專利名稱：修飾的安卡拉牛痘病毒(mva)的變株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾的安卡拉(Ankara)牛痘病毒(MVA)的新的毒株。該毒株對于大多數(shù)哺乳動物特別是人有著強減毒毒性，雖然如此，但它生長在能有效產(chǎn)生治療性物質(zhì)例如疫苗的傳代細(xì)胞系的細(xì)胞中。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這種修飾的MVA株的方法。MVA可以作為載體系統(tǒng)，或者以作為輔助劑或者作為免疫系統(tǒng)的非特異性成分的調(diào)節(jié)劑的活性或滅活形式用于例如腸胃外的免疫接種。
背景技術(shù)：
生物體總是不斷地受到一些感染性物質(zhì)如細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲的侵襲。免疫系統(tǒng)通過破壞和消除這些感染物質(zhì)和它們所產(chǎn)生的毒性分子而防止生物體受到由這些物質(zhì)引起的經(jīng)常性感染。免疫系統(tǒng)可分為特異性和非特異性部分，但這兩部分是緊密地交叉關(guān)聯(lián)的。非特異性免疫應(yīng)答能夠立即防御各種各樣的外來物質(zhì)和感染性試劑。相反，特異性免疫應(yīng)答是當(dāng)生物體第一時間受到一種物質(zhì)的攻擊時，在某一滯后期之后產(chǎn)生。但是，特異性免疫應(yīng)答是高效的。特異性免疫應(yīng)答的作用是保護(hù)一種從特異性感染恢復(fù)的肌體，使其能抵抗這種特異性感染，但是對其它傳染性疾病仍然易受感染。一般情況下，受相同或者非常相似感染物質(zhì)的第二次感染會引起輕得多的癥狀或者根本沒有癥狀。該免疫性持續(xù)時間長，在一些情況下甚至是終生的。這種免疫記憶被用于接種疫苗，這時生物體受到無毒或滅活形式的感染試劑的攻擊而誘發(fā)特異性免疫。有時將輔助劑摻入疫苗中以增強特異性免疫應(yīng)答。
對于傳染性疾病和免疫性的認(rèn)識大多來自對天花的研究。這種疾病是由天花病毒引起的，天花病毒是正痘病毒屬中的一員。近兩個世紀(jì)以前，開始用牛痘進(jìn)行免疫性接種，產(chǎn)生抗天花免疫。用牛痘病毒進(jìn)行隨后的免疫接種。二十世紀(jì)五十年代早期，很多工業(yè)化國家通過利用牛痘病毒疫苗的接種消除了地方性天花。然而，用這種牛痘病毒接種疫苗有時會導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如接種后腦炎、擴散化牛痘或者接觸性感染。
Anton Mayr開發(fā)出一種不表現(xiàn)出這些并發(fā)癥的新的疫苗。這種痘病疫苗由修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)組成并且用于腸胃外接種抵抗天花，大約150 000例接種沒有引起與該接種相關(guān)的任何并發(fā)癥。即使具有免疫缺陷的兒童也沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用。MVA是通過在雞胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中誘變和篩選源安卡拉牛痘病毒傳代575代之后獲得的。生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)特性反映出該MVA是安全的。MVA具有低的分子量，基因組中有6處缺失，并且對于哺乳動物細(xì)胞是高度減毒的，即其合成DNA和蛋白質(zhì)，但是基本上不產(chǎn)生病毒顆粒。Anton Mayr開發(fā)的修飾的安卡拉牛痘病毒保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收集中心(the European Collection of Cell Cultures(ECACC))Salisbury，UK，保藏號是No.V 94012707。
抗天花疫苗接種是非常成功的。在1979年，世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization)宣告天花被根除。因此，對兒童中止了大量接種疫苗，而只有一些國家的實驗室工作人員和軍隊成員接受該接種。
根除天花的同時，去除了人的痘病感染的主要致因。但是，一些非人痘病病毒減小了宿主特異性，即它們不只是在它們典型的宿主中引起感染(例如對于母牛牛痘感染)，而且還引起其它動物感染(例如鼠和貓)。人也可以受到這種途經(jīng)的感染。因為部分人口不再有抗天花的免疫能力，動物物種的正痘感染對于他們是危險的。馴養(yǎng)動物是感染人的主要來源。因此，對馴養(yǎng)動物接種抵抗正痘病毒的疫苗越來越重要。另外，MVA作為基因治療的載體是有意義的，即將核酸序列轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中在那里表達(dá)。
