專利名稱：谷氨酸n－衍生物的多糖酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新產(chǎn)物，即谷氨酸N-衍生物(N-GA)的多糖酯。在此描述了它們作為藥物的抗增生的用途。
現(xiàn)有技術(shù)在本領(lǐng)域已經(jīng)描述過幾種改性的多糖。它們通過如下方式獲得在多糖鏈上存在的一些基團(tuán)，例如羧基、胺基、或羥基的化學(xué)改性，形成酯、酰胺、醚。應(yīng)用領(lǐng)域有幾種和包括例如食品、清漆、分析化學(xué)、化妝品和藥物。
在藥物領(lǐng)域，認(rèn)為多糖是適于制備可控藥物釋放化合物的化合物。它們事實上特別容易被生物體所耐受，這是由于例如透明質(zhì)酸和肝素，它們是它的一部分。
用于藥用活性分子的可控釋放的多糖可以如下方式存在與藥物混合(WO99/02151)或通過，例如酯或酰胺鍵，共價結(jié)合到其上(US4851521和US5733891)。
然而，除它們作為載體的功能以外，一些多糖具有它們自身的生物活性或它們是有機(jī)體的組分例如，肝素是抗凝劑；透明質(zhì)酸是玻璃體液和滑膜液的主要組分，此外通常用于治療骨關(guān)節(jié)病和關(guān)節(jié)病的臨床實踐。硬葡聚糖(Sizofiran)，另一種多糖，用于腫瘤的治療。其它硫酸化多糖證明可有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜炎和銀屑病。
具有二氫葉酸還原酶(DHFR)抑制活性的谷氨酸N衍生物的藥物用途報導(dǎo)在文獻(xiàn)(Goodman&Gilman，治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)，McGraw-Hill，1996，1253頁)中。酶DHFR負(fù)責(zé)7，8-二氫葉酸鹽循環(huán)到它的還原的，生理學(xué)活性的6(R)-四氫形式。還原葉酸鹽的可利用性對于支持活躍增生細(xì)胞的復(fù)制是必須的。谷氨酸N衍生物，它作為DHFR的有效抑制劑的細(xì)胞毒性效果，已經(jīng)可歸因于還原葉酸鹽細(xì)胞內(nèi)池的缺失。這些藥物通常用作幾類病狀如腫瘤、銀屑病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的抗增生劑。然而它們的藥物用途強(qiáng)烈地受到它們的高全身毒性限制，因此非常需要允許更低劑量藥物的給藥從而降低毒性的體系或更具體的制劑。
這些N-GA衍生物的一些已經(jīng)連接到其它分子上，特別是連接到大分子，如血清白蛋白，或合成聚合物，明膠和一些多糖上。例如，已經(jīng)使用縮合劑(羰基咪唑)制備聚-氨甲喋呤-葡聚糖(CA2,009,695)。此最后的反應(yīng)方法并不允許制備結(jié)構(gòu)確定的產(chǎn)物，這是由于幾種不同類型的羧基和羥基它們的無規(guī)反應(yīng)。不能深刻說明此產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，因此特征僅為在從反應(yīng)混合物分離的材料中存在的氨甲喋呤的數(shù)量。事實上，沒有給出關(guān)于在多糖上取代位置的證據(jù)。相同類型的反應(yīng)方法已經(jīng)應(yīng)用于制備其它的多糖衍生物，它們再次允許制備無規(guī)取代的聚合物(US5,554,386)。在聚合物上引入氨甲喋呤以制備藥理活性體系的嘗試是在多糖葡聚糖和藥物之間的共軛反應(yīng)，它通過間隔基團(tuán)進(jìn)行。至少，在該共軛之前將葡聚糖采用高磺酸鹽改性且因此它的原始糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致不同的聚合物(Dang等人，Cancer Res.，54，1729，1994)。在用于現(xiàn)有技術(shù)的一些反應(yīng)中，設(shè)想在氨甲喋呤羧基和氨基之間的可能不希望的交聯(lián)反應(yīng)。
概述一類通式(I)化合物的多糖酯，通常稱為N-GA(谷氨酸的N衍生物)，表示本發(fā)明的目的。
這些N-GA化合物具有如下通式 其中
-R2和R4表示-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O和包含兩個氮原子的6元環(huán)任選地是芳族的；-X和Y表示-C(R5)＝、-N＝和包含它們的環(huán)任選地是芳族的，或它們表示-CH(R5)-或-NH-和包括它們的環(huán)是脂族的；-R5表示-H、C1-C5烷基；-Z表示-CH(R10)-、-N(R10)-、-O-；-R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有1-3個選自氮、硫和氧的雜原子的5-6元雜環(huán)，-Ar表示可能與一個或多個5-6元芳族環(huán)稠合的1，4-苯基，可能的雜環(huán)，可能被R2取代。用于制備多糖酯的多糖從天然來源獲得和在單糖單元上存在的它們伯羥基與通式(I)化合物的γ-羧基完全或部分酯化。
本發(fā)明的產(chǎn)物可用于藥物領(lǐng)域作為細(xì)胞增生的抑制劑和因此用于制備治療瘤、炎癥性或自身免疫疾病的藥劑。
本發(fā)明進(jìn)一步包括新藥物組合物，該組合物包含作為活性化合物的該多糖酯，多糖酯與合適的藥物賦形劑和/或溶劑結(jié)合，和它們在治療和預(yù)防特征為細(xì)胞過度增生的疾病中的用途。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的涉及一類通常稱為N-GA(谷氨酸的N衍生物)的通式(I)化合物的多糖酯。
