專利名稱：具有促細(xì)胞程序死亡活性的嵌合前列腺歸巢肽的制作方法
本項(xiàng)研究是由國立癌癥研究所(USA)的資金CA74238，CA28896和CA30199以及國防部資金DAMD17-98-1-8581資助的。美國政府在本發(fā)明中具有一定的權(quán)利。
背景資料前列腺腺癌近年來成為美國人中診斷出的發(fā)病率最高的癌癥，頭一次超過了肺癌的發(fā)病率。據(jù)估計(jì)每年有30000個(gè)美國人死于這種惡性腫瘤。另外，前列腺癌影響整個(gè)世界的男性，據(jù)報(bào)道最高的發(fā)病率是在美國和北歐國家，在整個(gè)歐洲有中等程度的高發(fā)病率。前列腺癌是一種老年男性疾病，這種疾病的患者75％是60-80歲。在50歲，估計(jì)美國人發(fā)生臨床上明顯的前列腺癌的可能性是大約10％。然而，尸檢研究顯示前列腺癌的真正發(fā)病率實(shí)際上明顯高于臨床跡象所表明的發(fā)病率。
治療癌癥如前列腺癌的一個(gè)主要障礙是相對(duì)缺少可以選擇性定向癌組織而不影響正常組織的制劑。例如，放療和手術(shù)治療通常是局部治療，可以引起治療區(qū)域的正常組織損傷，產(chǎn)生疤痕，嚴(yán)重情況下可以喪失正常組織功能?；熗ǔＪ侨硎┯没焺?，可引起器官如骨髓，粘膜，皮膚和小腸的損傷，經(jīng)歷快速細(xì)胞轉(zhuǎn)換和連續(xù)細(xì)胞分化。結(jié)果，在用化療劑治療癌癥患者時(shí)由于全身應(yīng)用而導(dǎo)致發(fā)生非所需的副作用，例如惡心，脫發(fā)和血細(xì)胞數(shù)降低。這種非所需副作用通常限制可以施用的治療量。由于治療中的這個(gè)缺點(diǎn)，癌癥仍然是導(dǎo)致患者發(fā)病和死亡的主要因素。
已經(jīng)觀測到有一類肽具有有效的抗微生物活性，這類肽包括天然發(fā)生的肽如蜂毒肽，短桿菌肽，爪蟾抗菌肽，防衛(wèi)素和殺菌肽。天然發(fā)生的抗微生物肽和相關(guān)的合成的抗微生物序列，通常在兩親性結(jié)構(gòu)域中具有等價(jià)數(shù)目的極性和非極性殘基，及足夠數(shù)目的堿性殘基以使所述肽在中性pH中全部是正電荷。抗革蘭氏陽性菌的兩親性α螺旋肽的生物活性可以得自這些肽形成穿經(jīng)雙分子層膜的離子通道的能力。由于細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間細(xì)胞膜的不同，許多抗微生物肽選擇性抑制和殺死細(xì)菌，同時(shí)維持低哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞毒性，并具有不同的細(xì)菌細(xì)胞敏感性。如本文所示，這些抗微生物肽可以被賦予抗一種特定的真核細(xì)胞的選擇性胞毒性，如針對(duì)前列腺內(nèi)皮細(xì)胞。
因此，需要能選擇性定向于前列腺的一種新抗癌治療劑。本發(fā)明通過提供促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽(prostate-homing pro-apoptotic peptides)而滿足這一需要，其組合一種抗微生物肽和一種前列腺歸巢肽，產(chǎn)生一種具有抗前列腺的選擇性毒性的綴合物。也提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明還提供了一種在體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)前列腺癌選擇性毒性的方法。這個(gè)方法包括給患有前列腺癌的患者施用一種嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，其含有連接于一種抗微生物肽的前列腺歸巢肽，其中嵌合肽由前列腺組織選擇性內(nèi)在化并對(duì)其呈現(xiàn)高胞毒性，而抗微生物肽當(dāng)不與前列腺歸巢肽連接時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物的胞毒性較低。這種在體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)前列腺癌選擇性毒性的方法，可以例如通過用含有序列SMSIARL(SEQ ID NO207)或功能等價(jià)序列的前列腺歸巢肽進(jìn)行。抗微生物肽可以包括例如序列D(KLAKLAK)2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽包括序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
另外，本發(fā)明提供了一種治療患有前列腺癌的患者的方法，通過為患者施用一種嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，從而此嵌合肽對(duì)腫瘤具有選擇性毒性。此嵌合肽含有連接于一種抗微生物肽的前列腺歸巢肽，其中嵌合肽由前列腺組織選擇性內(nèi)在化并對(duì)其呈現(xiàn)高胞毒性，而抗微生物肽當(dāng)不與前列腺歸巢肽連接時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物的胞毒性較低。前列腺歸巢肽部分可以患有例如序列SMSIARL(SEQ ID NO207)或功能等價(jià)序列，抗微生物肽部分可以含有例如序列D(KLAKLAK)2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此嵌合肽含有序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
下組相當(dāng)于上組中所示結(jié)構(gòu)的″HPP-1″的氨基酸序列。
圖2示出在存在D(KLAKLAK)2的情況下，線粒體溶脹和線粒體依賴性細(xì)胞程序死亡。
a.示出在存在D(KLAKLAK)2或Ca+2(陽性對(duì)照)的情況下的線粒體溶脹曲線(光學(xué)吸收光譜)。
b.示出在存在D(KLAKLAK)2或DLSLARLATARLAI(SEQ IDNO204)，在有或無線粒體情況下，32kDa proform及8和20kDa加工形式的caspase-3裂解的免疫印跡。示出了典型的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果是在三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的綜合。
圖3示出在用CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)處理的皮膚微管內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體溶脹和細(xì)胞程序死亡。
a.皮膚微管內(nèi)皮細(xì)胞索形成，標(biāo)尺＝250um。
b.用CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)處理的增殖皮膚微管內(nèi)皮細(xì)胞中DEVD-pNA水解(caspase活化)。
c.用HPP-1處理的(黑色條桿)或用對(duì)照的肽D(KLAKLAK)2(灰色條桿)處理一段時(shí)間后，增殖皮膚微管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率(t檢驗(yàn)，P＜0.05)d.用HPP-1處理的(黑色條桿)或用對(duì)照的肽D(KLAKLAK)2(灰色條桿)處理一段時(shí)間后，形成索的皮膚微管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率(t檢驗(yàn)，P＜0.05)。
圖4示出用HPP-1處理攜帶人MDA-MB-435衍生的乳腺癌異種移植體的裸鼠的作用。
a.用HPP-1處理的腫瘤的體積與用對(duì)照的CARAC-GG-D(KLAKLAK)2處理的腫瘤的體積的對(duì)比。示出了在第1天至第50天內(nèi)腫瘤體積的不同(t檢驗(yàn)，P＝0.027)。
b.示出用HPP-1或?qū)φ针?D(KLAKLAK)2和CNGRC(SEQ IDNO8)的混合物)處理攜帶人MDA-MB-435衍生的乳腺癌異種移植體的裸鼠的生存的Kaplan-Meier生存圖。每組均包含13只動(dòng)物(Log-Rank檢驗(yàn)，P＜0.05)。
圖5示出在新生小鼠中CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2對(duì)氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新血管化的作用。示出用載體(黑色條桿)；CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2(斑紋條桿)；和未綴合的CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)與D(KLAKLAK)2的對(duì)照混合物(陰影條桿)處理的視網(wǎng)膜新血管數(shù)。
圖6示出靜脈內(nèi)注射的前列腺歸巢肽的生物素綴合物在前列腺組織中的積聚。a.對(duì)來自經(jīng)注射生物素標(biāo)記的前列腺歸巢肽SMSIARL(SEQ ID NO207)的小鼠的前列腺組織切片進(jìn)行的親和素-過氧化物酶染色。b.對(duì)來自經(jīng)注射生物素標(biāo)記的對(duì)照肽CARAC(SEQ ID NO208)的小鼠的前列腺組織切片進(jìn)行的親和素-過氧化物酶染色。
圖7示出在正常小鼠前列腺中由SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡。a.對(duì)來自用SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2嵌合肽處理的小鼠的前列腺組織進(jìn)行的TUNEL染色。b.類似于a的視野的放大倍數(shù)觀察。c.對(duì)用250ug SMSIARL(SEQ ID NO207)和D(KLAKLAK)2的未綴合混合物處理的陰性對(duì)照小鼠進(jìn)行的TUNEL染色。
圖8示出用SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2，單獨(dú)的載體，單獨(dú)的D(KLAKLAK)2肽，或單獨(dú)的SMSIARL肽(SEQ ID NO207)處理TRAMP小鼠的存活力。
圖9示出前列腺歸巢SMSIARL(SEQ ID NO207)噬菌體與人前列腺血管的結(jié)合。a和b.對(duì)人前列腺組織切片進(jìn)行的過氧化物酶染色，所述切片含有均用109TU SMSIARL噬菌體(SEQ ID NO207)覆蓋及用抗噬菌體抗體檢測的的正常組織和癌組織。a是一般性觀察(x 20)而b示出對(duì)a組進(jìn)行的高倍率詳細(xì)觀察(x 40)。c.如a組用沒有肽插入體的噬菌體進(jìn)行過氧化物酶染色。d.如a組用可溶的包含在蓋玻片中的SMSIARL肽SEQ ID NO207進(jìn)行的過氧化物酶染色。
發(fā)明詳述抗微生物肽，也稱為溶細(xì)胞肽或通道形成肽，是廣譜的抗菌劑。這些肽典型地破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡。有100多種抗微生物肽是天然發(fā)生的。另外，已經(jīng)合成了一些類似物，如Javadpou等，J.Med.Chem.393107-3113(1996)；及Blondelle和Houghten，生物化學(xué)3112688-12694(1992)所述，在此均并入?yún)⒖肌Ｒ恍┛刮⑸镫娜绶涠倦牟皇沁x擇性的，在最小的殺菌濃度對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞有損傷，其它一些是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有選擇性的。例如天然發(fā)生的爪蟾抗菌肽和殺菌肽在對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞不致死的濃度呈現(xiàn)基本的殺菌活性。
抗微生物肽通常含有陽離子氨基酸，其附著于陰離子磷脂的頭部基團(tuán)，導(dǎo)致負(fù)電荷的膜優(yōu)先破壞。一旦靜電結(jié)合，兩親性螺旋可以使脂質(zhì)基質(zhì)變形，導(dǎo)致喪失膜屏障功能(Epand，兩親性螺旋，CRC出版社Boca Raton(1993)；Lugtenberg和Alphen，生物化學(xué)生物生理學(xué)綜述73751-115(1983)，所述文獻(xiàn)均并入?yún)⒖?。原核胞質(zhì)膜保持大跨膜電位，并具有高含量的陰離子磷脂。相反，真核胞質(zhì)膜的外層通常具有較低的或沒有膜電位，而且?guī)缀踔挥杉嫘粤字M成。因此，由于獨(dú)特的膜組分，相比之下抗微生物肽可以優(yōu)先破壞原核細(xì)胞膜而非真核細(xì)胞膜。
本發(fā)明涉及令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即抗微生物肽序列可以連接于一種定向腫瘤的分子，以產(chǎn)生歸巢的促細(xì)胞程序死亡綴合物，其通常在真核細(xì)胞外無毒性，但是當(dāng)將其定向于真核細(xì)胞并被其內(nèi)在化時(shí)，其促進(jìn)線粒體膜的破壞及相繼的細(xì)胞死亡。歸巢的促細(xì)胞程序死亡綴合物如HPP-1，其含有連接于環(huán)狀腫瘤歸巢分子CNGRC(SEQ IDNO8)的抗微生物肽D(KLAKLAK)2，在體內(nèi)對(duì)血管發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞有選擇性毒性，因此可以用作新的抗癌治療劑。
因此本發(fā)明提供了一種歸巢的促細(xì)胞程序死亡綴合物，其包括連接于抗微生物肽的一種腫瘤歸巢分子，其選擇性歸巢于選擇的細(xì)胞或組織，其中綴合物被哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織選擇性內(nèi)在化，并對(duì)其具有高毒性，而當(dāng)抗微生物肽不與腫瘤歸巢分子連接時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較低。例如，本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物對(duì)血管生成內(nèi)皮細(xì)胞具有選擇性毒性，并可以用于例如在體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)具有血管生成結(jié)構(gòu)的腫瘤的選擇毒性。
如本發(fā)明所揭示，一種具有對(duì)細(xì)菌而非真核細(xì)胞具有選擇性毒性的合成的抗微生物肽，D(KLAKLAK)2，在明顯低于殺死真核細(xì)胞的濃度的10uM濃度誘導(dǎo)明顯的線粒體溶脹(圖2a)，相比之下表明D(KLAKLAK)2優(yōu)先破壞線粒體膜而非真核細(xì)胞膜(見實(shí)施例1)。另外，如通過特征性caspase-3加工測定，D(KLAKLAK)2激活線粒體依賴性游離細(xì)胞程序死亡(圖2b)，而無α螺旋形成肽DLSLARLATARLAI(SEQ ID NO204)無此功能。這些結(jié)果表明抗微生物肽如D(KLAKLAK)2可以破壞線粒體膜，線粒體膜與細(xì)菌膜一樣，具有高含量的陰離子磷脂，反映細(xì)菌和線粒體是共同祖先(Epand，如前，1993；Lugtenberg和Alphen，如前，1983；Matsuzaki等，生物化學(xué)346521-6526(1995)；Hovius等，F(xiàn)EBS通信33071-76(1993)；及Baltcheffsky和Baltcheffsky Lee等，線粒體和微粒體，Addison-WesleyReading，MA(1981)，所述文獻(xiàn)均在此并入?yún)⒖?。
如本發(fā)明所進(jìn)一步揭示的，抗微生物肽D(KLAKLAK)2通過甘氨酸-甘氨酸鍵與環(huán)狀腫瘤歸巢肽CNGRC(SEQ ID NO8)綴合，產(chǎn)生肽CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2，稱為“HPP-1”。如本發(fā)明所揭示，在血管生成的組織培養(yǎng)模型中，通過分析索形成對(duì)HPP-1進(jìn)行測試，索形成是一種遷移形式，這是根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)從一般的“鵝卵石”形轉(zhuǎn)變?yōu)殒湢罨蛩鳡钏硎?。?0uM HPP-1處理正常人體皮膚微管細(xì)胞(DMECs)，在增殖條件(圖3c)或索形成條件(圖3d)下，隨著時(shí)間推移可以降低存活性百分率，而用未定向的D(KLAKLAK)2肽處理，存活性只有可忽略的損失(見實(shí)施例2)。另外，如表1所示，用HPP-1處理的DMECs的增殖或遷移LC50低于血管生成的LC50。DMECs在單層細(xì)胞中保持100％的鋪滿率，表明在血管生成條件下優(yōu)先被HPP-1殺死。本發(fā)明揭示的結(jié)果進(jìn)一步表明用D(KLAKLAK)2處理24小時(shí)的DMECs的線粒體保持正常的形態(tài)，而那些用CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2或ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2處理的線粒體形態(tài)改變，之后表現(xiàn)為細(xì)胞程序死亡的經(jīng)典的形態(tài)學(xué)指征包括核濃縮和破碎。
