專利名稱：處理或抑制細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過提供使用TNFα拮抗劑的療法處理或者抑制缺血事件后的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡，處理或者抑制再灌注損傷，和降低心肌梗塞后的死亡率。
血管床血流的減少或者中斷是許多臨床事件的原因，這些事件需要立即處理并且對受損器官或者組織恢復(fù)充分灌注。不同組織可以承受不同程度的缺血損傷。然而，如果不進(jìn)行再灌注，所有組織會發(fā)展為不可逆的損傷和細(xì)胞壞死。心臟組織減少灌注(缺血)，會導(dǎo)致心臟因為組織缺少氧氣和能量而喪失正常工作的能力。永久損傷與心肌所經(jīng)受的氧氣缺少的持續(xù)時間直接相關(guān)。缺血組織再灌注，簡單的是指到那些組織或者器官系統(tǒng)的血流恢復(fù)。通過機(jī)械或者藥理方法實現(xiàn)再灌注的必要性，已經(jīng)為醫(yī)療團(tuán)體所接受，特別是在心肌梗塞臨床處理中。數(shù)據(jù)顯示當(dāng)血流回到組織時，“再灌注損傷”會損害組織救治的程度。
如冠狀血管成型術(shù)溶栓治療這樣的治療干預(yù)，是直接針對急性心肌缺血治療的。已經(jīng)熟知，發(fā)生心肌梗塞病人的死亡率，直接依賴于左心室功能障礙的程度，后者與形成梗塞并因此失去功能的心肌的數(shù)量直接相關(guān)。一般有這樣的共識，經(jīng)受一段時間缺血的心肌組織，取決于在確定時間內(nèi)用于恢復(fù)細(xì)胞存活力和功能的血流恢復(fù)。
缺血后的受損組織只能通過再灌注進(jìn)行恢復(fù)。雖然再灌注的做法會進(jìn)一步加重?fù)p傷。因為研究者開始認(rèn)識到這一點，所以研究工作都是針對作用機(jī)制，以及開發(fā)用于抑制與再灌注損傷相關(guān)的細(xì)胞損傷的潛在治療方法。很多細(xì)胞機(jī)制被認(rèn)為是造成缺血引起的再灌注損傷的原因。
TNFα是一種巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它對很多細(xì)胞類型都可以造成廣泛的作用。TNF蛋白質(zhì)通過與在TNF應(yīng)答細(xì)胞漿膜上表達(dá)的特異性TNF受體(TNFR)蛋白質(zhì)結(jié)合，激發(fā)對細(xì)胞的生物效應(yīng)。TNFα引起的效應(yīng)包括，對腫瘤細(xì)胞系的抑制作用或者細(xì)胞毒性作用，刺激成纖維細(xì)胞的增殖以及骨髓細(xì)胞的細(xì)胞吞噬/細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的粘連分子，抑制脂肪細(xì)胞中特定酶的合成，以及誘導(dǎo)組織相容性抗原的表達(dá)。[參見，美國專利5,610,279]。TNFα也能引起促炎作用，該促炎作用引起組織損傷，例如軟骨和骨降解[Saklatvala，Nature 322547(1986)；Bertolini，Nature 319516(1986)]。TNFα也與感染、免疫紊亂、腫瘤病理、自身免疫病理、以及對宿主的移植疾病相關(guān)。TNFα也涉及引起與癌癥相關(guān)的稱作惡病質(zhì)的衰竭綜合征，它包括反應(yīng)于惡性生長的進(jìn)展性體重減輕、厭食、以及對瘦弱體質(zhì)的持續(xù)侵蝕。[參見WO 98/51344]。
TNFα也被認(rèn)為有助于引起心室功能紊亂、肺水腫、以及心肌病。[Torre-Amione G，J Am Coll Cardiol 271201-1206(1996)]。不斷增加的證據(jù)表明，由TNF與TNF受體I和II(TNFR，p55，p75)結(jié)合觸發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)的成分是造成在心肌中觀察到的急性損傷效應(yīng)的直接原因[Oral，H.，J Biol Chem.272(8)4836-4842(1997)；Kapadia，S.，Am J.Physiol.268H517-H525(1995)]。