這些N-GA化合物具有如下通式 其中
-R2和R4表示-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O和R2和R4連接到其上的6元環(huán)任選地是芳族的；-X和Y選自-C(R5)＝、-CH(R5)-、-NH-、-N＝，其中R5表示-H、C1-C5烷基，和包括X和Y的環(huán)任選地是芳族的；-R5表示-H、C1-C5烷基；-Z表示-CH(R10)-、-N(R10)-、-O-；-R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有1-3個選自氮、硫和氧的雜原子的5-6元雜環(huán)，-Ar表示可能與一個或多個5-6元芳族環(huán)稠合的1，4-苯基，可能的雜環(huán)，可能被R2取代。
在通式(I)中，根據(jù)環(huán)是否是芳族的，可發(fā)生如下狀況1)當(dāng)包含兩個氮原子的6元環(huán)是芳族的時，則兩個氮原子是-N＝和被R2和R4取代的碳原子分別是-C(R2)＝和-C(R4)＝和R2和R4不同于＝O；此外連接X和Y和通常連接到兩者環(huán)上的碳原子，分別是-C(X)＝和-C(Y)＝；2)當(dāng)包含兩個氮原子的6元環(huán)不是芳族的時，則兩個氮原子的形式是-NH，和被R2和R4取代的碳原子分別是-CH(R2)＝和-CH(R4)＝或當(dāng)R2和/或R4是＝O時，相應(yīng)的碳原子不被H取代，和a)當(dāng)包含X和Y的環(huán)不是芳族的時，連接到X和Y的碳原子是-CH(X)-和-CH(Y)-；或b)當(dāng)包含X和Y的環(huán)是芳族的時，它們是-C(X)＝和-C(Y)＝；3)當(dāng)包含X和Y的環(huán)是芳族的時則X和Y是-C(R5)＝、-N＝和連接X和Y和通常連接到兩者環(huán)上的碳原子，是-C(X)＝和-C(Y)＝和連接到X和連接到-CH2-Z-上的碳原子不被-H取代和連接到Y(jié)上的剩余碳原子是-CH＝；4)當(dāng)包含X和Y的環(huán)不是芳族的時，則X和Y是-CH(R5)-、-NH-和a)當(dāng)該兩個包含N的環(huán)是芳族的時，連接到X和Y的碳原子(也屬于包含N的環(huán))是-C(X)＝和-C(Y)＝，或b)當(dāng)該包含N的環(huán)不是芳族的時，它們是-CH(X)-和-CH(Y)-，和連接到X和連接到-CH2-Z-上的碳原子被-H取代和連接到Y(jié)上的剩余碳原子是-CH2-。
在根據(jù)本發(fā)明的多糖酯中，多糖的伯羥基與通式(I)化合物的γ-羧基部分或完全酯化。N-GA的γ-羧基直接連接到-(CH2)2-上的基團(tuán)。
根據(jù)本發(fā)明的第一優(yōu)選實施方案，當(dāng)R2和R4是-NH2或-OH時，R5當(dāng)存在時表示-H、-CH3，包含兩個氮原子(-N＝)的6元環(huán)是芳族的；Z選自-CH(R10)-、-N(R10)-，其中R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基。
在第二優(yōu)選實施方案中，當(dāng)R2是＝O和R4是-NH2時，包含兩個氮原子的6元環(huán)不是芳族的；X和Y是氮原子(-N＝)和包含它們的環(huán)是芳族的；Z是-N(R10)-，其中R10表示-H或-CH3；Ar是1，4苯基。
在第三優(yōu)選實施方案中，當(dāng)R2和R4是-NH2時，包含兩個氮原子(-N＝)的6元環(huán)是芳族的；X和Y是氮原子(-N＝)和包含它們的環(huán)是芳族的，Z是-N(R10)-，其中R10是-CH3或-H；Ar是1，4苯基。
在第四優(yōu)選實施方案中，當(dāng)R2和R4是-NH2時，包含兩個氮原子(-N＝)的6元環(huán)是芳族的；X和Y是氮原子(-N＝)和包含它們的環(huán)是芳族的，Z是-CH(C2H5)-和Ar是1，4-苯基。在通式(I)化合物和多糖之間的酯化發(fā)生在多糖的單糖單元的伯羥基和通式(I)化合物(N-GA)的γ-羧基之間。
這些多糖酯的取代程度為＞0-1，優(yōu)選0.005-1。術(shù)語“取代程度”(DS)表示每摩爾數(shù)包含伯羥基的單糖單元的通式(I)化合物(N-GA)的數(shù)目。相應(yīng)于1的取代程度表示所有伯羥基和N-GA酯化的產(chǎn)物。
用于本發(fā)明的多糖是陰離子的或中性的和至少一些的它們單糖單元包含伯羥基。多糖分離自不同的來源動物、人體、植物、微生物和它們的天然重均分子量(MW)為1×103-2×106。
多糖含有線性或支化結(jié)構(gòu)和由如下單糖單元組成D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-和L-甘露糖、D-半乳糖、L-巖藻糖、D-果糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖醛酸、L-古洛糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-半乳糖醛酸、N-乙?；?L-半乳糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺，3，6-脫水-D-半乳糖、N-乙?；?D-半乳糖胺、3，6-脫水-D-半乳糖、3，6-脫水-L-半乳糖。這些單糖可任選地包含硫酸鹽或乙?；?。