如實(shí)施例3所示，HPP-1肽CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2在體內(nèi)也具有活性。如圖4a和4b所示，用HPP-1處理攜帶人MDA-MD-435乳腺癌異種移植體的裸鼠。與對(duì)照組相比，用HPP-1處理的動(dòng)物組中腫瘤體積平均較小，而且存活時(shí)間較長。另外，一些經(jīng)HPP-1處理的小鼠比對(duì)照小鼠的存活時(shí)間長幾個(gè)月，表示原發(fā)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移均被抑制?；趯?duì)腫瘤的組織病理學(xué)分析，腫瘤結(jié)構(gòu)的破壞和廣泛的細(xì)胞死亡很明顯，大約50％的細(xì)胞程序死亡。HPP-1對(duì)衍生自人黑素瘤細(xì)胞系C8161的腫瘤也有抵抗作用；ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2對(duì)MDA-MD-435乳腺癌腫瘤有抵抗作用?？偠灾?，這些結(jié)果表明基于腫瘤歸巢分子和抗微生物肽序列的歸巢促細(xì)胞程序死亡肽，在真核細(xì)胞外可以是無毒性的，但當(dāng)被定向的真核靶細(xì)胞內(nèi)在化時(shí)，可以促進(jìn)線粒體膜破壞及相繼的細(xì)胞死亡。歸巢促細(xì)胞程序死亡肽如HPP-1，其對(duì)血管生成內(nèi)皮尋細(xì)胞具有選擇性毒性，對(duì)抗癌治療具有特殊價(jià)值。
本發(fā)明揭示的其它結(jié)果示出視網(wǎng)膜新血管化可以被本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物選擇性抑制。特別地，用歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2處理的小鼠中視網(wǎng)膜新血管數(shù)目，比對(duì)照水平降低30-40％(見圖5)。因此，本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物可以含有一種腫瘤歸巢分子，或可以含有另一種分子，其選擇性歸巢選擇的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織。
本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物特征在于對(duì)將其內(nèi)在化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有高毒性。如本文所用術(shù)語“高毒性”是指綴合物在導(dǎo)致所選擇的細(xì)胞或組織的細(xì)胞死亡中的相對(duì)作用力。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可以使用各種熟知的細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)分析毒性。通常地，術(shù)語高毒性是指一種綴合物，其中半數(shù)致死量(LC50)濃度低于大約100uM，優(yōu)選低于大約50uM。例如，如本發(fā)明所揭示，歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物HPP-1的特征在于對(duì)血管增殖和索形成DMEM細(xì)胞及KS1767而言，LC50分別為51，34和42。另外，用本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物處理的攜帶腫瘤的小鼠的存活力延表明選擇性毒性可以在體內(nèi)再生。
如本發(fā)明所用術(shù)語“抗微生物肽”是指具有抗微生物活性的一種天然發(fā)生的或合成的肽，其具有殺死或減緩一或多種微生物生長的能力。一種抗微生物肽可以例如殺死或減緩一或多種細(xì)菌菌株生長，包括革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌，或真菌或原生動(dòng)物。因此，抗微生物肽可以具有例如抑菌或殺菌活性，抵抗例如大腸桿菌，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一或多種菌株。雖然不期望受以下理論的限制，抗微生物肽可以由于通過自身聚集形成穿經(jīng)雙分子層膜的離子通道的能力而具有生物活性。
抗微生物肽是典型高堿性的，并可以具有線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。如下所述，抗微生物肽可以具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)(見美國專利5789542；Javadpour等，如前，1996；Blondelle和Houghten，如前，1992)所述?？刮⑸镫囊部梢允抢绂伶?片層形成肽，如Mancheno等，J.Peptide Res.51142-148(1998)所述。
抗微生物肽可以是天然發(fā)生的或合成的肽。天然發(fā)生的抗微生物肽已經(jīng)分離自生物學(xué)原料如細(xì)菌，昆蟲，兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物并認(rèn)為代表可誘導(dǎo)的防御蛋白，保護(hù)宿主機(jī)體免于細(xì)菌感染。天然發(fā)生的抗微生物肽包括短桿菌肽，爪蟾抗菌肽，蜂毒肽，防衛(wèi)素和殺菌肽(見例如Maloy和Kari，生物聚合物37105-122(1995)；Alvarez-Bravo等，生物化學(xué)雜志302535-538(1994)；Bessalle等，F(xiàn)EBS 274151-155(1990)；及Blondelle和Houghten在Bristol編輯的醫(yī)用化學(xué)年鑒，p159-168，科學(xué)出版社，San Diego，所述文獻(xiàn)在此均并入?yún)⒖?。如以下進(jìn)一步揭示，抗微生物肽也可以是天然肽的類似物，尤其是其保留或增強(qiáng)兩親性。
摻入本發(fā)明歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物的抗微生物肽，當(dāng)不與腫瘤歸巢分子連接時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有低毒性。對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性可易于使用常規(guī)方法確定。例如對(duì)哺乳動(dòng)物毒性可以通過在體外人體紅細(xì)胞的裂解加以分析，例如Javadpour等，如前，1996所述。具有“低哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性”的抗微生物肽是指不裂解人體紅細(xì)胞或需要高于100uM的裂解活性濃度，優(yōu)選高于200，300，5000或1000uM濃度。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其中抗微生物肽部分當(dāng)被真核細(xì)胞內(nèi)在化時(shí)，促進(jìn)線粒體膜破壞。特別地，相比之下這種抗微生物肽優(yōu)先破壞線粒體膜而非真核細(xì)胞膜。線粒體膜，與細(xì)菌膜一樣但與真核胞質(zhì)膜相反，具有高含量負(fù)電荷磷脂。可以使用例如線粒體溶脹分析(如實(shí)施例1所述)或其它本領(lǐng)域熟知的方法分析抗微生物肽在破壞線粒體膜中的活性。如本發(fā)明所揭示例如D(KLAKLAK)2在10uM濃度誘導(dǎo)明顯的線粒體溶脹，明顯低于殺死真核細(xì)胞所需的濃度。在例如50uM，40uM，30uM，20uM，10uM，或更低濃度誘導(dǎo)明顯線粒體溶脹的抗微生物肽，認(rèn)為是促進(jìn)線粒體膜破壞的肽。
本發(fā)明還提供了一種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其中腫瘤歸巢分子連接于具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的抗微生物肽。在本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中，抗微生物肽部分可以具有例如序列(KLAKLAK)2(SEQ ID NO200)；(KLAKKLA)2(SEQ ID NO201)；(KAAKKAA)2(SEQ ID NO202)；或(KLGKKLG)3(SEQ IDNO203)，尤其序列D(KLAKLAK)2。本發(fā)明的促細(xì)胞程序死亡綴合物可以具有例如序列CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2或ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2。
抗微生物肽通常在稀釋的水相溶液中具有隨機(jī)卷曲構(gòu)象，而高水平螺旋可以通過促螺旋溶劑和兩親性培養(yǎng)基如微膠粒，合成的雙分子層或細(xì)胞膜誘導(dǎo)。本領(lǐng)域熟知α螺旋結(jié)構(gòu)，理想的α螺旋特征在于每個(gè)轉(zhuǎn)角具有3.6個(gè)殘基，及每個(gè)殘基翻譯1.5_(5.4每個(gè)轉(zhuǎn)角；見Creighton，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子學(xué)性質(zhì)，W.H Freeman，New York(1984))。在兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)中，極性和非極性氨基酸殘基排列為兩親性螺旋，這是一種α螺旋，當(dāng)只觀察肽的螺旋軸時(shí)，其中疏水性氨基酸殘基集中在一面，親水性氨基酸殘基集中在相對(duì)的那一面。
已經(jīng)分離了多種具有不同序列的抗微生物肽，共同特點(diǎn)是呈現(xiàn)一個(gè)兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)(Saberwal等，生物化學(xué)生物生理學(xué)綜述1197109-131(1994))。推測由于氨基酸取代形成的兩親性和螺旋性增強(qiáng)的天然肽的類似物，典型地具有增強(qiáng)的抗微生物活性。通常地，具有抗微生物活性增強(qiáng)的類似物，其抗哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞毒性也提高(Maloy等，生物聚合物37105-122(1995))。
關(guān)于抗微生物肽所用的術(shù)語“兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)”，是指一種α螺旋，其疏水性一面在生理pH含有一些極性殘基，親水性一面含有非極性殘基。極性殘基可以是例如賴氨酸殘基或精氨酸殘基，而非極性殘基可以是例如亮氨酸或丙氨酸殘基。具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的抗微生物肽在兩親性結(jié)構(gòu)域中具有相同數(shù)目的極性和非極性殘基，和足夠數(shù)目的堿性殘基，以使肽在中性pH中全部是正電荷(Saberwal等，生物化學(xué)生物生理學(xué)綜述1197109-131(1994)，在此并入?yún)⒖?。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解在本發(fā)明的兩親性肽中包含促進(jìn)螺旋的氨基酸如亮氨酸和丙氨酸是有利的(見例如Creighton如前，1984)。
本領(lǐng)域熟知具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的各種抗微生物肽。這種肽包括基于7體模塊模式(heptad building block scheme)的合成的最低限要求的肽，其中重復(fù)的7體模塊由重復(fù)的三聚體和一另外的殘基組成。這種合成的抗微生物肽包括例如通式為[(X1X2X2)(X1X2X2)X1]n(SEQ ID NO205)或[(XiX2X2)X1(X1X2X2)]n(SEQ ID NO206)的肽，其中X1是極性殘基，X2是非極性殘基；n是2或3(見Javadpour等，如前，1996)。例如(KLAKLAK)2(SEQ IDNO200)；(KLAKKLA)2(SEQ ID NO201)；(KAAKKAA)2(SEQ ID NO202)；和(KLGKKLG)3(SEQ ID NO203)是具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的合成的抗微生物肽。本領(lǐng)域也已知具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的相似的合成的抗微生物肽，例如McLaughlin和Becker的美國專利No.5789542所述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于確定螺旋性，例如使用圓二色譜學(xué)確定。在222nm測定摩爾橢圓率后，可以測定α螺旋性的百分率，如Javadpour等，如前，1996所述(也見于McLean等，生物化學(xué)3031-37(1991)所述，在此將其并入?yún)⒖?。當(dāng)在兩親性介質(zhì)如25mM SDS中分析時(shí)，本發(fā)明的兩親性α螺旋抗微生物肽可以具有例如至少大約20％的螺旋性。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這種具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的抗微生物肽當(dāng)在25mM SDS中分析時(shí)，可以具有例如至少大約25％，30％，35％或40％螺旋性。具有α螺旋結(jié)構(gòu)的抗微生物肽當(dāng)在25mMSDS中分析時(shí)，可以具有例如25％-90％螺旋性；25％-60％螺旋性；25％-50％螺旋性；25％-40％螺旋性；30％-90％螺旋性；30％-60％螺旋性；30％-50％螺旋性；40％-90％螺旋性或40％-60％螺旋性。兩親性可易于確定，例如使用代表肽的螺旋輪確定(見例如Blondelle和Houghten，如前，1994所述)。
本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2的結(jié)構(gòu)示于

圖1。從圖1中可以看出，歸巢結(jié)構(gòu)域CNGRC(SEQ ID NO8)是一種二硫鍵環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并通過甘氨酸-甘氨酸橋連偶聯(lián)于膜破壞結(jié)構(gòu)域D(KLAKLAKKLAKLAK)。綴合物的膜破壞抗微生物部分中的D-氨基酸，可以用于賦予綴合物以提高的體內(nèi)穩(wěn)定性。另外，膜破壞性D(KLAKLAKKLAKLAK)部分，形成一種兩親性螺旋。尤其地，賴氨酸殘基排列在螺旋的一面(以螺旋的黑暗區(qū)域示出)，而非極性亮氨酸和丙氨酸殘基排列在相對(duì)的那一面(螺旋的亮區(qū))。
本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物可以是一種嵌合肽，其中腫瘤歸巢分子是腫瘤歸巢肽。本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡嵌合肽可以具有各種長度，從大約18個(gè)氨基酸至大約50個(gè)氨基酸或更多。本發(fā)明的嵌合肽可以例如具有大約20-50個(gè)氨基酸，優(yōu)選20-40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選20-30個(gè)氨基酸。這種嵌合肽可以例如具有最多40，35，30，27，25或21個(gè)氨基酸。本發(fā)明的嵌合肽可以是線性的或環(huán)狀的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡嵌合肽包括一種環(huán)狀的腫瘤歸巢肽部分。
本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡嵌合肽也可以是肽模擬物。本文所用術(shù)語“肽模擬物”廣泛用于指一種類肽分子，其基本具有相應(yīng)肽的活性。肽模擬物包括化學(xué)修飾的肽，含有非天然發(fā)生的氨基酸的類肽分子等，具有從中衍生肽模擬物的肽的選擇性歸巢活性和高毒性(見例如Burger′s，醫(yī)用化學(xué)和藥物揭示，第5版，1-3卷((ed.M.E.Wolff；Wiley Interscience 1995)，將其在此并入?yún)⒖?。例如，在本發(fā)明的嵌合肽的抗微生物肽部分內(nèi)包含D氨基酸可以是有利的(見實(shí)施例1和2所述)。肽模擬物提供了各種比所述肽更好的優(yōu)點(diǎn)，包括在通過消化管期間穩(wěn)定性提高，并因此可利于用作口服治療劑。
在本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中，“偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域”可以用于連接腫瘤歸巢肽和抗微生物肽，并可以例如使完整綴合物具有機(jī)動(dòng)性。偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域可以是例如甘氨酸-甘氨酸接頭，丙氨酸-丙氨酸接頭，或其它摻入甘氨酸，丙氨酸或其它氨基酸的接頭。甘氨酸-甘氨酸偶聯(lián)結(jié)構(gòu)域的使用見實(shí)施例2所述。
