。該物質不用進一步純化，用于下一(HH)步驟。
(2R)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟腦磺酸鹽(13，(+)-EM-652(1S)-CSA鹽)的合成。將(2R，S)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟腦磺酸鹽±12(759g)在95％乙醇中的懸浮液在攪拌下加熱至約70℃，直至固體溶解。讓溶液下攪拌下冷卻至室溫，然后用少量用(2R)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-[2’”-哌啶子基]乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃(1S)-10-樟腦磺酸鹽13的晶體接種。將該溶液于室溫下攪拌總共約3天。過濾出晶體，用95％乙醇洗滌并干燥(291g，76％)。該產物的de為94.2％，純度為98.8％。
(S)-(+)-7-羥基-3-(4’-羥基苯基)-4-甲基-2-(4”-(2’”-哌啶子基乙氧基)苯基)-2H-1-苯并吡喃鹽酸鹽EM-01538(EM-652，HCl)的合成。將化合物13(EM-652-(+)-CSA鹽，500mg，0.726mmol)在二甲基甲酰胺(11μl，0.15mmol)中的懸浮液用0.5M碳酸鈉水溶液(7.0ml，3.6mmol)處理，并攪拌15分鐘。該懸浮液用乙酸乙酯(7.0ml)處理并在4小時內攪拌。然后，有機相用飽和碳酸鈉水溶液(2×5ml)和鹽水(1×5ml)洗滌，經硫酸鎂干燥并濃縮。所得的粉紅色泡沫(EM-652)在乙醇(2ml)中的溶液用2N鹽酸(400μl，0.80mmol)處理，攪拌1小時，用蒸餾水(5ml)處理，在30分鐘內攪拌。將所得的懸浮液過濾，用蒸餾水(5ml)洗滌，風干并在高度真空(65℃)下干燥，得到奶油狀粉末(276mg，77％)細灰白色粉末；掃描量熱法熔點開始于219℃，ΔH＝83J/g；[α]24D＝154°，在10mg/ml甲醇中；1H NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.6(broad，2H，H-4)，1.85(broad，4H，H.3″″and 5″″)，2.03(s，3H，CH3)，3.0 and 3.45(broad，4H，H-2″″and 6″″)，3.47(t，J＝4.9Hz，2H，H-3)，4.26(t，J＝4.9Hz，2H，H-2)，5.82(s，1H，H-2)，6.10(d，J＝2.3Hz，1H，H-8)，6.35(dd，J＝8.4，2.43Hz，1H，H-6)，6.70(d，J＝8.6Hz，2H，H-3′，and H-5＇)，6.83(d，J＝8.7Hz，2H，H-3″and H-5″)，7.01(d，J＝8.5Hz，2H，H-2′and H-6′)，7.12(d，J＝8.4Hz，1H，H-5)，7.24(d，J＝8.6Hz，2H，H-2″and H-6″)；13C RMN(CD3OD，75MHz)δppm 14.84，22.50，23.99，54.78，57.03，62.97，81.22，104.38，109.11，115.35，116.01，118.68，125.78，126.33，130.26，130.72，131.29，131.59，134.26，154.42，157.56，158.96，159.33.元素組成C，H，N，Cl理論值70.51，6.53，2.84，7.18％；實測值70.31，6.75，2.65，6.89％。
實施例4材料和方法動物
重18-20g的雌性BALB/c小鼠(BLAB/cAnNCrlBR)得自Charles-River，Inc.(St-Constant，Quebec，Canada)，在溫度(23±1℃)和光(12h光照/天，于715開燈)受控的環(huán)境中，每只籠子關養(yǎng)5只。飼喂小鼠嚙齒動物飼料，并讓其自由獲取自來水。在異氟烷麻醉下，通過兩側脅腹切開，對動物進行卵巢切除(OVX)，隨機指定到各組，每組10只動物。10只小鼠保持無傷作為對照。治療
在第一個實驗(圖12-15)中，從卵巢切除后2天開始，通過管飼法，每日一次以1、3或10μg/只動物的劑量口服試驗化合物即EM-652.HCl、lasofoxifene(作為游離堿；活性和無活性對映體)和雷洛昔芬9天。在第二個實驗(表3)中，從卵巢切除后2天開始，通過管飼法，每日一次以1、3、10或30μg/只動物的劑量口服TSE 424達9天。在兩個實驗中，為了評估抗雌激素活性，在卵巢切除后5天開始用雌酮治療(E1，0.06μg，s.c.注射，每日兩次)，并給予6天。將化合物溶于乙醇(4％終濃度)，并在0.4％甲基纖維素中給予。無傷對照組和OVX對照組的小鼠在所述9天期間僅接受溶媒(4％ETOH-0.4％甲基纖維素)。在卵巢切除后第11天早晨，通過在腹主動脈進行驅血法殺死動物?？焖俳馄食鲎訉m和陰道，稱重，并將其保持在10％緩沖的福爾馬林中，以供進一步的組織學檢查。結果實驗1
如圖12所示，以1μg、3μg和10μg的口服日劑量給予的EM-652.HCl分別引起對雌酮刺激的子宮重量的24％、48％和72％的抑制(對于所有劑量而言，相對于對照，p＜0.01)，而以相同劑量給予的雷洛昔芬分別引起該參數的6％(NS)、14％(p＜0.01)和43％(p＜0.01)的抑制。另一方面，lasofoxifene(作為游離堿)在所用的最低劑量下沒有抑制效應，而它在3μg和10μg的日劑量下分別引起對雌酮刺激的子宮重量的25％(p＜0.01)和44％(p＜0.01)的抑制。lasofoxifene的無活性對映體在所用的任何劑量下都對該參數沒有抑制效應。
上述化合物對陰道重量有相似的效應。每日口服EM-652.HCl在1μg、3μg和10μg劑量下分別引起對陰道重量的10％(NS)、25％和53％的抑制(對于兩個最高劑量而言，p＜0.01)(圖13)，而雷洛昔芬僅在最高劑量(10μg)下對該參數有顯著24％(p＜0.01)的抑制效應。與雷洛昔芬類似，lasofoxifene(作為游離堿)僅在所用的最高劑量下引起顯著的37％(p＜0.01)的抑制效應，而無活性對映體在所用的任何劑量下對陰道重量都無抑制效應。當將化合物以1μg和10μg的口服日劑量單獨給予卵巢切除小鼠時(在無雌酮的情況下)，EM-652.HCl在所用的兩種劑量下對子宮重量都無顯著刺激效應，而用10μg lasofoxifene和雷洛昔芬治療，分別引起對子宮重量的93％(p＜0.01)和85％(p＜0.01)的刺激(圖14)，因此表明后兩種化合物對該參數有雌激素效應。同樣，EM-652.HCl對陰道重量無顯著的刺激效應(圖15)，而給予10μglasofoxifene和雷洛昔芬，分別引起對陰道重量的73％(p＜0.01)和56％(p＜0.01)的刺激。另一方面，lasofoxifene的無活性對映體對子宮重量和陰道重量均無刺激效應。實驗2
如表3所示，以1μg、3μg、10μg或30μg的口服日劑量給予的TSE 424分別引起對雌酮刺激的子宮重量的12％(NS)、47％、74％和94％的抑制(對于三種最高劑量而言，相對于E1對照，p＜0.01)。另一方面，以3μg、10μg和30μg的劑量每日口服TSE 424，分別引起對陰道重量的16％(NS)、56％(p＜0.01)和93％(p＜0.01)的抑制。
當以3μg和30μg的口服日劑量將所述化合物單獨給予(在無雌酮的情況下)卵巢切除小鼠時，TSE 424在所用的兩種劑量下對子宮重量和陰道重量均無顯著的刺激效應(表3)。表3將增加濃度的TSE 424口服9天給予同時用或不用雌酮治療的卵巢切除小鼠對子宮重量和陰道重量的影響。**p＜0.01，相對于E1治療的對照。