主多糖鏈含有β-(1→3)或β-(1→2)或β-(1→4)-D-糖苷或α-(1→3)、α-(1→4)、α-(1→6)-糖苷結(jié)構(gòu)；優(yōu)選是β-構(gòu)型。側(cè)鏈優(yōu)選由與如下結(jié)合的D-糖基單元組成β-(1→2)、β-(1→3)、β-(1→4)、β-(1→6)、或α-(1→4)、α-(1→6)或甚至更優(yōu)選β-(1→6)鍵。
當(dāng)多糖是中性的時，它優(yōu)選是從藻類、真菌、植物、細(xì)菌或酵母菌分離的葡聚糖(葡萄糖多糖)。優(yōu)選的中性多糖屬于β-(1→3)-D-葡聚糖(β-(1→3)-D-葡萄糖的多糖)類和是線性或支化的?？捎糜诒景l(fā)明的葡聚糖的優(yōu)選例子是硬葡聚糖、蘑菇多糖、裂裥菌素、茯苓多糖(pachimaran)、產(chǎn)堿桿菌多糖、昆布多糖、芽霉菌糖。該多糖由藻類、酵母菌和真菌大量生產(chǎn)。在它們之中，優(yōu)選是硬葡聚糖。硬葡聚糖是在主鏈中每三個葡萄糖處側(cè)鏈由β-(1→6)-D-葡萄糖單元構(gòu)成的β-(1→3)-D-葡聚糖。此多糖主要從真菌，如葡糖酸小核菌(Sclerotiumglucanicum)或齊整小核菌(S.rolfsii)提取。真菌發(fā)酵表示它們生產(chǎn)的進(jìn)一步有用方式。
當(dāng)多糖是陰離子時，使用羧化多糖，如透明質(zhì)酸或它的鹽(二聚體單元由N-乙?；?D-葡糖胺和D-葡萄糖醛酸組成)。果膠是陰離子多糖的另一種例子。果膠是由D-半乳糖醛酸和D-半乳糖組成的多糖，其中羧基可與甲基部分酯化。用于本發(fā)明酯的另一類陰離子多糖，由硫酸化多糖，例如肝素、硫酸軟骨素或硫酸皮膚素表示。用于本發(fā)明酯制備的硫酸化多糖的其它例子，是如在WO98/23648中描述的從Grateloupia doryphora或G.filicina種類的藻類提取。也可以有利地使用從屬于Grateloupiaceae或Codiaceae科的不同的藻類或從其它微生物分離的其它硫酸化多糖。
在陰離子多糖的情況下，任選地將本發(fā)明的酯與如下物質(zhì)成鹽堿金屬(優(yōu)選Na和K)、堿土金屬(優(yōu)選Ca和Mg)、過渡金屬(優(yōu)選Cu、Zn、Ag、Au、Co)。通過熟練技術(shù)人員用已知的方法獲得衍生多糖，如通過本發(fā)明化合物成鹽而獲得的那些。
任選地，將在本發(fā)明多糖酯的單糖單元上的游離羥基，進(jìn)一步通過引入選自如下的一種或多種取代基改性低級C1-C6烷基、-COOH、NH2、-NH-COCH3、-SO3H、-OPO3H2、-COO-(CH2)n-COOH、-COOR、-COR、-OR、-O-(CH2)n-OCOR，其中n＝1-4和R＝C1-C10烷基。這些取代物可以容易地通過本領(lǐng)域已知的方法獲得，和選擇例如用于改性多糖酯的親水特征，調(diào)節(jié)它們的溶解度。
本發(fā)明的多糖酯具有特有化學(xué)特征，該特征在于如下兩者存在雙區(qū)域選擇性和天然多糖結(jié)構(gòu)的保持。此外，在N-GA和多糖之間不存在間隔臂或化學(xué)基團(tuán)。
至于涉及的雙區(qū)域選擇性，術(shù)語“雙”表示在多糖和在N-GA兩者上的選擇性。因此獲得的衍生物是獨特的。事實上，在多糖上存在的幾個羥基之中，僅有單糖單元的伯羥基與N-GA酯化。關(guān)于在N-GA上的選擇性，盡管此分子包含兩個顯示相當(dāng)相似化學(xué)反應(yīng)性的反應(yīng)性羧基，本發(fā)明的衍生物涉及僅含有涉及反應(yīng)的一個特定羧酸和更精確地γ-羧酸的產(chǎn)物，例如由NMR光譜確認(rèn)。結(jié)果是，本發(fā)明的衍生物具有高度規(guī)則和確定的三維結(jié)構(gòu)。相對于現(xiàn)有技術(shù)的無規(guī)取代衍生物此特征提供明確的藥理學(xué)優(yōu)點。事實上可能游離伯或仲羥基的無規(guī)取代導(dǎo)致具有依賴于取代類型的可變活性的產(chǎn)物。
此外，不同于現(xiàn)有技術(shù)的N-GA的大分子衍生物，在本發(fā)明的酯中，多糖保持原始天然化學(xué)結(jié)構(gòu)。在此將起始多糖改性的意義在于在單糖單元上引入新基團(tuán)但并不改進(jìn)單糖單元的結(jié)構(gòu)特性。因此保存多糖的整體性的優(yōu)點在于在酯鍵的體內(nèi)水解之后，僅產(chǎn)生已知的生物相容性代謝物(天然多糖如葡聚糖或透明質(zhì))。根據(jù)進(jìn)一步的實施方案，本發(fā)明涉及N-GA多糖酯的制備方法。
通式(I)化合物和多糖的酯化工藝通過如下物質(zhì)的區(qū)域選擇性反應(yīng)而發(fā)生多糖單糖單元的的活化伯羥基和N-GA的γ-羧基。通過選擇合適的反應(yīng)物數(shù)量，獲得具有不同取代程度的多糖酯。方法包括如下步驟a)通過鹵化，多糖的單糖單元的伯羥基的活化，獲得區(qū)域選擇性鹵代多糖；b)通過鹵素原子的置換，在步驟a)的鹵代多糖和N-GA羧基之間酯鍵的形成。
步驟a)通過如下方式進(jìn)行在合適的有機(jī)溶劑中，在攪拌下在25-100℃下將多糖懸浮1-5小時，隨后活化伯羥基，該活化在烷基或芳基鹵化物存在下，在有機(jī)溶劑中，在-20℃到70℃的溫度下在攪拌下進(jìn)行1-18小時；合適的鹵化物是甲磺酰溴、對甲苯磺酰溴、甲磺酰氯、對甲苯磺酰氯；合適的溶劑是二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮?？梢匀芜x地將此反應(yīng)混合物堿化到9-11的pH值。在鹵化結(jié)束時，將混合物中和及通過已知技術(shù)如沉淀，干燥，冷凍干燥將鹵代多糖回收。當(dāng)多糖是陰離子多糖時，它可以游離或成鹽的形式，優(yōu)選以成鹽的形式使用。
