專利名稱：胃腸外應(yīng)用噬菌體相關(guān)的裂解酶治療性治療細菌感染的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明公開了通過將與適宜載體混合的裂解酶、holin裂解酶、改組裂解酶和/或嵌合裂解酶胃腸外引入患者體內(nèi)以治療細菌感染的方法和組合物。所述注射可以肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)進行。2.現(xiàn)有技術(shù)的描述過去，已經(jīng)用抗生素來治療各種感染。Selman Waksman在鏈霉菌的引入和生產(chǎn)方面的工作和Fleming博士的青霉素的發(fā)現(xiàn)、以及抗生素領(lǐng)域中許多其它人的研究是眾所周知的。在數(shù)年內(nèi)已經(jīng)對“基礎(chǔ)”抗生素進行了添加和化學(xué)修飾，以嘗試使其更加強有力或治療對這些抗生素過敏的人。
其它研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這些抗生素的新用途。美國專利第5,260,292號(Robinson等)公開了用氨基青霉素局部治療痤瘡。局部治療痤瘡和痤瘡樣皮膚病的方法和組合物包括應(yīng)用治療痤瘡和痤瘡樣皮膚病有效量的抗生素，所述抗生素選自氨芐青霉素、阿莫西林、其它氨基青霉素類和頭孢菌素類以及它們的衍生物和類似物。美國專利第5,409,917號(Robinson等)公開了用頭孢菌素類治療局部治療痤瘡。
然而，由于更多的抗生素一直是開處方或以日益增加的比率用于多種疾患，因此越來越多的細菌產(chǎn)生了對抗生素的抗性?，F(xiàn)在使用更大劑量的更強的抗生素來治療抗性愈來愈強的細菌菌株。因此，已經(jīng)產(chǎn)生了多種抗生素抗性細菌。更多抗生素的應(yīng)用和顯示出抗性的細菌數(shù)已經(jīng)導(dǎo)致需要使用的抗生素的時間增加?，F(xiàn)在更加頻繁地使用廣譜非特異性抗生素，其中某些對患者有有害效應(yīng)。另外，對抗生素顯示出過敏反應(yīng)的人數(shù)似乎越來越多。
因而，已經(jīng)進行了其它研究，以便首先鑒別細菌，然后殺死細菌。
已經(jīng)嘗試應(yīng)用噬菌體治療細菌性疾病。美國專利第5,688,501號(Merril等)公開了一種用對特定細菌?；牧倚曰蚍橇倚允删w治療動物體內(nèi)由細菌引起的感染性疾病。
美國專利第4,957,686號(Norris)公開了一種改進牙科保健的方法，所述方法將寄生于具有容易粘附于唾液薄膜特性的細菌的噬菌體引入口腔。
應(yīng)該注意，將噬菌體直接引入動物體內(nèi)以預(yù)防疾病或抵抗疾病有一些缺點。具體地說，細菌必須處于正常的生長期以供噬菌體附著。細菌和噬菌體都必須處于正確和同步的生長周期中。另外，必須有適當(dāng)數(shù)目的噬菌體附著于細菌。噬菌體也必須具有足夠活性。噬菌體也受許多物質(zhì)抑制，包括來自它將要攻擊的生物的細菌碎片。使直接應(yīng)用噬菌體治療細菌感染進一步復(fù)雜化的是使噬菌體無功能的免疫反應(yīng)的可能性。另一問題是細菌表面的受體突變，防止噬菌體附著。
因此，其它人已經(jīng)探索了應(yīng)用其它更安全、更有效的方法來治療和預(yù)防細菌感染。
已經(jīng)廣泛研究更有效治療的一類細菌是鏈球菌屬(Streptococcus)。鏈球菌屬包括種類繁多的致病菌和發(fā)現(xiàn)棲居于各種各樣宿主(包括人類、馬、豬和牛)的共生性革蘭氏陽性菌。在宿主體內(nèi)，通常發(fā)現(xiàn)鏈球菌在口、鼻孔和咽的粘膜表面定居。然而，在某些情況下，它們也可以棲居于皮膚、心臟或肌肉組織。
人類的致病鏈球菌包括化膿鏈球菌(S.pyogenes)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)和糞鏈球菌(S.faecalis)。雖然A組(GroupA)鏈球菌可以存在于喉或皮膚上，并且不引起病癥，但它們也可以引起范圍從輕度至重癥或甚至威脅生命的感染。在致病溶血性鏈球菌中，化膿鏈球菌或A組鏈球菌已經(jīng)被認為是急性咽炎(“鏈球菌喉”)、膿皰病、風(fēng)濕熱、猩紅熱、腎小球腎炎和侵入性筋膜炎的病原體。壞死性筋膜炎(有時被媒體描述為“食肉細菌”)是一種肌肉和脂肪組織的破壞性感染。當(dāng)侵入性A組鏈球菌突破受感染人的防御時，發(fā)生侵入性A組鏈球菌感染。在美國，每年發(fā)生約10,000-15,000例侵入性GAS疾病，導(dǎo)致超過2,000人死亡。CDC估計，在美國每年發(fā)生500-1,500例壞死性筋膜炎和2,000-3,000例鏈球菌性中毒性休克綜合征。約20％的壞死性筋膜炎患者死亡，60％的鏈球菌性中毒性休克綜合征患者死亡。約10-15％的其它形式侵入性A組鏈球菌性疾病患者死亡。
另外，C組鏈球菌可以因皮膚割破而引起蜂窩織炎，雖然蜂窩織炎通常與金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)相關(guān)。蜂窩織炎可以引起死亡，特別是在老年個體或已經(jīng)虛弱的個體中。
報道已經(jīng)描述了由C組鏈球菌生物在感染被鑒定為C1的特定噬菌體后產(chǎn)生的一個酶的特征(Maxted，W.R.“The Active Agent inNascent Page Lywsis of Streptococci，”J.Gen Micro.，第16卷，第585-595頁，1957，Krause，R.M.，“對溶血性鏈球菌的噬菌體的研究，”J.Exp.Med.第108卷，第803-821頁，1958)和Fischetti，(Fischetti，V.A.等，“C組鏈球菌噬菌體相關(guān)溶素的純化和物理特性，”J.Exp.Med，第133卷，第1105-1117頁，1971)。所述酶命名為溶素，發(fā)現(xiàn)其特異性地切割A(yù)組、C組和E組鏈球菌的細胞壁。這些研究人員提供了有關(guān)該酶裂解A組鏈球菌并釋放細胞壁糖類的特征和活性的信息。