腫瘤內(nèi)的血管通常經(jīng)過激活血管生成，導(dǎo)致新血管持續(xù)形成以支持腫瘤生長。這種血管生成性血管與成熟的血管不同，血管生成性血管表現(xiàn)為獨(dú)特的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記，包括αvβ3整聯(lián)蛋白(Brooks，細(xì)胞791157-1164(1994)；WO 95/14714，Int.Filing Date November22，1994)和血管生成生長因子的受體(Mustonen和Alitalo，細(xì)胞生物學(xué)雜志129895-898(1995)；Lappi，Semin.癌癥生物學(xué)6279-288(1995))。另外，腫瘤血管與其它血管從組織學(xué)方面可以區(qū)別，腫瘤血管是有孔的(Folkman，自然醫(yī)學(xué)127-31(1995)；Rak等，抗癌藥物63-18(1995))。因此，腫瘤血管的獨(dú)特性質(zhì)使其成為對(duì)抗癌治療劑特別有吸引力的靶。
如本發(fā)明所揭示，腫瘤歸巢分子可以結(jié)合腫瘤小血管的內(nèi)皮細(xì)胞系。腫瘤內(nèi)的血管是獨(dú)特的，據(jù)推測由于持續(xù)的新血管化，形成腫瘤生長所需的新血管。腫瘤內(nèi)血管生成性新血管的獨(dú)特性質(zhì)是通過內(nèi)皮細(xì)胞及周圍細(xì)胞內(nèi)存在特殊標(biāo)記而反映出來的(Folkman，自然生物技術(shù)15510(1997)；Risau，F(xiàn)ASEB雜志9926-933(1995)；Brooks等，如前，1994)；這些標(biāo)記很可能被所揭示的腫瘤歸巢分子所定向。
腫瘤歸巢分子定向腫瘤內(nèi)血管的能力，為全身治療腫瘤或直接定向腫瘤細(xì)胞的治療方法提供了有益的幫助。例如，腫瘤細(xì)胞基于血管供養(yǎng)而存活，及血管的內(nèi)皮細(xì)胞系易于進(jìn)行循環(huán)探查。相反，為到達(dá)固體腫瘤細(xì)胞，治療劑必須克服潛在的遠(yuǎn)距離擴(kuò)散，緊密包裹腫瘤細(xì)胞，以及具有高間質(zhì)壓力阻止溢出的密集的纖維基質(zhì)(Burrows and Thorpe，Pharmacol.Ther.64155-174(1994))。
另外，當(dāng)定向于腫瘤血管時(shí)，可以不需要?dú)⑺廊康陌屑?xì)胞，因?yàn)閮?nèi)皮的部分裸露可導(dǎo)致阻塞性血栓形成，阻止血液流向全部的腫瘤血管(Burrows和Thorpe，如前，1994)。另外，與直接定向腫瘤不同，在腫瘤血管定向中存在一個(gè)固有的擴(kuò)增機(jī)制。一條單一的毛細(xì)管可供養(yǎng)最多100個(gè)腫瘤細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞均是主要依賴于血液供養(yǎng)(Denekamp，Cancer Metast.Rev.9267-282(1990)；Folkman，如前，1997)。
如上所述及在此所例證的，選擇性歸巢腫瘤血管的血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤歸巢分子，可以特別用于將促細(xì)胞程序死亡抗微生物肽定向于腫瘤血管，同時(shí)降低促細(xì)胞程序死亡抗微生物肽對(duì)正常的健康器官或組織具有毒性作用的可能性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其包括與抗微生物肽連接的一種選擇性歸巢血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤歸巢分子，綴合物被血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞選擇性內(nèi)在化，并呈現(xiàn)對(duì)其具有高毒性，而當(dāng)抗微生物肽不與腫瘤歸巢分子連接時(shí)，其對(duì)哺乳動(dòng)物歸巢的毒性較低。
如本文所用術(shù)語“選擇性毒性”是指與導(dǎo)致的細(xì)胞或組織相比，在所選擇的細(xì)胞或組織中細(xì)胞死亡增強(qiáng)。通常地，選擇性毒性特征在于與對(duì)照的細(xì)胞或組織如抑制血管發(fā)生(angiostatic)的內(nèi)皮細(xì)胞相比，在選擇的細(xì)胞或組織如血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞中，細(xì)胞死亡程度高至少兩倍。因此如本文所用術(shù)語選擇性毒性涵蓋了比毒性，從而細(xì)胞死亡基本只發(fā)生在所選擇的細(xì)胞或組織中，以及毒性只針對(duì)除了選擇的細(xì)胞或組織之外限量的細(xì)胞或組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)一步了解術(shù)語選擇性毒性指通過所有機(jī)制包括細(xì)胞程序死亡和壞死性細(xì)胞死亡所引起的細(xì)胞死亡。因此，對(duì)血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)選擇性毒性的本發(fā)明歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，相比之下可以增強(qiáng)血管生成內(nèi)皮細(xì)胞死亡而非增強(qiáng)抑制血管發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞或周圍的其它細(xì)胞死亡。
如本發(fā)明所揭示，鑒別的腫瘤歸巢分子用于將與歸巢分子連接的所需的抗微生物肽定向于選擇的細(xì)胞類型如血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞。在被腫瘤血管中的血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)在化之后，抗微生物肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有毒性，從而限制腫瘤的血液供養(yǎng)并抑制腫瘤生長。
用于本發(fā)明歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中的腫瘤歸巢分子，可以是一種肽，其含有例如NGR基序如CNGRC(SEQ ID NO8)；NGRAHA(SEQ ID NO6)或CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)。用于本發(fā)明中的腫瘤歸巢分子還可以含有RGD基序并可以是例如CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)或可以含有GSL基序如肽CGSLVRC(SEQ ID NO5)。其它腫瘤歸巢分子可以通過在體內(nèi)淘選經(jīng)篩選分子文庫而鑒別，如以下詳細(xì)闡述(也見于實(shí)施例4-8所述；1997年4月22日發(fā)布的美國專利No.5622699；及Pasqualini和Ruoslahti，自然380364-366(1996)所述，在此均將其并入?yún)⒖?。
本文所用術(shù)語“腫瘤歸巢分子”是指一種有機(jī)化合物如藥物；一種核酸分子；一種肽或肽模擬物或蛋白質(zhì)，其在體內(nèi)選擇性歸巢于所選擇的細(xì)胞或組織。“選擇性歸巢”是指在體內(nèi)腫瘤歸巢分子優(yōu)先結(jié)合選擇的細(xì)胞或組織，而不是對(duì)照細(xì)胞，組織或器官，而且通常特征在于在選擇的細(xì)胞或組織處的定位比對(duì)照細(xì)胞或組織高至少兩倍。用于本發(fā)明的腫瘤歸巢分子可以例如是一種分子，其優(yōu)先結(jié)合血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞而不是其它細(xì)胞或抑制血管發(fā)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
腫瘤歸巢分子是使用如下所述體內(nèi)淘選方法鑒別的。通過抗乳腺癌，黑素瘤和Kaposi′s肉瘤的體內(nèi)淘選，鑒別表達(dá)選擇性歸巢腫瘤的各科肽的噬菌體(分別見表2，3和4)。由于噬菌體的規(guī)格大(900-1000nm)及循環(huán)時(shí)間短(3-5min)，因此不太可能將噬菌體從循環(huán)系統(tǒng)，尤其在腦和腎臟中除去。組織染色研究表明主要?dú)w巢并結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記的腫瘤歸巢分子，其可能以器官特異性方式表達(dá)。這些結(jié)果表明體內(nèi)淘選可以用于鑒別和分析內(nèi)皮細(xì)胞特異性。這種分析不可能使用培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞趨于喪失其組織特異性差異(Pauli和Lee，實(shí)驗(yàn)研究58379-387(1988))。
盡管在進(jìn)行體內(nèi)淘選的條件下鑒別腫瘤歸巢肽通常結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記，但在腫瘤實(shí)質(zhì)尤其在施用所述肽之后的稍后的時(shí)間，也觀測到特異的存在表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體(實(shí)施例7)。這些結(jié)果表明表達(dá)所述肽的噬菌體可以經(jīng)過腫瘤中的血管，這可能是由于血管的有孔性質(zhì)所致的，并表明體內(nèi)淘選方法可以用于鑒別由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的靶分子，以及由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的靶分子。
基本如Smith和Scott所述構(gòu)建噬菌體肽展示文庫(如前，1993；也見于Koivunen等，生物技術(shù)學(xué)13265-270(1995)；Koivunen等，酶學(xué)方法245346-369(1994b)，在此均將其并入?yún)⒖?。編碼基本具有隨機(jī)氨基酸序列的肽的寡核苷酸是基于“NNK”密碼子合成的，其中N是A，T，C或G，K是G或T?！錘NK″編碼32個(gè)三鏈體，其編碼20個(gè)氨基酸和一個(gè)琥珀終止密碼子(Scott和Smith如前，1990)。在一些文庫中，每個(gè)寡核苷酸中包含至少一個(gè)編碼半胱氨酸密碼子，以可以通過二硫鍵形成環(huán)肽(實(shí)施例4)。將此寡核苷酸插入載體，與編碼基因III(gIII)蛋白的序列同框，由此表達(dá)肽-gIII融合蛋白。在表達(dá)之后，融合蛋白在含有載體的噬菌體表面表達(dá)(Koivunen等，如前，1994b；Smith和Scott，如前，1993)。
在體內(nèi)淘選之后，基于其選擇性歸巢人乳腺癌，小鼠黑素瘤或人Kaposi′s肉瘤的能力分離的噬菌體，展示只有少量不同的肽序列(分別見表2，3和4)。一種篩選揭示了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)整聯(lián)蛋白識(shí)別序列的肽序列(Ruoslahti，Ann.Rev.CellDevel.Biol.12697(1996))，一種預(yù)先證實(shí)選擇性結(jié)合含有αv的整聯(lián)蛋白的肽(Koivunen等，如前，1995；WO 95/14714)。大多數(shù)剩余的腫瘤歸巢肽的序列不顯示與內(nèi)皮細(xì)胞受體的已知配體有任何明顯的相似性。然而有一種腫瘤歸巢肽含有天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)基序，其是弱整聯(lián)蛋白結(jié)合基序，類似于整聯(lián)蛋白結(jié)合肽中存在的基序(Ruoslahti等，1996年7月16日公布的美國專利N0.5536814，在此并入?yún)⒖?；也見于Koivunen等，如前，1994a)。其它篩選已經(jīng)揭示了許多含有NGR的肽(見表2)。盡管NGR肽結(jié)合整聯(lián)蛋白的能力較弱，整聯(lián)蛋白受體可以不是由在此例證的NGR腫瘤歸巢肽識(shí)別的靶分子。所用術(shù)語“整聯(lián)蛋白”是指一種異源二聚體細(xì)胞表面粘著受體。
由噬菌體表達(dá)的歸巢乳腺癌的肽包括肽CGRECPRLCQSSC(SEQ ID NO2)和CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3；見表2；實(shí)施例4)。相似的，腫瘤歸巢肽，包括肽CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)和CGSLVRC(SEQ ID NO5)，是從施用于攜帶乳腺癌的小鼠的兩個(gè)其它噬菌體文庫中鑒別的(表2)。這些基序中有一些基序以及新的基序，也是通過篩選抗小鼠黑素瘤和人Kaposi′s肉瘤而分離的(見表3和4)。這些經(jīng)過表明腫瘤歸巢分子可以使用體內(nèi)淘選方法鑒別。
鑒別的三個(gè)歸巢腫瘤基序可以特別用于本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中。，其中腫瘤歸巢分子部分含有NGR基序，RGD基序或GSL基序的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物可以用于將連接的抗微生物肽定向于血管生成性血管內(nèi)皮細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其包括一種含有NGR序列的腫瘤歸巢肽，其連接于一種抗微生物肽。在本發(fā)明的這種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中，腫瘤歸巢肽可以是例如CNGRC(SEQ ID NO8)；NGRAHA(SEQ ID NO6)或CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物包括序列CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其包括一種含有RGD序列的腫瘤歸巢肽，其連接于一種抗微生物肽。在這種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中，腫瘤歸巢肽可以是例如CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物包括序列ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2。
本發(fā)明另外提供了一種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其包括一種含有GSL序列的腫瘤歸巢肽，其連接于一種抗微生物肽。在這種歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中，腫瘤歸巢肽可以是例如CGSLVRC(SEQ ID NO5)。
如上所述，一個(gè)基序含有包埋于肽結(jié)構(gòu)CDCRGDCFC(SEQ IDNO1)中的RGD序列(Ruoslahti，如前，1996)，已知其選擇性結(jié)合αv整聯(lián)蛋白(Koivunen等，如前，1995；WO 95/14714)。由于αvβ3和αvβ3整聯(lián)蛋白均是血管生成性血管的標(biāo)記物(Brooks等，如前，1994；Friedlander等，科學(xué)2701500(1995))，對(duì)表達(dá)肽CDCRGDCFC(SEQID NO1)的噬菌體檢測定向腫瘤情況，如本發(fā)明所揭示，其以高選擇性方式歸巢腫瘤(見實(shí)施例6)。另外，由CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)噬菌體進(jìn)行的歸巢，通過聯(lián)合施用游離CDCRGDCFC(SEQ IDNO1)肽而抑制。
另一種歸巢乳腺腫瘤的肽具有序列CNGRCVSGCAGRC(SEQID NO3)，其含有預(yù)先已知具有弱整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的NGR基序(Koivunen等，生物化學(xué)雜志26820205-20210(1993)；Koivunen等，如前，1994a；WO 95/14714)。由于鑒別了一種含有NGR的肽，對(duì)兩種均含有NGR基序的其它肽，線性肽NGRAHA(SEQ ID NO6)和環(huán)狀肽CVLNGRMEC(SEQ ID NO7)進(jìn)行檢測其歸巢腫瘤情況。與表達(dá)CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)的噬菌體一樣，表達(dá)NGRAHA(SEQ ID NO6)或CVLNGRMEC(SEQ ID NO7)的噬菌體歸巢腫瘤。另外，歸巢腫瘤不是依賴于腫瘤類型或物種，因?yàn)槭删w選擇性積聚在人乳腺癌以及攜帶小鼠黑素瘤的小鼠和攜帶人Kaposi′s肉瘤異種移植體的小鼠的腫瘤中。