步驟b)通過如下方式進(jìn)行將a)中獲得的鹵代多糖懸浮在有機(jī)溶劑或其混合物中，隨后在堿性試劑存在下，加入在相同有機(jī)非質(zhì)子溶劑或其混合物中的N-GA。將反應(yīng)在室溫下，在攪拌下進(jìn)行0.5-3天。合適的溶劑是二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮。在反應(yīng)結(jié)時，通過已知技術(shù)如沉淀，干燥，冷凍干燥，回收谷氨酸N衍生物的多糖酯。
關(guān)于本發(fā)明方法多糖鹵化(步驟a)的進(jìn)一步詳細(xì)情況在WO99/18133中找到，在此描述的條件可以適用于陰離子和中性多糖兩者。也可以應(yīng)用多糖和通式(I)化合物的其它酯化反應(yīng)，它允許雙區(qū)域選擇性，如包括在其上發(fā)生選擇性衍生的特定化學(xué)基團(tuán)的保護(hù)和解保護(hù)的反應(yīng)。
本發(fā)明的酯抑制細(xì)胞過度增生和具有令人驚奇地低全身毒性。
特別地，本發(fā)明的產(chǎn)物在特征為細(xì)胞過度增生的如下所有那些病狀和障礙的治療中有活性如炎癥性、自身免疫性或瘤疾病和特別是在容易發(fā)生腫瘤惡化的炎癥性病狀中，如腸內(nèi)炎癥性疾病，即憩室炎、克隆病、結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎，如在Levin等人中描述的那樣(J.Cell.Biochem.Suppl.，1992，16G47-50)。本發(fā)明的多糖酯也用于治療骨頭或腱的滑膜細(xì)胞增生，它導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退化，如在Echanet等人中描述的那樣(J.Immunol.，1993，151(9)4908-4917)。這樣的退化在關(guān)節(jié)疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼態(tài)關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎中經(jīng)常發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明的化合物也用于特征為異常細(xì)胞增生的皮膚疾病和甚至用于繼發(fā)性細(xì)胞增生的控制，例如用于假體醫(yī)用裝置(例如心血管支架、或其它輔助器)的外科插入或血管病癥或用于哮喘發(fā)作、心肌梗塞或肺動脈高壓。
至于涉及的抗腫瘤疾病，本發(fā)明的產(chǎn)物也可適用于治療幾種類型的人體腫瘤，例如卵巢癌、淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、絨毛膜癌、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、骨肉瘤。
在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，該組合物包含與適當(dāng)?shù)乃幱觅x形劑和/或稀釋劑結(jié)合的本發(fā)明酯衍生物。包含本發(fā)明多糖酯的該組合物可任選地包括具有抗增生活性的其它已知藥物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物適于胃腸外、口服或局部給藥。優(yōu)選的胃腸外給藥方式是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和皮下。當(dāng)它們?yōu)橐后w形式時，組合物可以為溶液或懸浮液的形式，均可以在含水或非含水介質(zhì)中?；蛘?，可以按固體形式配制組合物，其中就在給藥之前，通過加入合適的液體介質(zhì)，將凍干或干燥的產(chǎn)物溶解或懸浮。以固體或半固體形式的藥物組合物是插入物、凝膠、乳膏、顆粒劑、粉末、片劑、膠囊、丸劑或微囊包封的制劑。其它類型的制劑可以由專家已知的技術(shù)設(shè)定。
本發(fā)明的酯衍生物的劑量可依賴于病狀和種類和嚴(yán)重程度，以及依賴于患者的年齡、體重和一般狀況而變化。
試驗部分實施例1.測量重均分子量(Mw)的方法。
多糖試劑的分子量由HP-SEC(高效尺寸排阻色譜)分析。分析條件是色譜帶有Rheodyne 9125注射器的HPLC Jasco PU-980。柱TSK PwxlG6000+G5000+G3000(TosoHaas)300mmx7.8mm ID，13，10，6μm粒徑；溫度40℃流動相NaCl 0.15M通量0.8ml/min檢測器LALLS CMX-100(TSP Chromatix)，Po＝150mV；差示折光指數(shù)410(Waters)，靈敏度128x；溫度32℃。
注射體積100μl將要分析的樣品在大約1.0mg/ml的濃度下溶于0.15M NaCl中和在攪拌下保持12小時。然后，將溶液在0.45μm多孔過濾器(Millipore)上過濾和最后注入色譜。分析允許Mw(重均分子量)，Mn(數(shù)均分子量)，PI(多分散性)的測量。通過折光率的積分控制聚合物樣品溶液的濃度。