美國專利第5,604,109號(Fischetti等)涉及通過用半純化的C組鏈球菌噬菌體相關(guān)的溶素酶進行酶消化，快速檢測臨床樣本中的A組鏈球菌。本發(fā)明基于這樣一個發(fā)現(xiàn)對感染特定噬菌體的細菌特異性的噬菌體裂解酶可以有效和高效率地分解所述細菌的細胞壁。同時，所述酶的底物在哺乳動物組織中不存在，因而當(dāng)在消化所述細菌的細胞壁期間存在所述酶時，所述酶對于哺乳動物蛋白和組織是非破壞性的。
美國專利第5,985,271號(Fischetti等)、美國專利第5,997,862號(Fischetti等)和美國專利第6,017,528號(Fischetti等)公開了口服給藥方式的組合物和應(yīng)用，例如用于預(yù)防性和治療性治療A組鏈球菌喉感染(通常稱為鏈球菌喉)的含有感染C1噬菌體的C組鏈球菌產(chǎn)生的溶素酶的糖果、口香糖、錠劑、含片、片劑、散劑、氣霧劑、液體或液體噴霧劑。這是美國專利第5,604,109號的溶素酶。
在美國專利第5,604,109號中用來生產(chǎn)和純化所述溶素酶的相同的通用技術(shù)，可以用來生產(chǎn)感染細菌專性噬菌體的所述細菌產(chǎn)生的其它裂解酶。根據(jù)細菌，可以改變生長培養(yǎng)基和條件。
通過用細菌專性噬菌體感染細菌產(chǎn)生的噬菌體相關(guān)裂解酶的應(yīng)用，對于疾病的治療有許多好處。裂解酶具有與其互補的噬菌體相似的特性，因為它們都靶向特定的細菌，并且當(dāng)被選擇時，都不干擾正常菌群的功能。此外，烈性噬菌體主要攻擊不受質(zhì)粒變異影響的細胞壁結(jié)構(gòu)。所述裂解酶的作用快速，并且不依賴于細菌生長。另外，可以將裂解酶導(dǎo)向粘膜內(nèi)襯，在此停留時，它們將能夠殺死定居細菌。
美國專利第6,056,954號(Fischetti等)公開了用于預(yù)防性或治療性治療細菌感染的方法和組合物，包括將有效量的至少一種由感染細菌專性噬菌體的所述細菌產(chǎn)生的裂解酶給予至感染部位。所述裂解酶優(yōu)選包含一種適合于將所述裂解酶傳遞至所述感染部位的載體。該方法和療法可以用來治療上呼吸道感染、局部感染、陰道感染、眼部感染、耳感染、用于胃腸外療法和大多數(shù)其它細菌感染。
美國專利第6,056,955號(Fischetti等)公開了鏈球菌感染的局部療法。
通過用細菌專性噬菌體感染細菌產(chǎn)生的噬菌體相關(guān)裂解酶的應(yīng)用，對于疾病的治療有許多好處。由于所述噬菌體靶向特定的細菌，因此所述裂解酶并不干擾正常的菌群。此外，烈性噬菌體主要攻擊不受質(zhì)粒變異影響的細胞壁結(jié)構(gòu)。所述裂解酶的作用快速，并且不依賴于細菌生長。
然而，有時到治療感染時為止，所述細菌感染已經(jīng)發(fā)展為更為嚴重的疾病。例如，例如金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的皮膚感染可以發(fā)展為蜂窩織炎，該疾病如果不被制止，可以導(dǎo)致結(jié)締組織分解、敗血癥和可能導(dǎo)致死亡。其它細菌感染也可以演變?yōu)樯顚咏M織感染。由其它細菌引起的其它感染(性質(zhì)上不一定是皮膚感染)可能感染機體的某些組織并在此定居，使得感染難以治療。
美國申請第09/482,992號公開了通過胃腸外引入至少一種由感染所述細菌的專性噬菌體的細菌產(chǎn)生的裂解酶和用于將所述裂解酶傳遞到患者體內(nèi)的適宜載體、治療細菌感染的方法和組合物。所述注射可以肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)進行。
用于獲得和純化由感染所述噬菌體的細菌產(chǎn)生的裂解酶的方法是本領(lǐng)域已知的。最近的某些證據(jù)提示，裂解鏈球菌生物的噬菌體酶可能實際上是一種用來構(gòu)建細胞壁和所述噬菌體的細菌酶。雖然在細菌中復(fù)制，但噬菌體基因產(chǎn)物可以引起細菌酶的正調(diào)節(jié)或去阻抑，以便釋放所述噬菌體。這些細菌酶可能受細菌細胞的嚴密調(diào)節(jié)，并且可以被所述細菌用來構(gòu)建和裝配細胞壁。
然而，除本發(fā)明人外，尚未探索應(yīng)用這些裂解酶以預(yù)防性和治療性治療細菌性疾病。由噬菌體產(chǎn)生的裂解酶是特異性的并且有效殺死選定的細菌。
目前在生物技術(shù)領(lǐng)域傾向于對微生物進行基因組測序，以便部分幫助設(shè)計治療藥物的確定。這種類型的建模是適時且昂貴的，可能或不能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新藥物。本發(fā)明的精巧之處在于這樣一個事實噬菌體誘導(dǎo)的裂解酶已經(jīng)進化為極其有效的、所選定細菌的靶向殺傷劑。經(jīng)純化酶的一級結(jié)構(gòu)和測序用作模板，由此可以實施多種化學(xué)操作(例如改組)以優(yōu)化所述酶的效力。
這些噬菌體誘導(dǎo)的裂解酶可用于殺死多種細菌病原體，包括涉及例如鏈球菌屬、假單胞菌屬等的典型臨床疾病的病原體以及涉及生物戰(zhàn)因子的病原體，例如分別引起炭疽和鼠疫的芽孢桿菌屬(Bacillus)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)，還可用于其它用途。