有許多肽包括含有RGD和NGR的肽，結(jié)合腫瘤血管。最小的環(huán)狀NGR肽CNGRC(SEQ ID NO8)是基于CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)序列合成的。當(dāng)CNGRC(SEQ ID NO8)肽與表達(dá)CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)，NGRAHA(SEQ ID NO6)或CVLNGRMEC(SEQ ID NO7)的噬菌體共同注射時(shí)，噬菌體在乳腺癌異種移植體中的積聚受抑制。然而，甚至當(dāng)以比抑制NGR噬菌體歸巢的劑量高10倍的數(shù)量施用時(shí)，CNGRC(SEQ ID NO8)肽也不抑制表達(dá)CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)肽的噬菌體的歸巢。相比之下，CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)肽部分抑制NGR噬菌體的歸巢，雖然需要的數(shù)量是CNGRC(SEQ ID NO8)肽的5-10倍。這些結(jié)果表明NGR肽和RGD肽在腫瘤血管中結(jié)合不同的受體位點(diǎn)。
第三種基序GSL(甘氨酸-絲氨酸-亮氨酸)，也是在對(duì)攜帶乳腺癌，惡性黑素瘤或Kaposi′s肉瘤的小鼠中進(jìn)行體內(nèi)淘選后鑒別的。表達(dá)GSL肽CGSLVRC(SEQ ID NO5)的噬菌體的歸巢，通過共同施用游離CGSLVRC(SEQ ID NO5)肽而受到抑制。與RGD和NGR肽一樣，表達(dá)GSL肽的噬菌體也結(jié)合腫瘤血管。鑒于存在于腫瘤歸巢肽中的保守的RGD，NGR和GSL基序的鑒別，應(yīng)意識(shí)到含有這些基序的肽可以用作腫瘤歸巢肽，并特別可以形成歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其可以選擇性將抗微生物肽輸送至腫瘤。
構(gòu)建含有最多13個(gè)氨基酸的各種肽文庫，通過在體內(nèi)淘選抗乳腺腫瘤肽而獲得NGR肽CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)。通過篩選一個(gè)隨機(jī)肽文庫獲得的這種NGR肽，是一種腫瘤歸巢肽。另外，當(dāng)基于通式CXXXNGRXX(SEQ ID NO13)或CXXCNGRCX(SEQ ID NO14)構(gòu)建肽文庫，且所述序列均有偏于NGR序列，并用于體內(nèi)淘選抗乳腺腫瘤時(shí)，可以獲得許多NGR肽(見表2)。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的腫瘤歸巢分子可以包含RGD或NGR或GSL氨基酸序列。這種腫瘤歸巢分子可以是小如5個(gè)氨基酸的肽如CNGRC(SEQ ID NO8)。這種腫瘤歸巢肽的長度可以不僅是至少13個(gè)氨基酸，這是所例舉的最大的肽，但也可以是達(dá)到所需的20個(gè)氨基酸，或30個(gè)氨基酸，或50-100個(gè)氨基酸。本發(fā)明的腫瘤歸巢肽通常是通過常規(guī)合成方法產(chǎn)生的。
通過使噬菌體循環(huán)大約4分鐘，隨后通過心臟灌注到小鼠體內(nèi)，對(duì)比組織染色，或在注射噬菌體后24小時(shí)分析組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。在施用24小時(shí)后，在循環(huán)中基本沒有噬菌體殘留，并因此不需灌注(Pasqualini等，如前，1997)。在腫瘤血管中觀測到明顯的噬菌體染色，但在正常內(nèi)皮細(xì)胞中，在施用CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO3)噬菌體后4分鐘檢測的樣品中(實(shí)施例7)，沒有染色。相比之下，腫瘤染色在24小時(shí)很明顯，并表現(xiàn)為從血管之外播散至腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)。NGRAHA(SEQ ID NO6)和CVLNGRMEC(SEQID NO7)噬菌體示出相似的染色模式(實(shí)施例7)。相反，對(duì)照器官和組織示出很少的或沒有免疫染色，證實(shí)NGR基序?qū)δ[瘤血管的特異性。然而，脾和肝正如所預(yù)期那樣捕獲噬菌體，因?yàn)楸痪W(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)吸收是噬菌體顆粒的通性，不依賴于由噬菌體表達(dá)的肽存在與否(Pasqualini等，如前，1997)。
在施用表達(dá)含有GSL基序的肽CLSGSLSC(SEQ ID NO4)的噬菌體后，也可以觀測到免疫染色，而且與NGR肽一樣，在這種情況中定位于黑素瘤內(nèi)的血管(見以下所述；也見于實(shí)施例7和8所述)。相似的，在將表達(dá)含有RGD基序的肽CDCRGDCFC(SEQ IDNO1)的噬菌體施用于攜帶乳腺腫瘤的小鼠后，免疫染色定位于腫瘤內(nèi)的血管，但在腦，腎或各種其它非腫瘤組織中未觀測到染色(見實(shí)施例6和7；也見于Pasqualini等，如前，1997)。這些結(jié)果表明各種腫瘤歸巢肽通常歸巢于腫瘤的血管。
體內(nèi)淘選方法在鑒別腫瘤歸巢分子中的普遍適應(yīng)性，是通過將表達(dá)不同群體肽的噬菌體注射至攜帶同系黑素瘤的小鼠而加以檢測(實(shí)施例8)。為進(jìn)行這些研究選擇B16小鼠黑素瘤模型，因?yàn)檫@樣的腫瘤是高血管化的，而且這種腫瘤細(xì)胞系的生物學(xué)特點(diǎn)已經(jīng)充分定性。(見Miner等，癌癥研究424631-4638(1982))。另外，由于B16黑素瘤細(xì)胞是來源于小鼠的，因此與在正常器官中的分布相比，在宿主和腫瘤歸巢供體之間的種屬差異不影響例如噬菌體在腫瘤中的分布。如本發(fā)明所述，揭示腫瘤歸巢肽，包括例如含有GSL基序的肽的體內(nèi)抗B16黑素瘤細(xì)胞的淘選，及施用抗噬菌體抗體對(duì)腫瘤和其它器官進(jìn)行的免疫染色表明，表達(dá)CLSGSLSC(SEQ ID NO4)的噬菌體在黑素瘤中產(chǎn)生免疫染色，但在皮膚，腎或其它對(duì)照器官中基本無染色(實(shí)施例8)。染色模式通常在黑素瘤內(nèi)的血管，但非只限于血管。
盡管在小鼠中進(jìn)行了體內(nèi)淘選，但腫瘤歸巢分子如包含NGR，RGD或GSL基序的肽也似乎可以定向人體血管。NGR噬菌體結(jié)合移植的人乳腺腫瘤中的血管，但不結(jié)合正常組織中的血管，表明這個(gè)基序可以特別用于定向患者體內(nèi)的腫瘤。CDCRGDCFC(SEQ IDNO1)肽結(jié)合人αv整聯(lián)蛋白(Koivunen等，如前，1995)，其選擇性在患者的腫瘤血管中表達(dá)(Max等，Int.J.Cancer 71320(1997)；Maxet al.，Int.J.Cancer 72706(1 997))。使用其中CDCRGDCFC(SEQ IDNO1)連接于抗微生物肽的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，提供了另外的優(yōu)勢，即由于乳腺癌細(xì)胞例如可以表達(dá)αvβ3整聯(lián)蛋白，抗微生物肽可以自身定向于腫瘤細(xì)胞(Pasqualini等，如前，1997)。事實(shí)上，許多人體腫瘤表達(dá)這種整聯(lián)蛋白，其可以參與一些腫瘤如惡性黑素瘤的進(jìn)展(Albelda等，癌癥研究506757-6764(1990)；Danen等，Int.J.Cancer 61491-496(1995)；Felding-Habermann等，J.Clin.Invest.892018-2022(1992)；Sanders等，Cold Spring Harb.Symp.Ouant.Biol.58233-240(1992)；Mitjans等，J.Cell.Sci.1083067-3078(1995))。與CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)肽不同，NGR肽表現(xiàn)為不結(jié)合MDA-MD-435乳腺癌細(xì)胞。然而，NGR肽能將治療有效量的阿霉素輸送于乳腺腫瘤，表示即使腫瘤歸巢分子只歸巢腫瘤血管，即不直接歸巢腫瘤細(xì)胞，這種血管定向已經(jīng)足以賦予與分子連接的基序的作用。
由于αvβ3整聯(lián)蛋白是由血管生成性血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的，因此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定經(jīng)歷血管發(fā)生的腫瘤血管是否可以在體內(nèi)使用所述方法定向。將表達(dá)已知結(jié)合αvβ3整聯(lián)蛋白的肽CDCRGDCFC(SEQID NO1；見Koivunen等，如前，1995)的噬菌體，注射入攜帶腫瘤的小鼠體內(nèi)，小鼠攜帶的腫瘤是從人體乳腺癌細(xì)胞，小鼠黑素瘤細(xì)胞或人Kaposi′s肉瘤細(xì)胞中形成的(見實(shí)施例7)。CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)噬菌體選擇性歸巢每種腫瘤，而這種歸巢用對(duì)照噬菌體不發(fā)生。例如，在攜帶通過移植人乳腺癌細(xì)胞而形成的腫瘤的小鼠中，與未選擇的對(duì)照噬菌體相對(duì)比，CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)噬菌體在腫瘤中積聚20-80倍。
噬菌體的組織染色示出CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)噬菌體在腫瘤內(nèi)的血管中積聚，而在腦，腎或其它對(duì)照器官中未觀測到染色。CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)噬菌體的歸巢特異性，可以通過競爭實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其中，聯(lián)合注射游離CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)肽明顯降低RGD噬菌體的腫瘤歸巢，而聯(lián)合注射不含有RGD的對(duì)照肽，對(duì)RGD噬菌體的歸巢沒有作用(見實(shí)施例6)。這些結(jié)果表明αvβ3定向分子是在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的腔表面上表達(dá)，而且結(jié)合含有αv的整聯(lián)蛋白的肽可以選擇性結(jié)合這個(gè)整聯(lián)蛋白，并因此選擇性結(jié)合經(jīng)過血管發(fā)生的血管。
這些研究結(jié)果表明腫瘤歸巢分子可以通過體內(nèi)淘選鑒別，而且在一些情況中，腫瘤歸巢分子可以歸巢腫瘤中的血管組織以及腫瘤實(shí)質(zhì)，可能是由于血管上有孔使噬菌體易于從循環(huán)系統(tǒng)中透出。由于這種腫瘤歸巢分子的歸巢腫瘤的能力，這種分子用于將連接的抗微生物肽定向于腫瘤。因此，本發(fā)明提供了一種綴合物，這種綴合物包含與一種基序連接的一種腫瘤歸巢分子，可以用于將所述基序定向于腫瘤細(xì)胞。
分子歸巢于一種特殊的腫瘤以選擇性歸巢另一種相同或相似組織學(xué)類型的腫瘤的能力，可以使用例如在裸鼠中生長的人體腫瘤或生長于同系小鼠中的小鼠腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定。例如，各種人乳腺癌細(xì)胞系，包括MDA-MB-435乳腺癌(Price等，癌癥研究50717-721(1990))，SKBR-1-II和SK-BR-3(Fogh等，J.Natl.Cancer Inst.59221-226(1975))，及小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞系，包括EMT6(Rosen等，Int.J.Cancer 57706-714(1994))和C3-L5(Lala和Parhar，Int.J.Cancer 54677-684(1993))，是易于獲得的，并通常用作人體乳腺癌的模型。使用這種乳腺腫瘤模型，例如可以獲得關(guān)于鑒別的乳腺腫瘤歸巢分子多不同的乳腺腫瘤的特異性的信息，而且可以鑒別歸巢廣泛的不同乳腺腫瘤的或提供最有利特異性的分子。另外，這種分析可以產(chǎn)生新的信息，例如關(guān)于腫瘤基質(zhì)的信息，因?yàn)榛|(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)與內(nèi)皮細(xì)胞一樣，可以通過腫瘤以不能再生的方式修飾。
分子如肽或蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤的選擇性歸巢，可以歸因于肽對(duì)腫瘤細(xì)胞是存在的特定細(xì)胞靶分子如細(xì)胞表面受體的的特殊識(shí)別。細(xì)胞的選擇性依賴于特定的靶分子，所述分子只由一種或少量不同類型的細(xì)胞表達(dá)，這樣所述分子開始?xì)w巢于腫瘤。如上所述，鑒別的腫瘤歸巢肽，至少部分可識(shí)別腫瘤血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記。然而，大多數(shù)細(xì)胞，尤其與器官或組織不同的細(xì)胞，可以表達(dá)不同的靶分子。因此，體內(nèi)淘選可以用于鑒別這樣的分子，其選擇性歸巢于特定類型的腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞；特異性歸巢可以通過進(jìn)行適當(dāng)?shù)母偁幏治鲎C實(shí)。
如本文所述術(shù)語“腫瘤”是指一種細(xì)胞團(tuán)，其特征在于至少部分含有血管生成性血管。所用術(shù)語“腫瘤”廣泛性包括腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及供養(yǎng)其的基質(zhì)，包括可以滲透腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞團(tuán)的血管生成性血管。盡管腫瘤通常是惡性腫瘤即“癌”，但腫瘤也可以是非惡性腫瘤，導(dǎo)致與腫瘤血管的新血管化。術(shù)語“正常的”或“非腫瘤”組織是指不是腫瘤的組織。如本文所揭示，腫瘤歸巢分子可以基于其歸巢腫瘤而不歸巢于相應(yīng)的非腫瘤組織的能力加以鑒別。
本文所用術(shù)語“相應(yīng)的”，當(dāng)用于指腫瘤或組織或二者時(shí)，是指相同組織學(xué)類型的兩或多個(gè)腫瘤，或兩或多個(gè)組織，或腫瘤和組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到組織的組織學(xué)類型是細(xì)胞包括組織的一種功能。因此，技術(shù)人員意識(shí)到例如相應(yīng)于乳腺腫瘤的非腫瘤組織是正常組織，而相應(yīng)于黑素瘤的非腫瘤組織是皮膚，其含有色素細(xì)胞。另外，針對(duì)本發(fā)明，應(yīng)意識(shí)到腫瘤歸巢分子可以特異性結(jié)合由腫瘤血管表達(dá)的靶分子，其通常含有經(jīng)過新血管化的血管，在這種情況中，相應(yīng)于腫瘤的一種組織包含非腫瘤組織，所述組織含有未經(jīng)歷激活血管生成的血管。
用于本發(fā)明的一種腫瘤歸巢分子，可以通過體內(nèi)淘選方法篩選一種分子文庫而鑒別，如1997年4月22日公布的美國專利No.5,622,699和Pasqualini和Ruoslahti，自然380364-366(1996)所述，意識(shí)文獻(xiàn)均并入?yún)⒖肌１疚乃眯g(shù)語“文庫”普遍是指分子的集合。一個(gè)文庫可以含有少量或大量不同的分子，從大約10個(gè)分子到幾十億個(gè)分子或更多。如果需要，分子可以連接于一個(gè)標(biāo)記，這個(gè)標(biāo)記可以易于回收或鑒別所述分子。
如本文所用術(shù)語“分子”普遍是指一種多聚或非多聚的有機(jī)化合物如藥物；一種核酸分子如RNA，cDNA或寡核苷酸；一種肽，包括所述肽的變體或修飾的肽或類肽分子，在此稱為肽模擬物，其模擬肽的活性；或一種蛋白質(zhì)如一種抗體或一種生長因子受體或其片段如抗體的Fv，F(xiàn)d，或Fab片段，其含有一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。為方便起見，術(shù)語“肽”在此是指肽，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)片段等。分子也可以是非天然發(fā)生的分子，其不是在自然界中發(fā)生的，但可以是通過體外方法產(chǎn)生的，或可以是天然發(fā)生的分子如從一個(gè)cDNA文庫中表達(dá)的蛋白質(zhì)或其片段。