已表明包括TNF的炎癥細(xì)胞因子是由肌細(xì)胞在缺血發(fā)生后立即釋放[Meldrum，D.R.，J Mol Cell Cardiol.301683-1689(1998)]，并且認(rèn)為其參與粘連分子的表達(dá)，這些粘附分子有助于中性粒細(xì)胞外滲。鞘磷脂酶途徑可以通過TNF釋放而激活，而且被認(rèn)為是細(xì)胞因子重要的信號傳遞途徑[Kim et al.J Biol Chem 266484-489(1991)；Dressler et al.，Science 2551715-1718(1992)；Yang et al.J Biol Chem 26820520-20523(1993)]。該途徑被證明存在于心肌細(xì)胞中。[Oral et al.，J Biol Chem 2724836-4842(1997)]。鞘磷脂酶可被TNF激活，而將與膜結(jié)合的鞘磷脂降解為神經(jīng)酰胺。內(nèi)源神經(jīng)酰胺酶催化神經(jīng)酰胺合成鞘氨醇。已證明神經(jīng)酰胺和鞘氨醇都具有第二信使特性。已表明鞘氨醇能通過降低鈣誘導(dǎo)的肌漿網(wǎng)鈣釋放以及直接抑制L-型鈣流的能力而抑制心臟功能。Cain等[Crit CareMed.27(7)1309-1318(1999)]使用懸浮在器官浴中的激活的人心房小梁，并且記錄了組織產(chǎn)生的展開力。加入濃度分級的TNF-α、IL-1β或者TNF-α+IL-1β，并評估功能。另外，在TNF-α或者IL-1β之前把組織暴露于N-油酰乙醇胺(NOE)。TNF-α和IL-1β都以濃度依賴方式抑制人心肌的功能。通過NOE對心肌鞘氨醇抑制，消除了TNF-α或者IL-1β的心肌抑制作用。研究者總結(jié)了TNF-α和IL-1β能分別和協(xié)同抑制人心肌功能。鞘氨醇可能參與導(dǎo)致人心肌功能抑制的TNF-α和IL-1β信號。
細(xì)胞損傷也被證明存在于其他組織中。在鞘氨醇和代謝物以及C2、C8或者C16神經(jīng)酰胺存在或者不存在的情況下培養(yǎng)成人腎臟近端小管(HK-2)細(xì)胞0-20小時。鞘氨醇(＞或者＝10微摩爾每升)和選擇的神經(jīng)酰胺(C2和C8)在沒有DNA梯或者細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變時，都誘導(dǎo)快速的濃度依賴的細(xì)胞毒性，表明是細(xì)胞死亡的一種壞死形式。研究者能夠在人包皮成纖維細(xì)胞中重現(xiàn)該結(jié)果，表明這與急性細(xì)胞損傷和修復(fù)區(qū)域廣泛相關(guān)[Iwata et al.，PANS 92(19)8970-8974(1995)]。
ENBREL(etanercept；p75TNFRFc)是一種二聚體融合蛋白質(zhì)，由人75千道爾頓(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合蛋白質(zhì)，和與其連接的人IgG1 Fc部分組成。Etanercept是一種目前市場上銷售的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的TNFα拮抗劑，而且正在進(jìn)行慢性心力衰竭治療的臨床試驗[Bozkurt B，JACC(Suppl)184-185A(1999)；Deswal A，Circulation (suppl)96(8)I-323(1997)]。
WO 98/51344公開了結(jié)合VEGF拮抗劑使用TNFα拮抗劑治療或者預(yù)防TNF-介導(dǎo)疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、以及與移植有關(guān)的急性和慢性免疫疾病。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種處理或者抑制缺血事件后的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡的方法，該方法包括提供有效劑量的TNFα拮抗劑。更具體地，本發(fā)明提供了通過提供有效劑量的TNFα拮抗劑，處理或者抑制由于心肌梗塞、心肌缺血、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜中動脈阻塞、外周動脈阻塞(例如，栓塞)、短暫缺血發(fā)作(例如，腦缺血發(fā)作)、缺血性卒中、缺血性動脈阻塞引起的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡，以及處理和抑制由于凍瘡、動脈血栓形成和阻塞、以及擠壓傷引起的再灌注損傷的一種方法。本發(fā)明也提供了一種通過提供有效劑量TNFα拮抗劑以降低心肌梗塞后死亡率的方法。本發(fā)明另外提供了一種通過提供有效劑量TNFα拮抗劑以抑制心臟缺血事件后心臟損傷的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種通過提供有效劑量TNFα拮抗劑以處理或者抑制再灌注損傷的方法。
本發(fā)明所使用的術(shù)語提供有效劑量TNFα拮抗劑，是指或者直接給予這種拮抗劑，或者給予能在體內(nèi)形成有效劑量TNFα拮抗劑的藥物前體、衍生物或者類似物。
