專利名稱：由抗原提呈細胞可獲得的雜交細胞的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及雜交細胞以及制備和使用雜交細胞的方法。雜交細胞最切實的實際應(yīng)用可能是產(chǎn)生雜交瘤，再用雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體。此外，在多種情況下它們用于研究目的，但是直到目前它們更廣泛應(yīng)用例如臨床治療應(yīng)用還不是切實可行的。所述臨床應(yīng)用包括用于治療或預(yù)防癌癥和其它疾病以及用于預(yù)防移植排斥的細胞疫苗。針對這些缺陷，本發(fā)明提供的方法和試劑使雜交細胞的廣泛應(yīng)用變成現(xiàn)實。
雖然免疫治療是半個多世紀以來癌癥治療的目標(biāo)，但是目前分子免疫學(xué)的最新發(fā)展才使免疫治療成為治療癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥患者的真正可行的選擇。過去十年已經(jīng)批準和引入了幾種免疫治療策略，廣泛用于若干轉(zhuǎn)移性癌癥，Parkinson等，CANCER MEDICINE，第四版，第1213-1226頁(Holland等主編，1997)。最著名的策略可能包括IL-2治療(Philip等，Seminars in Oncology.24(1增刊4)S32-8，1997年2月)和針對黑素瘤的腫瘤疫苗。Smith等，Int J Dermatol 1999；38(7)490-508。雖然這些策略有效對抗部分腫瘤，但因為它們僅僅增強腫瘤細胞已經(jīng)衰弱的呈遞其“外源”表位給CD8 T細胞并因此產(chǎn)生腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)的能力，所以它們的效力是有限的。
自體完整腫瘤細胞型疫苗首先用于免疫治療惡性黑素瘤。所述完整腫瘤細胞型疫苗是有利的，因為它們包含大量抗原，這排除了免疫應(yīng)答一次針對一種抗原的需要。這是重要的，因為目前幾乎不能鑒定出可用于誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)腫瘤消退的特異性腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。Boon等，Immunol Today 1997；18267-268。然而，目前單獨的自體完整腫瘤細胞型疫苗僅顯示孤立或非常有限的成功。Smith等，見上文。如下可知，完整腫瘤細胞型疫苗獲得非常有限的成功可能源于損害它們作為抗原呈遞細胞(“APC”)的能力的腫瘤細胞突變。
許多腫瘤免疫實驗室的證據(jù)證明腫瘤細胞頑固的部分原因是，它們采取突變部分或完全破壞它們在產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞CTL過程中作為APC起作用的能力。Stockert等，J.Exp.Med.1998；1871349-1354；Sahin等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 1995；9211810-11813；Gabrilovich等，Nature Med.1996；21096-1103；Ishida等，J.Immunol.1998；1614842-4851。這些觀察結(jié)果刺激發(fā)展嘗試取代腫瘤細胞作為APC的策略，而不是試圖促進腫瘤已經(jīng)衰弱的抗原呈遞過程。所述取代的最佳候選者是樹突細胞(“DC”)。
DC是“專職”抗原呈遞細胞，在刺激免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。DC不僅能夠激活原初CD4+T輔助細胞，而且能夠刺激未致敏的CD8+細胞毒性T淋巴細胞。Steinman，R.M.Annu.Rev.Immunol.1991；9，271-296；Macatonia等，J.Exp.Med.1988；169，1255-1264；Mehta-Damaniet等，J.Immunol.1994；153，996-1003；Porgador等，J.Exp.Med.1995；182，255-260。
因為這些特性，人們已經(jīng)廣泛研究DC作為用于癌癥免疫治療的抗原呈遞細胞。用完整腫瘤抗原或腫瘤抗原肽脈沖處理DC，可以將腫瘤抗原加載到DC上。Young等，J.Exp.Med.1996；183，7-11；Mayordoma等，Nat.Med.1995；1，1297-1302；Bakkar等，Cancer Res.1995；55，5330-5334；Flamand等，Eur.J.Immunol.1994；24，605-610；Gong等，Gene Ther.1997；4，1023-1028；Song等，J.Exp.Med.1997；186，1247-1256；Specht等，J.Exp.Med.1997；186，1213-1256。
例如，已經(jīng)使用肽或腫瘤裂解物脈沖處理的樹突細胞免疫黑素瘤患者。Rosenberg等，Nature Med 1998；4321-327；Wallack等，Cancer1995；7534-42；Bystryn，Rec.Results Cancer Res.1995；139337-348；Mitchell等，Semin.Oncol.1998；25623-635；Morton等，Ann.N.Y.Acad.Sci.1993；690120-134；Berd等，Semin Oncol.1998；25646-653；Berd等，J.Clin.Oncol.1997；152359-2370。
如此加載腫瘤抗原的腫瘤抗原負荷DC能夠誘導(dǎo)細胞和體液抗原特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。Shurin，M.R. Cancer Immunol.Immunother.1996；43，158-164。然而，該方法局限于表達已知腫瘤抗原的腫瘤的應(yīng)用。見Haigh等，Oncology 1999；13，1561-1573。該方法對于那些沒有鑒定出腫瘤抗原的腫瘤是無用的，例如患者原發(fā)性腫瘤，而這為大多數(shù)實際情況。顯然需要替代策略。
抗原脈沖處理技術(shù)的另一個問題是APC的抗原呈遞系統(tǒng)在所述蛋白/抗原在細胞內(nèi)合成而不是在細胞外合成時作用最有效和效率最高，這是使用抗原脈沖處理細胞的一個重大缺陷。為避免這一問題，多個實驗室已經(jīng)嘗試使用基因治療將特異性腫瘤抗原引入樹突細胞。Gong等，1997，Gene Ther.4，1023-28；Song等，1997，J.Exp.Med.1861247-56；和Specht等，1997，同上文。然而，該基因治療方法也有許多缺點，其中包括1)鑒定所有重要特異性腫瘤抗原的能力有限，2)對特異性腫瘤抗原基因作圖的能力有限，3)僅能夠?qū)⒁环N或少數(shù)已知腫瘤抗原基因引入樹突細胞4)該過程耗時繁瑣。
另一方面，DC與腫瘤細胞之間的融合物代表另一種可用方法，該方法產(chǎn)生有效腫瘤抗原呈遞細胞，將所有可能腫瘤抗原呈遞給免疫細胞。Gong等，Nat.Med.1997；3558-561；Wang等，J.Immunol.1998；161，5516-5524；Lespagnard等，Int.J.Cancer 1998；76，250-258；Rowse等，Cancer Res.1998；58，315-321。已經(jīng)將DC與腫瘤細胞融合，所述融合細胞有效呈遞腫瘤抗原到免疫細胞并刺激特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。Gong等；Wang等；Lespagnard等，所有這些參考文獻同上文。