腫瘤歸巢分子也可以是一種肽模擬物。本文所用術(shù)語“肽模擬物”普遍是指一種類肽分子，其具有腫瘤歸巢分子的結(jié)合活性。針對(duì)本發(fā)明的腫瘤歸巢肽，肽模擬物，包括化學(xué)修飾的肽，含有非天然發(fā)生的氨基酸的類肽分子，peptoids等，具有衍生肽模擬物的腫瘤歸巢肽的結(jié)合活性(見例如Burger′s醫(yī)用化學(xué)和藥物開發(fā)，如前，1995)。本領(lǐng)域熟知鑒別肽模擬物的方法，包括例如篩選含有潛在的肽模擬物的文庫。例如，Cambridge Structural Database含有已知具有晶體結(jié)構(gòu)的300,000個(gè)以上化合物(Allen等，Acta Crystallogr.Section B，352331(1979))。這個(gè)結(jié)構(gòu)性數(shù)據(jù)庫不斷地被校正，因?yàn)樾戮w結(jié)構(gòu)不斷測定，而且其可以篩選具有適當(dāng)形狀的化合物，例如與腫瘤歸巢分子相同形狀的化合物，以及潛在的與結(jié)合腫瘤歸巢肽的靶分子在空間和化學(xué)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的化合物。在不能獲得腫瘤歸巢肽或結(jié)合腫瘤歸巢分子的靶分子的晶體結(jié)構(gòu)之處，可以產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)，使用例如CONCORD程序(Rusinko等，J.Chem.Inf.Comput.Sci.29251(1989))。另一種數(shù)據(jù)庫Available Chemicals Directory(Molecular Design Limited，Informations Systems；San Leandro CA)，含有大約100,000種化合物，它們可以商購并也可以研究以鑒別潛在的腫瘤歸巢肽的肽模擬物。
本領(lǐng)域熟知制備含有不同的各種類型分子如肽，類肽(peptoids)，和肽模擬物的文庫的方法，而且可以商購各種文庫(見例如Ecker和Crooke，生物技術(shù)13351-360(1995)，和Blondelle等Trends Anal.Chem.1483-92(1995)；也見于Goodman和Ro，設(shè)計(jì)藥物的肽模擬物，Burger′s醫(yī)用化學(xué)和藥物開發(fā)，第一卷(M.E.Wolff編輯；John Wiley & Sons 1995)，p803-861和Gordon等J.Med.Chem.371385-1401(1994)；以上所述文獻(xiàn)均并入?yún)⒖?。在分子是肽，蛋白質(zhì)或其片段之處，所述分子可以在體外直接產(chǎn)生，或可以從可以在體外產(chǎn)生的核酸中表達(dá)。本領(lǐng)域熟知合成肽和核酸的化學(xué)方法。
分子的文庫也可以這樣產(chǎn)生，例如從收集自細(xì)胞，組織，器官或相應(yīng)有機(jī)體的mRNA中構(gòu)建一個(gè)cDNA表達(dá)文庫。本領(lǐng)域熟知產(chǎn)生這種文庫的方法(見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社出版社1989)，在此將其并入?yún)⒖?。優(yōu)選地，由所述cDNA編碼的肽是在含有所述cDNA的細(xì)胞或病毒表面表達(dá)的。例如，可以將cDNA克隆入一種噬菌體載體如fuse 5(實(shí)施例4)中，其中基于表達(dá)，編碼的肽以融合蛋白形式在噬菌體表面表達(dá)。另外，分子的文庫可以包含核酸分子的文庫，其可以是DNA或RNA或其類似物。核酸分子結(jié)合例如細(xì)胞表面受體是熟知的(見例如O′Connell等，美國科學(xué)院院報(bào)935883-5887(1996)；Tuerk和Gold科學(xué)249505-510(1990)；Gold等，Ann.Rev.Biochem.64763-797(1995)；以上文獻(xiàn)在此均并入?yún)⒖?。因此，可以將核酸分子文庫施用于患有腫瘤的治療個(gè)體，并隨后通過體內(nèi)淘選鑒別腫瘤歸巢分子。如果需要，所述核酸分子可以是核酸類似物，例如是對(duì)核酸酶攻擊的敏感性較低的核酸(見例如Jelinek等，生物化學(xué)3411363-11372(1995)；Latham等，核酸研究222817-2822(1994)；Tam等，核酸研究22977-986(1994)；Reed等，癌癥研究596565-6570(1990)，以上文獻(xiàn)均并入?yún)⒖?。
如本發(fā)明所述，體內(nèi)淘選可以用于鑒別一種腫瘤歸巢分子，其可以連接于抗微生物肽以形成本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡肽。體內(nèi)淘選包含將一種文庫施用于治療個(gè)體，收集腫瘤樣品并鑒別腫瘤歸巢分子。腫瘤歸巢分子可以用本領(lǐng)域熟知的各種方法鑒別。通常地，腫瘤中存在腫瘤歸巢分子是基于文庫中分子共有的一或多種特性，，然后鑒別特定的腫瘤歸巢分子的結(jié)構(gòu)。例如，一種高靈敏檢測方法如質(zhì)譜法，單獨(dú)使用或組合如氣相層析這種方法，可以用于鑒別腫瘤中腫瘤歸巢分子。因此，在文庫包含通?；谟袡C(jī)分子如藥物的結(jié)構(gòu)而不同的分子之處，腫瘤歸巢分子可以通過確定特定分子存在的親代峰值而鑒別。
如果需要，可以收集腫瘤，然后使用如HPLC這樣的方法加工，依賴于例如文庫中包含的分子的共性，可以使一種組分富集在具有限定范圍分子量或極性或非極性特性的分子中。進(jìn)行HPLC的條件依賴于特定分子的化學(xué)性，而且這已經(jīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。相似地，本領(lǐng)域熟知大批除去潛在的干擾細(xì)胞原料如DNA，RNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)或碳水化合物的方法，可以是使用例如選擇性提取方法富集含有一種有機(jī)分子的組分。在文庫包含一群不同的有機(jī)化學(xué)分子之處，每種分子均連接特異的寡核苷酸標(biāo)記，這樣特異的分子可以通過使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)確定寡核苷酸的序列而加以鑒別，從收集的腫瘤樣品中除去基因組DNA，以降低背景PCR的潛力。另外，文庫可以包含一群不同的分子，如有機(jī)化合分子，其均連于一種普通的共有標(biāo)記。基于共有標(biāo)記的存在和性質(zhì)，從腫瘤樣品中可以基本分離出選擇性歸巢腫瘤的文庫分子。這些及其它方法可以用于富集針對(duì)特定的腫瘤歸巢分子收集的腫瘤樣品，從而從收集的腫瘤樣品中除去潛在的污染物，并提高檢測分子的敏感性。
在此提供的跡象表明在體內(nèi)淘選期間有足夠量的腫瘤歸巢分子選擇性歸巢腫瘤，這樣可以易于鑒別所述分子。例如，在腫瘤中鑒別表達(dá)相同肽的各種獨(dú)立的噬菌體，所述腫瘤是從移植的人體乳腺癌細(xì)胞(表2)，小鼠黑素瘤細(xì)胞(表3)或人Kaposi′s肉瘤細(xì)胞(表4)中形成的。
盡管鑒別的腫瘤歸巢分子的一個(gè)基本組分具有相同的結(jié)構(gòu)，但只測定了少數(shù)分離的噬菌體的肽插入體。然而應(yīng)意識(shí)到在對(duì)歸巢器官的分子進(jìn)行體內(nèi)淘選后，已經(jīng)回收了成百上千個(gè)至數(shù)百萬個(gè)表達(dá)歸巢血管肽的分子(見例如美國專利No.5，622,699；Pasqualini和Ruoslahti，如前，1996)。這些結(jié)果表明在體內(nèi)歸巢后，在腫瘤中存在一定數(shù)量的特異性腫瘤歸巢分子，從而提高了鑒別所述分子的便利性。
鑒別腫瘤歸巢分子，尤其未標(biāo)記的分子的便利性，依賴于各種因素，包括存在潛在的污染背景細(xì)胞物。因此，在腫瘤歸巢分子是一種未標(biāo)記的肽的情況下，必須有大量分子歸巢腫瘤，以鑒別抗細(xì)胞蛋白背景的特異性肽。相反，少量未標(biāo)記的有機(jī)化合物歸巢分子如藥物是可以鑒別的，因?yàn)檫@種分子在機(jī)體內(nèi)通常沒有或只有少量。在這種情況下，可以使用高靈敏方法如質(zhì)譜法鑒別腫瘤歸巢分子。技術(shù)人員意識(shí)到鑒別分子的方法部分依賴于特定分子的化學(xué)性。
在腫瘤歸巢分子是一種核酸分子或是用一種核酸分子標(biāo)記的情況下，一種分析如PCR可以特別用于鑒別所述分子的存在，因?yàn)樵瓌t上PCR可以檢測一個(gè)單一核酸分子的存在(見例如Erlich，PCR技術(shù)原理和用于DNA擴(kuò)增(Stockton出版社1989)在此將其并入?yún)⒖?。初步研究表明在將10ng大約600bp質(zhì)粒經(jīng)靜脈內(nèi)注射入小鼠并使其循環(huán)2分鐘后，通過PCR在肺組織樣品中可以檢測到所述質(zhì)粒。這些結(jié)果表明當(dāng)施用于循環(huán)系統(tǒng)中時(shí)，所述核酸分子是足夠穩(wěn)定的，這樣體內(nèi)淘選可以用于鑒別選擇性歸巢腫瘤的核酸分子。對(duì)文庫分子可以進(jìn)行標(biāo)記，這樣可易于回收或鑒別所述分子。如本文所用術(shù)語“標(biāo)記”是指一種物理的，化學(xué)的或生物學(xué)組分，如分別是一種塑料微珠，一種寡核苷酸或一種噬菌體，其連接于一種文庫分子。本領(lǐng)域熟知標(biāo)記分子的方法(Hermanson，生物綴合技術(shù)(科學(xué)出版社，1996)，在此將其并入?yún)⒖?。
一種標(biāo)記，可以是共有標(biāo)記或特異性標(biāo)記，可以用于鑒別歸巢腫瘤的文庫分子的存在和結(jié)構(gòu)。如本文所用術(shù)語“共有標(biāo)記”是指文庫中每個(gè)分子均共有的一種物理的，化學(xué)的或生物學(xué)組分。生物素，例如可以是一種共有標(biāo)記，其連接文庫中的每個(gè)分子。共有標(biāo)記可以用于鑒別樣品中文庫分子的存在與否，并還可以用于從樣品中基本分離所述分子。例如，在共有標(biāo)記是生物素的情況下，文庫中生物素標(biāo)記的分子可以通過與鏈親和素結(jié)合而基本分離，或者其存在可以通過與標(biāo)記的鏈親和素結(jié)合加以鑒別。在文庫是一種噬菌體展示文庫的情況下，表達(dá)肽的噬菌體是另一種共有標(biāo)記，因?yàn)槊總€(gè)文庫肽均連接于噬菌體。另外，肽如血凝素抗原可以是一種共有標(biāo)記，其連接于文庫中的每個(gè)分子，從而可以使用血凝素抗原特異性抗體，以從選擇的腫瘤樣品中基本分離文庫分子。
共有標(biāo)記也可以是一種核酸序列，其可以用于鑒別樣品中文庫分子的存在與否，或從樣品中鑒別分離文庫分子。例如，每種文庫分子均可以連接于同樣的選擇的核苷酸序列，所述核苷酸序列組成共有標(biāo)記。然后，一種含有互補(bǔ)于共有標(biāo)記的核苷酸序列的親和柱，可以用于雜交含有共有標(biāo)記的文庫分子，這樣從腫瘤樣品中基本分離所述分子?；パa(bǔ)于共有核苷酸序列標(biāo)記的一部分的核苷酸序列，也可以用作PCR引物，這樣可以通過PCR鑒別樣品中是否存在含有共有標(biāo)記的分子。
標(biāo)記也可以是一種特異性標(biāo)記。如本文所用術(shù)語“特異性標(biāo)記”是指一種物理的，化學(xué)的或生物學(xué)標(biāo)記，其連接于文庫中特定的分子，而且是特定分子所特有的。如果一種特異性標(biāo)記是可易于鑒別的，則是特別適用的。對(duì)文庫的一種特定分子而言是唯一的一種核苷酸序列，例如是一種特異性標(biāo)記。例如，合成用獨(dú)特的核苷酸序列標(biāo)記的肽的方法，提供了一個(gè)分子文庫，文庫分子均含有一種特異性標(biāo)記，這樣基于確定核苷酸序列，可以認(rèn)識(shí)到肽的相同性(見Brenner和Lerner，美國科學(xué)院院報(bào)895381-5383(1992)在此并入?yún)⒖?。使用一種核苷酸序列作為肽或其它類型分子的特異性標(biāo)記，提供了一種鑒別樣品中是否存在所述分子的簡便方法，因?yàn)榭梢允褂靡环N非常靈敏的方法如PCR方法確定特異性標(biāo)記的核苷酸序列，從而鑒別與特異性標(biāo)記連接的分子的序列。相似地，編碼在噬菌體上表達(dá)的肽的核酸序列，例如是另一種特異性標(biāo)記，因?yàn)閷?duì)特異性標(biāo)記進(jìn)行測序可以鑒別表達(dá)的肽的氨基酸序列。
存在共有標(biāo)記或特異性標(biāo)記可以提供一種在體內(nèi)淘選后鑒別或回收腫瘤歸巢分子的方法。另外，組合共有標(biāo)記和特異性標(biāo)記尤其可以用于鑒別腫瘤歸巢分子。例如，可以制備一個(gè)肽文庫，使每個(gè)肽均連接于一個(gè)特異性核苷酸序列標(biāo)記(見例如Brenner和Lerner，如前，1992)，其中每個(gè)特異性核苷酸序列標(biāo)記已經(jīng)摻入一個(gè)共有標(biāo)記如生物素中。在歸巢腫瘤時(shí)，特定的腫瘤歸巢肽可以基于共有標(biāo)記從腫瘤樣品中基本分離，特異性肽可以基于特異性標(biāo)記例如通過PCR鑒別(見Erlich，如前，1989)。
標(biāo)記也可以作為一種支持物。如本文所用術(shù)語“支持物”是指一種標(biāo)記，其具有分子可以附著的限定表面。通常地，用作支持物的標(biāo)記是一種共有標(biāo)記。例如，支持物可以是一種生物學(xué)標(biāo)記如病毒或類病毒顆粒如噬菌體；一種細(xì)菌如大腸桿菌；或一種真核細(xì)胞如酵母，昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞；或者可以是一種物理標(biāo)記如脂質(zhì)體或微珠，其可以由塑料，瓊脂糖，明膠或其它生物學(xué)或惰性材料。如果需要，用作支持物的共有標(biāo)記可以與特異性標(biāo)記連接。因此，例如可以認(rèn)為一種噬菌體展示文庫是由噬菌體和編碼表達(dá)的肽的核酸序列組成，所述噬菌體即是共有標(biāo)記也是一種支持物，所述核酸序列是一種特異性標(biāo)記。
通常地，支持物的最短直徑應(yīng)小于大約10um-50um，這樣支持物可以相對(duì)不受防礙地穿過所述個(gè)體的毛細(xì)管基膜，而且不阻塞循環(huán)。另外，支持物可以是非毒性的，以不影響細(xì)胞表面分子的正常表達(dá)或所述個(gè)體的生理功能，而且是可生物降解的，尤其在未處死用于體內(nèi)淘選的個(gè)體以收集選擇的腫瘤的情況下。
在分子連接于支持物時(shí)，標(biāo)記的分子包含附著于支持物表面的分子，這樣可定位推測能與所述個(gè)體細(xì)胞中的靶分子相互作用的分子部分，以能參與這種相互作用。例如，在腫瘤歸巢分子懷疑是生長因子受體的配體時(shí)，定位附著于支持物的分子的結(jié)合部分，因此其可以與腫瘤細(xì)胞上的生長因子受體相互作用。如果需要，可以將一種適當(dāng)?shù)拈g隔分子定位在分子與支持物之間，這樣潛在的腫瘤歸巢分子與靶分子的相互作用的能力不受影響。間隔分子也可以含有一種反應(yīng)基團(tuán)，提供一種常規(guī)及有效地連接分子與支持物的方式，并且如果需要，可以含有一種標(biāo)記，其可以易于回收或鑒別所述分子(見Hermanson如前，1996)。
如本發(fā)明所例證，懷疑能歸巢選擇的腫瘤如乳腺癌或黑素瘤的肽，表達(dá)為融合蛋白的N末端，其中C末端由噬菌體包被蛋白組成。在表達(dá)融合蛋白時(shí)，C末端的包被蛋白將融合蛋白與噬菌體表面連接起來，這樣N末端肽定位于與腫瘤中靶分子相互作用的位置上。因此，具有共有標(biāo)記的分子是通過將肽與噬菌體連接而形成的，其中所述噬菌體提供了一個(gè)生物學(xué)支持物，所述肽分子連接為融合蛋白，融合蛋白的噬菌體編碼部分作為一種將分子，而且編碼所述肽的核酸提供了一種特異性標(biāo)記，可以鑒別腫瘤歸巢肽。
如本文所用術(shù)語“體內(nèi)淘選”，當(dāng)涉及用于鑒別腫瘤歸巢分子時(shí)，是指一種篩選文庫的方法，通過將所述文庫施用于一個(gè)個(gè)體，并鑒別選擇性歸巢個(gè)體體內(nèi)腫瘤的分子(見美國專利No.5,622,699)。術(shù)語“施用于個(gè)體”，當(dāng)涉及一個(gè)分子文庫或這個(gè)文庫的一部分時(shí)，普遍是指將所述文庫輸送于個(gè)體體內(nèi)腫瘤，所述個(gè)體通常是脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物如人體。
文庫可以這樣施用于個(gè)體，例如通過將所述文庫注射入循環(huán)系統(tǒng)中，這樣所述分子穿經(jīng)腫瘤；在經(jīng)過適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間之后，通過將個(gè)體處死或除去腫瘤樣品將循環(huán)終止(實(shí)施例4；也見于美國專利No.5,622,699；Pasqualini和Ruoslahti，如前，1996)?；蛘撸梢詫⒁粋€(gè)套管插入個(gè)體的血管中，這樣可以通過灌注適當(dāng)?shù)囊欢螘r(shí)間而施用文庫，之后文庫可以通過通過從循環(huán)中除去，或可以處死個(gè)體以收集腫瘤，或者將腫瘤制成樣品，以終止循環(huán)。相似的，可以將文庫通過不流經(jīng)個(gè)體適當(dāng)?shù)难埽员苊饨?jīng)過一或幾個(gè)器官包括腫瘤。應(yīng)意識(shí)到文庫也可以施用于一種分離的灌注的腫瘤。在分離的灌注的腫瘤中進(jìn)行的這種淘選，可以有效地鑒別結(jié)合腫瘤的分子，而且如果需要，可以用于初始篩選文庫。