實施例55A對骨丟失、血清脂質和總體脂肪的預防效應。動物和治療
使用在治療開始時重約220-270g的10-12周齡雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。在實驗開始之前，讓動物適應環(huán)境條件(溫度22±3℃；濕度50±20％；12h光照-12h黑暗周期，于0715開燈)至少1周。將動物單獨關養(yǎng)，并讓其自由獲取自來水和粒狀合格的嚙齒動物飼料(Lab Diet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。在Canadian Council onAnimal Care(CCAC)和the Association for Assessment and Accreditationof Laboratory Animal Care(AAALAC)批準的動物設備中，按照實驗動物護理和使用的CCAC指南，進行實驗。
在第一個實驗中，將154只大鼠隨機分配在每組14只動物的如下11個組中1)無傷對照；2)OVX對照；3)OVX+E2(1mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+E2+EM-652.HCl；6)OVX+脫氫表雄酮(DHEA；80mg/kg)；7)OVX+DHEA+EM-652.HCl；8)OVX+DHEA+E2；9)OVX+DHEA+E2+EM-652.HCl；10)OVX+GW5638；11)OVX+E2+GW 5638。該研究的第1天，在異氟烷麻醉下，將合適組別的動物的兩側卵巢切除(OVX)。將DHEA作為在50％乙醇-50％丙二醇中的溶液，局部應用于背側皮膚，而另一種試驗化合物作為在0.4％甲基纖維素中的懸浮液經管飼法口服。治療始于該研究的第2天，在3個月期間每日進行一次。
在第二個實驗中，將132只大鼠隨機分配在每組14或15只動物的如下9個組中1)無傷對照；2)OVX對照；3)OVX+Premarin(0.25mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+Premarin+EM-652.HCl；6)OVX+TSE 424(2.5mg/kg)；7)OVX+Premarin+TSE424；8)OVX+lasofoxifene(酒石酸鹽；外消旋物；2.5mg/kg)；9)OVX+Premarin+lasofoxifene。該研究的第1天，在異氟烷麻醉下，將合適組別的動物的兩側卵巢切除(OVX)。試驗化合物作為在0.4％甲基纖維素中的懸浮液經管飼法口服。治療始于該研究的第2天，在26周內每日進行一次。在兩個實驗中，在同一時期內，不接受試驗物質的動物僅用合適的溶媒治療。骨鹽密度的測量
治療3個月(實驗1)或26周(實驗2)之后，用雙能x射線吸收測量法(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)和區(qū)域高分辨率掃描軟件，在異氟烷麻醉下對各只大鼠進行全身骨骼和腰椎掃描。測定腰椎(脊椎L2至L4)的骨鹽密度(BMD)和總機體組成(脂肪百分率)。血清分析
治療3個月(實驗1)或26周(實驗2)之后，從禁食過夜的動物在頸靜脈收集血樣(在異氟烷麻醉下)。加工樣品以進行血清制備，將其于-80℃冷凍直至分析。用Boehringer Mannheim Diagnostic Hitachi 911分析儀(Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems)，測定血清膽固醇水平和堿性磷酸酶活性(ALP)。統計學分析
數據以均數±SEM表示。按照Duncan-Kramer的多重極差檢驗(multiple-range test)(Kramer CY；Biometrics 1956；12307-310)，測定統計學顯著性。結果
如表4所示，在卵巢切除3個月之后，腰椎BMD在OVX對照動物中比在無傷動物中低10％(p＜0.01)。在所用的劑量下，單獨給予雌二醇和EM-652.HCl，分別以98％(p＜0.01)和65％(p＜0.05)預防腰椎BMD損失，而用E2與EM-652.HCl聯合治療，61％預防OVX誘發(fā)的腰椎BMD降低(p＜0.05)。另一方面，雖然單獨給予DHEA 43％預防腰椎BMD降低(p＜0.05)，用DHEA+E2+EM-652.HCl聯合治療，91％預防OVX誘發(fā)的腰椎BMD降低，并導致BMD數值與無傷對照沒有差異。
在表5中，卵巢切除后26周時，與無傷對照相比，腰椎BMD降低18％(p＜0.01)。單獨給予的Premarin、EM-652.HCl、TSE 424和lasofoxifene，分別以54％、62％、49％和61％預防腰椎BMD的降低(相對于OVX對照，所有化合物，p＜0.01)。將Premarin加入EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene，導致腰椎BMD的數值與通過給予每種單獨的SERM獲得的數值無顯著性差異(表5)。同樣，將DHEA加入E2或EM-652.HCl，完全預防OVX誘發(fā)的腰椎BMD的降低(表4)。DHEA對BMD的正效應也得到其對骨生成和更新標記的血清堿性磷酸酶活性(ALP)的效應的支持。ALP活性從OVX對照動物中的73±6IU/L分別增加至DHEA、DHEA+EM-652.HCl、DHEA+E2以及DHEA+E2+EM-652.HCl治療的動物中的224±18IU/L、290±27IU/L、123±8IU/L和261±20IU/L(所有的，p＜0.01)，因此，表明DHEA對骨生成有刺激效應(表6)。
除對骨丟失的預防效應外，給予EM-652.HCl、TSE 424、lasofoxifene、GW 5638、DHEA和E2，對總體脂肪百分率和血清脂質有某些有益效應。卵巢切除3個月后，總體脂肪增加22％(p＜0.05；表6)。給予EM-652.HCl完全預防OVX誘發(fā)的脂肪百分率的增加，而將DHEA和/或E2加入所述SERM中，導致脂肪百分率的數值低于在無傷對照動物中觀察到的數值。卵巢切除26周后，在給予Premarin、EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene后，雌激素缺乏誘發(fā)的40％的脂肪增加分別被74％、78％、75％和114％逆轉，而將Premarin加入每種SERM中，完全預防OVX誘發(fā)的脂肪百分率的增加(表7)。
如表6所示，在卵巢切除后3個月，與無傷對照相比，在OVX對照大鼠中觀察到血清膽固醇水平增加22％(p＜0.01)。事實上，血清膽固醇從無傷動物的2.01±0.11mmol/L增加至OVX對照中的2.46±0.08mmol/L。僅給予E2或DHEA，將血清膽固醇水平分別降至1.37±0.18mmol/L和1.59±0.10mmol/L，而僅給予EM-652.HCl或聯合E2和/或DHEA給予EM-652.HCl，導致膽固醇水平顯著低于(在0.65mmol/L和0.96mmol/L之間)無傷動物中發(fā)現的水平(2.01±0.11mmol/L)。同樣，單獨或聯合E2或Premarin給予GW 5638、TSE 424和lasofoxifene，完全預防OVX誘發(fā)的血清膽固醇水平增加，并導致數值低于在無傷動物中發(fā)現的數值(表6和表7)。表4.在用單獨給予或聯合給予的雌二醇、EM-652.HCl、GW 5638或DHEA治療卵巢切除雌性大鼠3個月后對預防骨丟失的影響*，p＜0.05；**，p＜0.01，實驗大鼠相對于OVX對照大鼠。表5.在用單獨給予或聯合Premarin給予的Premarin、EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene治療卵巢切除雌性大鼠26周后對預防骨丟失的影響*，p＜0.01，實驗大鼠相對于OVX對照大鼠。表6.在用單獨給予或聯合給予的雌二醇、EM-652.HCl、GW 5638或DHEA治療卵巢切除雌性大鼠3個月后對總體脂肪百分率、血清膽固醇水平和堿性磷酸酶活性的影響*，p＜0.05；**，p＜0.01，實驗大鼠相對于OVX對照大鼠。表7.在用單獨給予或聯合Premarin給予的Premarin、EM-652.HCl、TSE 424或lasofoxifene治療卵巢切除雌性大鼠26周后對總體脂肪百分率、血清膽固醇水平和堿性磷酸酶活性的影響*，p＜0.05；**，p＜0.01，實驗大鼠相對于OVX對照大鼠。5B對骨丟失和總體脂肪的治療效應動物和治療