然而，上述融合方案依賴于DC和腫瘤細胞各自中的選擇標(biāo)記(使細胞抗特定細胞毒素的基因產(chǎn)物或使細胞在某些代謝條件下生長的基因產(chǎn)物)來分離所得的雜交細胞。當(dāng)僅有包含兩種選擇標(biāo)記的融合細胞能夠存活時，在兩種細胞毒素存在下，通過長期培養(yǎng)選擇出很少的細胞融合產(chǎn)物。由于使用選擇標(biāo)記的引入和選擇方案需要培養(yǎng)和多次細胞分裂，因此它們不能應(yīng)用于樹突細胞，這是因為DC是終末分化的不分裂細胞。因此，毫不奇怪以前的融合工作依賴于攜帶有所述標(biāo)記的已經(jīng)充分定義的腫瘤細胞系以及DC特異性和腫瘤特異性綴合抗體，這限制了該策略在治療癌癥中的應(yīng)用。
總的來說，以前基于癌癥的融合方法具有如下限制1)它們需要顯示特定標(biāo)記的確定腫瘤細胞系；2)它們需要DC和腫瘤細胞特異性抗體來選擇融合細胞；3)融合細胞的選擇和擴增需要太長時間。
使用雜交細胞預(yù)防移植排斥的領(lǐng)域甚至比癌癥領(lǐng)域發(fā)展更慢。事實上，沒有發(fā)現(xiàn)這樣的報告。
預(yù)防移植排斥的一般方法利用抑制整個免疫系統(tǒng)的非選擇性免疫抑制藥物。Abbas等，CELLULAR AND MOLECULARIMMUNOLOGY，第347-350頁。所述方法的明顯缺點是，使患者對在免疫系統(tǒng)完整的情況下能夠阻擋的疾病更易感。
人們已經(jīng)認識到抗原呈遞細胞激活T細胞至少必須發(fā)生兩種相互作用。所述相互作用是加載有抗原的主要組織相容性(MHC)抗原和T細胞受體之間的相互作用，以及某些輔助分子和它們在T細胞上的關(guān)聯(lián)受體之間的相互作用。輔助分子中研究最充分的一類輔助分子是B7(B7.1和B7.2)，B7與T細胞上的CD28和CTLA4相互作用。Abbas等，同上文。因此，破壞MHC的相互作用或所述輔助分子的相互作用可導(dǎo)致可用于例如預(yù)防移植排斥的無反應(yīng)。
事實上，破壞B7相互作用不僅預(yù)防免疫應(yīng)答，還導(dǎo)致對在該破壞過程中呈遞的任何抗原產(chǎn)生永久性的耐受性。Wei等，1996，StemCells 14232-38。因此，在移植排斥情況下，阻斷B7可產(chǎn)生耐受，預(yù)防排斥。所述方法的問題以及其不能臨床嘗試的可能原因是耐受性涉及治療期間呈遞的任何抗原，而不僅限于移植抗原。換句話說，假如患者在破壞B7期間暴露于一種病原體，所述患者的免疫系統(tǒng)將永久性地對該病原體具有耐受性。這將阻止患者抵抗所述病原體，可能產(chǎn)生致命性后果。顯然，需要更特異性的方法。
一種有前景的方法利用缺乏輔助分子如B7的細胞呈遞抗原。這些細胞仍然利用MHC呈遞抗原，然而因為它們?nèi)狈せ钏璧妮o助相互作用，所以它們誘導(dǎo)呈遞抗原特異性耐受性。因此，可用特異性抗原加載這些細胞(包括未成熟的(原初)B細胞)并誘導(dǎo)抗原特異性無變應(yīng)性。與上述癌癥實例一樣，該抗原對抗原方法并不具有實際臨床應(yīng)用所需的一般應(yīng)用性。需要可應(yīng)用于任何移植器官的方法，并且該方法不受所述器官的免疫原性抗原的影響。
如上所述，顯然本領(lǐng)域需要誘導(dǎo)和抑制對整個細胞的特異性免疫應(yīng)答的可廣泛應(yīng)用、快速方法以及完成所述方法的特異性試劑。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明目的之一是提供本領(lǐng)域上述缺陷的解決方案。
進而為了達到所述目的，本發(fā)明提供用于制備雜交細胞的試劑盒。一方面，所述試劑盒包含至少兩種基本不含內(nèi)毒素的染料和利用一種方法由反應(yīng)細胞制備雜交細胞的說明書，所述方法包括使反應(yīng)細胞分別與其中一種所述染料接觸。另一方面，所述試劑盒包括至少兩種基本不含內(nèi)毒素的染料和一種促進細胞融合的試劑。所述不含內(nèi)毒素的染料最好是熒光染料，如花菁染料。
同時按照本發(fā)明的所述目的，公開了雜交細胞制備物。在一個實施方案中，所述制備物包含具有不多于n-1選擇標(biāo)記的雜交細胞，其中n代表用于形成所述雜交細胞的反應(yīng)細胞數(shù)，并且所述制備物基本不含非雜交細胞。在另一實施方案中，所述制備物包含原發(fā)性腫瘤細胞和抗原呈遞細胞的雜交細胞。在又一實施方案中，所述制備物包含正常細胞和抗原呈遞細胞的雜交細胞，其中所述抗原呈遞細胞缺乏產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答所需的輔助因子。所述正常細胞可以分離自移植器官。再一實施方案是包含病原性細胞和抗原呈遞細胞的雜交細胞的制備物，所述病原性細胞例如來自寄生蟲的細胞。一種雜交細胞制備物包括用至少兩種不同染料標(biāo)記的雜交細胞，所述染料最好是熒光染料，例如花菁染料。所述雜交細胞可以由例如樹突細胞或未成熟B細胞獲得。
按照所述目的，本發(fā)明的另一方面提供制備雜交細胞的方法。本發(fā)明方法的一個實施方案包括使至少兩種不同細胞在促進細胞融合的條件下接觸，然后純化獲得的雜交細胞，而不需要進行抗生素或代謝選擇。在一個方面，使用熒光染料如花菁染料完成該方法，通過熒光激活細胞分類術(shù)分離雜交細胞。所述方法涉及使反應(yīng)細胞如巨噬細胞、樹突細胞和缺乏產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答所需輔助因子的抗原呈遞細胞與第二種反應(yīng)細胞融合，所述第二種反應(yīng)細胞如腫瘤細胞、病原性細胞和正常細胞。最好在約48小時內(nèi)完成所述方法。
又一方面，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，該方法涉及提供本發(fā)明的雜交細胞制備物，所述制備物衍生自癌細胞反應(yīng)細胞；然后將所述雜交細胞給予癌癥患者。該方法包括用細胞因子或淋巴因子如白介素-2輔助治療。
再一方面，本發(fā)明設(shè)想治療與病原生物存在有關(guān)的疾病的方法，該方法涉及提供本發(fā)明的雜交細胞制備物，所述雜交細胞制備物衍生自從所述病原生物分離的細胞，然后將所述細胞給予患者。該方法也可以包括用細胞因子或淋巴因子如白介素-2的輔助治療。
此外，按照本發(fā)明所述，本發(fā)明提供誘導(dǎo)抗原的免疫耐受性的方法，所述方法包括提供本發(fā)明的雜交細胞制備物，所述雜交細胞制備物衍生自表達需要免疫耐受的抗原的細胞，然后將所述制備物給予患者。免疫耐受性細胞可以是來自移植器官的細胞，其中所述患者需要進行器官移植。
附圖簡述

圖1顯示樹突細胞和癌細胞形成的本發(fā)明雜交細胞能夠產(chǎn)生腫瘤特異性細胞毒性T細胞反應(yīng)，所述反應(yīng)與體內(nèi)免疫治療有關(guān)。
圖2A顯示FACS檢測在對照樹突細胞上的抗原呈遞標(biāo)記。顯示一般分布。
圖2B顯示在樹突/腫瘤細胞的雜交細胞上的抗原呈遞標(biāo)記。顯示與對照樹突細胞相比的一般分布，該分布意味著所述雜交細胞保留抗原呈遞所需的所有標(biāo)記。
發(fā)明詳述一方面，本發(fā)明提供快速有效制備可在多種臨床和非臨床應(yīng)用中使用的雜交細胞。所述雜交細胞尤其可以用于激發(fā)免疫系統(tǒng)治療或預(yù)防疾病的治療方案。例如，在優(yōu)選實施方案中，通過將癌細胞與抗原呈遞細胞融合，使用本發(fā)明的雜交細胞治療癌癥。在另一實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞包含漿細胞和癌細胞，所述雜交細胞象常規(guī)雜交瘤一樣，可用于制備單克隆抗體。在又一實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞包含缺乏免疫原性反應(yīng)所需輔助成分的抗原呈遞細胞以及預(yù)定移植到患者體內(nèi)的器官的細胞?？梢杂眠@些細胞誘導(dǎo)對所述移植細胞的耐受性，由此降低移植排斥的發(fā)生率。還提供產(chǎn)生雜交細胞和實施本發(fā)明方法的試劑盒。制備雜交細胞的方法本發(fā)明設(shè)想制備雜交細胞的方法，該方法快速簡便并可用于完全分化的不分裂細胞。本發(fā)明方法涉及使至少兩種不同細胞(“反應(yīng)細胞”)在促進細胞融合的條件下接觸，然后純化所得的雜交細胞(“產(chǎn)物細胞”)，而不需要進行抗生素或代謝選擇。一般地說，在暴露于促進細胞融合的條件后，在相當(dāng)短的時間內(nèi)完成純化，例如在少于約24到48小時內(nèi)。