對于MVA的對數(shù)復(fù)制，需要原代和次生雞胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。從孵化10-12天的雞蛋獲得該細(xì)胞。由于使雞蛋發(fā)生生物變異性，因此從該細(xì)胞培養(yǎng)體系獲得的細(xì)胞在細(xì)胞水平上也是變異的。另外，在雞胚胎“成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物”中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)其它細(xì)胞類型例如上皮細(xì)胞。這種細(xì)胞變異也導(dǎo)致雞胚胎成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒的變異。因此難以將細(xì)胞培養(yǎng)體系標(biāo)準(zhǔn)化并且使之有效，以保證不斷產(chǎn)生高質(zhì)量MVA。此外，孵化的雞蛋中已經(jīng)存在的微生物或病毒對細(xì)胞培養(yǎng)體系的污染不能完全排除。當(dāng)MVA在病毒污染的細(xì)胞中生長時，MVA可能會與污染的病毒重組。因此可以產(chǎn)生具有新的和不可預(yù)計特征的MVA。對于在懸浮培養(yǎng)物中大規(guī)模產(chǎn)生病毒，原代或次生雞胚胎成纖維細(xì)胞也不是最合適的。另外，超梯度離心對MVA的純化和濃縮會是有益的。然而，當(dāng)原代或次生雞胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)MVA時，這樣的純化是困難的。最后，越來越多的患者產(chǎn)生了抗雞蛋的白蛋白的變應(yīng)性。雖然該培養(yǎng)法的體外條件大大降低了變應(yīng)原的潛在性，但是不能完全排除變應(yīng)性反應(yīng)的危險。
總之，一方面，MVA只能有效地生長在原代或次生雞胚胎成纖維細(xì)胞中，但是產(chǎn)生很多缺點；另一方面，其作為疫苗的大規(guī)模接種已證明了MVA對人的拯救性應(yīng)用。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生MVA同型病毒顆粒的條件。另外，所述條件將使得MVA容易大規(guī)模地生產(chǎn)。
發(fā)明的詳細(xì)描述為了實現(xiàn)上述目的和其它目的，本發(fā)明提供適合在傳代細(xì)胞系細(xì)胞中生長的MVA毒株，所述細(xì)胞系對產(chǎn)生治療性物質(zhì)是有效的。
本發(fā)明第一次使有效且大規(guī)模生產(chǎn)MVA成為可能。由于傳代細(xì)胞系的細(xì)胞是同種的并且它們的特征是穩(wěn)定的，因此從這些細(xì)胞系收獲的MVA也是同種的，具有高度可預(yù)測特征。此外，可以控制微生物遭污染的危險并且能夠排除在雞胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)MVA時發(fā)現(xiàn)的雞蛋蛋白質(zhì)對MVA制備的污染?？煞奖愕靥幚碛谰帽Ａ舻募?xì)胞系，因此非常適合工業(yè)化應(yīng)用。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，MVA適合在哺乳動物細(xì)胞系的細(xì)胞中生長，這為疫苗的生產(chǎn)提供可能條件。出人意料地發(fā)現(xiàn)適應(yīng)于哺乳動物細(xì)胞系例如非洲綠猴腎細(xì)胞系的MVA對人以及對各種各樣的其它哺乳動物仍然具有減毒毒性。因此，MVA是高度減毒的，即合成DNA和蛋白質(zhì)時實際上沒有產(chǎn)生病毒顆粒，結(jié)果實際上排除了產(chǎn)生疾病的能力。因此，根據(jù)本發(fā)明的MVA也非常適合作為人用和各種各樣的哺乳動物用的疫苗。因此，MVA在獸醫(yī)領(lǐng)域特別適用。
此外，本發(fā)明提供了獲得MVA株的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，用野生型MVA感染適合產(chǎn)生治療物質(zhì)的細(xì)胞系的細(xì)胞。優(yōu)選的是，對于這種感染使用的是高度的多重感染(MOI)，即對于一個細(xì)胞使用多種病毒。然后，收獲病毒并且用新制備的病毒感染相同細(xì)胞系的新細(xì)胞。重復(fù)所述過程(連續(xù)傳代)直到MVA適應(yīng)所述細(xì)胞系。當(dāng)感染后72小時達(dá)到適應(yīng)時，病毒效價與輸入的病毒效價相比，提高至少1-至9-倍，優(yōu)選10-至99-倍，更優(yōu)選100-至106-倍，最優(yōu)選高于107-至1010-倍。這種適應(yīng)是在有限次數(shù)的傳代之后達(dá)到的。
″適應(yīng)生長″是指與最初用來感染細(xì)胞的病毒的量(輸入)相比，提高了由感染產(chǎn)生的病毒的量(輸出)。在這種情況下，輸出/輸入之比大于1。
在ECACC，Salisbury，UK保藏的保藏號是99101431和/或臨時登記號01021411的MVA的″衍生物″是指這樣的一種MVA，其適合以基本上和該保藏菌株的生長速度相同的速度在非洲綠猴腎細(xì)胞中生長，但是與保藏的菌株相比其基因組中至少有一處差別。
術(shù)語″免疫系統(tǒng)″主要描述在防御生物體抵抗外來物質(zhì)和微生物中所涉及的一種復(fù)合體。它分為含幾種細(xì)胞類型(例如淋巴細(xì)胞和從白細(xì)胞衍生的其它細(xì)胞)的細(xì)胞部分，和含肽和蛋白質(zhì)(例如抗體、補體因子、和細(xì)胞因子)的體液部分。