在該實驗中使用至多9月齡的雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。在卵巢切除之前，讓動物適應環(huán)境條件(溫度22±3℃；濕度50±20％；12h光照-12h黑暗周期，于0715開燈)至少1周。在異氟烷麻醉下，將動物兩側卵巢切除(OVX)。將20只動物保持無傷作為對照。將動物單獨關養(yǎng)，并讓其自由獲取自來水和粒狀合格的嚙齒動物飼料(LabDiet 5002，Ralston Purina，St-Louis，MO)。在Canadian Council on AnimalCare(CCAC)和the Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care(AAALAC)批準的動物設備中，按照實驗動物護理和使用的CCAC指南，進行實驗。
在OVX后10周，將139只大鼠隨機分配在每組17-20只動物的如下8個組中1)無傷對照；2)OVX對照；3)OVX+E2(1mg/kg)；4)OVX+EM-652.HCl(2.5mg/kg)；5)OVX+E2+EM-652.HCl；6)OVX+脫氫表雄酮(DHEA；80mg/kg)；7)OVX+DHEA+EM-652.HCl；8)OVX+DHEA+EM-652.HCl+E2。將DHEA作為在50％乙醇-50％丙二醇中的溶液，局部應用于背側皮膚，而E2和EM-652.HCl作為在0.4％甲基纖維素中的懸浮液經管飼法口服。在卵巢切除后10周開始治療，并且在26周內每日進行一次治療。在同一時期內，不接受試驗物質的動物僅用合適的溶媒治療。骨鹽密度的測量
在OVX之前、治療第一天(OVX后10周)之前以及在治療26周之后，用雙能x射線吸收測量法(DEXA；QDR 4500A，Hologic，Waltham，MA)和區(qū)域高分辨率掃描軟件，在異氟烷麻醉下對各只大鼠進行全身骨骼、腰椎和右側股骨掃描。測定腰椎(脊椎L2至L4)、股骨的骨鹽密度(BMD)和總機體組成(脂肪百分率)。統計學分析
數據以均數±SEM表示。按照Duncan-Kramer的多重極差檢驗(Kramer CY；Biometrics 1956；12307-310)，測定統計學顯著性。結果
在以上描述的前項研究(實施例5A)中，在OVX時開始給予試驗化合物，以便研究對骨丟失的預防效應。在本項研究中，在OVX后10周開始給予試驗化合物，以便研究所給予的治療的可能的治療效應。在OVX之前(基線值)以及在開始治療之前測量BMD，以便確立在開始治療之前存在骨質減少。如圖16所示，卵巢切除10周后，腰椎BMD降低8％，在OVX后動物僅接受溶媒的的另外26周之后，進一步降低12％(對照組)。每日給予確立骨質減少的動物E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA或DHEA+EM-652.HCl達26周，完全預防在OVX對照動物中觀察到的腰椎BMD的進一步降低，而給予E2+EM-652.HCl+DHEA，導致BMD值略高于在治療開始之前觀察到的BMD值。另一方面，如圖17中所示，股骨BMD在卵巢切除后10周降低4％，在僅用溶媒治療的另外26周之后進一步降低6％。與腰椎BMD相似，每日給予E2、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl、DHEA或DHEA+EM-652.HCl達26周，完全預防在OVX對照動物中觀察到的股骨BMD的進一步降低。另一方面，給予E2+EM-652.HCl+DHEA，導致股骨BMD值甚至略高于在OVX之前觀察到的BMD值，因此表明這種聯合治療對骨生成的有益效應。用EM-652.HCl+E2+DHEA聯合治療，不僅在骨質減少的動物完全預防進一步的OVX誘發(fā)的骨丟失，而且也有某些治療效應。
除對骨的效應外，如圖18中所示，給予DHEA、E2和/或EM-652.HCl預防OVX誘發(fā)的總體脂肪的增加。事實上，在OVX對照動物中，脂肪百分率在卵巢切除10周后增加47％，在僅用溶媒治療的26周內進一步增加17％(對照組)。每日給予E2、DHEA、EM-652.HCl、E2+EM-652.HCl或DHEA+EM-652.HCl達26周，預防在OVX對照組中觀察到的17％的增加。另一方面，用EM-652.HCl+E2+DHEA聯合治療，完全逆轉了OVX的效應，并且導致脂肪百分率數值與動物卵巢切除之前觀測的數值相似，因而表明該療法有治療效應。實施例6
本發(fā)明化合物對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞中堿性磷酸酶活
性的影響材料細胞儲備培養(yǎng)物的保持
來源于很好分化的子宮內膜腺癌的人Ishikawa細胞系由ErlioGurpide博士(The Mount Sinai Medical Center，New York，NY)好意提供。Ishikawa細胞常規(guī)在含有5％(v/v)FBS(胎牛血清)并補充100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.1mM非必需氨基酸溶液的Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM)中保持。將細胞以1.5×106細胞的密度，于37℃接種到Falcon T75搖瓶中。細胞培養(yǎng)實驗
在實驗開始之前24小時，將接近鋪滿的Ishikawa細胞的培養(yǎng)基更換為新鮮的無雌激素的基本培養(yǎng)基(EFBM)，該培養(yǎng)基由無酚紅Ham’s F-12和Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的1∶1(v∶v)混合物組成，并補充100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mM谷氨酰胺和5％FBS，所述FBS用包有葡聚糖的活性炭處理兩次，以除去內源類固醇。然后，用0.1％胰酶制劑(Sigma)和0.25mM HEPES收獲細胞，將其重懸于EFBM中，并在100μl體積中以2.2×104細胞/孔的密度，接種到Falcon 96孔平底微量滴定板中，讓其附著于平板表面達24小時。此后，將培養(yǎng)基更換為含有指定濃度化合物的新鮮EFBM，終體積為200μl。將細胞孵育5天，48小時后更換培養(yǎng)基。堿性磷酸酶測定