在優(yōu)選實施方案中，在至少兩種不同染料的輔助下完成所述方法，所述染料可以是熒光染料。因此，所述方法包括使需要融合的兩種細胞類型分別與不同染料接觸。該融合前標(biāo)記步驟用不同染料標(biāo)記每種細胞，使得能夠區(qū)分每種融合母細胞和雜交細胞融合產(chǎn)物每種反應(yīng)細胞被一種染料染色，而產(chǎn)物細胞被兩種染料染色。用這種方法，可以將雜交融合產(chǎn)物與反應(yīng)細胞分開，例如通過熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)等等。
可用于本發(fā)明的染料的特征是與細胞結(jié)合足夠時間，使得能夠通過這樣的結(jié)合檢測到細胞。此外，有用的染料并不極大地消除細胞生活力，優(yōu)選保留大于約50％的細胞生活力。通常它們是熒光染料。一組有用的染料包含所謂“花菁”染料?；ㄝ既玖嫌卸喾N類型，在不同波長發(fā)射熒光，以便當(dāng)它們與細胞結(jié)合時能夠單獨或共同檢測出來。一些代表性花菁染料可見Horan等，美國專利第4,783,401號(1998)、美國專利第4,762,701號(1998)和美國專利第4,859,584號(1989)，其內(nèi)容特此通過引用專門加入本文中。
兩種尤其有用的花菁染料是PKH26-GL和PHK2-GL，可以從Sigma Chemical Co.獲得。由于已經(jīng)廣泛研究和使用這些染料，因此優(yōu)選使用它們。例如，已經(jīng)在體內(nèi)動物研究中使用它們進行細胞運輸研究。Horan等，Nature 1989；340，167-168；Horan等，Methods CellBiol.1990；33，469-490；Michelson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；93，11877-11882。在實驗室動物中，已經(jīng)顯示這些染料不影響細胞生長或功能，并且不從用這些染料染色的細胞遷移到其它細胞(Horan等，1989)，因此毒性低，這是體內(nèi)應(yīng)用的一個所需特性。
按照本發(fā)明在體內(nèi)使用的染料應(yīng)當(dāng)不含內(nèi)毒素，例如根據(jù)鱟變形細胞(LAL)測試不含內(nèi)毒素。一般地說，當(dāng)測量到的內(nèi)毒素水平低于約1ng/μg染料，優(yōu)選低于約0.1ng/μg染料，那么就認為所述染料是“不含內(nèi)毒素的”。
更一般地說，所述染料基本不含熱原，不論熱原性是由內(nèi)毒素產(chǎn)生或由其它熱原產(chǎn)生。因此，在下面情況下認為染料“基本不含熱原”用所述染料標(biāo)記的所述雜交細胞的最終制劑(例如注射到接受者體內(nèi)的形式)產(chǎn)生低于約1內(nèi)毒素單位(EU)/劑，優(yōu)選低于約0.1EU/劑，最優(yōu)選低于約0.05EU/劑。毒性域值由下面事實決定當(dāng)采取本發(fā)明的治療方法時，大多數(shù)本文設(shè)想的體內(nèi)方法少于約10-8g與細胞結(jié)合的所述染料導(dǎo)入患者體內(nèi)。
常規(guī)的花菁染料標(biāo)記方法需要存在細胞穩(wěn)定劑(滲透壓調(diào)節(jié)劑)如糖(如葡萄糖或甘露醇)、氨基酸和/或某些商品緩沖劑。見例如Horan等，美國專利第4,783,401號(1998)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜(DMSO)能夠取代這樣的穩(wěn)定劑。尤其是用標(biāo)準培養(yǎng)基稀釋的DMSO可以用作花菁染料的溶劑，并且其促進染料的有效和穩(wěn)定攝入，而不導(dǎo)致細胞生活力大量喪失。DMSO濃度的一般使用范圍是從約10％到約50％，優(yōu)選的范圍是從約20％到約40％。因此，本發(fā)明還設(shè)想使用DMSO取代常規(guī)穩(wěn)定劑，用花菁染料標(biāo)記細胞的方法及相應(yīng)的試劑盒。
一旦標(biāo)記了反應(yīng)細胞，就使它們在促進細胞融合的條件下相互接觸。所述促進融合的條件是技術(shù)人員眾所周知的，通常涉及加入促進細胞融合的試劑。據(jù)認為這些試劑的作用利用分子集群機制使細胞集中到它們足夠接近以引起細胞膜融合的程度。本發(fā)明設(shè)想任何符合這些特征的試劑，而代表性有用試劑是聚合化合物，如聚乙二醇。所述試劑的有效量一般是從約20％到約80％(w/v)。優(yōu)選范圍是從約40％到約60％，更優(yōu)選約50％。
形成雜交細胞后，將它們與未融合的反應(yīng)細胞分開是有利的。例如，在細胞疫苗的情況下，所述純化顯著提高效價。例如，可以通過常規(guī)FACS方法完成純化。
所述方法明確地設(shè)想更高級數(shù)的雜交細胞，即在兩種以上細胞間的融合。在每種情況下，所需要作的僅是增加可以用作標(biāo)記選擇更高級數(shù)雜交細胞的染料。例如，用三種不同染料標(biāo)記的三種不同反應(yīng)細胞形成“三雜交細胞(tribred)”，諸如此類。因此，本文所用術(shù)語“雜交細胞”設(shè)想兩種或更多種反應(yīng)細胞間的融合物。本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明還涉及用于標(biāo)記細胞和制備雜交細胞的試劑盒。這些試劑盒用于實施制備雜交細胞的本發(fā)明方法。例如，標(biāo)記試劑盒包含至少一種染料，并且可以包含DMSO和標(biāo)記說明書。本發(fā)明的雜交細胞制備試劑盒包含至少兩種基本不含內(nèi)毒素和/或不含熱原的染料、制備雜交細胞的說明書和/或其包含促進細胞融合的試劑。雜交細胞制備物本發(fā)明還設(shè)想雜交細胞制備物。一般地說，所述制備物將基本不含反應(yīng)細胞(少于約50％反應(yīng)細胞，更優(yōu)選少于約10％到25％反應(yīng)細胞，最優(yōu)選少于約5％反應(yīng)細胞)。從可能具有但不一定具有選擇標(biāo)記的反應(yīng)細胞制備本發(fā)明的雜交細胞。無論如何，至少一種反應(yīng)細胞缺乏所述標(biāo)記。因此，如果n表示反應(yīng)細胞數(shù)，那么在大多數(shù)情況下n-1表示雜交細胞存在的選擇標(biāo)記最大數(shù)目。例如，當(dāng)兩種反應(yīng)細胞融合形成雜交細胞時，所述雜交細胞將包含不多于一種選擇標(biāo)記。
詞組“選擇標(biāo)記”在本文中以其常規(guī)意義使用，指抗生素抗性或代謝標(biāo)記，如次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)等等。選擇標(biāo)記是內(nèi)源產(chǎn)生的，并且不包括外源添加物質(zhì)如染料。
在一個實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞制備物包含一種原發(fā)性腫瘤細胞和一種抗原呈遞細胞(APC)作為反應(yīng)細胞。所述雜交細胞可用作細胞疫苗以誘導(dǎo)針對腫瘤的免疫應(yīng)答。所述腫瘤細胞可以是任何類型，包括常見癌癥，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮膚癌、肺癌等等。所述APC最好是專職APC，例如巨噬細胞或樹突細胞。由于樹突細胞優(yōu)越的抗原呈遞能力，更優(yōu)選使用它們。發(fā)明人考慮了同系融合以及同種異體融合，因為發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用對二者適用良好的小鼠模型。