本發(fā)明(將美國專利第5,604,109號的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)應(yīng)用由細菌生物體在感染特定噬菌體后產(chǎn)生的一種酶，作為用于已經(jīng)因所述感染生病的患者的治療性治療。本發(fā)明基于這樣一個發(fā)現(xiàn)對于感染特定噬菌體的細菌特異性的噬菌體裂解酶，可以有效且高效率地降解所述細菌的細胞壁。同時，半純化的酶缺乏蛋白水解酶活性，因此當(dāng)在消化所述細菌細胞壁期間存在時，對哺乳動物蛋白和組織不具有破壞性。
嵌合酶、改組酶、裂解酶和holin酶的構(gòu)建、純化和分離也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。具體地說，美國專利第6,132,970號(Stemmer)(通過引用結(jié)合到本文中)公開了用于構(gòu)建這些酶的多種新技術(shù)和更為確立的方法的修改。所提出的發(fā)明利用這些技術(shù)，并將其用于增強具體指明的噬菌體相關(guān)裂解酶。在美國專利第6,056,954號(也通過引用結(jié)合到本文中)中所述的用于分離溶素酶的技術(shù)可以應(yīng)用于其它噬菌體相關(guān)裂解酶。同樣，其它現(xiàn)有技術(shù)可以用于分離裂解酶。
對于定義，改組酶是其中通常不止一種特定酶的不止一個序列已經(jīng)在一個或多個位置被切割，并且以特定順序或隨機順序重建、從而增強其活性或特異性的酶。
嵌合酶是組合兩種或更多種酶、具有兩個或更多個活性部位的酶，因此所述嵌合酶可以獨立地作用于相同或不同的分子。這將可供潛在同時治療兩種或更多種不同的細菌感染。
holin酶在細胞膜中產(chǎn)生孔。更具體地講，holin酶形成終止呼吸的致死性膜損害。同所述裂解酶一樣，holin酶由噬菌體基因組編碼并攜帶。事實上，相當(dāng)普遍的是，發(fā)現(xiàn)holin酶的遺傳密碼與噬菌體中的裂解酶的密碼鄰接或甚至在所述密碼內(nèi)。大多數(shù)holin序列短，且其性質(zhì)總體上是疏水性的，具有一個高度親水性羧基末端結(jié)構(gòu)域。在許多情況下，推定的holin酶在噬菌體酶活性結(jié)構(gòu)域內(nèi)的不同讀框上編碼。在其它情況下，所述holin酶在與編碼所述噬菌體的DNA鄰接或接近的DNA上編碼。holin酶通常在噬菌體感染晚期合成，在細胞質(zhì)膜中發(fā)現(xiàn)，在此它引起膜損害。
根據(jù)一級結(jié)構(gòu)分析，holin酶可以分為兩大類。I類holin通常為95個殘基或更長，可能具有三個潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域。II類holin通常較小，約65-95個殘基，分布有帶電荷和疏水性殘基，表明有2個TM結(jié)構(gòu)域(Young等，Trends in Microbiology第8卷，第4期，2000年3月)。然而，至少對于革蘭氏陽性宿主的噬菌體而言，所述雙組分裂解系統(tǒng)可能不是普遍的。雖然已經(jīng)表明或提示幾種噬菌體存在holin，但尚未發(fā)現(xiàn)編碼所有所述噬菌體的推定holin的基因。其中，已經(jīng)表明或提示乳球菌噬菌體Tuc2009、乳球菌NLC3、肺炎球菌噬菌體EJ-1、加氏乳桿菌(lactobacillus gasseri)噬菌體Nadh、金黃色葡萄球菌噬菌體Twort、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)噬菌體、肺炎球菌噬菌體Cp-1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)噬菌體M29、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckki)噬菌體LL-H溶素和金黃色葡萄球菌噬菌體N11存在holin。(Loessner等，Journal of Bacteriology，1999年8月，第4452-4460頁)。
所述裂解系統(tǒng)由holin和至少一種能夠降解細菌細胞壁的肽聚糖水解酶或“溶素”組成。溶素可以是作用于糖部分的內(nèi)-N-乙酰葡糖胺糖苷酶或N-乙酰胞壁質(zhì)酶(溶菌酶)、作用于肽交聯(lián)橋的內(nèi)肽酶、或更通常為水解連接糖部分和肽部分的酰胺鍵的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。通常，所述holin在噬菌體感染晚期表達，在細胞膜中形成孔，允許所述溶素接近細胞壁肽聚糖，導(dǎo)致釋放子代噬菌體。重要的是，外源添加的溶素可以裂解細菌細胞的細胞壁，產(chǎn)生稱為“自外溶菌作用”的現(xiàn)象。然而，在含有外膜的革蘭氏陰性細菌中，外源添加的與裂解酶組合的holin的存在，可能允許更有效地使所述裂解酶接近肽聚糖，使得更好地裂解。
更具體地講，當(dāng)純化時，酶的序列可以通過常規(guī)技術(shù)測定，一級結(jié)構(gòu)的重排可以通過現(xiàn)有技術(shù)例如改組來完成，以提高所述酶的活性和穩(wěn)定性。改組也允許組合酶(“嵌合酶”)具有不止一種活性。
通過用細菌專性噬菌體感染細菌產(chǎn)生的噬菌體相關(guān)裂解酶的應(yīng)用，對于疾病的治療有許多好處。由于所述噬菌體靶向特定的細菌，因此所述裂解酶并不干擾正常的菌群。此外，烈性噬菌體主要攻擊不受質(zhì)粒變異影響的細胞壁結(jié)構(gòu)。所述裂解酶的作用快速，并且不依賴于細菌生長。
本發(fā)明的一個目的是靜脈內(nèi)應(yīng)用至少一種噬菌體相關(guān)裂解酶、至少一種嵌合裂解酶、至少一種改組裂解酶、至少一種holin酶或其組合，治療敗血癥、一般性感染和深層組織感染。