在孵育期結束時，將微量滴定板倒置，傾出生長培養(yǎng)基。用200μl/孔PBS(0.15M NaCl、10mM磷酸鈉，pH7.4)沖洗平板。然后從平板除去PBS，同時小心地留下一些殘留的PBS，將洗滌步驟重復一次。然后傾出緩沖鹽水，將倒置的平板在紙巾上逐漸吸干。在將蓋子復原后，將板置于-80℃達15分鐘，然后于室溫解凍10分鐘。然后將板置于冰上，加入50μl含有5mM磷酸對硝基苯酯、0.24mM MgCl2和1M二乙醇胺的冰冷溶液(pH9.8)。然后將板溫至室溫，讓由于產生對硝基苯酯而產生的黃色顯色(8分鐘)。在酶聯免疫吸附測定平板讀出儀(BIO-RAD，2550型EIA讀出儀)中，于405nm監(jiān)測平板。計算
運用加權迭代非線性平方回歸，計算劑量反應曲線以及IC50值。表8
*1nM E2刺激的百分率＝OD 405nm化合物-OD 405nm基線/OD 405nm 1nM E2-OD 405nm基線請也參見Labrie等，EM-652(SCH 57068)，在乳腺和子宮內膜中作為純抗雌激素起作用的第三代SERM，J.Steroid Biochem.and Mol.Bio.69，51-84，1999。
實施例7EM-652.HCl、TSE 424和lasofoxifene對人乳癌MCF-7細胞增殖的影響方法細胞儲備培養(yǎng)物的保持
MCF-7人乳癌細胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心第147代#HTB，常規(guī)在無酚紅Dulbecco改進的Eagle’s-Ham’s F12培養(yǎng)基、上述補充物和5％FBS中生長。MCF-7人乳腺癌細胞系來源于一位69歲白種女患者的胸膜積液。使用第148代和165代之間的MCF-7細胞，并且每周傳代。細胞增殖研究
用0.1％胰酶制劑(Sigma)收獲晚期對數生長期的細胞，將其重懸于合適的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有50ng牛胰島素/ml和5％(v/v)FBS，所述FBS用包有葡聚糖的活性炭處理兩次，以除去內源類固醇。將細胞以指定的密度接種到24孔Falcon塑料培養(yǎng)板(2cm2/孔)中，讓其附著于平板表面達72小時。此后，將培養(yǎng)基更換為含有指定濃度化合物的新鮮培養(yǎng)基，所述化合物是由在99％重蒸乙醇中在存在或不存在E2的情況下的1000×儲備液稀釋的。對照細胞僅接受所述乙醇溶媒(0.1％EtOH，v/v)。將細胞孵育指定的時間間隔，以2天或3天的間隔更換培養(yǎng)基。通過測量DNA含量，測定細胞數目。計算和統計學分析
運用加權迭代非線性最小平方回歸，計算劑量反應曲線以及IC50數值。所有結果均以均數±SEM表示。
表9
實驗1
實驗2
實施例8EM-652.HCl、他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、艾多昔芬、GW-5638和雷洛昔芬對裸鼠體內人ZR-75-1乳房腫瘤生長影響的比較
該實施例的目的是比較EM-652.HCl和6種其它口服抗雌激素(SERM)對很好表征的雌激素敏感性ZR-75-1乳癌異種移植物在卵巢切除裸鼠體內生長的激動劑效應和拮抗劑效應。材料和方法人ZR-75-1乳癌細胞
ZR-75-1人乳癌細胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)，在無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為細胞補充2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100IU青霉素/ml、100μg鏈霉素/ml和10％(v/v)胎牛血清，在95％空氣/5％CO2的潮濕環(huán)境中、于37℃孵育。將細胞每周傳代，并用0.083％胰酶制劑/0.3mM EDTA于85-90％鋪滿時收獲細胞。動物和腫瘤接種
雌性純合nu/nu Br無胸腺小鼠(28-42日齡)得自Charles River，Inc.(Saint-Constant，Québec，Canada)。小鼠(每個籠子5只)關養(yǎng)在保持在空氣層流罩超凈臺中的具有空氣過濾罩的乙烯籠子中，并且在限制病原體的條件下維持。光周期為12小時光照和12小時黑暗(于0715開燈)?；\子、褥草和食物(Agway Pro-Lab R-M-H Diet#4018)在使用之前進行高壓滅菌。將水高壓滅菌，并且任意供應。在異氟烷誘導的麻醉下切除兩側卵巢。在卵巢切除時，皮下插入雌二醇(E2)植入物，以刺激原始腫瘤生長。在1cm長的硅橡膠管(內徑0.062英寸；外徑0.095英寸)中制備E2植入物，該植入物含有0.5cm的1∶10(w/w)的雌二醇和膽固醇的混合物。卵巢切除后一周，將0.1ml RPMI-1640培養(yǎng)基+30％Matrigel中的2×106ZR-75-1(第93代)細胞通過2.5cm長的22號針頭皮下接種到每只卵巢切除(OVX)小鼠的兩側脅腹。4周后，所有動物體內的E2植入物用相同大小的含雌酮植入物(E1∶膽固醇，1∶25，w∶w)取代。1周后開始隨機化和治療。治療
在治療開始前一天，將帶有平均面積為24.4±0.4mm2(范圍為5.7-50.7mm2)的ZR-75-1腫瘤的255只小鼠隨機指定到17個組(根據腫瘤大小)中，每組有15只小鼠(總共29或30個腫瘤)。這17個組包括2個對照組(OVX和OVX+雌酮)、7個補充雌酮植入物并用抗雌激素治療的組、以及8個僅接受一種抗雌激素的其它組。然后從卵巢切除的對照組(OVX)和將僅接受所述抗雌激素的組的動物體內取出雌酮植入物。此后，在9個其它組中的含雌酮植入物每6周進行更換。在Oncologyand Molecular Endocrinology Research Center的醫(yī)藥化學部，合成EM-652.HCl、雷洛昔芬、屈洛昔芬、艾多昔芬和GW 5638。他莫昔芬購自Plantex(Netanya，Israёl)，而檸檬酸托瑞米芬購自Orion(Espoo，Finland)。在雌酮刺激下，以懸浮于0.2ml 0.4％(w/v)甲基纖維素中的50μg(平均2mg/kg)的口服日劑量給予所述抗雌激素。在無雌酮刺激的情況下，動物通過口服途徑，每日一次用200μg(平均8mg/kg)每種抗雌激素治療。兩個對照組中的動物僅接受0.2ml的所述溶媒。每個月制備合適濃度的所述抗雌激素懸浮液，于4℃貯存，并在恒定攪拌下使用。粉劑儲備物密封貯存于4℃(艾多昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、GW 5638、屈洛昔芬)或室溫(他莫昔芬、EM-652.HCl)。腫瘤測量和尸體剖檢
記錄兩個垂直的直徑，用以下公式計算腫瘤面積(mm2)L/2×W/2×π。將治療的第一天測量的面積作為100％。
治療161天后，用異氟烷麻醉留下的動物，并通過斷頭術將其殺死。為了進一步鑒定所述雌激素和抗雌激素的效應，立即取出雌激素效應組織，例如子宮和陰道，去除結締組織和脂肪組織，并稱重。準備子宮，以通過用Image Pro-Plus(Media Cybemetics，Maryland，USA)進行的圖象分析來評價子宮內膜厚度。簡而言之，將子宮在10％福爾馬林中固定，并包埋在石蠟中。分析小鼠子宮的蘇木精染色和曙紅染色的切片。每個子宮分析4個圖象(每個子宮角2個圖象)。在每組所有動物中測量平均上皮細胞高度。反應標準
在研究結束時或在每只動物死亡時(如果這在實驗過程中發(fā)生)評價腫瘤反應。在這種情況下，在所述腫瘤反應分析中，僅使用存活時間達該項研究的至少一半時間(84天)的小鼠的數據。簡而言之，完全消退鑒別在實驗結束時檢測不到的腫瘤；部分消退對應于消退≥其原始大小的50％的腫瘤；穩(wěn)定反應是指消退＜50％或發(fā)展≤50％的腫瘤；而發(fā)展是指與其原始大小相比發(fā)展≥50％的腫瘤。統計學分析