實施例2.鹵代硬葡聚糖的制備將160mL的無水DMF在80℃下加熱和在氮氣下混合1小時。將1g重均分子量為60000(如在實施例1中所述測量的)的硬葡聚糖，加入和將系統(tǒng)混合三小時。將溶液冷卻到室溫。然后將9.8g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。將反應(yīng)混合物在混合下保持另外20分鐘和然后在80℃下加熱16小時。將混合物冷卻到室溫和通過加入30mL的Milli-Q水而終止反應(yīng)。將混合物采用3N NaOH中和，然后在減壓下濃縮和最后傾入800mL丙酮中。將產(chǎn)物通過過濾收集，采用丙酮洗滌，在蒸餾水中懸浮和透析。將混合物過濾和將固體材料在烘箱中、在真空、室溫下干燥。固體重量1g。
將產(chǎn)物采用13C NMR光譜(DEPT)，在DMSO-d6/TFA中在50℃下分析。參與鹵化的多糖的CH2-O(C6)的信號為34.5ppm，然而在未衍生多糖中的相同基團(tuán)得到61ppm的信號?；瘜W(xué)位移中的變化提供在葡萄糖殘基的伯羥基上發(fā)生鹵化反應(yīng)的證據(jù)。
實施例3.硬葡聚糖與化合物MT的酯化將帶有如下取代基的通式(I)化合物MT與鹵代硬葡聚糖酯化R2和R4-NH2，包含兩個氮原子的6元環(huán)是芳族的；X和Y是-N＝和包含它們的環(huán)是芳族的；Z是-N(CH3)-；Ar是1，4-苯基。
在80℃下，將如在實施例2中獲得的150mg鹵代硬葡聚糖溶于15mL的DMSO。在3小時之后，將溶液冷卻到室溫和加入在10mL DMSO中的512mg的MT。將反應(yīng)混合物在室溫下，在堿性試劑存在下，在氮氣下和避光保護(hù)48小時條件下混合。然后將產(chǎn)物在250mL丙酮中沉淀和通過過濾收集，采用丙酮洗滌，懸浮在蒸餾水中和采用0.2N HCl中和，和再次采用丙酮沉淀。將固體在烘箱中在真空、室溫下干燥。固體重量80mg。
產(chǎn)物的分析FT-IR光譜(Perkin-Elmer mod.1750)在1730cm-1的譜帶(KBr粒料)典型的酯鍵。1H NMR光譜(NMR Varian Inova500-500MHz)在23℃下對溶于DMSO-d6/TFA的產(chǎn)物的擴(kuò)散試驗顯示共價結(jié)合到多糖上的MT的存在。將產(chǎn)物采用1H NMR光譜，在DMSO-d6/TFA中在50℃下分析。從光譜的分析來看是顯然的是由于MT的γ-亞甲基對信號的改進(jìn)質(zhì)子不是當(dāng)量的和它們分裂成兩個多重峰(2.35e2.45ppm)，然而起始MT(即未鍵合到多糖上的MT)的相應(yīng)基團(tuán)特征為信號為三重峰的形式。由于羧酸的酯化的γ-質(zhì)子的非當(dāng)量，在雜雙核光譜1H-13C HSQC(在32ppm的13C信號)中確認(rèn)。
實施例4.鹵代硬葡聚糖的制備在80℃下，將300mg重均分子量為995000(如在實施例1中所述測量的)的硬葡聚糖懸浮在40mL無水DMF中和在80℃、氮氣氣氛下1小時保持混合。將混合物冷卻到室溫和然后將2.9g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。將反應(yīng)混合物在混合下保持另外30分鐘和然后在80℃下加熱16小時。將混合物冷卻到室溫和通過加入8mL的Milli-Q水而停止反應(yīng)。將混合物采用0.1N NaOH中和，然后在減壓下濃縮和傾入200mL丙酮中。將產(chǎn)物通過過濾收集，采用丙酮洗滌，在蒸餾水中懸浮，然后對蒸餾水透析和冷凍干燥。固體重量290mg。
將產(chǎn)物采用13C NMR光譜分析，它顯示如在實施例2中所述在伯羥基上發(fā)生鹵化反應(yīng)。
實施例5.硬葡聚糖與MT的酯化在80℃下，將如在實施例4中獲得的90mg鹵代硬葡聚糖懸浮于20mL的DMSO。在4小時之后，將溶液冷卻到室溫和加入溶于20mL DMSO中的293mg的MT。在堿性試劑存在下，在混合下，在氮氣下將反應(yīng)混合物保持到室溫，和避光保護(hù)48小時。然后將混合物傾入250mL丙酮中。將產(chǎn)物通過過濾收集，采用MeOH充分洗滌，過濾和最后在烘箱中在真空、室溫下干燥。固體重量90mg。
將產(chǎn)物采用1H NMR光譜在DMSO-d6/TFA中分析，它顯示如在實施例3中共價結(jié)合到多糖上的MT的存在。
實施例6.鹵代硬葡聚糖的制備在80℃下，在混合下和在氮氣下將600mg重均分子量為140000(如在實施例1中所述測量的)的硬葡聚糖懸浮在40mL無水DMF中1小時。將混合物冷卻到室溫和然后將5.9g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。將反應(yīng)混合物在混合下保持30分鐘，然后在80℃下加熱16小時。將混合物冷卻到室溫和通過加入8mL的Milli-Q水而停止反應(yīng)。將混合物采用0.1N NaOH中和，在減壓下濃縮和在200mL丙酮中沉淀。將產(chǎn)物通過過濾收集，采用丙酮洗滌，在蒸餾水中懸浮，然后對蒸餾水透析和冷凍干燥。重量710mg。
將產(chǎn)物采用13C NMR光譜分析，它顯示如在實施例2中所述化合物中觀察到的在伯羥基上發(fā)生鹵化反應(yīng)。
實施例7.硬葡聚糖與MT的酯化在80℃下，將在實施例6中獲得的500mg鹵代硬葡聚糖懸浮于110mL的DMSO中。在4小時之后，將溶液冷卻到室溫和加入在33mL DMSO中的1.63g的MT。在堿性試劑存在下，在混合下，在氮氣下將反應(yīng)混合物保持到室溫，和避光保持48小時。然后將混合物在250mL丙酮中沉淀和通過過濾收集，采用丙酮洗滌，懸浮在蒸餾水中和采用0.2N HCl中和，再次采用丙酮沉淀。產(chǎn)物的重量(RG4900)470mg。