另一具體雜交細胞包含一種病原性細胞和一種APC。這些雜交細胞也可用作細胞疫苗。抗原呈遞細胞還是尤其優(yōu)選樹突細胞。另一方面，所述病原性細胞實際上可以是任何類型。例如，它可以是已經(jīng)去除細胞壁的細菌細胞(螺桿菌屬(Helicobacter)等等)。所述病原性細胞可以是真菌細胞，如假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、曲霉屬(Aspergillus)和鏈格孢屬(Alternaria)。
所述病原性細胞也可以是寄生蟲細胞，例如來自錐蟲寄生蟲、阿米巴寄生蟲、各種原生動物、線蟲、吸蟲和絳蟲的細胞。代表性屬包括瘧原蟲屬(Plasmodium)、利什曼原蟲屬(Leishmania)、錐蟲屬(Trypanosoma)、內(nèi)阿米巴屬(Entamoeba)、納歸蟲屬(Naeglaria)、棘阿米巴屬(Acanthamoeba)、雙核阿米巴屬(Dientamoeba)、弓形蟲屬(Toxoplasma)、肺囊蟲(Pneumocystis)、巴貝蟲屬(Babesia)、等孢子球蟲屬(Isopora)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、Cyclospora、賈第蟲屬(Giardia)、小袋蟲屬(Balantidium)、酵母菌屬(Blastocystis)、小孢子蟲目(Microsporidia)、肉孢子蟲屬(Sarcocystis)、吳策線蟲屬(Wuchereria)、布魯絲蟲屬(Brugia)、盤尾屬(Onchocerca)、羅阿絲蟲屬(Loa)、Tetrapetalonema、曼森線蟲屬(Mansonella)、惡絲蟲屬(Dirofilaria)、蛔蟲屬(Ascaris)(蛔蟲)、板口線蟲屬(Necator)(鉤蟲)、鉤蟲屬(Ancylostoma)(鉤蟲)、類圓線蟲屬(Strongyloides)(線蟲)、蟯蟲屬(Enterobius)(蟯蟲)、鞭蟲屬(Trichuris)(毛首鞭蟲)、毛圓線蟲屬(Trichostrongylus)、毛細線蟲屬(Capillaria)、毛線蟲屬(Trichinella)、Anasakis、Pseudoterranova、龍線屬(Dracunculus)、裂體吸蟲屬(Schistosoma)、支睪吸蟲屬(Clonorchis)、并殖吸蟲屬(Paragonimus)、后睪吸蟲屬(Opisthorchis)、片吸蟲屬(Fasciola)、后殖吸蟲屬(Metagonimus)、異形吸蟲屬(Heterophyes)、姜片蟲屬(Fasciolopis)、絳蟲屬(Taenia)、膜殼絳蟲屬(Hymenolepis)、裂頭屬(Diphyllobothrium)、迭宮絳蟲屬(Spirometra)和棘球?qū)?Echinococcus)。
在另一實施方案中，本發(fā)明的雜交細胞制備物包含一種需要免疫耐受性的靶細胞和一種缺乏免疫原性反應(yīng)所需輔助分子的抗原呈遞細胞。一般這些APC缺乏B7(如B7.1或B7.2)；代表性細胞是原初未成熟的B細胞和成纖維細胞，但任何能夠呈遞抗原(具有MHC分子)、缺乏輔助分子的細胞就能滿足要求。在B7的情況下，特異性抗體是已知的，而技術(shù)人員非常了解確定任何特定細胞類型是否缺乏B7的方法。優(yōu)選原初B細胞，因為它們表達高水平的MHC分子和所有本領(lǐng)域內(nèi)已知的有效細胞-細胞接觸所需的粘附分子。
無論如何，因為所得的雜交細胞攜帶有I類MHC分子和II類MHC分子，因此它們具有呈遞抗原到免疫系統(tǒng)的能力，但由于它們不具有必要的輔助標(biāo)記如B7(CD28或FLTA4配體)，因此它們不能激活免疫系統(tǒng)。因此，這些雜交細胞不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而是細胞編程性死亡清除，由此使免疫系統(tǒng)對這些雜交細胞呈遞的靶細胞抗原具有耐受性。所述免疫細胞雜交細胞可用于治療自身免疫病如移植排斥。
可以使用一組如上文所述的染料制備本發(fā)明的雜交細胞制備物。因此，用至少兩種不同染料標(biāo)記本發(fā)明的雜交細胞。這些染料最好是熒光染料，其中優(yōu)選花菁染料。或者，例如可以用在反應(yīng)細胞上差異表達的細胞表面標(biāo)記以及它們的對應(yīng)抗體制備雜交細胞?？梢允褂盟隹贵w順序淘選每種標(biāo)記。見Gong等，1997，Nat.Med.3558-61。治療方法本發(fā)明的方法和產(chǎn)品可用于治療和預(yù)防方法，本文中的“治療”包括“預(yù)防”。所述方法基本上涉及給予患者一種“靶”細胞和另一種細胞(一般是抗原呈遞細胞)的雜交細胞。所述“靶”細胞是尋求免疫應(yīng)答的細胞。根據(jù)需要治療的疾病，所述免疫應(yīng)答可以是陽性或陰性的。例如，在治療癌癥或寄生蟲病時需要陽性免疫應(yīng)答，在預(yù)防移植排斥時需要陰性免疫應(yīng)答。
一種具體治療或預(yù)防方法涉及癌癥。該方法包括給予患者本發(fā)明的雜交細胞或用本發(fā)明的方法或試劑盒制備的雜交細胞。一方面，如上所述，所給予的雜交細胞具有n-1種選擇標(biāo)記?？梢杂弥辽賰煞N染料標(biāo)記所述雜交細胞。
代表性癌癥治療方法涉及用不同染料標(biāo)記分離的腫瘤細胞和免疫細胞，所標(biāo)記的細胞形成雜交細胞。分離所述雜交細胞，以可接受的賦形劑給予患者。為避免給予有活力的癌細胞，建議在融合前用致死劑量照射所述腫瘤反應(yīng)細胞。該步驟殺死細胞，但不妨礙獲得的雜交細胞有效呈遞腫瘤抗原。發(fā)明人考慮了同系融合以及同種異體融合，因為發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用對二者適用良好的小鼠模型。
此外，通過聯(lián)合使用其它抗腫瘤藥物和所述雜交細胞，可以促進癌癥治療。一類這樣的藥物是免疫調(diào)節(jié)劑。包括細胞因子和淋巴因子，尤其是白介素2(IL-2)和IL-2衍生物如aldesleukin(Proleukin，Chiron Corp.)。優(yōu)選使用IL-2，因為它會進一步增強所述雜交細胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。本文所用的“白介素2”一般用于指天然分子和保留基本白介素2活性(如促進T細胞生長)的任何衍生物或類似物。也可以使用其它淋巴因子和細胞因子作為輔助治療。實例包括γ干擾素(IFN-γ)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等等。
對所述癌癥治療方案的改進方案可用于治療任何與病原生物有關(guān)的疾病。在改進方案中，所述反應(yīng)細胞是APC和從病原生物分離的細胞。在其它方面，將按照與癌癥治療相同的方式完成治療。
本發(fā)明的另一不同方面包括治療自身免疫病的方法。用與上文所述癌癥治療基本相同的方式完成所述方法。主要的區(qū)別是反應(yīng)細胞不同。在自身免疫病的情況下，目標(biāo)是減少或消除免疫應(yīng)答，而癌癥治療的目標(biāo)是產(chǎn)生或增強免疫應(yīng)答。
可使用本發(fā)明的雜交細胞治療自身免疫病的部分原因基于以下觀察結(jié)果某些細胞能夠呈遞抗原，但它們?nèi)狈μ峁╆栃悦庖邞?yīng)答的輔助分子。通常這些細胞缺乏B7，例如它們可以是未成熟B細胞或成纖維細胞。事實上，這些細胞的抗原呈遞產(chǎn)生陰性免疫應(yīng)答。它使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生耐受性，誘導(dǎo)特定抗原反應(yīng)性免疫細胞的編程性細胞死亡。