按照用于重復度量的ANOVA，分析第1天和第161天之間總腫瘤表面積的變化。該模型包括治療、時間、和時間-治療相互作用效應加上用于說明隨機化所述層的項。因而，根據時間-治療相互作用，檢驗161天時不同治療效應的顯著性。殘差分析指出，對原始尺度的度量不適合于用ANOVA分析，也不適合于嘗試的任何變換。因此根據所述分析，選擇所述秩。治療對上皮厚度的影響通過也包括隨機化時的層的單因素ANOVA來評價。用最小平方均數統計，進行后驗配對比較(posteriori pairwise comparison)。總體1型誤差率(α)控制在5％，以宣布所述差異的顯著性。所有計算均采用SAS軟件(SAS Institute，Carry，NC)上的Proc MIXED進行。結果對ZR-75-1腫瘤生長的拮抗劑效應
單獨的雌酮(OVX+E1)在23周治療期內引起ZR-75-1腫瘤大小增加707％(圖19A)。將50μg口服日劑量的純抗雌激素EM-652.HCl給予雌酮刺激的小鼠，完全防止腫瘤生長。事實上，不僅防止腫瘤生長，而且在治療23周后，腫瘤大小比治療開始時的原始數值低26％(p＜0.04)。在用EM-652.HCl治療后獲得的這一數值與在僅卵巢切除(OVX)后觀察到的數值沒有統計學差異，在僅卵巢切除后，腫瘤大小比原始腫瘤大小降低61％。在相同劑量(50μg)和治療期下，所述6種其它抗雌激素沒有降低原始平均腫瘤大小。在這些組中的腫瘤都顯著高于OVX對照組和EM-652.HCl治療組(p＜0.01)。事實上，與治療前數值相比，用屈洛昔芬、托瑞米芬、GW 5638、雷洛昔芬、他莫昔芬和艾多昔芬治療23周，分別導致平均腫瘤大小高于治療前數值478％、230％、227％、191％、87％和86％(圖19A)。對ZR-75-1腫瘤生長的激動劑效應
在不補充雌酮的情況下，用200μg日劑量的他莫昔芬治療161天后，平均腫瘤大小增加至高于基線196％(p＜0.01，相對于OVX)(圖19B)。另一方面，用艾多昔芬治療的小鼠的平均腫瘤大小增加(125％)(p＜0.01)，而在用托瑞米芬治療的小鼠體內腫瘤大小增加86％(p＜0.01)(圖19B)。將200μg EM-652.HCl加入200μg他莫昔芬，完全抑制僅用他莫昔芬觀察到的增殖(圖19C)。另一方面，在實驗結束時，與OVX對照組相比，用單獨的EM-652.HCl(p＝0.44)、雷洛昔芬(p＝0.11)、屈洛昔芬(p＝0.36)或GW 5638(p＝0.17)治療，不顯著改變ZR-75-1的腫瘤大小(圖19B)。對反應類別的影響在雌酮刺激時50μg抗雌激素的影響
除了對腫瘤大小的影響外，在實驗結束時各個腫瘤達到的反應類別是療效的一個重要參數。在卵巢切除小鼠中，分別在21％、43％和38％的腫瘤中達到完全反應、部分反應和穩(wěn)定反應，而所述腫瘤沒有一個發(fā)展。另一方面，在補充雌酮的OVX動物中，100％的腫瘤已經發(fā)展(圖20A)。在EM-652.HCl治療的補充雌酮的OVX動物組中，分別在17％、17％和60％的腫瘤中觀察到完全反應、部分反應和穩(wěn)定反應，而僅7％的腫瘤(30個腫瘤中的2個腫瘤)發(fā)展。在相同的雌酮刺激條件下，用50μg日劑量的任一所述其它抗雌激素治療不能將發(fā)展中腫瘤的百分率降至低于60％。事實上，在他莫昔芬治療組中65％的腫瘤(26個中的17個)發(fā)展，而用托瑞米芬治療有89％的腫瘤(28個中的25個)發(fā)展，用雷洛昔芬治療有81％的腫瘤發(fā)展(26個中的21個)，用屈洛昔芬治療100％的腫瘤(23個中的23個)發(fā)展，而用艾多昔芬治療有71％的腫瘤(28個中的20個)發(fā)展，用GW 5638治療有77％的腫瘤(26個中的20個)發(fā)展(圖20A)。在無雌酮刺激下200μg抗雌激素對反應類別的影響
如圖20B所示，他莫昔芬、艾多昔芬和托瑞米芬在無雌酮刺激的情況下導致發(fā)展中腫瘤的比率高于使用所述其它抗雌激素的所述比率。事實上，在他莫昔芬、艾多昔芬和托瑞米芬以200μg的日劑量治療后，分別有62％(26個中的16個)、33％(24個中的8個)和21％(28個中的6個)的腫瘤屬于發(fā)展類別。如圖20C中可以見到的，將200μgEM-652.HCl加入他莫昔芬中，將僅用他莫昔芬的發(fā)展中腫瘤的百分率從62％(26個中的16個)降至將EM-652.HCl加入他莫昔芬中時的7％(28個中的2個)?？勾萍に貙ψ訉m上皮細胞厚度的影響
測量子宮內膜上皮細胞高度，作為子宮內膜中每種化合物的激動劑效應和拮抗劑效應的最直接的參數。在存在雌酮刺激時每日50μg抗雌激素對子宮上皮細胞厚度的影響
在50μg口服日劑量下，EM-652.HCl將雌酮對上皮高度的刺激效應抑制70％。所測試的6種其它抗雌激素的功效顯著較低(p＜0.01)。事實上，屈洛昔芬、GW 5638、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬和艾多昔芬對雌酮刺激分別抑制17％、24％、26％、32％、41％和50％(表10)。在無雌酮刺激時每日200μg抗雌激素對子宮上皮細胞厚度的影響
無雌酮刺激時，EM-652.HCl和屈洛昔芬是所測試的僅有的不顯著增加上皮細胞高度的化合物(分別為OVX對照組數值的114％和101％)。他莫昔芬(155％)、托瑞米芬(135％)和艾多昔芬(176％)對子宮上皮高度有顯著刺激作用(p＜0.01，相對于OVX對照組)。雷洛昔芬(122％)和GW 5638(121％)對子宮上皮高度有統計學顯著性的刺激作用(p＜0.05，相對于OVX對照組)(表10)。所測量的每種抗雌激素對子宮重量和陰道重量的激動劑效應和拮抗劑效應同對子宮上皮厚度所觀察的模式一致(數據未顯示)。
表10
a，b實驗小鼠相對于OVX對照小鼠aP＜0.05；bP＜0.01。
c，d實驗小鼠相對于EM-652.HCl治療小鼠cP＜0.05；dP＜0.01。
實施例9在口服一劑14C-EM-800(20mg/kg)后雌性大鼠腦中的放射性
實施例9顯示了在口服一劑14C-EM-800(20mg/kg)后大鼠腦中的放射性。為了比較，包括了得自這些動物中的每只的血液、血漿、肝和子宮的數值。這些結果來自LREM研究第1129號-在給雄性和雌性Long-Evans大鼠口服一劑14C-EM-800(20mg/2ml/kg)后放射性的組織分布和排泄。這些數字表明，雌性Long-Evans大鼠腦中來源于藥物的總放射性量非常低(ng相當物/g組織)，在給藥后12小時后檢測不到。2小時時，腦中的放射性比肝中的放射性低412倍，比子宮中的放射性低21倍，比血液中的放射性低8.4倍，比血漿中的放射性低13倍。由于腦中總放射性的未知部分是由于血液放射性的污染所致，因此，表1中所示的腦放射性的數值過高地估計了腦組織自身中14C(EM-800)相關的放射性水平。這樣的數據提示，抗雌激素在腦組織中的水平(如果存在抗雌激素的話)太低，以致不能抵消外源雌激素的效應。重要的是注意到，在腦組織中檢測到的一些放射性可能是由于組織中的殘留血液所致。另外，用于該項研究的14C-EM-800的放射化學純度最低為96.25％。
表11
表12實施例10抗雌激素EM-652.HCl與雌二醇的組合保護抵抗子宮刺激
材料和方法
動物和治療