將產(chǎn)物采用1H NMR光譜在DMSO-d6/TFA中分析，它顯示如在實施例3中所述共價結(jié)合到多糖上的MT的存在。
實施例8.鹵代硬葡聚糖的制備在80℃下，將1g重均分子量為120000(如在實施例1中所述測量的)的透明質(zhì)酸的四丁基銨鹽懸浮在50mL DMF中，并在混合下和在氮氣氣氛下保持約1小時。將混合物冷卻到室溫。然后將1.28g甲磺酰溴在0℃下加入到溶液中。將反應(yīng)混合物在混合下保持另外30分鐘，然后在80℃下加熱16小時。將混合物冷卻到室溫和通過加入約10mL的Milli-Q水而停止反應(yīng)。將混合物采用0.1N NaOH中和，然后在減壓下濃縮和傾入200mL丙酮中。將產(chǎn)物通過過濾收集，采用丙酮洗滌，懸浮在蒸餾水中，然后對蒸餾水中透析和冷凍干燥。固體重量480mg。
將產(chǎn)物采用13C NMR光譜(DEPT)，在DMSO-d6/TFA中在50℃下分析。參與鹵化的多糖的CH2-O(C6)的信號為34.5ppm，然而在未衍生多糖中的相同基團(tuán)得到61ppm的信號?；瘜W(xué)位移中的變化提供在葡萄糖殘基的伯羥基上發(fā)生鹵化反應(yīng)的證據(jù)。
實施例9.透明質(zhì)與MT的酯化在80℃下，將如在實施例8中獲得的50mg鹵代透明質(zhì)懸浮于5mL的DMSO。在2-3小時之后，將混合物冷卻到室溫和加入溶于2mL DMSO中的59mg的MT。在堿性試劑存在下，在混合下，在氮氣氣氛下將反應(yīng)混合物保持到室溫，和避光保護(hù)48小時。然后將混合物傾入50mL丙酮中。將產(chǎn)物通過過濾收集，采用MeOH充分洗滌，過濾和最后在烘箱中在真空、室溫下干燥。固體重量70mg。
將產(chǎn)物采用1H NMR光譜在DMSO-d6/TFA中分析，它顯示共價結(jié)合到多糖上的MT的存在。
實施例10.本發(fā)明化合物對二氫葉酸還原酶活性的影響向所需體積的蒸餾水中，以如下順序，將試劑和測試樣品加入到3ml一次性比色杯中H2O(0.1-0ml)，1.5M乙酸鈉緩沖劑(1ml)，1.8MKCl(1ml)，3mM NADPH(0.15ml)，在PBS中的測試溶液(0-0.1ml)，二氫葉酸還原酶(DHFR)(約0.01Uμl)(5ml)。所有的試劑均購自Sigma。將DHFR引入，混合和在30℃下培養(yǎng)2min。通過加入二氫葉酸(3mM，0.15ml)引發(fā)反應(yīng)，隨后是在340nm處吸光度隨時間減少。測試溶液包含a)MT(在實施例3中定義)，2.2×10-5M，b)數(shù)量相應(yīng)于2×10-5M MT當(dāng)量，如在實施例7中獲得的本發(fā)明化合物(RG4900)。
包括對照溶液，它包含作為測試溶液的0.1ml PBS。
2.2×10-5M的MT測試濃度完全抑制二氫葉酸還原酶的活性。如稱為MT的化合物RG4900的等摩爾濃度，并不抑制DHFR活性，如由等于對照反應(yīng)的ΔA340證明。然而在反應(yīng)開始時，在化合物存在下吸光度降低的速率略微低于對照反應(yīng)。此觀察到的化合物RG4900對DHFR的殘余抑制作用可能是由于在制劑中存在的較低量的游離MT。最后，一旦酯鍵在合適細(xì)胞隔室中水解之后從前藥中釋放，大多數(shù)DHFR抑制活性由MT進(jìn)行。
已經(jīng)通過在不同pH下進(jìn)行的幾個試驗研究酯水解的條件。在水解之后進(jìn)行的DHFR抑制的測試證明水解體系的抑制活性。
實施例11.本發(fā)明化合物抗增生活性的體外分析在如下幾種腫瘤細(xì)胞系上進(jìn)行本發(fā)明化合物RG4900多糖酯的抗增生活性如SK-OV-3(人體細(xì)胞系)卵巢癌細(xì)胞，HT29結(jié)腸癌細(xì)胞(人體細(xì)胞系)，NIH-H460肺癌細(xì)胞(人體細(xì)胞系)，L1210白血病細(xì)胞(鼠細(xì)胞系)。在添加有10％FCS的RPMI-1640介質(zhì)(Sigma Chemical Co.，St.Louis)中，在生理葉酸鹽濃度(2nM)下，在保持于37℃的50cm2塑料瓶(CorningIndustries，Corning，NY)中，在包含5％CO2的潮濕氣氛下，將上述細(xì)胞系生長為單層。每周將它們傳代到新鮮的介質(zhì)中。在試驗測試開始之前，采用胰蛋白酶的溶液將指數(shù)生長相從燒瓶中除去。然后將細(xì)胞接種到添加有10％FCS的RPMI-1640介質(zhì)中的6孔盤中(30.000細(xì)胞/盤)。將細(xì)胞生長24小時，以促進(jìn)粘合，然后將介質(zhì)除去和采用試驗介質(zhì)置換。將細(xì)胞培養(yǎng)72或120小時。通過如下方式制備試驗介質(zhì)在添加有10％FCS的RPMI-1640介質(zhì)中，在0-5000μg/ml N-GA當(dāng)量的不同最終濃度下，在本發(fā)明多糖酯的PBS緩沖劑中，稀釋原液。采用在0-100μg/ml濃度范圍的相應(yīng)N-GA，進(jìn)行對比測試。通過臺盤藍(lán)比色測定，它與有活力細(xì)胞的數(shù)目成比例，確定抗增生活性。
表1顯示在實施例7化合物(RG4900)存在下，在治療72和120小時之后，細(xì)胞系SK-OV-3(卵巢癌)的生長百分比。每個值是4個不同測試的平均值。被測試化合物的濃度稱為在相應(yīng)化合物中存在的MT數(shù)量。采用等于30.000細(xì)胞/盤的細(xì)胞密度進(jìn)行試驗。