術(shù)語TNFα拮抗劑在WO 98/51344中有精確定義，定義為在體內(nèi)降低、阻斷、抑制、消除或者干擾TNFα活性。例如，合適的TNFα拮抗劑能夠結(jié)合TNFα，并且包括抗-TNFα抗體、其抗原結(jié)合片段，以及受體分子和特異結(jié)合TNFα的衍生物。合適的TNFα拮抗劑也能阻止或者抑制TNFα合成和/或TNFα釋放，并且包括這樣的化合物，例如酞胺哌啶酮、替尼達(dá)普，以及磷酸二酯酶抑制劑，例如，但不局限于己酮可可堿和咯利普蘭。能阻止或者抑制TNFα合成和/或TNFα釋放的合適的TNFα拮抗劑，也包括A2b腺苷受體增強(qiáng)子和A2b腺苷受體激動劑(例如，51-(N-環(huán)丙基)-羧基酰胺腺苷，51-N-乙基羧基酰胺腺苷，環(huán)己基腺苷和R-N6-苯基-2-丙基腺苷)參見，例如，Jancobson，GB 2 289218A。合適的TNFα拮抗劑也能夠阻止或者抑制TNFα受體信號傳導(dǎo)，包括分裂素激活蛋白(MAP)激酶抑制劑。其他合適的TNFα拮抗劑包括降低、阻斷、抑制、消除或者干擾膜TNFα剪切的試劑，例如，但不局限于金屬蛋白酶抑制劑；降低、阻斷、抑制、消除或者干擾TNFα活性的試劑，例如，但不局限于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑，例如卡托普利、依那普利和賴諾普利；以及降低、阻斷、抑制、消除或者干擾TNFα產(chǎn)生和/或合成的劑試，例如，但不局限于MAP激酶抑制劑。
TNFα拮抗劑優(yōu)選結(jié)合TNFα。更優(yōu)選的TNFα受體分子是一種TNFα受體片段/免疫球蛋白融合蛋白。更加優(yōu)選的是，該融合蛋白包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重鏈的部分或者全部恒定區(qū)。
特別優(yōu)選的TNFα拮抗劑是etanercept(p75TNFRFc)，它是一種二聚體融合蛋白質(zhì)，由人75千道爾頓(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合蛋白質(zhì)，和與其連接的人IgG1 Fc部分組成。Etanercept的商業(yè)銷售名稱是ENBREL，目前被允許用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。Etanercept可以根據(jù)美國專利5,605,690，5,478,925，EP 464533和EP 670730中描述的方法制備，這些專利在此引入作為參考。
另一種優(yōu)選的TNFα拮抗劑稱作p55TNFRFc，它是一種二聚體融合蛋白質(zhì)，由人55千道爾頓(p55)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的細(xì)胞外配體結(jié)合蛋白質(zhì)和與其連接的人IgG1 Fc部分連接。p55TNFRFc的制備公開在美國專利5,610,279中，該專利此處收作參考。
TNFα拮抗劑處理或者抑制缺血事件后的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡的能力，以及處理或者抑制再灌注損傷的能力，在兩個體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗過程中得到評估。第一個試驗過程評估了TNF和鞘氨醇對心臟功能的影響，第二個試驗過程評估了主冠狀動脈阻塞30分鐘后再灌注后的存活率。在第二個試驗過程中，Etanercept作為代表性的TNFα拮抗劑被評估，該試驗?zāi)M急性心肌梗塞。也進(jìn)行了一個體外標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗過程，以評估鞘氨醇對肌細(xì)胞的心臟抑制作用。使用的步驟和得到的結(jié)果描述如下。
步驟手術(shù)準(zhǔn)備用戊巴比妥鈉(50 mg/kg I.P.)麻醉體重為505±5g的雄性Sprague-Dawley大鼠。氣管插管縫合到一定位置，與小動物呼吸器(Harvard Apparatus，Model 683，South Natick，MA)連接，設(shè)置到100次呼吸/分鐘，潮氣量為2-3mL/呼吸。用具有循環(huán)熱水的加熱墊(K-model 100，Baxter Laboratories)維持體溫。進(jìn)行左胸切開術(shù)，暴露心臟，除去心包。使用連接血管導(dǎo)管(20 Gauge)的充鹽水聚乙烯導(dǎo)管測量左心室壓力，該血管導(dǎo)管穿過心尖，并且與一個P23 ID Statham/Gould壓力傳導(dǎo)器相連。動脈血壓通過插入左頸動脈的充鹽水聚乙烯導(dǎo)管(PE 50)監(jiān)測。右頸靜脈也套管插入聚乙烯導(dǎo)管(PE 50)，用于靜脈內(nèi)藥物灌注和補(bǔ)充體積(0.9％NaCl)。皮下針置于四肢，用于心電圖記錄。所有的數(shù)據(jù)輸出都記錄于具有Po-Ne-Mah數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)(Valley View，OH)的Gould Model 6600(Valley View，OH)系列記錄儀，顯示在生理平臺CRS800W/CRS400W記錄儀(GeneralScanning Inc.，Bedford MA)上。