術(shù)語″免疫應(yīng)答″是指當(dāng)外來物質(zhì)或微生物進(jìn)入生物體時免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。一般情況下，免疫應(yīng)答分為特異性和非特異性反應(yīng)，而這兩部分緊密地交叉關(guān)聯(lián)。非特異性免疫應(yīng)答被認(rèn)為是抵抗各種各樣外來物質(zhì)和感染物質(zhì)的即時防御。特異性免疫應(yīng)答是表征生物體抵抗外來物質(zhì)的一種高效防御機制，其在滯后期之后產(chǎn)生抵抗所述外來物質(zhì)并且對于所述物質(zhì)是高度特異性的。特異性免疫應(yīng)答對于保護(hù)從特異性感染恢復(fù)的個體在將來抵抗這種特異性感染的現(xiàn)象中起著決定作用。
″免疫系統(tǒng)的激活劑″是指能激發(fā)或者增強免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。
″免疫系統(tǒng)的抑制劑″是指能夠降低或抑制免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。
″免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定劑″是指能夠保持免疫應(yīng)答為恒定水平的任何物質(zhì)。
本發(fā)明人提供了兩種優(yōu)選的MVA株，它們是適應(yīng)于稱為Vero細(xì)胞系(ATCC No.CCL-81)的非洲綠猴細(xì)胞系。在非洲綠猴腎細(xì)胞中傳代100-代的MVA-株稱為″Vero-MVA″，其保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收集中心(the EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC))，Salisbury，UK，保藏號是No.99101431。在非洲綠猴腎細(xì)胞中傳代200-代后的MVA-株稱為″Vero-MVA-200″，保藏在ECACC，臨時登記號是01021411。
通過在合適的條件下培養(yǎng)核準(zhǔn)的細(xì)胞系的細(xì)胞，用MVA感染細(xì)胞并且收獲由所述細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒，進(jìn)一步擴增如上所述獲得的MVA。因此該MVA能夠被大規(guī)模有效并且容易地擴增。出人意料的是，本發(fā)明的MVA在除Vero細(xì)胞之外的細(xì)胞例如人細(xì)胞系包括HL，HEP-2或HeLA中沒有表現(xiàn)出高的毒性。
在本發(fā)明另一個實施方案中，MVA包含至少一種異源核酸序列，即自然狀態(tài)下在MVA基因組(重組MVA)中沒有發(fā)現(xiàn)的核酸序列。優(yōu)選的是，該異源核酸序列是一種基因，更優(yōu)選是一種編碼免疫蛋白質(zhì)的基因，并且最優(yōu)選是一種編碼能抵抗瘧疾、狂犬病和/或肝炎的免疫蛋白質(zhì)的基因。所述異源核酸序列的表達(dá)，優(yōu)選的是在牛痘病毒啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下進(jìn)行，更優(yōu)選處于MVA-自身啟動子的調(diào)控下進(jìn)行。在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案中，在MVA基因組天然存在的缺失位點處插入該異源核酸的所述序列(PCT/EP96/02926中公開)。
利用重組MVA將核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞中，所述核酸序列對于靶細(xì)胞是同源的或異源的。將異源核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞中可以用來產(chǎn)生由體外所述核酸序列編碼的異源核酸、肽和/或多肽和/或蛋白質(zhì)。該方法包括用重組MVA感染宿主細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感染的宿主細(xì)胞，并且任選地分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的肽和/或蛋白質(zhì)。
此外，同源或異源序列的導(dǎo)入可應(yīng)用于體外、優(yōu)選體內(nèi)的基因治療。對于體外和離體各自基因治療來說，從要治療的個體分離細(xì)胞，用重組MVA轉(zhuǎn)化并且再次導(dǎo)入取出這些細(xì)胞的個體中。對于體內(nèi)基因治療，直接對活動物體包括人體施用重組MVA。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，所述重組MVA表達(dá)抗原或者抗原表位。最優(yōu)選的是，所述載體表達(dá)了Plasmodium falciparum、分枝桿菌(Mycobacteria)、皰疹病毒(Herpes virus)、流感病毒(Influenza virus)、肝炎病毒、或人免疫缺陷病毒的抗原決定簇。