使用體內(nèi)淘選鑒別腫瘤歸巢分子在此加以了例證，通過在攜帶腫瘤的小鼠中篩選一種噬菌體肽展示文庫，并鑒別選擇性歸巢乳腺腫瘤或黑素瘤的特異性肽(實(shí)施例4)。然而，展示蛋白質(zhì)受體分子的噬菌體文庫，包括例如一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段如Fv，F(xiàn)d，或fAB片段；或一種細(xì)胞粘著受體如一種整聯(lián)蛋白或一種選擇蛋白，也可以用于進(jìn)行本發(fā)明?？梢允褂檬熘姆椒?gòu)建這種分子的變體，如隨機(jī)誘變，位點(diǎn)直接誘變或基于密碼子的誘變(見Huse，1993年11月23日公布的美國專利No.5,264,563所述，在此將其并入?yún)⒖?。如果需要，可以在噬菌體表達(dá)后但在施用于個(gè)體之前，將肽進(jìn)行化學(xué)修飾。因此，可以通過各種體內(nèi)淘選篩選各種類型的噬菌體展示文庫。噬菌體展示技術(shù)提供了一種表達(dá)不同種群的隨機(jī)的或選擇性隨機(jī)肽的方法。本領(lǐng)域熟知噬菌體展示的各種方法和產(chǎn)生不同種群肽的方法。例如，Ladner等(1993年6月29日公布的美國專利No.5223409，在此并入?yún)⒖?闡述了制備噬菌體表面上不同種群的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。尤其Ladner等闡述了用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫的噬菌體載體，以及選擇潛在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域及產(chǎn)生隨機(jī)或選擇性突變的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法。
相似地，Smith和Scott(酶學(xué)方法217228-257(1993)；也見于Scott和Smith，科學(xué)249386-390(1990)，在此均并入?yún)⒖?闡述了產(chǎn)生噬菌體展示文庫，包括載體的方法，以及使表達(dá)的肽種群多樣化的方法(也見于Huse，WO 91/07141和WO 91/07149，在此均并入?yún)⒖?；也見于?shí)施例4)。當(dāng)與例如基于密碼子的誘變方法一起使用時(shí)，噬菌體展示技術(shù)可以是特別有力的，這可以用于產(chǎn)生隨機(jī)肽或隨機(jī)或所需有偏差的肽(Huse，美國專利No.5,264,563，如前，1993)。這些或其它熟知方法可以用于產(chǎn)生一個(gè)噬菌體展示文庫，其可以進(jìn)行體內(nèi)淘選以鑒別腫瘤歸巢分子，用于本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物中。
除了篩選噬菌體展示文庫之外，體內(nèi)淘選可以用于篩選各種其它類型的文庫，包括例如RNA或DNA文庫或化學(xué)制品文庫。如果需要，可以將腫瘤歸巢分子標(biāo)記，這可以易于從腫瘤中回收所述分子，或鑒別腫瘤中所述分子。例如，在篩選一個(gè)有機(jī)分子文庫時(shí)，所述文庫中有機(jī)分子均含有共有標(biāo)記，所述標(biāo)記可以是一種組分如生物素，其可以直接連接于分子，或連接于含有所述分子的支持物。生物素提供了一種共有標(biāo)記，用于從選擇的腫瘤樣品中使用親和素或鏈親和素親和基質(zhì)回收所述分子。另外，分子或含有分子的支持物可以連接于一種半抗原，如4-乙氧基-亞甲基-2-苯基-2-唑啉-5-one(phOx)，其可以由連接于一個(gè)磁珠的抗phOx抗體結(jié)合，從而回收所述分子。本領(lǐng)域熟知純化生物素或phOx苯基的綴合物的方法，而且進(jìn)行這些步驟的材料是可以商購的(例如Invitrogen，La Jolla CA；和Promega Corp.，Madison WI)。在篩選噬菌體文庫的情況中，可以使用如實(shí)施例4所述方法回收所述噬菌體。
體內(nèi)淘選提供了一種直接鑒別腫瘤歸巢分子的方法，所示分子可以選擇性歸巢腫瘤。如本文所用術(shù)語“歸巢”或“選擇性歸巢”是指在施用于個(gè)體后，一種特定的分子相對(duì)特異性結(jié)合腫瘤中的靶分子。通常地，與對(duì)照器官或組織相比，腫瘤歸巢分子的特征是部分表現(xiàn)為與腫瘤的特異性結(jié)合至少高兩倍(2×)。應(yīng)意識(shí)到，在一些情況中，分子可以非特異性定位于含有腫瘤的一個(gè)器官或組織。例如，體內(nèi)淘選噬菌體展示文庫可以在器官中產(chǎn)生高背景，如在肝和脾中，其含有網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞組織系統(tǒng)(RES)的一個(gè)標(biāo)志成分。因此，在腫瘤存在于例如肝臟中的情況下，歸因于RES吸收的分子的非特異性結(jié)合可以使鑒別腫瘤歸巢分子更加困難。
腫瘤歸巢分子的選擇性歸巢，通過檢測不同個(gè)體噬菌體的抗體歸巢腫瘤能力的不同，可以與非特異性結(jié)合區(qū)分。例如，選擇性歸巢可以通過如下鑒別，將推定的歸巢腫分子如在噬菌體上表達(dá)的肽，與過量的非感染性噬菌體或大約5倍量的表達(dá)未選擇的肽的噬菌體組合，將混合物注射入個(gè)體中，并收集腫瘤樣品。在后一情況中，例如提供的表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體的注射量非常低，對(duì)靶分子而言是不飽和的，測定到腫瘤中大約20％以上的噬菌體表達(dá)推定的腫瘤歸巢分子，這表明由噬菌體表達(dá)的肽是一種特異性腫瘤歸巢分子。另外，非特異性定位與選擇性歸巢可以通過競爭實(shí)驗(yàn)加以區(qū)分，例如使用表達(dá)推定的腫瘤歸巢肽的噬菌體組合過量的“游離“肽進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例7)。
另外，可以使用各種方法防止分子與含有RES成分的器官非特異性結(jié)合。例如，一種選擇性歸巢含有RES成分的器官中腫瘤的分子，可以通過首先封阻RES而獲得，例如使用聚苯乙烯乳膠顆?；蚱暇厶橇蛩狨シ庾?見Kalin等，Nucl.Med.Biol.20171-174(1993)；Illum等，藥物科學(xué)雜志7516-22(1986)；Takeya等，普通微生物學(xué)雜志100373-379(1977)，在此均并入?yún)⒖?，然后將所述文庫施用于個(gè)體。例如，預(yù)先施用葡聚糖硫酸酯500或聚苯乙烯微球體，之后再施用測試物質(zhì)，用于封阻Kupffer細(xì)胞對(duì)測試物質(zhì)的非特異性吸收，Kupffer細(xì)胞是肝臟的RES成分(Illum等，如前，1986)。相似的，RES對(duì)制劑的非特異性吸收已經(jīng)使用碳?；蚬枋?Takeya等，如前，1977)，或明膠(Kalin等，如前，1993)封阻。因此，已知用于封阻RES的非特異性吸收的各種制劑并已經(jīng)常規(guī)使用。
防止噬菌體與RES或其它位點(diǎn)的非特異性結(jié)合，也可以例如通過用特異性噬菌體展示文庫與不產(chǎn)生感染的相同噬菌體一起組合注射小鼠而進(jìn)行(Smith等，如前，1990，1993)。另外，歸巢含有RES成分的器官中腫瘤的肽，可以通過使用與特定器官表現(xiàn)為低背景結(jié)合的噬菌體制備噬菌體文庫而鑒別。例如，Merrll等(美國科學(xué)院院報(bào)933188-3192(1996)，在此并入?yún)⒖?選擇不被RES吸收的λ-噬菌體，結(jié)果可以在循環(huán)中保留時(shí)間延長。使用相似的方法可以選擇一種纖維狀噬菌體變體。
腫瘤歸巢分子的選擇性歸巢，可以通過測定與對(duì)照器官或組織相比，腫瘤歸巢分子對(duì)腫瘤的特異性而證實(shí)。選擇性歸巢也可以通過示出通過一次體內(nèi)淘選鑒別的歸巢腫瘤的分子，在隨后的體內(nèi)淘選中腫瘤歸巢分子更多。例如通過體內(nèi)淘選分離選擇性歸巢黑素瘤的表達(dá)肽的噬菌體，然后進(jìn)行另外的體內(nèi)淘選。在第二次篩選之后，從腫瘤回收的噬菌體比從腦中回收的噬菌體高3倍。在第三次篩選后，回收自腫瘤的噬菌體比在腦中平均高10倍。選擇性歸巢也可以通過示出通過體內(nèi)淘選鑒別的歸巢選擇的腫瘤的分子，在隨后的體內(nèi)淘選中更多。
腫瘤歸巢分子可以通過體內(nèi)淘選例如含有移植腫瘤的小鼠加以鑒別。這種移植的腫瘤可以是例如移植至免疫缺陷的小鼠如裸鼠的人體腫瘤，或者是通過在組織培養(yǎng)物或在小鼠中傳代而維持的鼠腫瘤。由于細(xì)胞受體和結(jié)合特定受體的配體的保守性質(zhì)，期望各種種屬的血管發(fā)生性血管和組織學(xué)相似的腫瘤細(xì)胞，可以具有共有的細(xì)胞表面標(biāo)記，用作腫瘤歸巢分子的靶分子。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到在小鼠中鑒別的腫瘤歸巢分子也結(jié)合人體或其它種屬腫瘤中的相應(yīng)靶分子，所述鑒別的腫瘤歸巢分子是通過例如在含有限定組織學(xué)類型的鼠腫瘤如黑素瘤的小鼠中進(jìn)行體內(nèi)淘選而鑒別的。相似地，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中生長的腫瘤需要相關(guān)的新血管化，與在人體或其它種屬中生長的腫瘤所需求的一樣。因此，結(jié)合在小鼠中生長的腫瘤血管中的靶分子的腫瘤歸巢分子，也可以結(jié)合人體或其它哺乳動(dòng)物個(gè)體的腫瘤血管中的相應(yīng)靶分子。腫瘤歸巢分子的例如即歸巢人乳腺腫瘤又歸巢人Kaposi′s肉瘤，或歸巢小鼠黑素瘤的一般能力，表明所述靶分子是許多腫瘤所共有的。事實(shí)上，本發(fā)明揭示的結(jié)果表明所述靶分子是在新血管中表達(dá)的，所述新血管是宿主組織(見對(duì)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠中使用體內(nèi)淘選鑒別的腫瘤歸巢分子，可以易于檢測其結(jié)合患者的相應(yīng)腫瘤的能力，例如通過所述分子也特異性結(jié)合得自患者腫瘤的樣品而證實(shí)。例如，CDCRGDCFC(SEQ IDNO1)噬菌體和NGR肽已經(jīng)示出結(jié)合人體腫瘤顯微切片中的血管，而在非腫瘤組織的血管中很少或不發(fā)生結(jié)合。因此，可以使用常規(guī)方法證實(shí)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中通過體內(nèi)淘選鑒別的腫瘤歸巢分子，也可以結(jié)合人體腫瘤中的靶分子。
一次體內(nèi)淘選包含以下步驟將文庫施用于個(gè)體，收集選擇的腫瘤，并鑒別歸巢腫瘤的腫瘤歸巢分子。盡管不需要，但通常也進(jìn)行一或多次附加的體內(nèi)淘選。在進(jìn)行附加的體內(nèi)淘選的情況下，將在前一次體內(nèi)淘選中回收自腫瘤的分子施用于個(gè)體，所述個(gè)體可以是前一次淘選所用的相同個(gè)體，只收集腫瘤的一部分。
通過進(jìn)行第二次體內(nèi)淘選，可以確定從第一次體內(nèi)淘選回收的的分子的相對(duì)結(jié)合選擇性，這可以通過將鑒別的分子施用于個(gè)體，收集腫瘤，并確定在第二次體內(nèi)淘選之后與第一次相比是否有更多的噬菌體回收自腫瘤。盡管不需要，但也可以收集對(duì)照器官或組織，并將回收自腫瘤的分子與回收自對(duì)照器官的那些分子相比較。理想地，在第二次或隨后的體內(nèi)淘選后，從對(duì)照器官或組織中沒有分子可回收。然而通常地，對(duì)照器官或組織中也存在一定比例的所述分子。在這種情況下，可以測定選擇的腫瘤與對(duì)照器官中分子比率(選擇的對(duì)照的)。例如，第一次體內(nèi)淘選后歸巢黑素瘤的噬菌體，在二次附加的體內(nèi)淘選后，在歸巢選擇的腫瘤比歸巢對(duì)照器官腦高3倍(實(shí)施例8)。
可以使用附加的體內(nèi)淘選測定一種特定的分子是否只歸巢選擇的腫瘤，或可以識(shí)別腫瘤上的一個(gè)標(biāo)記，所述標(biāo)記也是在個(gè)體的一或多個(gè)正常器官或組織中表達(dá)的，或是與腫瘤上的靶分子充分相似的。不太可能的是腫瘤歸巢分子也歸巢相應(yīng)的正常組織，因?yàn)轶w內(nèi)淘選方法只選擇那些歸巢選擇的腫瘤的分子。在腫瘤歸巢分子除了腫瘤之外也直接歸巢一或多個(gè)正常器官或組織的情況中，認(rèn)為所述器官或組織組成了選擇的器官或組織的一個(gè)家族。使用體內(nèi)淘選方法，可以將只歸巢選擇的腫瘤的分子與也歸巢一或多個(gè)選擇的器官或組織的分子區(qū)分。這種鑒別在隨后的體內(nèi)淘選期間通過收集各種器官或組織而加快進(jìn)行。
術(shù)語“對(duì)照器官或組織”是指一種非腫瘤的器官，其是鑒別腫瘤歸巢分子所需的。對(duì)照器官或組織的特征在于腫瘤歸巢分子不選擇性地歸巢對(duì)照器官。可以收集對(duì)照器官或組織，例如以鑒別所述分子的非特異性結(jié)合，或確定歸巢分子的選擇性。另外，非特異性結(jié)合可以通過施用例如一個(gè)對(duì)照分子而鑒別，所述對(duì)照分子已知不歸巢腫瘤但其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于潛在的腫瘤歸巢分子?；蛘撸谑┯玫姆肿舆B接于支持物的情況中，單獨(dú)施用支持物也可以用于鑒別非特異性結(jié)合。例如，只表達(dá)基因III蛋白，但不含有肽融合蛋白的噬菌體，可以通過體內(nèi)淘選加以研究以確定噬菌體支持物的非特異性結(jié)合水平。
如本發(fā)明所揭示，腫瘤歸巢分子的特異性歸巢，可以通過對(duì)比檢測選擇的腫瘤組織和相應(yīng)非腫瘤組織，以及對(duì)照器官或組織而易于鑒別。例如，可以對(duì)腫瘤組織和相應(yīng)的非腫瘤組織進(jìn)行免疫組織學(xué)分析，使用特異于用于展示腫瘤歸巢肽的噬菌體的抗體進(jìn)行(實(shí)施例7)?；蛘?，可以使用一種特異于共有標(biāo)記的抗體，如FLAG表位等，所述共有標(biāo)記是與所述肽一起表達(dá)的，這種檢測系統(tǒng)是可商購的。
通常地，制備一個(gè)分子文庫，其含有不同種群的隨機(jī)或選擇性隨機(jī)化的相應(yīng)分子，然后將其施用于個(gè)體。在施用之后的一個(gè)選擇的時(shí)間，將個(gè)體處死并收集腫瘤，這樣可以鑒別腫瘤中存在的所述分子(實(shí)施例4)。如果需要，可以將一或多個(gè)對(duì)照器官或組織或它們的一部分制成樣品。例如，用一個(gè)噬菌體肽展示文庫注射攜帶乳腺腫瘤或黑素瘤的小鼠，然后在大約1-5分鐘之后，將小鼠麻醉，在液氮中冷凍或優(yōu)選通過心臟灌注以終止噬菌體循環(huán)，從每只小鼠收集腫瘤和一或多個(gè)對(duì)照器官，回收腫瘤和對(duì)照器官中存在的噬菌體，并鑒別選擇性歸巢各個(gè)腫瘤的肽(見實(shí)施例4，5和8)。
在提供的實(shí)施例中，將動(dòng)物處死以收集選擇的腫瘤和對(duì)照器官或組織。然而應(yīng)意識(shí)到只需要收集一部分腫瘤以回收含有腫瘤歸巢分子的支持物，而且相似地，只需要收集一部分器官或組織以作為對(duì)照。因此，可例如通過活檢收集一部分腫瘤，這樣可以將分子如噬菌體表達(dá)的肽根據(jù)所需第二次或更多次施用于相同個(gè)體。在第二次施用于相同個(gè)體的分子是標(biāo)記的或連接于例如支持物的情況中，所述標(biāo)記或支持物應(yīng)是非毒性和可生物降解的，以不干擾隨后的篩選。
在體外篩選噬菌體文庫已經(jīng)用于鑒別結(jié)合抗體或細(xì)胞表面受體的肽(Smith和Scott，如前，1993)。例如，體外篩選噬菌體展示文庫已經(jīng)用于鑒別特異性結(jié)合整聯(lián)蛋白粘著受體的新肽(Koivunen等，細(xì)胞生物學(xué)雜志124373-380(1994a)，在此將其并入?yún)⒖?，和特異性結(jié)合人尿激酶受體的新肽(Goodson等，美國科學(xué)院院報(bào)917129-7133(1994))。然而，這種體外研究不能洞察在體外特異性結(jié)合選擇的受體的肽是否在體內(nèi)也結(jié)合所述受體，或者所述結(jié)合肽或受體是否與機(jī)體內(nèi)的特異性器官所獨(dú)特的。另外，所述體外方法是使用限定的充分定性的靶分子在人工系統(tǒng)中進(jìn)行的。例如，Goodson等，如前1994，利用表達(dá)重組的尿激酶受體的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然而，這種體外方法受到一定限制，因?yàn)樾枰A(yù)先了解靶分子，并產(chǎn)生很少(如果有的話)的關(guān)于體內(nèi)應(yīng)用的信息。
在培養(yǎng)物中體外淘選細(xì)胞也已經(jīng)用于鑒別可特異性結(jié)合由所述細(xì)胞表達(dá)的受體的分子(Barry等，Nature Med.2299-305(1996)，在此并入?yún)⒖?。然而，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長時(shí)，由細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞表面分子通常改變。因此，使用培養(yǎng)無中的細(xì)胞的體外淘選方法也受到一定限制，其中不能保證歸因于結(jié)合培養(yǎng)物中細(xì)胞而鑒別的分子在體內(nèi)也具有相同結(jié)合活性。另外，不能使用體外淘選方法區(qū)分分子，所述分子只歸巢篩選中使用的腫瘤細(xì)胞，但不歸巢其它類型細(xì)胞。
相反，體內(nèi)淘選不需要預(yù)先了解靶分子或其實(shí)用性，而且可以鑒別結(jié)合體內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞表面靶分子的分子。同樣，由于在篩選期間存在“未定向的組織”，因此分離缺乏歸巢特異性的腫瘤歸巢分子的可能性明顯降低。另外，在通過體內(nèi)淘選獲得腫瘤歸巢分子中，歸因于例如代謝活性而對(duì)在體內(nèi)循環(huán)中降解特別敏感的任何分子，不可回收。因此，體內(nèi)淘選方法在鑒別選擇性在體內(nèi)歸巢腫瘤中存在的靶分子的腫瘤歸巢分子方面，比以往的方法具有明顯的優(yōu)勢。