本發(fā)明的另一目的是將至少一種噬菌體相關(guān)裂解酶、至少一種嵌合裂解酶、至少一種改組裂解酶、至少一種holin酶或其組合，注射到生物體組織中以治療深層組織感染。
在本發(fā)明的一個實施方案中，公開了由糞鏈球菌和金黃色葡萄球菌引起的多種疾病的療法。
在本發(fā)明的再一實施方案中，在所述治療劑中可以包括裂解金黃色葡萄球菌的酶-溶葡萄球菌素。
在本發(fā)明的又一實施方案中，在所述治療劑中可以包括常規(guī)抗生素和所述裂解酶，以及在所述治療劑中存在或不存在溶葡萄球菌素。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在所述治療劑中也可以包括至少一種裂解酶、至少一種嵌合裂解酶、至少一種改組裂解酶、至少一種holin酶或其組合。
所述治療劑可以通過肌內(nèi)、皮內(nèi)或皮下注射胃腸外給予，或者所述藥物可以靜脈內(nèi)給予。
本發(fā)明的另一目的是靜脈內(nèi)應(yīng)用至少一種噬菌體相關(guān)裂解酶、至少一種嵌合裂解酶、至少一種改組裂解酶、至少一種holin酶或其組合，治療敗血癥和一般性感染。
此外，本發(fā)明的一個目的是將噬菌體相關(guān)裂解酶注射到生物體組織中，以治療深層組織感染。
在本發(fā)明的一個實施方案中，公開了由肺炎鏈球菌、糞鏈球菌和金黃色葡萄球菌引起的多種疾病的療法。
在本發(fā)明的再一實施方案中，在所述治療劑中可以包括裂解金黃色葡萄球菌的酶-溶葡萄球菌素。
在本發(fā)明的又一實施方案中，在所述治療劑中可以包括常規(guī)抗生素和所述裂解酶，以及在所述治療劑中存在或不存在溶葡萄球菌素。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在所述治療劑中也可以包括不止一種裂解酶。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，用至少一種裂解酶、至少一種嵌合裂解酶、至少一種改組裂解酶、至少一種holin酶或其組合來治療細菌感染，從而提高殺傷細菌的速度和效率。
嵌合酶也可以用來通過在不止一個位置切割細胞壁，來治療一種細菌感染。
已經(jīng)產(chǎn)生并研究了多種嵌合裂解酶。基因E-L-一種分別由噬菌體φX174和MS2裂解蛋白E和L構(gòu)建的嵌合溶素，經(jīng)過內(nèi)部缺失，產(chǎn)生一系列新的裂解或殺傷特性改變的E-L克隆。在該項研究中，研究了親代基因E、L、E-L和E-L內(nèi)部截短形式的裂解活性，以根據(jù)不同跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的差異，表征所述不同裂解機制。胞質(zhì)空間和壁膜間隙電子顯微鏡和標(biāo)記酶的釋放表明，根據(jù)蛋白穿過大腸桿菌內(nèi)膜或者穿過內(nèi)膜和外膜，可以鑒別兩種不同的裂解機制。FEMS Microbiol.Lett.1998年7月1日，164(1)；159-67。
在另一試驗中，通過將乳球菌噬菌體Tuc2009溶素的N末端一半的編碼區(qū)與主要肺炎球菌自溶素的C末端結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)融合，已經(jīng)構(gòu)建了一種活性嵌合細胞壁裂解酶(TSL)。所述嵌合酶表現(xiàn)出能夠水解含膽堿的肺炎球菌細胞壁的糖苷酶活性。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案公開了應(yīng)用嵌合裂解酶來同時治療兩種感染性細菌，或在兩個不同位置切割細菌的細胞壁。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將holin酶與所述裂解酶結(jié)合使用，以提高殺傷所述細菌的速度和效率。holin酶也可以為嵌合和/或改組酶形式。holin酶也可以單獨用于治療細菌感染。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述holin酶是改組holin酶或嵌合holin酶，或者與所述裂解酶聯(lián)合，或者獨立于所述裂解酶。
用于治療細菌感染的方法包括用一種治療劑治療所述感染，所述治療劑包含有效量的由感染細菌專性噬菌體的所述細菌產(chǎn)生的至少一種裂解酶的修飾形式，其中所述至少一種裂解酶的修飾形式選自裂解酶、改組裂解酶、嵌合裂解酶及其組合。所述裂解酶最好在保證所述裂解酶活性的pH的環(huán)境中。所述holin酶也可以或者單獨使用或者與所述修飾的裂解酶聯(lián)合給予。所述holin酶可以以其“天然”狀態(tài)，可以是一種改組holin酶或者可以是一種嵌合裂解酶。
所述改組裂解酶和嵌合裂解酶可以或者通過酶法生產(chǎn)，或者通過重組DNA方法生產(chǎn)?？梢允褂萌魏我环N方法來生產(chǎn)這些酶。所述改組裂解酶和嵌合裂解酶可以稱為經(jīng)修飾的裂解酶或工程裂解酶。
所述裂解酶可以用來治療或預(yù)防流感嗜血菌(Hemophilusinfluenza)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、肺炎鏈球菌、糞鏈球菌、B組鏈球菌、李斯特氏菌屬、沙門氏菌屬(Salmonella)、大腸桿菌、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和其它細菌以及它們的任何組合。這種裂解酶可以或者補充嵌合和/或改組裂解酶，或者其自身可以是一種嵌合和/或改組裂解酶。同樣，可以包括一種holin酶，所述holin酶也可以是一種嵌合和/或改組裂解酶。