在第一個試驗過程中，手術(shù)處理大鼠(開胸，但不阻塞)，并通過低速靜脈輸注(每5分鐘0.1mg/kg)給予TNF、鞘磷脂、或者鞘氨醇。每只動物連續(xù)觀察15分鐘，然后進(jìn)行第二次給藥，低速靜脈輸注(每5分鐘0.3mg/kg)，每只動物再觀察15分鐘。
在第二個試驗過程中，進(jìn)行冠狀動脈阻塞的大鼠主冠狀動脈被固定，并在接近起點處使用5-0縫合進(jìn)行阻塞，縫合通過血管下，可以通過束緊PE管(PE 20)的一小段發(fā)動局部缺血。通過除去PE管小片段恢復(fù)再灌注。
確定梗塞大小取出心臟，切成5到6個冠狀切片，浸在1％氯化三苯四氮唑(TTC)中10-15分鐘。取出心臟切片，吸干，描記在乙酸鹽紙上。梗塞區(qū)域在缺血區(qū)以灰白色清楚分界，而未阻塞心肌是磚紅色的。用平面測量法確定所有切片的面積，梗塞區(qū)域以左心室的百分比表示。
大鼠血清中TNF的測定不用任何抗凝血劑，用注射器收集血液樣品，迅速置于Microtainer血清分離管(Becton Dickinson)中，2000g離心6分鐘。取出血清，立即冷凍，貯存于-20℃直至進(jìn)行分析。對每只大鼠，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，根據(jù)制造商說明使用Factor-Test-X(Genzyme Inc，Cambridge，MA.，Cat #80-3905-01)，測定在預(yù)選時間點收集的血清TNF濃度。簡言之，在0.1％牛血清白蛋白/磷酸緩沖液中1∶2稀釋100μL血清，加入雙份至96-孔微量滴定板上。通過大鼠TNF標(biāo)準(zhǔn)的濃度對其吸光度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。制造商的分析和我們實驗室的確認(rèn)表明這種分析可以測定游離TNF和結(jié)合etanercept的TNF(數(shù)據(jù)未顯示)。該分析的測量極限是10pg/mL。另外，制造商已確定該ELISA對于大鼠TNF是高度特異的。大鼠INF-γ，GRO-β/MIP-2，GRO/KC，和白細(xì)胞介素IL-1β，IL-2和IL-4，以及小鼠LIF，SCF，GM-CSF，和白細(xì)胞介素IL-1α，IL-3，IL-5，IL-7和IL-10，在濃度達(dá)到106pg/mL時，不產(chǎn)生可檢測到的交叉反應(yīng)。
心室肌細(xì)胞的分離使用Sliver，et al.，(13)中列出的改進(jìn)的Langendorff灌注方法分離心室肌細(xì)胞。簡言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg I.P.)麻醉體重2-4kg的任何性別的貓。在麻醉時，切開胸骨，迅速切除心臟，浸入4℃的無Ca++的Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)，用于主動脈套管插入。KHB有以下組分(mM)130 NaCl，4.8KCl，1.2MgSO4，1.2 NaH2PO4，25 NaHCO3，12.5葡萄糖。用95％O2/5％CO2氣體混合物平衡時溶液pH為7.35-7.40。溶液在整個過程中活躍通氣。插入套管的心臟在37℃用KHB清洗2-4分鐘，然后用含有0.7mg/mL II型膠原酶(197單位/mg；Worthington；Freehold，NJ USA)的KHB灌注12-15分鐘。把消化的心室組織與心房剖離開，切碎，用200μm孔的尼龍篩子過濾。濾出液50xg離心1-2分鐘，分離的細(xì)胞沉淀重懸浮于新鮮KHB。后一步驟進(jìn)行3次。在第三次重復(fù)時，沉淀重懸浮于含有2％牛血清白蛋白和100μMCa++的KHB中。得到的細(xì)胞懸浮液分成2等分。一份用Tyrode’s溶液(成分如下)1∶1稀釋，置于室溫(19-25℃)，在分離12小時內(nèi)用于細(xì)胞記錄。第二個等分用于平鋪細(xì)胞，用于以后的記錄，并分散至DMEM/F-12培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD，USA)1∶1混合物，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了硫酸鏈霉素(200μg/mL)和青霉素-G鈉鹽(200單位/mL)。平鋪的細(xì)胞在孵育箱(pH＝7.2)中維持室溫。懸浮培養(yǎng)基每兩天更換一次。