盡管還未充分揭示所述體內(nèi)淘選方法的運(yùn)行機(jī)制，但一種可能是分子如在噬菌體上表達(dá)的肽識(shí)別并結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞系上存在的靶分子。有跡象表明例如各種器官中的血管組織各不相同，而且這種不同可以參與調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞運(yùn)輸。例如，淋巴細(xì)胞歸巢淋巴結(jié)或其它淋巴組織，部分歸因于那些組織中內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)特異性“地址”分子(Salmi等，美國科學(xué)院院報(bào)8911436-11440(1992)；Springer，細(xì)胞76301-314(1994))。相似地，各種白細(xì)胞可以識(shí)別炎癥位點(diǎn)，部分歸因于由炎癥信號(hào)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)(見Butcher和Picker，科學(xué)27260-66(1996)；Springer，如前1994)。因此，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記提供了一種潛在的靶位，其可以由腫瘤歸巢分子選擇性結(jié)合，并用于將連接的抗微生物肽定向于腫瘤。
如果需要，可以包括其它的成分作為歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物的一部分。例如，在一些情況中，在腫瘤歸巢分子和抗微生物肽之間需要一種寡肽間隔物。這種間隔物是本領(lǐng)域熟知的，例如Fitzpatrick和Garnett，抗癌藥物開發(fā)101-9(1995))所述。
本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡嵌合肽，可以易于使用常規(guī)的固相肽合成方法以所需數(shù)量合成。本發(fā)明的嵌合肽也可以商購(例如購自AnaSpec，Inc.；San Jose，CA)。在抗微生物肽與非肽腫瘤歸巢分子連接的情況中，抗微生物肽部分可以使用熟知方法獨(dú)立地合成或商購獲得。
可以使用的將抗微生物肽與腫瘤歸巢分子連接的一些方法是本領(lǐng)域已知的，根據(jù)分子的特殊化學(xué)性質(zhì)選用不同的方法。例如，將半抗原與載體蛋白連接的方法是在應(yīng)用免疫學(xué)領(lǐng)域常規(guī)使用的(見例如Harlow和Lane，如前，1988；Hermanson，如前，1996)。
預(yù)制的抗微生物肽也可以綴合于腫瘤歸巢肽，例如使用碳二亞胺綴合法(Bauminger和Wilchek，酶學(xué)方法70151-159(1980)，在此并入?yún)⒖?。碳二亞胺包含具有通式R-N＝C＝N-R′的一組化合物，其中R和R’可以是脂肪族或芳香族化合物，并用于合成肽鍵。制備程序是簡便的，相對(duì)快速的，而且是在適度條件下進(jìn)行的。碳二亞胺化合物攻擊羧基團(tuán)，將它們改變?yōu)橛坞x氨基的反應(yīng)位點(diǎn)。碳二亞胺綴合法已經(jīng)用于將各種化合物綴合于載體以產(chǎn)生抗體。
水溶性碳二亞胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)可以用于將一種抗微生物肽與腫瘤歸巢分子綴合。這種綴合需要存在一個(gè)氨基團(tuán)，其可以例如由抗微生物肽提供，及需要一個(gè)羧基團(tuán)，其可以由腫瘤歸巢分子提供。
除了使用碳二亞胺直接形成肽鍵之外，也可以使用EDC制備活性酯如N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)。只結(jié)合氨基團(tuán)的NHS酯，然后可以用于誘導(dǎo)與阿霉素的單一氨基團(tuán)形成酰胺鍵。組合使用EDC和NHS通常用于進(jìn)行綴合，以提高綴合物形成的產(chǎn)量(Bauminger和Wilchek，如前，1980)。
也可以使用其它將抗微生物肽與腫瘤歸巢分子綴合的方法。例如，可以使用高碘酸鈉氧化隨后對(duì)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)物還原性烷化，因?yàn)榭梢越宦?lián)戊二醛。然而，應(yīng)意識(shí)到，不論選擇何種產(chǎn)生本發(fā)明綴合物的方法，必須保證腫瘤歸巢分子保留其定向能力及抗微生物肽保留其抗微生物活性。本領(lǐng)域已知的方法能證實(shí)本發(fā)明歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物的活性。
使用常規(guī)方法確定形成的抗微生物肽/腫瘤歸巢分子綴合物的產(chǎn)量。例如，可以使用HPLC或毛細(xì)管電泳或其它定性或定量方法(鍵例如Liu等，J.Chromatoqr.735357-366(1996)；Rose等，J.Chromatogr.425419-412(1988)，在此均并入?yún)⒖?；也見于?shí)施例8)。特別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到選擇一種確定綴合反應(yīng)的產(chǎn)量的方法，部分依賴于特異性抗微生物肽和腫瘤歸巢分子的物理和化學(xué)特性。在綴合之后，將反應(yīng)產(chǎn)物脫鹽以除去任何游離肽或分子。
本發(fā)明還提供了將抗微生物肽在體內(nèi)定向于具有血管發(fā)生性血管的腫瘤的方法。這個(gè)方法是將本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物施用于具有血管發(fā)生性血管的腫瘤的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)將抗微生物肽在體內(nèi)定向于具有血管發(fā)生性血管的腫瘤的方法中，所述抗微生物肽可以包括例如序列D(KLAKLAK)2。可以施用于含有血管發(fā)生性血管的腫瘤的個(gè)體的特別有效的綴合物包括CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2和ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2。
本發(fā)明還提供了在體內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)具有血管發(fā)生性血管的腫瘤具有選擇性毒性的方法。這個(gè)方法是將本發(fā)明的歸巢出細(xì)胞程序死亡綴合物施用于含有血管發(fā)生性血管的腫瘤的個(gè)體。在本發(fā)明方法中用于誘導(dǎo)選擇性毒性的抗微生物肽可以是例如含有序列D(KLAKLAK)2的肽。可以施用的，以誘導(dǎo)對(duì)含有血管發(fā)生性血管的腫瘤具有體內(nèi)選擇性毒性的特別有效的綴合物包括CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2和ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2。
本發(fā)明還提供了治療患有腫瘤的患者的方法，所述腫瘤具有血管發(fā)生性血管。在這種治療方法中，將本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物施用于患者，所述綴合物對(duì)腫瘤具有選擇性毒性?？刮⑸镫牟糠挚梢园ɡ缧蛄蠨(KLAKLAK)2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物具有序列CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2或ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2。
當(dāng)施用于個(gè)體時(shí)，本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物可以是藥物組合物，其患有例如所述綴合物和一種藥物適當(dāng)?shù)妮d體。藥物適當(dāng)?shù)妮d體是本領(lǐng)域熟知的，包括例如水相溶液如水或生理緩沖鹽水或其它溶劑或載體如二醇，甘油，油如橄欖油或可注射的有機(jī)酯。
藥物適當(dāng)?shù)妮d體可以患有生理適當(dāng)?shù)幕衔?，例如發(fā)揮穩(wěn)定或提高綴合物吸收的作用。這種生理適當(dāng)?shù)幕衔锇ɡ缣妓衔锶缙咸烟?，蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑如抗壞血酸或谷胱甘肽；鰲合劑；低分子量蛋白；或其它穩(wěn)定劑或賦形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知選擇藥物適當(dāng)?shù)妮d體，包括生理適當(dāng)?shù)幕衔铮蕾囉诶缢鼋M合物的施用途徑。所述藥物組合物還可以含有一種制劑如癌癥治療劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知本發(fā)明的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，可以作為藥物組合物通過各種途徑施用于個(gè)體，包括例如通過口服或非腸道施用，如靜脈內(nèi)施用。含有所述綴合物的藥物組合物可以通過注射或插管而施用。所述藥物組合物還可以是一種連接于可以摻入其中的脂質(zhì)體或其它聚合物基質(zhì)的腫瘤歸巢分子，和一種抗微生物肽(Gregoriadis，脂質(zhì)體技術(shù)，第一卷(CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L1984)，在此將其并入?yún)⒖?。例如由磷脂或其它脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體，是無毒的生理適當(dāng)?shù)募翱纱x的載體，其相對(duì)便于生產(chǎn)和施用。
針對(duì)本發(fā)明所揭示的方法，必須對(duì)個(gè)體施用有效量的所述歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物。所用術(shù)語“有效量”是指產(chǎn)生所需效應(yīng)的所述綴合物的數(shù)量。有效量通常依賴于與腫瘤歸巢分子連接的特定的抗微生物肽。其中腫瘤歸巢分子與特定的抗微生物肽連接的歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物，其有效量可以施用本領(lǐng)域熟知的方法確定。
施用歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物的途徑，部分依賴于所述分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如當(dāng)口服施用時(shí)，肽是特別不適用的，因?yàn)槠淇梢栽谙乐薪到?。然而，本領(lǐng)域熟知對(duì)肽進(jìn)行化學(xué)修飾，以使其對(duì)內(nèi)源性蛋白酶降解的敏感性降低，或更易于通過消化道的方法，包括摻入D-氨基酸(見例如Blondelle等，1995；Ecker和Crooke，如前，1995；Goodman和Ro，如前，1995)。這種修飾可以在通過體內(nèi)淘選鑒別的歸巢留肽上以及在抗微生物肽上進(jìn)行。另外，本領(lǐng)域已知制備肽模擬物文庫的方法，所述肽模擬物可以含有D-氨基酸，其它非天然發(fā)生的氨基酸，或化學(xué)修飾的氨基酸；或可以是模擬所述肽結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子；或可以是如vinylogous peptoids這樣的肽，而且可以用于鑒別口服施用穩(wěn)定的腫瘤歸巢分子。
腫瘤歸巢肽可以具有線性或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在這些肽中包括半胱氨酸殘基以環(huán)化所述肽。特別地，含有至少兩個(gè)半胱氨酸殘基的肽自動(dòng)環(huán)化。另外，這種環(huán)狀肽當(dāng)以線性方式存在時(shí)也可以是活性的(見例如Koivunen等，如前，1993)。例如，線性肽NGRAHA(SEQ ID NO6)也用作腫瘤歸巢分子(見表2)。因此，在一些情況中，本發(fā)明揭示的腫瘤歸巢肽或其它經(jīng)鑒別為腫瘤歸巢肽中的一或多個(gè)半胱氨酸殘基可以缺失，而不明顯影響所述肽的歸巢腫瘤活性。確定半胱氨酸殘基或半胱氨酸殘基的C末端或N末端氨基酸殘基對(duì)所述肽的腫瘤歸巢肽活性的必需性的方法，是本領(lǐng)域常規(guī)應(yīng)用并熟知的。
如本發(fā)明進(jìn)一步揭示，一些(非全部)腫瘤歸巢分子也可以歸巢不包含在腫瘤內(nèi)的血管發(fā)生性血管。例如含有RGD基序或GSL基序的腫瘤歸巢分子，特異性歸巢視網(wǎng)膜新生血管(Smith等，Invest.Ophthamol.Vis.Sci.35101-111(1994)，在此將其并入?yún)⒖?，而含有NGR基序的腫瘤歸巢肽在這種血管生成性血管中基本不積聚。這些結(jié)果表明腫瘤血管表達(dá)基本上不是由其它種類血管方式性血管表達(dá)的靶分子。本發(fā)明所揭示的方法可以用于區(qū)分腫瘤歸巢肽與歸巢非腫瘤血管發(fā)生性血管的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解為治療腫瘤，優(yōu)選施用一種具有腫瘤歸巢肽的綴合物，所述肽選擇性歸巢腫瘤血管。
本發(fā)明提供了嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，其可以用于治療例如良性前列腺增生或前列腺癌。如本發(fā)明所揭示，當(dāng)系統(tǒng)施用時(shí)，SMSIARL肽(SEQ ID NO207)可選擇性定位于前列腺組織，特別是前列腺血管(見實(shí)施例9B和9E)。另外，前列腺歸巢肽SMSIARL(SEQ ID NO207)可用于選擇性將一種連接的組分如生物素或噬菌體輸送至前列腺組織。如本發(fā)明所進(jìn)一步揭示，在小鼠前列腺中細(xì)胞程序死亡是由系統(tǒng)施用SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2嵌合肽而誘導(dǎo)的；在非前列腺組織中沒有細(xì)胞程序死亡跡象(見圖7和實(shí)施例9C)。在此揭示的結(jié)果還表明施SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2嵌合肽可延長TRAMP小鼠的存活時(shí)間，所述小鼠在轉(zhuǎn)基因的影響下發(fā)生前列腺癌，如Gingrich等，癌癥研究564096-4102(1996)所示。圖8示出SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2處理的的小鼠的存活時(shí)間比用單獨(dú)的載體，單獨(dú)的D(KLAKLAK)2肽或單獨(dú)的SMSIARL肽(SEQ ID NO207)處理的小鼠長?；谶@些結(jié)果，本發(fā)明提供了一種嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，以及施用所述肽治療患有前列腺癌的必然的方法，如以下進(jìn)一步闡述。
因此本發(fā)明提供了一種嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，其患有一種與抗微生物肽連接的前列腺歸巢肽，嵌合肽由前列腺組織選擇性內(nèi)在化并對(duì)其呈現(xiàn)高毒性，而抗微生物肽當(dāng)不與前列腺歸巢肽連接時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性很低。在本發(fā)明的嵌合肽中，歸巢前列腺部分可以含有例如序列SMSIARL(SEQ ID NO207)或功能等價(jià)序列，抗微生物肽部分可以具有一個(gè)兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)如序列(KLAKLAK)2(SEQID NO200)，(KLAKKLA)2(SEQ ID NO201)，(KAAKKAA)2(SEQ ID NO202)或(KLGKKLG)3(SEQ IDNO203)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗微生物肽部分含有序列D(KLAKLAK)2。本發(fā)明提供的一個(gè)促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽例如是SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