因為本發(fā)明的MVA出人意料地仍然是高度減毒的，所以MVA對于廣大的哺乳動物包括人的免疫是理想的。因此，本發(fā)明還提供一種含MVA的疫苗，用于活動物體包括人的免疫以抵抗痘感染，優(yōu)選抵抗正痘感染。除了MVA之外，所述疫苗可以含有一種或多種添加劑例如抗生素、防腐劑、或者穩(wěn)定劑。該疫苗特別適用于獸醫(yī)領(lǐng)域，例如用于對動物免疫接種以抵抗正痘感染，例如使貓免疫抵抗貓痘，使小鼠免疫抵抗先天性缺肢畸形，或者使駱駝免疫抵抗駱駝痘。該免疫接種優(yōu)選在腸胃外進(jìn)行。
加入上述的輔助劑通常能增強疫苗中抗原決定簇的免疫作用。輔助劑以非特異方式共同刺激免疫系統(tǒng)，引起抗疫苗抗原決定簇的更強的特異性免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，MVA被用作輔助劑，來輔助刺激抵抗疫苗的抗原決定簇的免疫應(yīng)答。在這種情況下，優(yōu)選的是MVA是滅活的。例如通過加熱或者用化學(xué)品可以對MVA進(jìn)行滅活。優(yōu)選地，通過β-丙醇酸內(nèi)酯對MVA滅活。根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，可以將滅活MVA加到抵抗各種傳染病的疫苗中來提高抵抗這種疾病的免疫性。
在感染情況下，肌體的免疫、神經(jīng)、激素和血管系統(tǒng)一起密切地起作用。這些相互作用能通過非特異性免疫系統(tǒng)的元件例如細(xì)胞因子如干擾素和白細(xì)胞介素進(jìn)行調(diào)節(jié)。痘病毒能夠影響免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)(Swiss Vet 11/99，13-17)。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，對哺乳動物(包括人)使用MVA、優(yōu)選被滅活的MVA來調(diào)節(jié)非特異性(先天的)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和體液。優(yōu)選的是，MVA被用作生物調(diào)節(jié)劑，其中免疫系統(tǒng)的功能障礙被消除并且身體本身的防御機理被激活、穩(wěn)定和/或抑制。最優(yōu)選的是，在病毒感染，例如皰疹、乙肝或丙肝感染的情況下，在慢性炎癥疾病和/或支持性腫瘤治療的情況下，MVA被用作生物調(diào)節(jié)劑。MVA也可以在提高抗感染敏感性的情況下例如應(yīng)激反應(yīng)和新生兒情況下被用來穩(wěn)定免疫系統(tǒng)?；钚缘暮?或優(yōu)選被滅活的MVA可以全身施用，例如肌內(nèi)和/或局部如通過粘膜和/或皮膚施用。
總之，本發(fā)明提供了MVA株，其一般是用于與野生型MVA相同的用途，但它消除了由野生型MVA在雞胚胎成纖維細(xì)胞中擴增而引起的若干問題。
發(fā)明概述本發(fā)明具體包括下面單一的或組合的特征一種修飾的安卡拉(Ankara)牛痘病毒(MVA)，適應(yīng)在傳代細(xì)胞系的細(xì)胞中生長，所述細(xì)胞系被核準(zhǔn)為產(chǎn)生治療性物質(zhì)的細(xì)胞系。
如上所述的MVA，適應(yīng)在哺乳動物細(xì)胞系的細(xì)胞中生長。
如上所述的MVA，其中所述細(xì)胞系被核準(zhǔn)為產(chǎn)生疫苗的細(xì)胞系。
如上所述的MVA，其中所述被核準(zhǔn)的細(xì)胞系是非洲綠猴腎細(xì)胞系。
如上所述的MVA，其中所述被核準(zhǔn)的細(xì)胞系是非洲綠猴腎細(xì)胞系A(chǔ)TCCNo.CCL-81。
如上所述的MVA，保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收集中心(the EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC))，Salisbury，UK，保藏號是No.99101431和/或其衍生物。
如上所述的MVA，保藏在ECACC，Salisbury，UK，臨時登記號是01021411和/或其衍生物。
如上所述的MVA，含有至少一種異源核酸序列。
如上所述的MVA，含有一種異源核酸序列，其編碼治療性蛋白質(zhì)和/或抗原決定簇例如免疫抵抗瘧疾、肝炎和/或狂犬病感染的肽。
由上述MVA感染的宿主細(xì)胞。
一種組合物，優(yōu)選藥物組合物，含有上述MVA和/或MVA的DNA。
如上所述的藥物組合物，其中該藥物組合物是疫苗。
對活動物體包括人進(jìn)行免疫接種的上述疫苗。
為抵抗正痘感染而進(jìn)行免疫接種的上述疫苗。
為使貓能抵抗貓痘，使小鼠能抵抗先天性缺肢畸形，和/或使駱駝能抵抗駱駝痘而進(jìn)行免疫接種的上述疫苗。
上述藥物組合物，其中MVA是非特異性免疫系統(tǒng)的激活劑、抑制劑和/或穩(wěn)定劑。
含有上述MVA和/或MVA的DNA作為輔助劑的藥物組合物。
含有上述重組MVA和/或重組MVA的DNA的藥物組合物。
在基因治療中使用的上述藥物組合物。
將同源和/或異源核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法，包括用上述MVA感染靶細(xì)胞。