使用在卵巢切除時重215-265g的10-12周齡雌性Sprague-Dawley大鼠(CrlCD(SD)Br)(Charles River Laboratory，St-Constant，Canada)。將動物單獨關養(yǎng)在環(huán)境受控的房間(溫度22±3℃；濕度50±20％；12h光照-12h黑暗周期，于0715開燈)中。讓動物自由獲取自來水和合格的嚙齒動物飼料(Lab Diet 5002(粒料)，Ralston Purina，St-Louis，MO)。在Canadian Council on Animal Care(CCAC)和the Association forAssessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)批準的動物設備中，按照實驗動物護理和使用的CCAC指南，進行實驗。將137只大鼠隨機分配在每組13或14只動物的如下10個組中1)無傷對照；2)卵巢切除(OVX)對照；3)OVX+17β-雌二醇(E2；2mg/kg)；組4-10)OVX+E2+EM-652.HCl(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3或10mg/kg)。該研究的第1天，在異氟烷麻醉下，將合適組別的動物的兩側卵巢切除(OVX)。所述試驗化合物作為在0.4％甲基纖維素中的懸浮液(0.5ml/大鼠)從該研究的第1天至第14天經管飼法每日口服一次。組1和組2的動物在所述同一時期內僅接受所述溶媒。在該研究的第15天，給每組4只動物灌注10％緩沖的福爾馬林，并加工組織以供組織學檢查。在異氟烷麻醉下通過在腹主動脈進行驅血法殺死其它動物。取出子宮和陰道，剝除剩余的脂肪并稱重。將得自每個子宮的標本在10％緩沖的福爾馬林中固定，以供采用計算機輔助程序(SoftwareImage-Pro Plus)測定子宮內膜上皮細胞高度。血清膽固醇水平
從禁食過夜的動物收集血清樣品，用Boehringer MannheimDiagnostic Hitachi 911分析儀(Boehringer Mannheim DiagnosticLaboratory Systems)，測定血清樣品的總膽固醇。統計學分析
數據以均數±SEM表示。按照Duncan-Kramer的多重極差檢驗(Kramer，Biometrics 12307-310，1956；)，測定統計學顯著性。結果
通過每日口服給予2mg/kg劑量的17β-雌二醇(E2)，完全逆轉了在卵巢切除后2周所觀察到的子宮重量的65％減少(490±26mg相對于480±17mg；N.S.)(圖21)。如同一圖中所示，用增加劑量EM-652.HCl，觀察到E2對子宮重量刺激效應的進行性抑制作用，在3mg/kg和10mg/kg劑量的該抗雌激素下分別觀察到對E2效應的84％和87％的逆轉。對子宮內膜上皮高度獲得了相當的結果(圖22)。事實上，E2刺激的子宮內膜上皮高度被3mg/kg和10mg/kg劑量的所述抗雌激素分別阻止了83％和93％。與無傷對照動物(31.1±0.7μm)相比，在用E2化合物治療的OVX動物組(41.9±1.2μm)中子宮內膜上皮高度較高(34.7％，p＜0.01)(圖23)。
給OVX動物補充E2，導致陰道重量與無傷動物陰道重量相似(149.9±9.0mg相對于145±5.3mg，N.S.)。在圖24中可以看到，在高于對子宮重量所觀察的劑量的EM-652.HCl下，觀察到對陰道重量的抑制作用。事實上，在至多1mg/kg的所述化合物下，沒有觀察到所述抗雌激素對陰道重量的顯著性抑制效應。事實上，雖然3mg/kg劑量的EM-652.HCl引起對E2刺激效應的統計學非顯著性的50％抑制，但在10mg/kg劑量的所述抗雌激素下，觀察到完全逆轉了E2對陰道重量的效應。
在OVX后2周，觀察到血清膽固醇增加37％(p＜0.01)。另一方面，用E2治療OVX動物，引起對血清膽固醇水平的53％抑制(p＜0.01)(圖25)。加入日劑量為0.01mg/kg至0.3mg/kg的EM-652.HCl，對E2的抑制作用沒有統計學顯著性的影響。另一方面，1.0、3.0和10mg/kg劑量的EM-652.HCl將E2的效應分別降低36％、30％和50％。本發(fā)明的數據清楚地證明，抗雌激素EM-652.HCl中和了雌激素在外周組織中作用的兩個充分確定的參數-E2對子宮重量和子宮內膜上皮高度的刺激效應。這些數據清楚地表明，在接受雌二醇以減輕血管舒縮癥狀的絕經后婦女中共同給予EM-652.HCl將預防雌激素對子宮內膜的刺激效應。
1.0mg/kg、3.0mg/kg和10mg/kg劑量的EM-652.HCl的抑制效應的36％、30％和50％逆轉，可能可以用所述抗雌激素的所述效應占優(yōu)勢來解釋，單獨使用所述抗雌激素時也許引起同樣程度的抑制。事實上，EM-652.HCl對大鼠子宮ER的親和性比E2本身對ER的親和性高約5倍(Martel等，J.Steroid Biochem.Molec.Biol.，64199-205，1998)。
藥用組合物和試劑盒實施例
以下通過實施例來敘述，但不限于所述實施例，敘述幾種利用優(yōu)選的活性SERM EM-800或EM-652.HCl(EM-1538)和優(yōu)選的活性雌激素17β-雌二醇、乙炔基雌二醇或結合雌激素的藥用組合物和試劑盒?？梢允褂帽景l(fā)明的其它化合物或其組合，來取代EM-800或EM-652.HCl或17β-雌二醇或乙炔基雌二醇，或者除EM-800或EM-652.HCl或17β-雌二醇或乙炔基雌二醇外，使用本發(fā)明的其它化合物或其組合。有效成分的濃度可以在下文討論的寬范圍內變動。可以包括的其它成分用量和類型是本領域眾所周知的。
實施例A
用于口服的藥用組合物(膠囊)
或
實施例B
試劑盒
口服所述SERM和雌激素 用于口服的非類固醇抗雌激素組合物(膠囊)
用于口服的雌激素組合物
(明膠膠囊)
其它SERM可以替代上述配方中的EM-800或EM-01538，而且其它雌激素可以替代17β-雌二醇、乙炔基雌二醇或結合雌激素?？梢园ú恢挂环NSERM或不止一種雌激素，在這種情況下，結合重量百分率最好是在上述實施例中給出的單一雌激素或單一SERM的重量百分率的結合重量百分率。
已經借助優(yōu)選實施方案和實施例描述了本發(fā)明，但本發(fā)明不限于所述實施方案和實施例。本領域技術人員會容易認識到本發(fā)明更寬的應用性和范圍，本發(fā)明的應用性和范圍僅受本文專利的權利要求書的限定。
權利要求
1.一種降低或消除絕經癥狀發(fā)生率的方法，所述方法包括給予需要所述消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物并且不是苯并噻吩衍生物。
2.一種治療下述病癥或降低患下述病癥危險的方法骨質疏松、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、早老性癡呆、胰島素抵抗、糖尿病、肌肉質量損失、肥胖、激素替代療法誘發(fā)的陰道出血和激素替代療法誘發(fā)的乳房觸痛；所述方法包括給予需要所述消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物并且不是苯并噻吩衍生物。
3.一種治療骨質疏松或降低患骨質疏松危險的方法，所述方法包括給予需要所述消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物并且是不同于以下物質的化合物苯并噻吩衍生物、萘衍生物、異喹啉衍生物或具有超過10％的2R構型對映體的3-苯基喹啉衍生物、3-苯硫基苯并二氫吡喃衍生物、3-苯基苯并二氫吡喃衍生物的對映體混合物。
4.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含
a)一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體；
b)治療有效量的至少一種雌激素或其前藥；和
c)治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，其中所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物，并且所述調節(jié)劑不是苯并噻吩衍生物、萘衍生物、異喹啉衍生物或具有超過10％的2R構型對映體的3-苯基喹啉衍生物、3-苯硫基苯并二氫吡喃衍生物、3-苯基苯并二氫吡喃衍生物的對映體混合物。