可以治療多種不同的細菌。在最常見感染深層組織、更具體地講感染結(jié)締組織的細菌中，有A組鏈球菌、葡萄球菌屬、假單胞菌屬和梭菌屬(Clostridium)。可以將不止一種裂解酶和不止一種holin裂解酶、改組裂解酶、嵌合裂解酶或其組合一次引入受感染的機體內(nèi)。
可以用多種不同方法引入所述裂解酶。這些方法包括將所述經(jīng)修飾的裂解酶靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和真皮下導(dǎo)入。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，可以通過將一種治療劑注射到所述患者的受感染組織中，治療深層組織感染，所述治療劑包含所述適宜的holin裂解酶、嵌合裂解酶、改組裂解酶、裂解酶或其組合以及一種所述酶的載體。所用的裂解酶可以或者補充嵌合和/或改組裂解酶，或者其自身可以是一種嵌合和/或改組裂解酶。同樣，可以包括一種holin酶，所述holin酶也可以是嵌合和/或改組裂解酶。所述載體可以包含蒸餾水、鹽溶液、白蛋白、血清或其任何組合。更具體地講，輸液或注射液可以以常規(guī)方式制備，例如添加防腐劑例如對羥基苯甲酸酯或穩(wěn)定劑例如乙二胺四乙酸的堿金屬鹽，然后可以將所述輸液或注射液轉(zhuǎn)移到輸注容器、注射用管形瓶或安瓿中?；蛘?，注射用的所述化合物可以與所述其它組分一起或者不與其它組分一起凍干，并且在使用時適宜地溶于緩沖液或蒸餾水。非水溶媒例如固定油和其它油酸乙酯可用于其中。在肌內(nèi)注射是所選擇的給藥方式的情況下，最好使用等滲制劑。一般而言，等滲添加劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在某些情況下，優(yōu)選等滲溶液例如磷酸緩沖鹽溶液。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在某些實施方案中，將血管收縮藥加入所述制劑中。提供無菌且無熱原的按照本發(fā)明的藥用制劑。
所述載體適宜含有少量添加劑，例如增強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。這類物質(zhì)在所應(yīng)用的劑量和濃度下對于受者是無毒的，包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸和其它有機酸或其鹽；抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；甘氨酸；氨基酸，例如谷氨酸、天冬氨酸、組氨酸或精氨酸；單糖、雙糖和其它糖類，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、海藻糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；相反離子，例如鈉；非離子表面活性劑，例如聚山梨酸酯、poloxamer或聚乙二醇(PEG)；和/或中性鹽，例如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等。藥用的甘油(glycerin)或甘油(glycerol)(1，2，3-丙三醇)是市售的?？梢栽跓o菌注射用水或氯化鈉注射液或其它藥學(xué)上可接受的含水注射液中稀釋，以0.1-100％(v/v)、優(yōu)選1.0-50％、更優(yōu)選約20％的濃度使用。DMSO是一種非質(zhì)子溶劑，具有突出的增強許多局部應(yīng)用藥物滲透的能力。DMSO可以在無菌注射用水、或氯化鈉注射液、或其它藥學(xué)上可接受的含水注射液中稀釋，并且以0.1-100％(v/v)的濃度使用。
所述載體溶媒也可以包括Ringer溶液、緩沖液和葡萄糖溶液，特別是當(dāng)制備靜脈溶液時。
在將包括經(jīng)修飾的裂解酶在內(nèi)的所述裂解酶加入所述載體系統(tǒng)或口服給藥方式之前或同時，最好所述酶在穩(wěn)定性緩沖液環(huán)境中，以保持約4.0至約9.0、更優(yōu)選約5.5至約7.5的pH范圍，最優(yōu)選pH約6.1。這是針對鏈球菌的溶素酶的最適pH范圍。
穩(wěn)定緩沖劑應(yīng)該為所述經(jīng)修飾的裂解酶的最佳活性創(chuàng)造條件。所述緩沖劑可以是一種還原試劑，例如二硫蘇糖醇。所述穩(wěn)定緩沖劑也可以是一種金屬螯合劑，例如乙二胺四乙酸二鈉鹽，或包括金屬螯合劑，或者它也可以含有磷酸鹽或檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖劑。在所述載體中存在的緩沖劑可以用來穩(wěn)定所述經(jīng)修飾的裂解酶的環(huán)境。
所述經(jīng)修飾的裂解酶治療所述感染的有效劑量率或有效量以及治療持續(xù)時間將部分取決于所述感染的嚴重程度、所述受體暴露于所述感染性細菌的持續(xù)時間、受感染皮膚或組織的平方厘米數(shù)、所述感染的深度、所述感染的嚴重程度以及各種各樣的其它變量。所述組合物可以每日一次至數(shù)次用于任何部位，并且可以短期或長期應(yīng)用。所述應(yīng)用可以持續(xù)數(shù)日或數(shù)周。所用的任何劑型都應(yīng)該確保最短時間的最小單位量。認為確保酶的有效量或有效劑量的酶的活性單位的濃度的范圍可以為每ml組合物約100單位至約500,000單位，優(yōu)選范圍為約1000單位/ml至約100,000單位/ml，最優(yōu)選約10,000-100,000單位/ml。每ml活性單位的量和暴露時間的長短取決于感染的性質(zhì)以及所述載體允許所述經(jīng)修飾的裂解酶接觸的量。人們會記得，經(jīng)修飾的裂解酶在液體環(huán)境中作用最佳。因此，所述經(jīng)修飾的裂解酶的效率與載體捕獲的水分量部分相關(guān)。為了治療敗血癥，應(yīng)該將治療劑連續(xù)靜脈內(nèi)注入血流中。經(jīng)修飾的裂解酶治療敗血癥的濃度取決于所述感染的嚴重程度。