獲得如上所述MVA株的方法，包括a)用野生型MVA，優(yōu)選保藏在ECACC，保藏號是No.V 94012707的MVA感染核準(zhǔn)的細(xì)胞系的細(xì)胞，b)收集病毒，c)用新產(chǎn)生的病毒感染相同細(xì)胞系的新細(xì)胞，和任選包括，d)重復(fù)b)和c)直到病毒適應(yīng)在所述細(xì)胞系的細(xì)胞中生長。
制備上述MVA的病毒顆粒的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)核準(zhǔn)的細(xì)胞系的細(xì)胞，用所述MVA感染所述細(xì)胞系，并且收集由所述細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒。
如上所述的方法，其中用在ECACC保藏的保藏號是No.99101431的和/或在ECACC保藏的臨時登記號是01021411的MVA或者這些毒株之一的衍生物感染所述細(xì)胞系。
制備核酸序列、肽、多肽和/或蛋白質(zhì)的方法，包括用上述重組MVA感染宿主細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感染的宿主細(xì)胞，以及，任選包括分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的核酸序列、肽和/或蛋白質(zhì)。
上述MVA在制備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用于治療或預(yù)防由所述MVA引起的疾病或障礙。
上述MVA在制備用于使活動物體包括人免疫的疫苗中的用途。
上述MVA在制備非特異性免疫系統(tǒng)的激活劑、抑制劑和/或穩(wěn)定劑中的用途。
如上所述的用途，用于制備輔助劑。
上述MVA作為疫苗的用途。
上述MVA作為輔助劑的用途。
上述MVA作為非特異性免疫系統(tǒng)的激活劑、抑制劑和/或穩(wěn)定劑的用途。
使活動物體包括人免疫的方法，所述方法包括對需要免疫的人施用治療有效量的上述藥物組合物。
將同源和/或異源核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法，包括用上述MVA和/或MVA的DNA感染靶細(xì)胞。
激活、抑制和/或穩(wěn)定活動物體包括人的免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括對活動物體包括人施用上述藥物組合物。
增強抗疫苗中抗原決定簇的特異性免疫應(yīng)答的方法，包括對活動物體包括人施用作為輔助劑的上述MVA。
適應(yīng)在傳代細(xì)胞系的細(xì)胞中生長的修飾的安卡拉牛痘病毒可通過包括下面步驟的方法獲得感染被核準(zhǔn)為產(chǎn)生治療性物質(zhì)的細(xì)胞系的細(xì)胞，收集由所述細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒顆粒，并且任選地包括重復(fù)進(jìn)行上述步驟，直到在所述細(xì)胞中獲得該MVA所需的生長特征。
實施例下面的實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很理解，提供的實施例不在任何方面解釋為將本發(fā)明技術(shù)的應(yīng)用限制于這些實施例。
實施例1MVA對Vero細(xì)胞的適應(yīng)和所述MVA株的表征1.MVA對非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)的適應(yīng)
Anton Mayr開發(fā)的修飾的安卡拉牛痘病毒野生型MVA保藏在ECACC，保藏號是No.V 94012707。該野生型MVA通過該病毒在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代而適應(yīng)在Vero細(xì)胞中生長(表1)。在第148至165代中使用靜態(tài)Vero細(xì)胞系(WHO原種ECACC No.88020401)的細(xì)胞克隆ATCC-No.CCL-81(WHO批量菌種，Master and Working Bank)。該細(xì)胞在由Earle′sMEM(ICN)，pH7，4-7，6，和5％的血清替代品BMS(Biochrom)組成的培養(yǎng)基中繁殖。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，通常是以1∶2至1∶4分裂細(xì)胞接種相同的工作庫的細(xì)胞。培養(yǎng)基每毫升含有大約250 000個細(xì)胞。細(xì)胞分別在試管(2ml)，Roux皿(100mi)，和塑料皿(分別是6和40毫升)中繁殖。一般情況下，16-24小時之后，細(xì)胞匯合形成單層。然后，用沒有任何添加劑的普通Earle′s MEM置換培養(yǎng)基。