肌細(xì)胞的電生理記錄在36-37℃，用破碎的整細(xì)胞結(jié)構(gòu)膜片，進(jìn)行膜片鉗電流和電壓記錄(14)。對于L-型Ca2+電流的研究，細(xì)胞用改進(jìn)的Tyrode’s溶液浸泡，該溶液含有(mM)157TEA-Cl，5 CaCl2，0.5 MgC12和10 HEPES。電極內(nèi)溶液含有(mM)10L-谷氨酸，20 CsCl，10 EGTA，1 MgCl2，1 CaCl2，20 HEPES和5 ATP-Mg2+；用CsOH調(diào)節(jié)pH。在所有研究中，測得的電極電阻為2-3.5MΩ。在形成封閉之前，在浸液中調(diào)節(jié)參照零點電位。使用連接有DigiData 1200 DA/AD獲取系統(tǒng)的Axon Instruments 200B放大器(Axon Instruments，CulverCity，CA USA)進(jìn)行記錄。通過從-30到+60 mV的去極化電壓梯度(長度1秒)激發(fā)離子流，以10-mV增加，維持電位為-40mV，頻率1Hz。通過注入主瞬時去極化電流脈沖，以1Hz頻率引發(fā)動作電位。數(shù)據(jù)獲取和分析中使用的軟件是pClamp v.6.04和Originv 5.0(MicrocalSoftware，Northampton，MA)。
結(jié)果未阻塞大鼠的血液動力學(xué)參數(shù)下表顯示了鞘氨醇、鞘磷脂和TNF在未發(fā)生心肌缺血的開胸大鼠中，對下列血液動力學(xué)參數(shù)的影響心率、平均血壓、左心室血壓(LVL)和其一階導(dǎo)數(shù)(+dP/dt)。
在未發(fā)生心肌缺血的開胸大鼠中測量的心血管參數(shù)組心率 平均血壓 LVPdev +dP/dt大鼠TNF-α0.1mg/kg iv(n＝5) -3±1 4±7 1±410±5+0.3mg/kg iv -3±2 4±6 -1±39±8鞘磷脂0.1mg/kg iv(n＝4) 7±9 -3±173±111±13+0.3mg/kg iv 8±10 2±2 4±126±15鞘氨醇0.3mg/kg iv(n＝4) -4±4 -24±12 -24±8*-33±12*+1.0mg/kg iv -18±1*-17±19 -24±14 -32±18*數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。數(shù)據(jù)是在用藥15分鐘后，相對用藥前基線的百分比變化。*是指整個觀察期間與其他預(yù)處理組相比p＜0.05。
該試驗過程的結(jié)果顯示，輸注鞘氨醇(0.1+0.3mg/kg)之后，整體心肌功能顯著降低LVP從基線降低24±8％，+dP/dt從基線降低33±12％。在本試驗方法中，給大鼠外源給藥的TNF劑量所造成血清濃度，比心肌缺血后內(nèi)源產(chǎn)生的TNF Cmax高2倍。然而，在沒有炎癥反應(yīng)時，即便非常高的TNF血清濃度也不能產(chǎn)生急性心臟功能抑制，這種炎癥反應(yīng)對于激發(fā)鞘脂類級聯(lián)反應(yīng)是必需的。在沒有肌細(xì)胞損傷時，給予鞘磷脂將不會抑制功能，因為膜鞘磷脂酶將不會被TNF濃度增加而激活，不能把鞘磷脂降解為神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺是前面所述的能在分離肌細(xì)胞中降低其收縮性的代謝物。
鞘氨醇對分離肌細(xì)胞的作用為了進(jìn)一步評估鞘氨醇對心肌功能和細(xì)胞損傷的作用，分離出分離的肌細(xì)胞，如上述測定鞘氨醇對鈣流的作用。以前的研究表明，鞘氨醇能通過減少鈣離子從肌漿網(wǎng)的釋放而影響動作電位產(chǎn)生[Yasui，et al，Am J.Physiol.270C645-649(1996)；MacDonell，et al.Am J. Physiol.275H2291-2299(1998)]。上述標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗方法得到的結(jié)果顯示，鞘氨醇以濃度依賴方式縮短了分離的貓心室肌細(xì)胞的動作電位持續(xù)時間(APD)，0.25μM、2.5μM、25μM鞘氨醇分別使95％完全復(fù)極化(APD95)待續(xù)時間降低16±2％、28±2％和39±2％(n＝4)。APD縮短，主要是抑制了平臺期的結(jié)果。在外部和吸液管中的溶液中，通過使用一種K+流阻斷劑Cs+，抑制其他K+流，分離出Ca+2流(ICa-L)。通過維持肌細(xì)胞在-40mV，并且在外部溶液中用TEA-C1代替NaCl，消除快速Na+流(INa)，其中-40mV是阻止大部分(INa)的電位。暴露于鞘氨醇(2.5和25μM)，造成ICa-L的顯著阻斷(25μM時阻斷17±7和75±4％)。心臟動作電位的減少和內(nèi)向Ca+2流的減少被認(rèn)為是與在全身給藥之后直接觀察到的或者在TNFR1激活后間接觀察到的負(fù)性肌力改變有關(guān)。鞘氨醇(25μM)最終引起心肌細(xì)胞死亡，細(xì)胞死亡是通過暴露于最高濃度鞘氨醇之后造成的形態(tài)和其失去活性確定的。用TNF(200-20,000單位/mL)處理肌細(xì)胞不改變動作電位或者ICa+2-L。