5.一種試劑盒，所述試劑盒包括一個第一容器，所述第一容器含有一種包含治療有效量的至少一種雌激素或其前藥的藥用制劑；并且所述試劑盒還包括一個第二容器，所述第二容器含有一種包含治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥的藥用制劑，所述調節(jié)劑不是苯并噻吩衍生物。
6.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含
a)一種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體；
b)治療有效量的至少一種雌激素或其前藥；
c)治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，其中所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物；和
d)治療有效量的至少一種另外的選自下列的藥物二膦酸鹽、雄激素類藥、睪酮、脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外的藥物的前藥。
7.權利要求2的方法，其中所述方法還包括給予治療有效量的二膦酸鹽作為聯合療法的一部分的步驟。
8.一種降低或消除絕經癥狀發(fā)生率的方法，所述方法包括給予需要所述危險消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物，還包括作為聯合療法的一部分給予治療有效量的至少一種選自下列的另外藥物的步驟脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、雄激素類藥、睪酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外藥物的前藥。
9.一種治療下述病癥或降低患下述病癥危險的方法骨質疏松、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、早老性癡呆、胰島素抵抗、糖尿病、肌肉質量損失、肥胖、激素替代療法誘發(fā)的陰道出血和激素替代療法誘發(fā)的乳房觸痛；所述方法包括給予需要所述消除或降低的患者治療有效量的雌激素或其前藥并結合給予所述患者治療有效量的選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥，所述調節(jié)劑是不同于所述雌激素的化合物，還包括作為聯合療法的一部分給予治療有效量的至少一種選自下列的另外藥物的步驟脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、雄激素類藥、睪酮、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外藥物的前藥。
10.一種試劑盒，所述試劑盒包括一個第一容器，所述第一容器含有一種包含治療有效量的至少一種雌激素或其前藥的藥用制劑；并且所述試劑盒還包括一個第二容器，所述第二容器含有一種包含治療有效量的至少一種選擇性雌激素受體調節(jié)劑或其前藥的藥用制劑，所述試劑盒包括至少一個另外的容器，所述另外的容器含有治療有效量的至少一種選自下列的另外的藥物脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、雄-5-烯-3β，17β-二醇、雄激素類藥、睪酮、4-雄烯-3，17-二酮和任一上述另外藥物的前藥。
11.可用于治療骨質疏松或降低患骨質疏松危險的權利要求5或權利要求10的試劑盒，所述試劑盒包括至少一個另外的容器，所述容器含有一種包含治療有效量的至少一種二膦酸鹽的藥用制劑。
12.權利要求1的方法，所述方法還包括作為聯合療法的一部分給予治療有效量的一種雄激素類藥。
13.權利要求1-12中任一項的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑的分子式具有以下特征
a)由1-2個間插碳原子間隔的兩個芳環(huán)，兩個芳環(huán)或者是未取代的，或者被一個羥基或一個在體內轉變?yōu)榱u基的基團取代；
b)具有一個芳環(huán)和一個叔胺官能或其鹽的側鏈；并且其中所述調節(jié)劑不是苯并噻吩衍生物、萘衍生物、異喹啉衍生物或具有超過10％的2R構型對映體的3-苯基喹啉衍生物、3-苯硫基苯并二氫吡喃衍生物、3-苯基苯并二氫吡喃衍生物的對映體混合物。
14.權利要求13的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述側鏈選自
和
15.權利要求13的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑選自三苯乙烯衍生物、吲哚衍生物、苯并吡喃衍生物、HMR 3339、HMR 3656、LY 335124、LY 326315、SH 646、ERA 923和苯并二氫吡喃(centchroman)衍生物。
16.權利要求6的藥用組合物、權利要求8和9的方法或權利要求10的試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑是下式的苯并噻吩衍生化合物
其中R1和R2獨立選自氫、羥基和在體內轉變?yōu)榱u基的部分；
其中R3和R4或者(a)獨立地為C1-C4烷基，或者(b)是與它們連接的氮結合為選自下列的部分吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亞甲基亞氨基和嗎啉代；
其中A選自-CO-、-CHOH和-CH2-；
其中B選自亞苯基、亞吡啶基和-環(huán)C4H2N2-。
17.權利要求16的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑選自雷洛昔芬、LY 353381和LY 335563。
18.權利要求13的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑是下式的三苯乙烯或二苯基氫化萘衍生化合物
或
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4、-OCH2CH2OH或-CH＝CH-COOH(R3和R4或者獨立選自C1-C4烷基，或者R3、R4以及與它們連接的氮原子一起為選自下列的環(huán)結構吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亞甲基亞氨基和嗎啉代)；
其中E和K獨立地為氫或羥基、磷酸酯或低級烷基，其中J為氫或鹵素。
19.權利要求1-14中任一項的方法、藥用組合物或試劑盒，其中選擇性雌激素受體調節(jié)劑是OH-他莫昔芬、屈洛昔芬、托瑞米芬、艾多昔芬、Lasofoxifene、iproxifene、FC1271和GW5638。
20.權利要求13的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑是下式的吲哚衍生化合物
其中D選自-OCH2CH2N(R7)R8、-CH＝CH-CON(R7)R8、-CC-(CH2)n-N(R7)R8(R7和R8或者獨立選自C1-C6烷基，或者R7、R8以及與它們連接的氮原子一起為選自下列的環(huán)結構吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亞甲基亞氨基、嗎啉代)；