對于野生型MVA的適應(yīng)作用使用試管培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行試驗。表1和2總結(jié)了傳代的結(jié)果。用10MOI(感染的多重性)野生型MVA感染非洲綠猴腎細(xì)胞，即平均來說，每個非洲綠猴腎細(xì)胞有10個病毒顆粒。開始使用的野生型MVA是遺傳學(xué)上同源的，并在雞胚胎成纖維細(xì)胞中傳代575代之后的噬斑純化的MVA(效價107.75KID50/ml)。24小時之后，匯合單層非洲綠猴腎細(xì)胞的90％被中毒方法破壞(50％被毒性破壞，40％被溶胞破壞)。收集細(xì)胞冷凍和解凍之后的培養(yǎng)基加細(xì)胞碎屑，含有產(chǎn)生的病毒，并且在培養(yǎng)試管中的單層非洲綠猴腎細(xì)胞(第2代)上接種0.2毫升的該混合物。將該過程重復(fù)200次。第3代之后，不再發(fā)現(xiàn)毒性作用，而觀察到4-6天后轉(zhuǎn)染(p.inf.)期間細(xì)胞變圓和溶胞為特征的輕微細(xì)胞病變作用(CPE)。病毒效價是101.0KID50/ml。總之，MVA在非洲綠猴腎細(xì)胞中的增殖雖然開始了但是非常無效力。第5代之后，發(fā)現(xiàn)典型的CPE在4-5天感染之后完成。病毒效價從第3代之后的101.0KID50/ml提高到第5代之后的104.0KID50/ml。因此，擴增的病毒在非洲綠猴腎細(xì)胞中更有效。在第5至11代，觀察到越來越早地完成CPE，并且每一代病毒效價都提高。在No.11代，在107.5KID50/ml達(dá)到平穩(wěn)期。因此，11代之后實現(xiàn)MVA對非洲綠猴腎細(xì)胞的適應(yīng)。在接下來的又30代中，對所有傳代的結(jié)果是相同的并且是能高度復(fù)制的CPE已經(jīng)開始24小時p.inf.并且在p.inf.三天之后影響所有的細(xì)胞。那時，20％的非洲綠猴腎細(xì)胞是完整的而80％溶胞。p.inf.三天之后，病毒效價總是大約107.75KID50/ml。15代之后，總是在p.inf.2-3天之后收集病毒，并且只用1MOI代替10MOI感染細(xì)胞(表2)。在接下來的其它幾代中，MVA的生長特征只是稍微改變。顯然，最佳病毒效價進(jìn)一步提高并且在200代達(dá)到1010KID50/ml。
總之，病毒在非洲綠猴腎細(xì)胞中以指數(shù)方式可重復(fù)生長。所述生長特征出人意料地不同于野生型MVA地特征。因此，通過連續(xù)傳代獲得新MVA株。所述新株稱為″Vero MVA″，在非洲綠猴腎細(xì)胞中傳代200代之后稱為″Vero-MVA-200″。
大量培養(yǎng)Vero-MVA和Vero-MVA-200。對于貯存，離心濃縮Vero-MVA，重新懸浮于2.5％的血漿代用品(polygeline)并且在2毫升的小瓶中凍干。凍干之后的效價仍然至少是108.5KID50/ml。對凍干的Vero-MVA和Vero-MVA-200檢測污染和毒性并且在+4℃下貯存。
2.Vero-MVA生物性能的表征將Vero-MVA(傳代100代)和VeroMVA-200(傳代200代)的生物特性與野生型MVA的特性相比較(表3和表5)。因而使用的是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。本發(fā)明人證明，除了非洲綠猴腎細(xì)胞之外，病毒的宿主范圍沒有改變，而且對于人或動物的毒性也沒有增加。Vero-MVA仍然被鑒定出在非容許的宿主細(xì)胞中繁殖失敗。
與牛痘病毒的Elstree株病毒顆粒相比較，Vero-MVA病毒顆粒的主要特性是通過抵抗Elstree株產(chǎn)生的抗體的交叉反應(yīng)來證明的。Elstree株是WHO推薦用于天花接種疫苗的牛痘株。將抵抗Elstree株產(chǎn)生的兔多克隆超免疫血清加到Vero-MVA中。100KID50/ml的Vero MVA被完全中和，血清稀釋度是1∶512。需要血清的2倍稀釋度來中和相同量的牛痘Elstree株(1∶256)。因此，牛痘免疫血清仍能夠有效中和Vero-MVA。
如表3，4和5所示，通過幾種附加試驗比較了Vero-MVA、Vero-MVA-200和野生型MVA。本發(fā)明人證明Vero-MVA和Vero-MVA-200對于哺乳動物包括人的毒性與野生型MVA相比沒有提高。還證明了Vero-MVA和Vero-MVA-200對于哺乳動物包括人沒有觸染性和毒性。出人意料的是，除了對非洲綠猴腎細(xì)胞之外，Vero-MVA的細(xì)胞特異性與野生型MVA的特異性或多或少是相同的Vero-MVA擴增和野生型MVA一樣，在人細(xì)胞系細(xì)胞(參見表4HL-，HEP-2-，和HeLa-細(xì)胞)中幾乎是無效的。因此，盡管人細(xì)胞和非洲綠猴腎細(xì)胞在種系發(fā)生學(xué)上密切相關(guān)，但是Vero-MVA沒有獲得在人細(xì)胞中擴增的能力。在其它試驗中，沒有觀察到顯著差別。
此外，還比較了野生型MVA和Vero-MVA-200的物理、化學(xué)、和生物學(xué)特征(表5)。與最初在安卡拉分離的痘病毒的基因組相比，在雞胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中生長的野生型MVA在左側(cè)反轉(zhuǎn)末端區(qū)中有三處缺失，而Vero-MVA-200在左側(cè)末端區(qū)中有四處缺失。因此，野生型MVA在非洲綠猴腎細(xì)胞中傳代導(dǎo)致附加的缺失。
使用Vero-MVA使馴養(yǎng)動物免疫抵抗正痘感染。收集動物的血清并且進(jìn)行中和試驗。本發(fā)明人證明動物產(chǎn)生高效價抗體。該抗體效價至少在1 11天時間內(nèi)是穩(wěn)定的。還證明在噬斑減少試驗中所述抗體能夠體外中和MVA病毒顆粒?？傊?，Vero-MVA可以被用作馴養(yǎng)動物和人抗正痘感染的疫苗。