表1
從以上所示的數(shù)據(jù)，顯然的是根據(jù)本發(fā)明的多糖酯發(fā)揮高的抗增生活性，它是時間和劑量依賴性的。
表2報導(dǎo)多糖酯和相應(yīng)未衍生多糖(硬葡聚糖，MW的SC140000)對SK-OV-3卵巢癌細(xì)胞存活的效果。在培養(yǎng)72和120小時之后，和在相應(yīng)于MT的5μg/ml濃度的多糖酯濃度下，進(jìn)行測試。
表2
從以上數(shù)據(jù)看出未衍生聚合物(SC)沒有效果。
表3顯示本發(fā)明多糖酯和根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)通過硬葡聚糖衍生制備的化合物(AB1)的IC50(必須將細(xì)胞生長降低到對照樣生長50％的濃度)數(shù)值。
在治療120小時之后進(jìn)行不同腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞樣品的計數(shù)。本發(fā)明酯的濃度表達(dá)為在多糖酯上存在的MT數(shù)量(ng/ml)。
表3
表3顯示的數(shù)據(jù)說明，相對于本發(fā)明的化合物，根據(jù)US5,554,386的實施例3制備的和測試為對比樣的無規(guī)取代的MT-硬葡聚糖(AB1)，呈現(xiàn)非常高的IC50。這提供清楚的指示，即通過N-GA的選擇取代，可獲得本發(fā)明化合物抗增生活性的強(qiáng)烈積極效果。
權(quán)利要求
1.通式(I)化合物的多糖酯 其中-R2和R4彼此獨立地選自-NH2、-OH、-OCH3、C1-C5烷基、＝O和包含兩個氮原子的6元環(huán)任選地是芳族的；-X和Y選自-C(R5)＝、-CH(R5)-、-NH-、-N＝，其中R5表示-H、C1-C5烷基，和包括X和Y的環(huán)任選地是芳族的；-Z選自-O-、-CH(R10)-、-N(R10)-，其中R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基、含有1-3個選自氮、硫和氧的雜原子的5-6元雜環(huán)，-Ar是1，4-苯基，可能與一個或多個5-6元芳族環(huán)稠合，任選地雜環(huán)，被以上定義的R2任選地取代；其中在多糖的單糖單元上存在的伯羥基與通式(I)化合物的γ-羧基部分或完全酯化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多糖酯，其中-R2和R4彼此獨立地選自-NH2和-OH和包含兩個氮原子的6元環(huán)是芳族的；-R5如存在，表示-H、-CH3；-Z選自-cH(R10)-、-N(R10)-，其中R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的多糖酯，其中-R2和R4彼此獨立地選自-NH2和＝O和包含兩個氮原子的6元環(huán)不是芳族的；-R5如存在，表示-H、-CH3；-Z選自-CH(R10)-、-N(R10)-，其中R10表示-H、C1-C5烷基、C1-C5烯基、C1-C5炔基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的多糖酯，其中-R2是＝O，R4是-NH2和包含兩個氮原子的6元環(huán)不是芳族的；-X和Y是-N＝和包含它們的環(huán)是芳族的；-Z是-N(R10)-，其中R10表示-H或-CH3；-Ar是1，4苯基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的多糖酯，其中-R2和R4是-NH2和包含兩個氮原子的6元環(huán)是芳族的；-X和Y是-N＝和包含它們的環(huán)是芳族的；-Z是-N(R10)-，其中R10表示-CH3或-H；-Ar是1，4苯基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的多糖酯，其中-R2和R4是-NH2和包含兩個氮原子的6元環(huán)是芳族的；-X和Y是-N＝和包含它們的環(huán)是芳族的；-Z是-CH(C2H5)-，-Ar是1，4苯基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一的多糖酯，其中多糖是中性或陰離子的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的多糖酯，其中多糖是線性或支化的和由選自如下的單糖單元組成D-葡萄糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖醛酸、L-古洛糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-果糖、N-乙?；?D-葡糖胺、N-乙?；?L-半乳糖胺、3，6-脫水-D-半乳糖、3，6-脫水-L-半乳糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求7-8任一的多糖酯，其中該多糖的主鏈含有β-(1→3)、β-(1→2)、β-(1→4)-D-糖苷結(jié)構(gòu)或α-(1→3)、α-(1→4)、α-(1→6)-糖苷結(jié)構(gòu)和可能的側(cè)鏈由與如下構(gòu)型結(jié)合的單糖組成β-(1→2)、β-(1→3)、β-(1→4)、β-(1→6)、α-(1→4)或α-(1→6)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的多糖酯，其中該多糖是β-(1→3)-D-葡聚糖。