為了加快對感染的治療，所述治療劑可以還包括協(xié)同增強所述經(jīng)修飾的裂解酶治療效應(yīng)有效量的至少一種也可以增強所述經(jīng)修飾的裂解酶殺細菌活性的補充藥物(complementary agent)。所述補充藥物可以是青霉素、合成青霉素桿菌肽、甲氧西林、頭孢菌素、多粘菌素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢孟多酯鈉、頭孢唑啉、頭孢克肟、頭孢美唑、頭孢尼西(cefonioid)、頭孢哌酮、頭孢雷特、cefotanme、頭孢噻肟、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢泊肟丙酯、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢曲松(cefriaxone)moxalactam、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢菌素C、頭孢菌素C鈉鹽、頭孢噻吩、頭孢噻吩鈉鹽、頭孢匹林、頭孢拉定、cefuroximeaxetil、二水頭孢噻吩、拉氧頭孢、氯碳頭孢(loracarbef)mafate、螯合劑和它們的任何組合。
另外，所述治療劑還可以包含用于治療任何金黃色葡萄球菌細菌的酶-溶葡萄球菌素。已經(jīng)表明粘液溶解肽例如溶葡萄球菌素在治療人類金黃色葡萄球菌感染方面有功效(Schaffner等，Yale J.Biol.& Med.，39230(1967)和由金黃色葡萄球菌引起的牛乳腺炎(Sears等，J.DairyScience，71(增刊1)244(1988))。溶葡萄球菌素是模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的一種基因產(chǎn)物，通過酶促降解金黃色葡萄球菌細胞壁的聚甘氨酸交聯(lián)而對金黃色葡萄球菌發(fā)揮抑制細菌和殺細菌效應(yīng)(Browder等，Res.Comm.，19393-400(1965))。美國專利第3,278,378號描述了從S.staphylolyticus(以后重命名為模仿葡萄球菌)的培養(yǎng)基生產(chǎn)溶葡萄球菌素的發(fā)酵法。在美國專利第3,398,056號和3,594,284號中進一步公開了生產(chǎn)溶葡萄球菌素的其它方法。隨后克隆了溶葡萄球菌素的基因并對其進行了測序(Recsei等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，841127-1131(1987))。重組粘液溶解殺細菌蛋白例如r-溶葡萄球菌素因其靶向特異性、毒性低和可能減少生物活性殘基，可能潛在地繞過與目前抗生素療法相關(guān)的問題。此外，溶葡萄球菌素也對非分裂細胞有活性，而大多數(shù)抗生素需要活躍分裂的細胞來介導(dǎo)其效應(yīng)(Dixon等，Yale J.Biology and Medicine，4162-68(1968)))。在存在或不存在所列的抗生素的情況下，可以將溶葡萄球菌素與所述經(jīng)修飾的裂解酶聯(lián)合使用。在同一治療劑中應(yīng)用溶葡萄球菌素和所述溶素酶兩者在一定程度上增加了重要性。通常，當(dāng)機體感染細菌時，由一個屬的細菌引起的感染使所述機體虛弱，或改變機體的菌群，使得其它潛在致病菌感染所述機體。有時共感染機體的細菌之一是金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌的許多菌株產(chǎn)生青霉素酶，使得葡萄球菌屬、鏈球菌屬和其它革蘭氏陽性菌菌株不為標(biāo)準抗生素殺死。因而，應(yīng)用所述經(jīng)修飾的裂解酶和溶葡萄球菌素、也許聯(lián)合抗生素，可以用作細菌感染的最為快速而有效的療法。在再一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明可以包括變?nèi)芫睾腿芫浮?br> 應(yīng)用裂解酶(包括但不限于holin裂解酶、嵌合裂解酶、改組裂解酶及其組合)快速裂解細菌細胞。

圖1的薄切片電子顯微鏡照片顯示了用溶素處理15秒的A組鏈球菌1的結(jié)果。該顯微鏡照片(25,000倍放大)顯示了由所述溶素酶導(dǎo)致細胞內(nèi)容物2通過細胞壁中產(chǎn)生的孔3流出。
如上所述，應(yīng)用所述holin裂解酶、嵌合裂解酶和改組裂解酶，可以伴隨應(yīng)用“天然”裂解酶，所述“天然”裂解酶未經(jīng)采用美國專利第6,132,970號所述方法或相似的現(xiàn)有技術(shù)方法修飾。
根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明的許多修改和變化都是可行的。因此，應(yīng)該理解，本發(fā)明可以在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)受保護，而不限于具體描述的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種治療細菌感染的方法，所述方法包括胃腸外給予有效量的治療劑，所述治療劑包含至少一種由細菌專性噬菌體感染的所述細菌產(chǎn)生的酶，其中所述至少一種酶選自裂解酶、經(jīng)修飾的裂解酶及其組合；和一種將所述裂解酶傳遞至所述感染部位的載體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述經(jīng)修飾的裂解酶選自嵌合裂解酶、改組裂解酶及其組合。