表1MVA對Vero細(xì)胞的適應(yīng)
*傳代11代之后只用1MOI代替10MOI接種表2MVA適應(yīng)Vero細(xì)胞期間病毒效價的變化傳代序號[p.inf.天數(shù)]之后收集每毫升效價[log10/ml]11 ＜2.023 2.035 1.055 4.084 6.511 3 7.518 2 8.019 2 7.7520 3 8.025 2 7.7529 2 7.7530 3 7.7531 3 8.045 2 7.7551 3 7.7560 2 8.066 2 7.7568 2 8.075 3 8.0100 2 8.0200 2 10.0
表3野生型MVA和Vero-MVA的生物學(xué)特征之比較
表4不同細(xì)胞培養(yǎng)體系中KID50/ml的Vero-MVA和野生型MVA的繁殖速度[log10/ml]
1)括號中標(biāo)明從組織和物種衍生的傳代細(xì)胞系。
2)從德國慕尼黑醫(yī)學(xué)微生物研究中心(collection of the institute ofmedical microbiology in Munich，Germany)獲得的細(xì)胞系。
表5野生型MVA(雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)572傳代)與Vero-MVA-200(非洲綠猴腎細(xì)胞中200傳代)之比較
134表
權(quán)利要求
1.一種修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)，適應(yīng)在傳代細(xì)胞系的細(xì)胞中生長，所述細(xì)胞系是被核準(zhǔn)為產(chǎn)生治療性物質(zhì)的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的MVA，適應(yīng)在哺乳動物細(xì)胞系的細(xì)胞中生長。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的MVA，其中所述細(xì)胞系是被核準(zhǔn)為產(chǎn)生疫苗的細(xì)胞系。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求1-3任一項的MVA，其中所述的被核準(zhǔn)的細(xì)胞系是Vero細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的MVA，其中所述的被核準(zhǔn)的細(xì)胞系是Vero細(xì)胞系A(chǔ)TCC No.CCL-81。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的MVA，保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收集中心(ECACC)，Salisbury，UK，保藏號是No.99101431和/或其衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的MVA，保藏在歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收集中心(ECACC)，Salisbury，UK，臨時登記號是01021411和/或其衍生物。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求1-7任一項的MVA，含有至少一種異源核酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要8的MVA，含有一種異源核酸序列，是一種編碼治療性蛋白質(zhì)和/或抗原決定簇的基因。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求1-9任一項的MVA病毒感染的一種宿主細(xì)胞。
11.一種藥物組合物，含有根據(jù)前面權(quán)利要求1-9任一項的MVA和/或MVA的DNA。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所述藥物組合物是疫苗。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，用于對包括人的活動物體的免疫接種。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的組合物，用于免疫抵抗正痘感染。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14的組合物，用于使貓免疫抵抗貓痘感染，使小鼠免疫抵抗先天性缺肢畸形感染和/或使駱駝免疫抵抗駱駝痘感染。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中MVA是非特異性免疫系統(tǒng)的激活劑、抑制劑和/或穩(wěn)定劑。
17.一種組合物，優(yōu)選藥物組合物，含有根據(jù)前面權(quán)利要求1-9任一項的MVA和/或MVA的DNA作為輔助劑。
18.一種藥物組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求8或9的重組MVA和/或重組MVA的DNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的組合物，用于基因治療。