因此，治療自身免疫病的方法利用一種在輔助相互作用上存在缺陷的APC和一種“正常細胞”作為反應(yīng)細胞。所述“正常細胞”是希望獲得免疫耐受性的任何靶細胞。例如，在預(yù)防移植排斥的方法中，它可以來自移植器官。另一方面，在通過移植或其它方法治療或預(yù)防糖尿病的情況下，所述正常細胞可以是胰島細胞。所述方法可以使免疫系統(tǒng)對任何類型細胞產(chǎn)生耐受性。
本文所用術(shù)語“治療”及其各種表達形式也包括預(yù)防方法。
為說明本發(fā)明提供上文詳細描述和下面的實施例，它們不是限制性的。技術(shù)人員知道，還有其它實施方案在本發(fā)明范圍內(nèi)而沒有詳細描述。
實施例實施例1動物研究本實施例顯示制備癌細胞和樹突細胞之間的某些雜交細胞，即樹突細胞瘤(dendritomas)。在一個小鼠轉(zhuǎn)移癌模型系統(tǒng)中，使用這些雜交細胞作為細胞疫苗以預(yù)防癌癥。
為從骨髓制備樹突細胞，處死合適數(shù)量的雌性C57BL/6J小鼠，以支持隨后的樹突細胞瘤注射(每種注射小鼠需要兩只小鼠)。從每只小鼠的后腿取出股骨和脛骨。用裝有含25mM Hepes(Gibco BRL)的RPMI 1640的注射器從骨中沖洗出骨髓。所述包含骨髓的培養(yǎng)基過濾通過40μm細胞滲濾器，用50ml圓錐形離心管收集。在1500rpm離心五分鐘，沉淀骨髓細胞。去上清后，輕輕敲打離心管，使細胞沉淀松動。加入5ml/小鼠ACK裂解液(0.15M NH4Cl，1mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA，pH7.3)并在室溫下溫育5分鐘，裂解紅細胞。在1500rpm離心五分鐘，沉淀細胞。去上清后，將所述細胞溫和地重懸浮于10ml/小鼠完全DC培養(yǎng)基(RPMI 1640，10％胎牛血清(FBS)，100μg/ml慶大霉素，10ng/ml GM-CSF，10ng/mlIL-4)。所述細胞以兩個孔/小鼠接種到六孔組織培養(yǎng)板中。所述培養(yǎng)物在37℃、5％CO2溫育過夜，然后從每個培養(yǎng)物除去未貼壁(floating)的細胞。貼壁細胞用1X磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗兩次。每孔細胞加入5ml完全DC培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)物在37℃、5％CO2溫育48小時。通過將包含細胞的上清轉(zhuǎn)移到15ml圓錐形離心管，從6孔板收獲樹突細胞。每孔用3ml1 X PBS洗兩次。每孔加入1ml 0.25％胰酶/EDTA(Gibco BRL)，用胰酶溫和處理所述細胞。振蕩所述板使胰酶溶液覆蓋整個表面后，快速除去所述胰酶溶液。輕敲所述板，取出松散貼壁的細胞。這些細胞重懸浮于2ml完全DC培養(yǎng)基并加入15ml管。在1500rpm離心五分鐘，沉淀細胞。所述細胞重懸浮于10ml完全DC培養(yǎng)基后，進行細胞計數(shù)。
從ATCC(CRL-6322)獲得B16F0小鼠黑素瘤細胞并使用標(biāo)準組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)。當(dāng)細胞可用時，用0.25％胰酶/EDTA處理所述細胞。進行細胞計數(shù)后，在1500rpm離心五分鐘，沉淀實驗所需數(shù)量的細胞。其余細胞繼續(xù)培養(yǎng)，以后使用。
為一般性細胞膜標(biāo)記小鼠樹突細胞和B16F0黑素瘤細胞，使用商業(yè)化的熒光細胞連接物試劑盒。用Sigma貯液號PKH2-GL標(biāo)記樹突細胞為熒光綠；用Sigma貯液號PKH26-GL標(biāo)記B16F0黑素瘤細胞為熒光紅。在25℃下進行染色程序。需要染色的細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌。所述細胞懸浮液在400 g離心五分鐘，獲得松散的沉淀。除去上清，在沉淀中剩下少于25μl培養(yǎng)基。輕敲所述管，重懸浮所述沉淀，然后在重懸浮細胞中加入1ml分別用于綠染色或紅染色的Diluent A或C。在染色前，用Diluent A或C在聚丙烯管中制備4×10-6摩爾染料(2X)。為最小化乙醇作用，加入的染料量少于各樣品體積的1％。將細胞稀釋液快速加入1ml 2X染料。立即用移液管溫和吹打，混合所述細胞和染料。然后所述混合物在25℃下溫育五分鐘。加入等體積FBS并溫育1分鐘，終止所述染色程序。用等體積完全培養(yǎng)基稀釋已經(jīng)染色的細胞。在400g離心10分鐘，從所述染色溶液取出染色的細胞?？偣蚕慈魏螅黾毎院线m濃度重懸浮于完全培養(yǎng)基中。通過熒光顯微術(shù)監(jiān)測染色效率。
在融合過程前，用5,000拉德照射紅熒光染色的B16F0小鼠黑素瘤細胞。在50ml圓錐離心管中以1∶1的比例混合小鼠樹突細胞和B16F0黑素瘤細胞，使兩種細胞類型融合。所述管倒?jié)M含25mM Hepes的無血清RPMI 1640。所述細胞混合物室溫下在1500rpm離心五分鐘。注意在融合過程中，所有溶液以及進行融合的管都在雙燒杯水浴保持在37℃。從所述混合細胞沉淀吸出上清液并棄去。用1ml血清學(xué)移液管，在一分鐘內(nèi)將在PBS(不含Ca++和Mg++)內(nèi)含50％PEG和10％DMSO的1ml預(yù)熱50％PEG/DMSO(Sigma)逐滴加入混合細胞沉淀，每加入一滴后用移液管尖攪拌細胞。用移液管再攪拌所述混合物一分鐘。
使用清潔的2ml血清學(xué)移液管，在兩分鐘內(nèi)將2 ml預(yù)熱的含25mM Hepes的無血清RPMI 1640逐滴加入所述細胞混合物，并在加入每滴后攪拌。用10ml血清學(xué)移液管，在二到三分鐘內(nèi)逐滴加入7ml預(yù)熱的含25mM Hepes的無血清RPMI 1640。室溫下在1500rpm離心五分鐘，沉淀細胞。棄去上清，將所述管放回?zé)≈小Ｓ们鍧嵉?0ml血清學(xué)移液管吸取10ml完全DC培養(yǎng)基，通過強力加入約3ml培養(yǎng)基到所述沉淀上并溫和加入其余培養(yǎng)基，重懸浮所述細胞沉淀于所述完全DC培養(yǎng)基中。所述重懸浮的細胞加入T75組織培養(yǎng)瓶中。將Instant Dendritomas(樹突細胞與黑素瘤細胞融合)在37℃、5％CO2溫育過夜。滴一滴細胞在載玻片上，通過熒光顯微術(shù)評估，確保發(fā)生融合。
通過取出包含細胞的上清并如上文所述用胰酶溫和處理貼壁細胞，從所述組織培養(yǎng)瓶獲得Instant Dendritomas。在1500rpm離心五分鐘，沉淀細胞。所述細胞沉淀重懸浮于2ml 1X PBS中并轉(zhuǎn)移到無菌聚苯乙烯圓底12×75mm Falcon管。所述細胞在1500rpm離心五分鐘后，重懸浮于1ml 1X PBS。使用FACS Caliber(BectonDickinson)，用標(biāo)準方法根據(jù)綠和紅雙熒光分選出InstantDendritomas。
在2000rpm離心30分鐘，沉淀分選出的細胞。去上清后，所述細胞以50,000細胞/0.5ml 1X PBS的濃度重懸浮。滴一滴細胞在載玻片上，通過熒光顯微術(shù)評估，確保所述分選物的整體純度。
在融合程序前三天，通過靜脈內(nèi)注射0.4ml 1X PBS中的0.75×106B16F0黑素瘤細胞攻擊雌性C57BL/6J小鼠。一旦沉淀并重懸浮Instant Dendritomas后，每只小鼠靜脈內(nèi)注射50,000細胞。隨后用IL-2處理，以10,000 IU/天/小鼠腹膜內(nèi)給予。監(jiān)測所述小鼠的肺轉(zhuǎn)移長達四周。
四周后，處死小鼠，計數(shù)轉(zhuǎn)移瘤。沒有用Instant Dendritomas處理的四只對照動物的每一只都有50個以上腫瘤。另一方面，只有一只處理過的動物有可測量的轉(zhuǎn)移瘤。這些數(shù)據(jù)指出，本發(fā)明的雜交細胞在公認的動物模型系統(tǒng)中有效治療癌癥。這些數(shù)據(jù)匯集在下面的表中。