有阻塞大鼠中的TNF水平如上所述，手術(shù)準(zhǔn)備大鼠并阻塞冠狀動脈。下表顯示了有心肌缺血的開胸大鼠中TNF的血清濃度。
組 賦形劑 Etanercept-30分鐘 0±0 0±00分鐘 6056±9252299±357*30分鐘2122±3712057±34960分鐘740±153 1592±258*90分鐘585±112 1108±279*120分鐘 338±44 721±209150分鐘 204±7 580±193*數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，單位pg/ml。
*是指在相同時間點，與賦形劑處理組相比p＜005。
基線＝-30分鐘，缺血結(jié)束＝0分鐘，再灌注＝30，60，90......分鐘。
在該試驗過程中，手術(shù)打開胸腔，但是沒有任何誘導(dǎo)的阻塞(假手術(shù)動物)的大鼠在整個試驗過程中具有穩(wěn)定的TNFα濃度，最大濃度242±90pg/mL。這些數(shù)據(jù)表明，血管阻塞造成TNFα水平大大增加，在缺血時期結(jié)束時達(dá)到頂峰。結(jié)果也表明，etanercept顯著降低0分鐘時反應(yīng)于血管阻塞的巨大TNFα濃度脈沖。
TNFα拮抗劑處理在有阻塞大鼠中對于死亡率的影響心肌缺血/再灌注后的存活百分比。在這個試驗中也進(jìn)行了評估。結(jié)果總結(jié)于下表。
進(jìn)行心肌缺血/再灌注的開胸大鼠，在有和無etanercept(3mg/kgiv)時的存活百分比組 賦形劑 Etanercent-30分鐘 100 1000分鐘 100 10030分鐘 83 10060分鐘 66 10090分鐘 50 89120分鐘 33 89*150分鐘 17 88*數(shù)據(jù)以存活百分比表示。
*是指在相同時間點，與賦形劑處理組相比p＜0.05。
基線＝-30分鐘，缺血結(jié)束＝0分鐘，再灌注＝30，60，90......分鐘。
在該標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗方法中，在阻塞之前立即給予etanercept(3mg/kg i.v.)，顯著降低由于心肌缺血/再灌注造成的死亡率。對于整體死亡率，在再灌注后期(t＝90分鐘)開始出現(xiàn)不同。例如，在t＝90分鐘時，賦形劑處理組的9只大鼠有4只死亡，相比較etanercept處理組的9只大鼠只有1只死亡，盡管差異沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性(p＝0.08)。在再灌注120和150分鐘時，etanercept和賦形劑對照組之間的差異，達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)顯著。在觀察到的賦形劑處理組7例死亡中，6例是由于急性泵衰竭和進(jìn)行性心動過緩，還有一只動物是死于再灌注之后早期的室性心律失常。etanercept處理組的兩例死亡都是由于心動過緩和泵衰竭。以左心室百分比表示的梗塞大小，在Etanercept組是24±3％，在賦形劑對照組是26±2％，表明不同的存活率不是梗塞大小不同的結(jié)果。這些結(jié)果表明，用TNFα拮抗劑處理，降低了心肌缺血/再灌注引起的死亡率，推測可能是由于阻止了從鞘磷脂產(chǎn)生鞘氨醇的級聯(lián)反應(yīng)，該級聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在響應(yīng)缺血/再灌注損傷的TNFα與TNFR1結(jié)合之后。