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的多糖酯，其中該多糖選自硬葡聚糖、蘑菇多糖、裂裥菌素、茯苓多糖(pachimaran)、產(chǎn)堿桿菌多糖、昆布多糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的多糖酯，其中該多糖是透明質(zhì)酸或它的鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的多糖酯，其中該多糖是硫酸化多糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的多糖酯，其中該硫酸化多糖從Grateloupiaceae或Codiaceae科的藻類提取。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14任一的多糖酯，其中多糖的單糖單元的至少一個羥基被選自如下的殘基取代C1-C6烷基、-COOH、-NH2、-NHCOCH3、-SO3H、-OPO3H2、-COO-(CH2)n-COOH、-COOR、-COR、-OR、-O-(CH2)n-OCOR，其中n＝1-4和R＝C1-C10烷基。
16.一種藥物組合物，包括作為活性化合物的根據(jù)權(quán)利要求1-15任一的多糖酯，與合適的藥用賦形劑和/或稀釋劑結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物，形式為溶液或懸浮液。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的藥物組合物，用于胃腸外、口服或局部給藥。
19.根據(jù)權(quán)利要求16-18任一的藥物組合物，其中胃腸外給藥通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和皮下方式進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求16-19任一的藥物組合物，形式為凝膠、乳膏、粉末、粒狀粉末、片劑、丸劑、膠囊或插入物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一的多糖酯用于制備用于治療和預(yù)防特征為細(xì)胞過度增生的疾病的藥劑的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的多糖酯用于制備用于治療和預(yù)防自身免疫或炎癥性病狀的藥劑的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的多糖酯用于治療和預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的多糖酯用于治療和預(yù)防皮膚疾病的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的多糖酯的用途，其中該皮膚疾病是銀屑病。
26.根據(jù)權(quán)利要求21的多糖酯用于治療和預(yù)防腫瘤的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的多糖酯用于治療和預(yù)防腸內(nèi)炎癥性病狀的用途。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求1-15的多糖酯的制備方法，包括如下步驟a)通過多糖的單糖單元的伯羥基的活化，獲得區(qū)域選擇性鹵代多糖；b)通過鹵素原子的置換，在區(qū)域選擇性鹵代多糖和通式(I)化合物的羧基之間形成酯鍵。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在步驟a)中的該活化通過多糖的鹵化而進(jìn)行。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中該鹵化在進(jìn)一步包括烷基或芳基鹵化物的有機(jī)溶劑中進(jìn)行。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該烷基或芳基鹵化物選自甲磺酰溴、對甲苯磺酰溴、甲磺酰氯、對甲苯磺酰氯。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中在步驟b)中，在堿性試劑存在下，將在步驟a)中獲得的鹵代多糖懸浮在有機(jī)溶劑中和然后與懸浮在相同的有機(jī)溶劑中的通式(I)的化合物混合。
33.根據(jù)權(quán)利要求30和32任一的方法，其中該有機(jī)溶劑選自二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及谷氨酸N－衍生物(N－GA衍生物)的多糖酯。這些多糖酯具有抗增生活性和特征為低全身毒性。本發(fā)明的酯用于預(yù)防和治療由細(xì)胞過度增生引起的疾病，特別是銀屑病、腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、或腸內(nèi)炎癥性病狀。
文檔編號A61K9/48GK1418103SQ01806646
公開日2003年5月14日 申請日期2001年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月17日
發(fā)明者G·米格里瑞尼, L·斯杜奇, A·拉斯特萊里 申請人:歐蘭德制藥有限公司