實施例2人類研究本實施例證明本發(fā)明的樹突細胞瘤雜交細胞誘導(dǎo)癌細胞特異性細胞毒性T細胞反應(yīng)。本實施例提供原理證據(jù)證明這些雜交細胞能夠誘導(dǎo)針對腫瘤的有治療意義的免疫應(yīng)答。
為增加從外周血分離的樹突細胞數(shù)量，利用使用抗CDl4包被板的淘選技術(shù)。將五百微克抗CDl4抗體重懸浮于5ml含BSA(每100μl抗體700μg BSA)的1X PBS。用5ml所述抗體包被一塊100mm組織培養(yǎng)板。所述板在室溫下旋轉(zhuǎn)并溫育一小時，或在4℃旋轉(zhuǎn)并溫育過夜。除去所述抗體溶液，然后用5ml 1X PBS洗板五次。
從全血中分離外周血單核細胞(PBMC)用無防腐劑或肝素鈉試管獲取來自患者的50ml外周血。所述血用1X PBS以1∶1稀釋。在15ml圓錐形離心管中，將8ml所述稀釋血鋪展在4ml室溫Ficoll-Paque Plus上。所述Ficoll梯度液在室溫下以400g離心40分鐘。使用巴氏吸管，小心地從Ficoll梯度液吸出PBMC層并轉(zhuǎn)移到清潔的15ml離心管。在管中加入四倍體積的1X PBS，倒置幾次以完全混合。所述PBMC在室溫下以100g離心10分鐘。去上清后，在細胞沉淀中加入10ml 1X PBS，并倒置混合。在室溫下以100g離心10分鐘，沉淀所述PBMC。除去上清，將所述PBMC重懸浮于5ml完全DC培養(yǎng)基(RPMI 1640，10％人血清，800 U/ml GMCSF，1000U/ml IL-4，100μg/ml慶大霉素)。
將所述重懸浮的PBMC(多達2×108)用移液管加入抗CD14包被的板，并旋轉(zhuǎn)以覆蓋整個板。所述板在室溫下溫育30分鐘。再次溫和旋轉(zhuǎn)所述板后，取出包含未貼壁細胞的上清。加入10ml 1X PBS并旋轉(zhuǎn)，洗滌貼壁細胞。重復(fù)該洗滌共四次，每次在同一位點進行吸量操作。在所述洗滌后，立即在板上加入10ml完全DC培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)物在37℃、5％CO2溫育5到10天，產(chǎn)生樹突細胞。
在手術(shù)后立即獲取從患者切割的腫瘤的一部分。將該部分腫瘤切成幾塊，置于含1X PBS的50ml圓錐離心管中。用解剖剪刀將所述腫瘤塊進一步切割成更小組織塊，然后置于T75組織培養(yǎng)瓶中。在瓶中加入10ml 0.25％胰酶/EDTA，在37℃震蕩溫育一小時。溫育后，在瓶內(nèi)加入15ml完全腫瘤細胞培養(yǎng)基(DMEM，10％人血清，200μg/ml慶大霉素)。取出腫瘤塊并置于清潔的T75瓶中，在37℃、5％CO2溫育過夜。
來自所述最初瓶的培養(yǎng)基/胰酶混合物包含一些單個腫瘤細胞。這些細胞過濾通過40μm細胞滲濾器，在1500rpm離心五分鐘沉淀。所述細胞重懸浮于10ml完全腫瘤細胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到T75組織培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2溫育。對于包含腫瘤塊的瓶，溫育過夜后加入20ml完全腫瘤細胞培養(yǎng)基。仔細監(jiān)測兩種瓶中的貼壁細胞。幾天后，從瓶中取出腫瘤塊。每三天流加培養(yǎng)貼壁腫瘤細胞，維持以供實驗使用。使用針對貼壁細胞的標(biāo)準組織培養(yǎng)技術(shù)，傳代培養(yǎng)所述細胞。
如上面實施例1所述制備細胞膜標(biāo)記的人樹突細胞和腫瘤細胞。
通過下面方法制備CD8+細胞毒性T細胞(CTL)。從全血中分離外周血單核細胞(PBMC)在無防腐劑或肝素鈉管中獲取來自患者的40ml外周血并在ACD管中獲取來自患者的10ml外周血。所述血用1X PBS以1∶1稀釋。在15ml圓錐形離心管中，將8ml所述稀釋的血鋪展在4ml室溫Ficoll-Paque Plus上。所述Ficoll梯度液在室溫下以400g離心40分鐘。使用巴氏吸管，小心地從Ficoll梯度液吸出PBMC層并轉(zhuǎn)移到清潔的15ml離心管。在管中加入四倍體積的1XPBS，倒置幾次以完全混合。所述PBMC在室溫下以100g離心10分鐘。去上清后，在細胞中加入10ml 1X PBS，并倒置混合。在室溫下以100g離心10分鐘，沉淀所述PBMC，然后重懸浮于完全淋巴細胞培養(yǎng)基(RPMI 1640，10％FBS，100μg/ml慶大霉素)。
從患者的無防腐劑或肝素鈉化的血中分離PBMC。對所述PBMC應(yīng)用如上文所述的相同淘選技術(shù)，只是使用抗CD4抗體包被板。淘選前，使PBMC通過尼龍毛柱，富集其中的T淋巴細胞。如下進行將0.5g精梳尼龍毛塞進一個10ml注射器，該注射器頂端裝有旋塞閥。該柱用含10％FBS的RPMI 1640在37℃洗滌兩次。關(guān)閉旋塞閥，在37℃溫育1小時。從柱中排出培養(yǎng)基直到液面到達尼龍毛頂端時，將PBMC加到柱上(高達每2ml培養(yǎng)基2×108)。打開旋塞閥，排放培養(yǎng)基直到細胞體積進入尼龍毛。關(guān)閉旋塞閥后，加入培養(yǎng)基直到覆蓋尼龍毛頂端。該柱在37℃溫育1小時。兩次用培養(yǎng)基洗滌，收集未粘附T細胞。經(jīng)過該T細胞富集步驟后，用抗CD4包被的板淘選T淋巴細胞?；厥誄D4抗體未結(jié)合的T細胞，假定它們是CD8+細胞(細胞毒性T淋巴細胞)。通過FACS分析證實為CD8+細胞。
為獲得腫瘤細胞特異性CTL的穩(wěn)定再刺激物，通過EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化使從ACD血分離的PBMC獲得無限分裂能力。如下完成將所述PBMC以1×106細胞/ml重懸浮于完全淋巴細胞培養(yǎng)基。在其中加入1ml EBV上清和0.2ml植物凝集素。該細胞混合物在T25組織培養(yǎng)瓶中于37℃、5％CO2下培養(yǎng)。
將從FACS分類獲得的Instant Dendritomas與所述富集的淘選CD8+T淋巴細胞以1∶10比例混合。需要使用的CD8+細胞在1500rpm離心5分鐘沉淀，然后重懸浮于1ml含RPMI 1640，10％FBS，1000U/ml IL-6，5ng/ml IL-12和10U/ml IL-12的培養(yǎng)基中。將該溶液加入分類后接種的Instant Dendritomas中。該培養(yǎng)物在37℃、5％CO2培養(yǎng)一周。在這一周內(nèi)用同樣培養(yǎng)基再流加培養(yǎng)培養(yǎng)所述細胞。
一周后，用照射過的用腫瘤裂解物脈沖處理的EBV轉(zhuǎn)化淋巴細胞再刺激所述已經(jīng)致敏的CD8+T細胞(CTL)。以前培養(yǎng)的腫瘤細胞用四個凍融循環(huán)處理，裂解細胞。為獲得含有腫瘤抗原的裂解物，已經(jīng)裂解的細胞在600g離心10分鐘。收集上清并在13,000g離心1小時。收集包含腫瘤抗原裂解物的上清。為再刺激所述CTL，用錐蟲藍排除進行活細胞計數(shù)。一旦確定了活細胞數(shù)量，就用腫瘤裂解物脈沖處理相同數(shù)量的EBV轉(zhuǎn)化淋巴細胞，將所述裂解物與所述淋巴細胞在37℃、5％CO2溫育1小時。所述脈沖處理的淋巴細胞用5,000拉德照射，然后與CTL在含有RPMI 1640，10％FBS，10U/ml IL-1α，5U/mlIL-2，50U/ml IL-4，125U/mlIL-6和30U/ml IL-7的培養(yǎng)基中混合。所述培養(yǎng)物在37℃、5％CO2培養(yǎng)，并每兩天進行流加培養(yǎng)再流加培養(yǎng)。在初次刺激后第7天和第14天進行再刺激。
每天再流加培養(yǎng)所述CTL，取出上清并貯存于-20℃。當(dāng)可行時，用OptEIA人IFN-γ試劑盒(PharMingen)進行γ干擾素(IFN-γ)測定。嚴格根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書實施該方法。使用Benchmark MicroplateReader(BioRad)讀取所述測定值。