基于在上述標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)試驗方法中獲得的結(jié)果，TNFα拮抗劑在降低心肌梗塞后死亡率上是有效的?；讷@得的結(jié)果，TNFα拮抗劑也在處理或者抑制缺血事件后的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡方面是有效的。更具體地，本發(fā)明提供了一種處理或者抑制由于心肌梗塞、心肌缺血、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜中動脈阻塞、外周動脈阻塞(例如，栓塞)、短暫缺血發(fā)作(例如，腦缺血發(fā)作)、缺血性卒中、缺血性動脈阻塞凍傷導(dǎo)致的損傷、動脈血栓形成和阻塞、以及擠壓傷引起的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡的一種方法。本發(fā)明對于處理或者抑制再灌注損傷也是有效的。用TNFα拮抗劑處理在過程之前或者過程期間也都是有效的，該過程包括缺血事件和其后的再灌注，例如移植手術(shù)，供體器官經(jīng)過一段時間缺血，然后再通過受體血液供給進(jìn)行再灌注；血管成型術(shù)或者冠狀血管內(nèi)支架放置；血栓溶解治療；心臟瓣膜置換；以及旁路手術(shù)。
TNFα拮抗劑可以按照藥劑配方標(biāo)準(zhǔn)方法單獨配制，或者結(jié)合一種或者多種可藥用載體給藥。給藥途徑包括口服、腸道外用藥(包括，但不局限于，靜脈注射、肌肉注射、皮下注射)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸、陰道內(nèi)、經(jīng)皮給藥。給藥途徑根據(jù)TNFα拮抗劑的性質(zhì)和用藥原因而變化。例如，當(dāng)TNFα拮抗劑在腸內(nèi)很快降解時，就優(yōu)選使用腸道外用藥。對于處理或者抑制缺血事件后的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡，因為etanercept的酸不穩(wěn)定性和需要快速開始起效，優(yōu)選用靜脈注射提供etanercept。
當(dāng)通過口服提供TNFα拮抗劑時，可以以這樣的形式提供，如片劑、膠囊、可分散粉末、顆粒，或者含有例如大約0.05％到5％懸浮劑的懸浮液，含有例如大約10％到50％糖類的糖漿，以及含有例如大約20％到50％酒精的酏劑，以及類似的形式，或者通過腸道外提供時，以無菌可注射溶液或者在等滲介質(zhì)中含有例如大約0.05-5％懸浮劑的可注射懸浮液的形式提供。這些藥物制劑可以含有，例如，大約0.05％到90％與載體結(jié)合的活性成分，更經(jīng)常是大約5％～60wt％。
對于片劑或膠囊用藥的配方，可以包括固體載體，包括淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖和高嶺土，而液體載體包括無菌水、聚乙二醇、非離子表面活性劑和食用油，例如玉米、花生和芝麻油，這些都適合活性成分的性質(zhì)以及用藥所需的特殊形式。也可以優(yōu)選包括通常用于制備藥物組合物的佐劑，例如調(diào)味劑、著色劑、防腐劑和抗氧化劑，例如維生素E、抗壞血酸、BHT和BHA。
當(dāng)腸道外或者腹膜內(nèi)給予TNFα拮抗劑時，可以在適當(dāng)混合羥基-丙基纖維素等表面活性劑的水中，把這些活性化合物的溶液或者懸浮液當(dāng)作游離堿或者可藥用鹽類來制備。也可以在甘油、液體聚乙二醇和其在油中的混合物中，制備分散體。在常規(guī)貯存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適合注射的藥劑形式包括，用于臨時制備無菌注射溶液或者分散體的無菌水溶液或者分散體和無菌粉末。在所有情況下，制劑必須是無菌的，而且必須具有流動性，易于注射。必須在制造和貯存條件下穩(wěn)定，必須能防止細(xì)菌和真菌等微生物污染。載體可以是溶劑或者分散介質(zhì)，含有例如，水、酒精、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩⒁约爸参镉汀＠缟虡I(yè)提供的Etanercept，是白色不含防腐劑的凍干粉末，在用水重建后腸道外用藥。
TNFα拮抗劑的劑量，預(yù)期根據(jù)TNFα拮抗劑的性質(zhì)、用藥原因、以及接受治療的病人個體不同而改變。對于長期治療，通常推薦以最小有效劑量開始治療，根據(jù)醫(yī)生監(jiān)測調(diào)整劑量。用etanercept治療，設(shè)計的靜脈內(nèi)用藥劑量可以為0.05-25mg/kg etanercept。針對特定的缺血事件，考慮可以以單個劑量或者多個劑量給予TNFα拮抗劑，或者針對將發(fā)生的缺血事件長期用藥，以抑制細(xì)胞損傷或者壞死。例如，預(yù)期可以長期給予遭受短暫缺血事件的患者TNFα拮抗劑，其中短暫缺血事件經(jīng)常在長時間內(nèi)發(fā)生。另外，考慮TNFα拮抗劑也可以在預(yù)計缺血事件將要發(fā)生的情況下預(yù)防性用藥(例如，移植手術(shù)或者血管成型術(shù)之前)。
權(quán)利要求