3.權(quán)利要求1的方法，其中還包含至少一種holin酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種hoiln酶是一種改組酶。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述至少一種holin酶是一種嵌合酶。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種酶用于治療假單胞菌屬(Pseudomonas)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種酶用于治療鏈球菌屬(Streptococcus)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種酶用于治療葡萄球菌屬(Staphylococcus)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種酶用于治療梭菌屬(Clostridium)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包含將所述組合物的pH維持在約4.0-約9.0的范圍內(nèi)的緩沖劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩沖劑將所述組合物的pH維持在約5.5-約7.5的范圍內(nèi)。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩沖劑包含一種還原劑。
13.權(quán)利要求12的方法，所述還原劑是二硫蘇糖醇。
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩沖劑包含一種金屬螯合劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述金屬螯合劑是乙二胺四乙酸二鈉鹽。
16.權(quán)利要求10的方法，其中所述緩沖劑是一種檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖劑。
17.權(quán)利要求1的方法，其中還包含一種作為防腐劑的殺細菌劑或細菌抑制劑。
18.權(quán)利要求1的方法，其中將所述至少一種裂解酶凍干。
19.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將濃度為約100至約500,000活性酶單位/ml的流體給予鼻腔通道或口腔通道的潮濕環(huán)境中。
20.權(quán)利要求19的方法，所述方法還包括將濃度為約100至約10,000活性酶單位/ml的流體給予鼻腔通道或口腔通道的潮濕環(huán)境中。
21.權(quán)利要求1的方法，其中靜脈內(nèi)給予所述治療劑。
22.權(quán)利要求1的方法，其中肌內(nèi)給予所述治療劑。
23.權(quán)利要求1的方法，其中皮下給予所述治療劑。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述治療劑還包含協(xié)同增強所述溶素酶治療效應(yīng)有效量的至少一種增強所述溶素酶殺細菌活性的補充藥物，所述補充藥物選自青霉素、合成青霉素桿菌肽、甲氧西林、頭孢菌素、多粘菌素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢孟多酯鈉、頭孢唑啉、頭孢克肟、頭孢美唑、頭孢尼西(cefonioid)、頭孢哌酮、頭孢雷特、cefotanme、頭孢噻肟、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢泊肟丙酯、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢曲松(cefriaxone)moxalactam、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢菌素C、頭孢菌素C鈉鹽、頭孢噻吩、頭孢噻吩鈉鹽、頭孢匹林、頭孢拉定、cefuroximeaxetil、二水頭孢噻吩、拉氧頭孢、氯碳頭孢(loracarbef)mafate和螯合劑。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體包括蒸餾水、鹽溶液、白蛋白、血清和其任何組合。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體還包含防腐劑。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述防腐劑包括對羥基苯甲酸酯。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體包含一種注射用的等滲溶液，所述等滲溶液包含一種選自以下的化合物氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、磷酸緩沖鹽溶液、明膠、白蛋白、血管收縮劑及組合。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述載體還包含DMSO。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于預(yù)防性治療感染。
31.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于治療性治療感染。