為確定所述Instant Dendritomas是否刺激腫瘤細胞特異性CTL反應(yīng)，使用所培養(yǎng)的腫瘤細胞作為靶細胞進行CTL測定。在15ml圓錐形離心管中以200g離心五分鐘，收獲并沉淀五萬個腫瘤細胞。棄去上清，剩下0.1ml培養(yǎng)基在沉淀內(nèi)。在剩余的培養(yǎng)基內(nèi)溫和地重懸浮細胞。如下用51Cr標(biāo)記腫瘤細胞加入0.1ml的1mCi/ml51Cr溶液和10μl FBS，溫和混合。松開管蓋，將該混合物置于37℃、5％CO2溫育1小時。溫育后，用14ml RPMI 1640洗滌標(biāo)記的腫瘤細胞兩次，然后以5×104細胞/ml重懸浮于完全淋巴細胞培養(yǎng)基中。
將CTL效應(yīng)細胞接種到圓底96孔組織培養(yǎng)板的4孔中，其濃度等于100∶1、30∶1、10∶1和3∶1效應(yīng)細胞靶細胞。在包含效應(yīng)細胞的孔中以及在其它兩個用作天然和最大釋放對照的孔中加入五千個標(biāo)記的靶細胞?；旌霞毎⒃?00 g離心30秒鐘。所述板在37℃、5％CO2培養(yǎng)四小時。溫育結(jié)束前30分鐘，在最大釋放對照孔中加入0.1ml Triton X-100。溫育結(jié)束后，細胞在板上以200g離心五分鐘。每份上清取0.1ml加入含5ml閃爍混合液的閃爍計數(shù)瓶中。使用LS6500多用途閃爍計數(shù)器(Beckman)測量51Cr釋放量。
所述CTL測定結(jié)果顯示隨著雜交細胞致敏的CTL與腫瘤細胞的比例增加，同位素的釋放也增加，說明CTL數(shù)量和殺死腫瘤呈正相關(guān)關(guān)系。在100∶1效應(yīng)細胞靶細胞比例觀察到超過50％的殺死細胞。另一方面，沒有用本發(fā)明雜交細胞致敏的對照T細胞沒有這樣的相關(guān)關(guān)系。甚至在100∶1的比例，對照T細胞裂解的腫瘤細胞并不多于在更低比例裂解的腫瘤細胞。這些結(jié)果證明使用我們的雜交細胞抗原呈遞細胞產(chǎn)生的CTL完全有功能并且對腫瘤細胞有特異性。結(jié)果描述于圖1。
事實上，這些數(shù)據(jù)提供了基本證據(jù)，即本發(fā)明的雜交細胞能夠用于體內(nèi)免疫治療。已知CTL在細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，即它們主要負責(zé)殺死攜帶“外源”抗原的細胞。例如，使用免疫療法治療癌癥背后的原理基于刺激腫瘤特異性CTL，從而導(dǎo)致殺死腫瘤細胞。本發(fā)明雜交細胞能夠刺激腫瘤特異性T細胞反應(yīng)的事實提供了它們能夠通過同樣機制用于體內(nèi)免疫療法的切實證據(jù)。實施例3樹突細胞瘤表征本實施例進一步表征實施例1和2中描述的反應(yīng)細胞和樹突細胞瘤。
熒光顯微分析顯示100％染色的細胞被成功標(biāo)記。為測試染料是否在兩種不同類型的細胞間交叉染色，混合綠DC和紅腫瘤細胞并溫育過夜。熒光顯微檢查顯示沒有交叉染色。對融合細胞的即時檢查證明綠DC與紅腫瘤細胞融合在一起，過夜回收后，融合細胞顯示兩種顏色。雙色細胞(約10％總細胞)，即Instant Dendritomas隨后通過FACS分類進行純化。超過95％分類細胞是雙色融合細胞。
Instant Dendritomas表達所有抗原呈遞所需的分子。FACS分析顯示Instant Dendritomas表達抗原呈遞所需的分子，如I類MHC分子、II類MHC分子、輔助刺激分子CD80(B7.1)和CD86(B7.2)。數(shù)據(jù)描述于圖2。“同種型”是陰性對照；HLA-A、B、C是I類MHC分子，而HLA-DR是II類MHC分子。此外，在顯微鏡下，InstantDendritomas也具有黑素瘤細胞所具有的黑色顆粒。
在圖2中，用上面的方法融合分別用綠染料染色的人外周血DC和用紅染料染色的腫瘤細胞。過夜溫育后，將細胞等量分為四組。然后所述細胞與Cy-Chrome綴合的抗體(一百萬細胞/微克抗體，Becton/Dickinson)在冰上溫育30分鐘，用所述抗體染色所述細胞。不同分組如下抗人HLA-A、B、C[組I]；抗人HLA-DR[組II]；抗人CD80[組III]；抗人CD86[組IV]。兩次洗滌除去未結(jié)合的抗體，將細胞沉淀重懸浮于0.5ml染色緩沖液(含0.1％BSA和0.1％疊氮化鈉的PBS)。使用CellQuest軟件通過FACS進行三色分析。用同樣抗體以同樣方法染色對照人DC。實施例4臨床方法本實施例提供用本發(fā)明雜交細胞制備物治療人類癌癥患者的代表性臨床方法。例如，該治療方案可使用按照本發(fā)明方法制備的樹突細胞瘤來治療黑素瘤患者。
從患者外周血單核細胞產(chǎn)生成熟樹突細胞。用無防腐劑或肝素鈉管從患者獲取50ml外周血。簡要地說，所述血用1X PBS以1∶1稀釋。在15ml圓錐形離心管中，將8ml所述稀釋的血鋪展在4ml室溫Ficoll-Paque Plus上，然后以40g離心40分鐘。從Ficoll梯度液吸出PBMC層并轉(zhuǎn)移到清潔的l5ml離心管。在管中加入四倍體積的1X PBS，倒置以混合細胞。所述PBMC在室溫下以100g離心10分鐘。加入10ml 1X PBS，并倒置混合細胞。所述PBMC在室溫下以100g離心10分鐘。將所述PBMC重懸浮于5ml完全DC培養(yǎng)基(RPMI 1640+10％人血清+800U/ml GMCSF+1000U/ml IL-4)。然后使用抗CD14包被的板淘選樹突細胞/前體細胞。將2×108PBMC加入抗CD14包被的板并旋轉(zhuǎn)。所述板在室溫下溫育30分鐘。取出未貼壁細胞。加入10ml 1X PBS，旋轉(zhuǎn)板，然后除去PBS。重復(fù)該PBS洗滌共四次，每次在同一位點進行吸量操作。此后，立即在板上加入10ml完全DC培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)物在37℃、5％CO2溫育5到10天，產(chǎn)生樹突細胞。
在活組織檢查或切除時獲得腫瘤。用下面方法培養(yǎng)腫瘤細胞。從腫瘤組織(1-5克)除去脂肪組織和壞死組織后，將所述腫瘤切成小大塊并放入T75瓶。加入10ml 0.25％胰酶/EDTA。所述溶液在37℃震蕩溫育一小時，然后加入15ml完全培養(yǎng)基(DMEM+10％人血清+慶大霉素)。然后取出腫瘤塊并置于清潔的T75瓶中。所述瓶在37℃、5％CO2溫育過夜。所述細胞懸浮液/胰酶/完全培養(yǎng)基在1000g離心5分鐘。所述細胞重懸浮于15ml完全培養(yǎng)基中，在T75組織培養(yǎng)瓶中37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時。裝有腫瘤塊的瓶在沒有培養(yǎng)基的情況下溫育過夜后，加入20ml完全培養(yǎng)基，然后該溶液在37℃、5％CO2培養(yǎng)兩天。除去腫瘤塊，并培養(yǎng)貼壁細胞。用于樹突細胞融合的腫瘤細胞來自這兩種培養(yǎng)物。
下一步涉及融合來自患者的腫瘤細胞和樹突細胞。在加入聚乙二醇作為融合劑后，通過細胞融合形成雜交細胞為常規(guī)工作。下面概述的程序是Prado等，1989 FEBS Lett.，259149-52報道的用于PEG介導(dǎo)的單層體細胞融合的改進形式。
首先，將腫瘤細胞暴露于單劑量5000拉德，該劑量足以殺死所有細胞。然后用PKH2-GL熒光染料(Sigma)將樹突細胞染成綠色，用PKH26熒光染料(Sigma)將腫瘤細胞染成紅色。使用Sigma程序的輕微改進形式，在25℃進行所述染色程序。用無血清培養(yǎng)基洗滌要染色的細胞。所述細胞懸浮液在400g離心5分鐘，獲得松散的沉淀，然后除去上清組份。輕敲離心管，重懸浮所述沉淀，然后加入1mlDiluent(在無血清RPMI中的20％DMSO)重懸浮細胞。染色前，在聚丙烯管中用Diluent制備4×10-6摩爾染料(2X)。將細胞稀釋液快速加入1ml 2X染料，然后立即用移液管溫和吹打，混合所述混合物。然后所述混合物在25℃下溫育五分鐘。加入等體積10％人血清并溫育1分鐘，終止所述染色程序，所述人血清可以是患者自己的血清。用等體積完全培養(yǎng)基稀釋染色細胞。在400g離心10分鐘，從所述染色溶液分離出染色的細胞。