20.一種將同源和/或異源核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求8或9的MVA感染靶細(xì)胞。
21.獲得根據(jù)前面權(quán)利要求1-7任一項的MVA株的方法，包括a)用野生型MVA，優(yōu)選保藏在ECACC，保藏號是No.V 94012707的MVA感染核準(zhǔn)的細(xì)胞系的細(xì)胞，b)收集病毒，c)用新產(chǎn)生的病毒感染相同細(xì)胞系的新細(xì)胞，和任選包括d)重復(fù)b)和c)，直到病毒適應(yīng)在所述細(xì)胞系的細(xì)胞中生長。
22.產(chǎn)生根據(jù)前面權(quán)利要求1-9任一項的MVA的病毒顆粒的方法，包括a)在合適的條件下培養(yǎng)核準(zhǔn)的細(xì)胞系的細(xì)胞，b)用所述MVA感染所述細(xì)胞系，以及c)收集由所述細(xì)胞產(chǎn)生的病毒顆粒。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞系是用根據(jù)權(quán)利要求6或7的MVA感染的。
24.一種制備核酸序列、肽和/或多肽的方法，包括a)用根據(jù)權(quán)利要求8或9的重組MVA感染宿主細(xì)胞，b)在合適的條件下培養(yǎng)感染的宿主細(xì)胞，以及任選包括c)分離和/或富集由所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的核酸序列、肽和/或蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)前面權(quán)利要求1-9任一項的MVA的用途，用于制備一種治療或預(yù)防由所述MVA引起的疾病或障礙的藥物組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，用于制備一種使包括人的活動物體免疫的疫苗。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，用于制備非特異性免疫系統(tǒng)的激活劑、抑制劑和/或穩(wěn)定劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，用于制備輔助劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-9的MVA作為疫苗的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-9的MVA作為輔助劑的用途。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-9的MVA作為免疫系統(tǒng)的激活劑、抑制劑和/或穩(wěn)定劑的用途。
32.使包括人的活動物體免疫的方法，所述方法包括對需要免疫的個體施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求11-15的組合物。
33.將同源和/或異源核酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求8或9的MVA和/或MVA的DNA感染靶細(xì)胞。
34.一種激活、抑制和/或穩(wěn)定包括人的活動物體的非特異性免疫系統(tǒng)的方法，所述方法包括施用根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物。
35.一種增強抗疫苗中抗原決定簇的特異性免疫應(yīng)答的方法，包括對包括人的活動物體施用根據(jù)前面權(quán)利要求1-9任一項的MVA作為輔助劑。
36.適應(yīng)在傳代細(xì)胞系的細(xì)胞中生長的修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)，可由包括下面步驟的方法獲得a)感染被核準(zhǔn)為產(chǎn)生治療性物質(zhì)的細(xì)胞系的細(xì)胞，b)收集由所述細(xì)胞系產(chǎn)生的病毒顆粒，以及任選地包括c)重復(fù)上述步驟，直到在所述細(xì)胞中獲得所述MVA所需的生長特征。
全文摘要
本發(fā)明提供修飾的安卡拉牛痘病毒(MVA)的新毒株，其對于大多數(shù)哺乳動物特別是人有著強減毒毒性，雖然如此但是其仍在被核準(zhǔn)為產(chǎn)生治療性物質(zhì)(例如疫苗)的傳代細(xì)胞系的細(xì)胞中生長。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)所述適應(yīng)的MVA株的方法。所述適應(yīng)的MVA可以作為載體系統(tǒng)，或者以作為輔助劑或作為免疫系統(tǒng)的非特異性成分的調(diào)節(jié)劑的活性或滅活形式用于例如腸胃外的免疫接種。
文檔編號A61K48/00GK1418248SQ01806494
公開日2003年5月14日 申請日期2001年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月14日
發(fā)明者安東·梅爾 申請人:安東·梅爾