32.權(quán)利要求1的方法，其中還包含至少一種酶，所述至少一種酶不是選自至少一種改組裂解酶、至少一種嵌合裂解酶和至少一種holin裂解酶。
33.一種用于治療細菌感染的組合物，所述組合物包含一種治療劑，所述治療劑包含有效量的至少一種由細菌專性噬菌體感染的所述細菌產(chǎn)生的酶和一種將所述裂解酶胃腸外傳遞至所述感染部位的載體，其中所述至少一種酶選自裂解酶、改組裂解酶、嵌合裂解酶及其組合；和一種用于將所述裂解酶胃腸外傳遞至所述感染部位的載體。
34.權(quán)利要求33的組合物，所述組合物還包含至少一種holin酶。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述至少一種holin酶是一種嵌合酶。
36.權(quán)利要求34的組合物，其中所述至少一種hoiln酶是一種改組酶。
37.權(quán)利要求33的組合物，其中所述至少一種酶用于治療假單胞菌屬。
38.權(quán)利要求33的組合物，其中所述至少一種酶用于治療鏈球菌屬。
39.權(quán)利要求33的組合物，其中所述至少一種酶用于治療葡萄球菌屬。
40.權(quán)利要求33的組合物，其中所述至少一種酶用于治療梭菌屬。
41.權(quán)利要求33的組合物，其中所述組合物還包含將所述組合物的pH維持在約4.0-約9.0的范圍內(nèi)的緩沖劑。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述緩沖劑將所述組合物的pH維持在約5.5-約7.5的范圍內(nèi)。
43.權(quán)利要求41的組合物，其中所述緩沖劑包含一種還原劑。
44.權(quán)利要求43的組合物，所述還原劑是二硫蘇糖醇。
45.權(quán)利要求41的組合物，其中所述緩沖劑包含一種金屬螯合劑。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述金屬螯合劑是乙二胺四乙酸二鈉鹽。
47.權(quán)利要求41的組合物，其中所述緩沖劑是一種檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖劑。
48.權(quán)利要求33的組合物，所述組合物還包含一種作為防腐劑的殺細菌劑或細菌抑制劑。
49.權(quán)利要求33的組合物，其中將所述至少一種酶凍干。
50.權(quán)利要求33的組合物，所述組合物還包括用于鼻腔或口腔通道的潮濕環(huán)境中的濃度為約100至約500,000活性酶單位/ml的流體。
51.權(quán)利要求50的組合物，所述組合物還包括用于鼻腔或口腔通道的潮濕環(huán)境中的濃度為約1000至約100,000活性酶單位/ml的流體。
52.權(quán)利要求33的組合物，其中靜脈內(nèi)給予所述治療劑。
53.權(quán)利要求33的組合物，其中肌內(nèi)給予所述治療劑。
54.權(quán)利要求34的方法，其中皮下給予所述治療劑。
55.權(quán)利要求33的組合物，其中所述治療劑還包含協(xié)同增強所述溶素酶治療效應(yīng)有效量的至少一種增強所述酶殺細菌活性的補充藥物，所述補充藥物選自青霉素、合成青霉素桿菌肽、甲氧西林、頭孢菌素、多粘菌素、頭孢克洛、頭孢羥氨芐、頭孢孟多酯鈉、頭孢唑啉、頭孢克肟、頭孢美唑、頭孢尼西、頭孢哌酮、頭孢雷特、cefotanme、頭孢噻肟、頭孢替坦、頭孢西丁、頭孢泊肟丙酯、頭孢他啶、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢曲松moxalactam、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢菌素C、頭孢菌素C鈉鹽、頭孢噻吩、頭孢噻吩鈉鹽、頭孢匹林、頭孢拉定、cefuroximeaxetil、二水頭孢噻吩、拉氧頭孢、氯碳頭孢mafate和螯合劑。
56.權(quán)利要求33的組合物，其中所述載體包括蒸餾水、鹽溶液、白蛋白、血清和其任何組合。
57.權(quán)利要求33的組合物，其中所述載體還包含防腐劑。
58.權(quán)利要求57的組合物，其中所述防腐劑包括對羥基苯甲酸酯。
59.權(quán)利要求33的組合物，其中所述載體包含一種注射用的等滲溶液，所述等滲溶液包含一種選自以下的化合物氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、磷酸緩沖鹽溶液、明膠、白蛋白、血管收縮劑及組合。
60.權(quán)利要求33的組合物，其中所述載體還包含DMSO。
61.權(quán)利要求33的方法，其中所述治療劑用于治療性治療感染。
62.權(quán)利要求33的方法，其中所述治療劑用于預(yù)防性治療感染。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于通過胃腸外導(dǎo)入治療劑治療細菌感染的方法和組合物，所述治療劑包含有效量的至少一種由感染細菌專性噬菌體的所述細菌產(chǎn)生的裂解酶，其中所述裂解酶選自裂解酶和經(jīng)修飾的裂解酶，例如改組裂解酶、嵌合裂解酶及其組合，其中所述裂解酶在用于將所述裂解酶傳遞到患者體內(nèi)的適宜載體中。所述治療劑還可以包括一種holin酶，所述holin酶可以是一種改組holin酶或嵌合holin酶。所述注射可以肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)進行。
文檔編號A61K47/20GK1418108SQ01806307
公開日2003年5月14日 申請日期2001年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月14日
發(fā)明者V·菲舍蒂, L·羅米斯 申請人:新眼界診斷公司