其中X選自氫和C1-C6烷基；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立選自氫、羥基、C1-C6烷基和在體內轉變?yōu)榱u基的部分。
21.權利要求20的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑是TSE 424(2-(4-羥基苯基)-3-甲基-1-[[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]甲基]-1H-吲哚-5-醇)。
22.權利要求13的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑是下式的苯并二氫吡喃衍生化合物
其中R1和R2獨立選自氫、羥基和在體內轉變?yōu)榱u基的部分；
其中R5和R6獨立地為氫或C1-C6烷基；
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4(R3和R4或者獨立選自C1-C4烷基，或者R3、R4以及與它們連接的氮原子一起為選自下列的環(huán)結構吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亞甲基亞氨基、嗎啉代)。
23.權利要求22的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述苯并二氫吡喃衍生物為(3，4-反式-2，2-二甲基-3-苯基-4-[4-(2-(2-(吡咯烷-1-基)乙氧基)苯基]-7-甲氧基苯并二氫吡喃)。
24.權利要求13的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑具有以下結構式
其中R1和R2獨立選自氫、羥基和在體內轉變?yōu)榱u基的部分；其中Z或者不存在或者選自-CH2-、-O-、-S-和-NR3-(R3為氫或低級烷基)；
其中R100為使L離開所述B-環(huán)4-10個間插原子的二價部分；
其中L為選自-SO-、-CON-、-N＜和-SON＜的二價或三價部分；
其中G1選自氫、C1-C5烴、與G2和L結合在一起為一個5-7元雜環(huán)的二價部分和上述基團的鹵代衍生物或不飽和衍生物；
其中G2或者不存在或者選自氫、C1-C5烴、與G1和L結合在一起為一個5-7元雜環(huán)的二價部分和上述基團的鹵代衍生物或不飽和衍生物；
其中G3選自氫、甲基和乙基。
25.權利要求24的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述化合物是具有以下通用結構的苯并吡喃衍生物或其藥學上可接受的鹽
其中D是-OCH2CH2N(R3)R4(R3和R4或者獨立選自C1-C4烷基，或者R3、R4以及與它們連接的氮原子一起為選自下列的環(huán)結構吡咯烷基、二甲基-1-吡咯烷基、甲基-1-吡咯烷基、哌啶子基、六亞甲基亞氨基、嗎啉代)；
其中R1和R2獨立選自氫、羥基和在體內轉變?yōu)榱u基的部分。
26.權利要求25的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述苯并吡喃衍生物由于大多數其立體異構體在碳2上具有絕對構型S而具有旋光性，所述化合物具有以下分子結構
其中R1和R2獨立選自羥基和在體內轉變?yōu)榱u基的部分；
其中R3是選自以下的種類飽和、不飽和或取代的吡咯烷基，飽和、不飽和或取代的哌啶子基，飽和、不飽和或取代的哌啶基，飽和、不飽和或取代的嗎啉代，含氮環(huán)部分，含氮多環(huán)部分，和NRaRb(Ra和Rb獨立地為氫、直鏈或支鏈C1-C6烷基、直鏈或支鏈C2-C6鏈烯基和直鏈或支鏈C2-C6鏈炔基)。
27.權利要求26的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述化合物或鹽基本缺乏(2R)-對映體。
28.權利要求26的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑選自EM-800
EM-1520
EM-1872
EM-1900
EM-1901
EM-1903
EM-1533
EM-1518
和EM-652.HCl(EM-1538)
其中指出其立體化學的所有上述分子結構由于大多數其立體異構體具有2S構型而具有旋光性。
29.權利要求26的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述苯并吡喃衍生物是選自以下的一種酸的鹽乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、富馬酸、氫碘酸、氫溴酸、鹽酸、氫氯噻嗪酸、羥基萘甲酸、乳酸、馬來酸、甲磺酸、甲基硫酸、1，5-萘二磺酸、硝酸、棕櫚酸、新戊酸、磷酸、丙酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對苯二甲酸、對甲苯磺酸和戊酸。
30.權利要求29的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述酸是鹽酸。
31.權利要求1-12中任一項的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑是EM-652.HCl(EM-1538)
并且由于大多數其立體異構體具有2S構型而具有旋光性；和
其中所述雌激素選自17β-雌二醇、17β-雌二醇酯、17α-雌二醇、17α-雌二醇酯、雌三醇、雌三醇酯、雌酮、雌酮酯、結合雌激素、馬烯雌酮、馬烯雌酮酯、17α-乙炔基雌二醇、17α-乙炔基雌二醇酯、美雌醇和美雌醇酯。
32.權利要求1-12中任一項的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述雌激素選自17β-雌二醇、17β-雌二醇酯、雌三醇、雌三醇酯、雌酮、雌酮酯、結合雌激素、馬烯雌酮、馬烯雌酮酯、17α-乙炔基雌二醇、17α-乙炔基雌二醇酯、美雌醇、美雌醇酯、苯雌酚(chemestrogen)、DES、植物雌激素、替勃龍、2’-乙基雌激素噁唑(ethylestrogenoxazole)和炔諾醇。
33.權利要求1、2、3、8和9中任一項的方法，其中所述選擇性雌激素受體調節(jié)劑在乳房組織或子宮內膜組織中沒有雌激素活性。
34.權利要求1-12中任一項的方法、藥用組合物或試劑盒，其中所述雌激素是一種混合雌激素/雄激素化合物。
35.權利要求34的方法，其中所述混合雌激素/雄激素化合物是替勃龍。
36.權利要求1和8的方法，其中絕經癥狀選自熱潮紅、血管舒縮癥狀、不規(guī)則月經、陰道干燥、頭痛和睡眠障礙。
37.權利要求1的方法，其中所述治療降低所述患者患乳癌或子宮內膜癌的危險。
全文摘要
公開了在易感的溫血動物包括人類中降低或消除熱潮紅和絕經癥狀發(fā)生率、同時降低患乳癌或子宮內膜癌的危險、此外還治療和/或抑制以下疾病發(fā)展的新方法骨質疏松、血膽固醇過多、血脂過多、動脈粥樣硬化、高血壓、胰島素抵抗、糖尿病、肌肉質量損失、肥胖、不規(guī)則月經、早老性癡呆或陰道干燥；所述方法包括給予選擇性雌激素受體調節(jié)劑(特別是具有通用結構(I)的化合物)和一定量的雌激素或混合雌激素/雄激素化合物。尤其公開了進一步給予二膦酸鹽或性類固醇前體，用于藥物治療和/或抑制這些上述疾病中某些疾病的發(fā)展。也公開了可用于本發(fā)明的用于傳遞有效成分的藥用組合物和試劑盒。
文檔編號A61P21/00GK1400904SQ01804028
公開日2003年3月5日 申請日期2001年1月26日 優(yōu)先權日2000年1月28日
發(fā)明者F·拉布里 申請人:恩多研究公司