綠色樹突細胞與紅色腫瘤細胞以1∶1的比例在50ml圓錐形離心管中混合。該管裝滿無血清DMEM。所述細胞混合物在500g離心5分鐘。在離心細胞的同時，在層流凈化罩內(nèi)制備三個37℃雙燒杯水浴∶將盛有100ml 37℃水的400ml燒杯放入盛有75到100ml 37℃水的600ml燒杯中。將預(yù)熱50％PEG溶液的管和完全無血清DMEM的管放入層流凈化罩內(nèi)的兩個37℃水浴內(nèi)。然后從所述細胞混合物吸取上清并棄去。將包含混合細胞沉淀的管放入層流凈化罩內(nèi)的雙燒杯水浴，在37℃下進行細胞融合。在一分鐘內(nèi)將1ml預(yù)熱的50％PEG逐滴加入所述混合細胞沉淀，每加入一滴后用移液管尖攪拌細胞。然后再攪拌所述混合物一分鐘。
使用清潔的移液管，在一分鐘內(nèi)將1ml預(yù)熱的RPMI+HEPES逐滴加入所述細胞混合物，并在加入每滴后攪拌。用另外1ml預(yù)熱的RPMI+HEPES溶液重復(fù)該步驟一次。用10ml移液管，在二到三分鐘內(nèi)逐滴加入7ml預(yù)熱的RPMI+HEPES。該混合物在500g離心5分鐘。在離心細胞的同時，將水浴調(diào)回37℃并放置于層流凈化罩內(nèi)。將預(yù)熱的完全DC培養(yǎng)基放在燒杯水浴中。棄去混合物的上清；將所述管放回?zé)≈?。用移液管，強力加?0ml預(yù)熱的完全DC培養(yǎng)基到所述細胞沉淀，然后加入T75瓶中。該制備物在潮濕的37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中溫育過夜。
第二天，使用CELLQuest軟件(Becton/Dickenson)在FACS Caliber熒光激活細胞分類儀上分析所述細胞。該儀器將攜帶綠染料和紅染料的融合細胞分離出來。然后將這些融合細胞(樹突細胞瘤)重懸浮于1ml NS(生理鹽水)中并注射入患者體內(nèi)。
所述疫苗將包括100,000個(或更多個)與樹突細胞融合的照射腫瘤細胞(即樹突細胞瘤)。將這些樹突細胞瘤重懸浮于1ml NS，然后靜脈內(nèi)注射入患者體內(nèi)。
也可以采用低劑量方案給予白介素2(如Aldesleukin)。當(dāng)使用IL-2時，從接種開始的那一天開始，以一千八百萬單位日劑量皮下注射5天。
權(quán)利要求
1.一種試劑盒，它包含(i)至少兩種基本無內(nèi)毒素的染料，(ii)用一種方法由反應(yīng)細胞制備雜交細胞的說明書，所述方法包括使反應(yīng)細胞分別與一種所述染料接觸。
2.一種試劑盒，它包含至少兩種基本無內(nèi)毒素的染料和一種促進細胞融合的試劑。
3.依照權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中所述染料是花菁染料。
4.一種雜交細胞制備物，該制備物包含攜帶不多于n-1種選擇標(biāo)記的雜交細胞，其中n代表用于形成所述雜交細胞的反應(yīng)細胞數(shù)，并且所述制備物基本不含非雜交細胞。
5.一種雜交細胞制備物，該制備物包含一種原發(fā)性腫瘤細胞和一種抗原呈遞細胞的雜交細胞，其中所述制備物基本不含非雜交細胞。
6.一種雜交細胞制備物，該制備物包含一種正常細胞與一種抗原呈遞細胞的雜交細胞，所述抗原呈遞細胞缺乏產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答需要的輔助因子，其中所述制備物基本不含非雜交細胞。
7.依照權(quán)利要求6的制備物，其中所述正常細胞分離自移植器官。
8.一種雜交細胞制備物，該制備物包含一種病原性細胞和一種抗原呈遞細胞的雜交細胞，其中所述制備物基本不含非雜交細胞。
9.依照權(quán)利要求8的制備物，其中所述病原性細胞是一種寄生蟲細胞。
10.一種雜交細胞制備物，該制備物包含用至少兩種不同染料標(biāo)記的雜交細胞，其中所述制備物基本不含非雜交細胞。
11.依照權(quán)利要求10的制備物，其中所述染料是花菁染料。
12.依照權(quán)利要求10的制備物，其中所述雜交細胞得自作為反應(yīng)細胞的樹突細胞。
13.依照權(quán)利要求10的制備物，其中所述雜交細胞得自作為反應(yīng)細胞的未成熟B細胞。
14.一種制備雜交細胞的方法，該方法包括(a)使至少兩種不同細胞在促進細胞融合的條件下融合，然后(b)純化所得雜交細胞，而不需要進行抗生素或代謝選擇。
15.依照權(quán)利要求14的方法，該方法還包括用一種不同的熒光染料標(biāo)記各所述不同細胞，其中使用熒光激活細胞分類術(shù)完成所述純化。
16.依照權(quán)利要求15的方法，其中所述雜交細胞包含至少一種選自以下的細胞巨噬細胞、樹突細胞、缺乏產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答所需輔助因子的抗原呈遞細胞。
17.依照權(quán)利要求14的方法，其中所述雜交細胞包含至少一種選自以下的細胞腫瘤細胞、病原性細胞和正常細胞。
18.一種制備雜交細胞的方法，該方法包括(a)使兩種不同細胞在促進細胞融合的條件下接觸，然后(b)在48小時內(nèi)純化所得的雜交細胞。
19.一種制備雜交細胞的方法，該方法包括(a)使第一種細胞接觸第一種染料，(b)使第二種細胞接觸第二種染料，(c)使所述第一種細胞和所述第二種細胞在促進細胞融合的條件下相互接觸，然后(d)純化所得的雜交細胞。
20.依照權(quán)利要求19的方法，其中所述染料是兩種不同的花菁染料，并且使用熒光激活細胞分類術(shù)完成所述純化。
21.依照權(quán)利要求20的方法，其中所述雜交細胞包含至少一種選自以下的細胞巨噬細胞、樹突細胞、缺乏產(chǎn)生陽性免疫應(yīng)答所需輔助因子的抗原呈遞細胞。
22.依照權(quán)利要求20的方法，其中所述雜交細胞包含至少一種選擇以下的細胞腫瘤細胞、病原性細胞和正常細胞。
23.一種治療癌癥的方法，該方法包括(a)提供依照權(quán)利要求12的雜交細胞制備物，其中所述雜交細胞得自作為第二種反應(yīng)細胞的癌細胞；然后(b)給予癌癥患者所述制備物。
24.依照權(quán)利要求23的方法，該方法還包括給予所述患者治療有效量的白介素2。
25.一種治療與病原生物存在有關(guān)的疾病的方法，該方法包括(a)提供依照權(quán)利要求12的雜交細胞制備物，其中所述雜交細胞由來自所述病原生物的第二種反應(yīng)細胞獲得；然后(b)給予患者所述制備物。
26.依照權(quán)利要求25的方法，該方法還包括給予所述患者治療有效量的白介素2。
27.一種誘導(dǎo)抗原免疫耐受性的方法，該方法包括(a)提供依照權(quán)利要求13的雜交細胞制備物，其中所述雜交細胞衍生自表達需要免疫耐受的抗原的第二種反應(yīng)細胞；然后(b)給予患者所述制備物。
28.依照權(quán)利要求27的方法，其中所述第二種反應(yīng)細胞是一種來自移植器官的細胞，并且所述患者需要進行器官移植。
全文摘要
一種制備雜交細胞的快速簡便方法，該方法適用于完全分化的不分裂細胞，該方法需要使至少兩種不同細胞在促進細胞融合的條件下接觸，然后純化所得的雜交細胞，而不需要進行抗生素或代謝選擇。該方法獲得的雜交細胞作為免疫系統(tǒng)細胞調(diào)節(jié)劑可用于各種用途，包括用于臨床治療方案。
文檔編號A61P31/04GK1427889SQ01806229
公開日2003年7月2日 申請日期2001年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月11日
發(fā)明者T·瓦格納, Y·韋 申請人:格林維爾醫(yī)院系統(tǒng)公司