1.一種處理或者抑制發(fā)生缺血事件后有需要的哺乳動物中細(xì)胞損傷或者抑制其細(xì)胞死亡的方法，該方法包括給該哺乳動物提供有效量的TNFα拮抗劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的細(xì)胞損傷或者死亡起因于心肌梗塞、心肌缺血、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜中動脈阻塞、外周動脈阻塞、短暫缺血發(fā)作、缺血性卒中、缺血性動脈阻塞、凍瘡、動脈血栓形成和阻塞或者擠壓傷。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是一種TNF受體/免疫球蛋白融合蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中的TNFα拮抗劑包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重鏈的部分或者全部恒定區(qū)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是etanercept。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是p55TNFRFc。
7.一種處理或者抑制有需要的哺乳動物中再灌注損傷的方法，該方法包括給該哺乳動物提供有效量的TNFα拮抗劑。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中的損傷起因于移植手術(shù)、血管成型術(shù)、冠狀動脈內(nèi)支架放置、溶栓治療、心臟瓣膜置換或者旁路手術(shù)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是一種TNF受體/免疫球蛋白融合蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中的TNFα拮抗劑包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重鏈的部分或者全部恒定區(qū)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是etanercept。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是p55TNFRFc。
13.一種降低有需要的哺乳動物心肌梗塞后死亡率的方法，該方法包括給該哺乳動物提供有效量的TNFα拮抗劑。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是一種TNF受體/免疫球蛋白融合蛋白。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中的TNFα拮抗劑包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重鏈的部分或者全部恒定區(qū)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是etanercept。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中的TNFα拮抗劑是p55TNFRFc。
18.TNFα拮抗劑在制造用于防止、處理或者抑制由于缺血事件造成的細(xì)胞損傷或者細(xì)胞死亡的藥物中的用途。
19.TNFα拮抗劑在制造用于防止、處理或者抑制再灌注損傷的藥物中的用途。
20.TNFα拮抗劑在制造用于降低心肌梗塞后死亡率的藥物中的用途。
21.如權(quán)利要求18所述的用途，其中的細(xì)胞損傷或者死亡起因于心肌梗塞、心肌缺血、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜中動脈阻塞、外周動脈阻塞、短暫缺血發(fā)作、缺血性卒中、缺血性動脈阻塞、凍瘡、動脈血栓形成和阻塞或者擠壓傷。
22.如權(quán)利要求18-21中任一項所述的用途，其中的TNFα拮抗劑是一種TNF受體/免疫球蛋白融合蛋白。
23.如權(quán)利要求18-21中任一項所述的用途，其中的TNFα拮抗劑包括一段TNFR片段和人免疫球蛋白重鏈的部分或者全部恒定區(qū)域。
24.如權(quán)利要求18-21中任一項所述的用途，其中的TNFα拮抗劑是etanercept。
全文摘要
本發(fā)明通過提供使用TNFα拮抗劑的療法，提供了一種處理或抑制缺血事件后細(xì)胞死亡、處理或抑制再灌注損傷、和降低心肌梗塞后死亡率的方法。
文檔編號A61P43/00GK1406132SQ01804781
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月10日
發(fā)明者G·S·弗里德里希斯, R·E·斯維洛, B·H·－N·喬, T·R·布里達(dá)爾, R·E·努曼, L·M·瓦納, L·M·基拉 申請人:惠氏公司