本發(fā)明還提供了一種將抗微生物肽在體內(nèi)定向于前列腺癌的方法。這個(gè)方法包括施用嵌合的歸巢前列腺的促尋細(xì)胞程序死亡肽，所述嵌合肽含有連接于抗微生物肽的前列腺歸巢肽，嵌合肽由前列腺組織選擇性內(nèi)在化并對(duì)其呈現(xiàn)高毒性，而當(dāng)抗微生物肽不與前列腺歸巢肽連接時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性很低。在本發(fā)明的一個(gè)方法中，前列腺歸巢肽可以含有例如序列SMSIARL(SEQ ID NO207)或功能等價(jià)序列，抗微生物肽可以含有序列如D(KLAKLAK)2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合的歸巢前列腺的促歸巢程序死亡肽包括序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
本發(fā)明還提供了一種在難題誘導(dǎo)對(duì)前列腺癌具有選擇性毒性的方法。這個(gè)方法包括為患有前列腺癌的個(gè)體施用嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，所述嵌合肽含有連接于抗微生物肽的前列腺歸巢肽，嵌合肽由前列腺組織選擇性內(nèi)在化并對(duì)其呈現(xiàn)高毒性，而當(dāng)抗微生物肽不與前列腺歸巢肽連接時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性很低。誘導(dǎo)在體內(nèi)對(duì)前列腺癌具有選擇性毒性的方法，例如可以用含有序列SMSIARL(SEQ ID NO207)或功能等價(jià)序列的前列腺歸巢肽進(jìn)行?？刮⑸镫目梢园ɡ缧蛄蠨(KLAKLAK)2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽包括序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
另外，本發(fā)明提供了一種治療患有前列腺癌的的患者的方法，這種方法是為患者施用本發(fā)明的嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，從而嵌合肽對(duì)腫瘤具有選擇性毒性。嵌合肽含有連接于抗微生物肽的前列腺歸巢肽，嵌合肽被前列腺組織選擇性內(nèi)在化并對(duì)其具有高毒性，而抗微生物肽當(dāng)不與前列腺歸巢肽連接時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性很低。前列腺歸巢肽部分可含有例如序列SMSIARL(SEQ ID NO207)或功能等價(jià)序列，抗微生物肽部分可以含有例如序列D(KLAKLAK)2。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，為治療患有前列腺腫瘤的患者，所述嵌合肽含有序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
如本文所用術(shù)語“前列腺歸巢肽”是指一種肽，與地址組織如腦相比，其在體內(nèi)選擇性歸巢前列腺組織。這種肽的一般特征是與對(duì)照細(xì)胞或組織相比，定位于前列腺組織至少高2倍。前列腺歸巢肽可以例如選擇性歸巢前列腺血管，而不歸巢其它類型細(xì)胞或其它血管(見實(shí)施例9)。
歸因于前列腺歸巢肽部分的選擇性歸巢活性，本發(fā)明的嵌合肽選擇性輸送于前列腺。用于本發(fā)明的各種前列腺歸巢肽包括SMSIARL(SEQ ID NO207)和VSFLEYR(SEQ ID NO222)，它們是通過將X7文庫注射入小鼠中(表7)，并隨后如美國專利No.5,622,699所述進(jìn)行體內(nèi)淘選而鑒別的。前列腺歸巢肽SMSIARL(SEQ IDNO21)和VSFLEYR(SEQ ID NO22)，與在腦中的富集相比在前列腺中分別富集34倍和17倍。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明依賴于含有序列SMSIARL(SEQ IDNO207)或功能等價(jià)序列的前列腺歸巢肽。針對(duì)SMSIARL(SEQ IDNO207)序列的術(shù)語“功能等價(jià)序列”是指一種序列，其選擇性結(jié)合前列腺血管的內(nèi)皮細(xì)胞，如圖9針對(duì)序列SMSIARL(SEQ ID NO207)所示出的那些，而且具有選擇性結(jié)合相同受體的功能。
應(yīng)了解本發(fā)明的嵌合的促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，可以用于在各種前列腺疾病中誘導(dǎo)選擇性毒性。這種疾病包括前列腺良性結(jié)節(jié)性增生，以及原發(fā)或二級(jí)癌癥，包括臨床跡象明顯的以及亞臨床癌癥。用本發(fā)明的嵌合肽治療的癌癥包括前列腺癌，如腺癌。
以下實(shí)施例用于例證本發(fā)明，而無限制本發(fā)明之意。實(shí)施例1對(duì)D(KLAKLAK)2定性這個(gè)實(shí)施例表明了D(KLAKLAK)2優(yōu)先破壞線粒體膜及誘導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞程序死亡。
選擇合成的14-mer KLAKLAKKLAKLAK(SEQ ID NO200)，將其稱為(KLAKLAK)2，因?yàn)槠湓诒葰⑺勒婧思?xì)胞所需的濃度低2個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下可以殺死細(xì)菌(Javadpour等，J.Med.Chem.393107-3113(1996))。所有的D-對(duì)映異構(gòu)體D(KLAKLAK)2用于避免蛋白酶降解(Bessalle等，F(xiàn)EBS通信274151-155(1990)；Wade等，美國科學(xué)院院報(bào)874761-4765(1990))。D(KLAKLAK)2優(yōu)先破壞線粒體膜D(KLAKLAK)2優(yōu)先通過真核細(xì)胞質(zhì)膜破壞線粒體膜的能力，通過線粒體溶脹分析及在線粒體依賴性無細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞程序死亡中，和通過胞毒性分析加以評(píng)價(jià)。
如下進(jìn)行線粒體溶脹分析。簡而言之，如Ellerby等，J.Neurosci.176165-6178(1997)所述制備大鼠肝臟線粒體。通過HPLC合成純度高于90％的肽(DLSLARLATARLAI(SEQ ID NO204)，得自CoastScientific，Inc.，San Diego，CA；所有其它肽得自AnaSpec，Inc.)。將線粒體用濃度為10μM的D(KLAKLAK)2，10μM的DLSLARLATARLAI陰性對(duì)照肽(SEQ ID NO204)，或200μM的Ca+2陽性對(duì)照物處理。將所述肽加入試管中的線粒體中，并通過測定在520nm的吸光度對(duì)溶脹定量。
如圖2a所示，10μM的D(KLAKLAK)2誘導(dǎo)明顯的線粒體溶脹。在3μM濃度發(fā)生明顯的適度溶脹，3μM這個(gè)濃度比殺死真核細(xì)胞需要的濃度(大約300μM)低兩個(gè)數(shù)量級(jí)，這是與測定殺死50％的單層細(xì)胞所需的濃度(LC50；表1)同樣測定的。用作陰性對(duì)照肽的非α螺旋形成肽DLSLARLATARLAI(SEQ ID NO204)不誘導(dǎo)線粒體溶脹。這些結(jié)果表明與真核細(xì)胞質(zhì)膜相比，D(KLAKLAK)2優(yōu)先破壞線粒體膜。
表1用HPP-1和D(KLAKLAK)2處理的真核細(xì)胞的LC50(μM)DMECKS1767 MDA-MB-435抑制血管發(fā)生的血管生成性增殖索形成 增殖增殖HPP-1 481 51 34 42 415D(KLAKLAK)2492 346 368 387 333結(jié)果是一式三份的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值(t-檢驗(yàn)，P＜0.03)。D(KLAKLAK)2誘導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞程序死亡分析D(KLAKLAK)2肽在無細(xì)胞系統(tǒng)中激活線粒體依賴性細(xì)胞程序死亡的能力，所述系統(tǒng)由懸浮于正常胞質(zhì)提取物中的正常的線粒體組成(Ellerby等，J.Neurosci.176165-6178(1997))。通過特征的caspase-3從失活的原形式加工為活性的蛋白酶形式測定細(xì)胞程序死亡(Alnenri等，細(xì)胞87171(1996))。
無細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡分析基本如下進(jìn)行。如Ellerby等，如前，1997所述重建無細(xì)胞系統(tǒng)，而且針對(duì)線粒體依賴性反應(yīng)，將大鼠肝臟線粒體懸浮于正常(無細(xì)胞程序死亡)胞質(zhì)提取物中，所述胞質(zhì)提取物是從皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞中制備的。在加入濃度為100uM的肽并在30℃或37℃溫育2小時(shí)后，通過離心除去線粒體，并將上清在12％凝膠(Biorad；Hercules，CA)上通過SDS/PAGE免疫印跡分析。將蛋白質(zhì)移至PVDF膜(Biorad)上，并用抗caspase-3抗體(SantaCruz Biotechnology；SantaCruz，CA)溫育，隨后進(jìn)行ECL檢測(Amersham；Arlington Heights，IL)。
特征的caspase-3加工是在皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞裂解物中測定的，如Ellerby等，如前，1997所述。簡而言之，將細(xì)胞裂解物等分(1ul裂解物，8-15mg/ml)加入100uM的N-乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-pNA(DEVD-pNA；BioMol；100ul，100mM HEPES，10％蔗糖，0.1％CHAPS，1mM DTT，pH7.0)。在25℃通過分光光度法(400nm)監(jiān)測DEVD-pNA的水解。
如圖2b所示，在泳道4在存在線粒體和D(KLAKLAK)2的情況下，觀測到特征的caspase-3加工為活性的蛋白酶。用作陰性對(duì)照的非α螺旋形成肽DLSLARLATARLAI(SEQ ID NO204)，當(dāng)在無細(xì)胞系統(tǒng)中測試時(shí)是失活的，而且對(duì)真核細(xì)胞無致死性(圖2b；也見于Ellerby等，如前，1997)。
總之，這些結(jié)果表明與真核細(xì)胞質(zhì)膜相比，D(KLAKLAK)2優(yōu)先破壞線粒體膜，并激活線粒體依賴性細(xì)胞程序死亡。實(shí)施例2HPP-1的特征這個(gè)實(shí)施例表明CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)在組織培養(yǎng)模型中抑制血管發(fā)生。
制備含有通過甘氨酸-甘氨酸橋連于抗微生物肽的歸巢結(jié)構(gòu)域的嵌合物。如上所述，由AnaSpec公司通過HPLC商業(yè)合成純度高于90％的肽。
歸巢結(jié)構(gòu)域可以是環(huán)狀的肽(通過半胱氨酸之間的二硫鍵形成的)CNGRC(SEQ ID NO8；見圖1)，或者是雙環(huán)狀的肽ACDCRGDCFC(SEQ ID NO16)，二者均具有歸巢腫瘤性質(zhì)(Pasqualini等，自然生物技術(shù)15542-546(1997)；Arap等，科學(xué)279377-380(1998))并可以由腫瘤內(nèi)在化(Arap等，如前，1998；Hart等，生物化學(xué)雜志26912468-12474(1994)；Bretscher等，EMBO雜志81341-1348(1989))。歸因于歸巢結(jié)構(gòu)域與受體之間的相互作用的推測的手性性質(zhì)，歸巢結(jié)構(gòu)域是從所有L氨基酸中合成的。甘氨酸-甘氨酸橋連用于偶聯(lián)歸巢結(jié)構(gòu)域和抗微生物結(jié)構(gòu)域，以增強(qiáng)所述肽的靈活性，及使?jié)撛诘目臻g相互作用最小化。用HPP-1處理的皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活能力在血管發(fā)生性組織培養(yǎng)模型中評(píng)價(jià)HPP-1的效力和特異性，如Goto等，Lab.Invest.69508-517(1993)所述。在血管發(fā)生期間，毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移(Risau，自然386671-674(1997)；Zetter，Ann.Rev.Med.49407-424(1998))。索形成是一種遷移形式，這是在體外通過內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)從通常的“橄欖形”轉(zhuǎn)變?yōu)殒湢罨蛩鳡钏境?，如圖3所示(也見于Goto等，如前，1993)。
在增殖和索形成的血管發(fā)生條件下，在正常人體皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(DMECs)上分析HPP-1的作用。另外，在單層細(xì)胞保持在100％鋪滿的抑制血管發(fā)生的條件下，分析HPP-1的作用。
簡而言之TM，將皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞(DMECs)在CADMECGrowth MediaTM(Cell Applications，Inc.；San Diego，CA)上生長。然后將皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞在三種實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)增殖，在補(bǔ)加500ng/ml人重組血管內(nèi)皮細(xì)生長因子(VEGF；Pharmingen)的生長培養(yǎng)基中達(dá)到30％鋪滿；不增殖，在保持單層細(xì)胞的培養(yǎng)基中達(dá)到100％鋪滿；索形成，在誘導(dǎo)索形成的培養(yǎng)基中達(dá)到60％鋪滿(進(jìn)行誘導(dǎo)所需的)。將KS1767和MDA-MB-435細(xì)胞如Arap等，如前，1998；Hernier等，如前，1994)所述進(jìn)行培養(yǎng)。
通過細(xì)胞程序死亡形態(tài)學(xué)測定存活百分率和LC50(表1)，如Ellerby等，J.Neurosci.176165-6178(1997)所述。針對(duì)存活百分率分析，將皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞用60uM HPP-1或?qū)φ针腄(KLAKLAK)2處理。在指定的時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞培養(yǎng)基從粘著的細(xì)胞中抽吸出，并將細(xì)胞用PBS在37℃輕輕沖洗一次。隨后將在PBS中稀釋20倍的染料混合物(100ug/ml口丫啶橙和100ug/ml溴化乙錠)輕輕移液在所述細(xì)胞上，在倒置顯微鏡(Nikon TE 300)上進(jìn)行觀測。細(xì)胞核居于邊緣和染色體濃縮和/或細(xì)胞核破碎(早期/中期細(xì)胞程序死亡)或者危及到細(xì)胞膜(晚期細(xì)胞程序死亡)的細(xì)胞是有損傷的，不能存活。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中給定的時(shí)間點(diǎn)有至少500個(gè)細(xì)胞是損傷的。存活百分率是相對(duì)于未處理的對(duì)照物計(jì)算的。單層細(xì)胞的LC50，增殖(60％鋪滿)，和索形成在72小時(shí)受損。
如圖3所示，用60mM的HPP-1在增殖和索形成條件下處理皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞，相對(duì)于未處理的對(duì)照物，隨著時(shí)間推移存活百分率降低(分別見圖3c和3d)。相反，用作為陰性對(duì)照的未定向的肽D(KLAKLAK)2處理，存活力幾乎不降低。另外，用HPP-1處理的皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖LC50和遷移，比在保持100％鋪滿單層細(xì)胞的angioststic皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖LC50和遷移第一個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)。這些結(jié)果表明HPP-1在血管發(fā)生條件下比在抑制血管發(fā)生的條件下殺傷力強(qiáng)。
對(duì)各種對(duì)照物對(duì)皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活力的作用也進(jìn)行分析。在血管發(fā)生條件下未定向的對(duì)照D(KLAKLAK)2的LC50與在抑制血管發(fā)生的條件下HPP-1的LC50相似。另外，未偶聯(lián)的D(KLAKLAK)2和CNGRC(SEQ ID NO8)，非定向形式的CARAC-GG-D(KLAKLAK)2和混雜形式的CGRNC-GG-D(KLAKLAK)2的結(jié)果與D(KLAKLAK)2相似。另外，另一種原型ACDCRGDCFC-D(KLAKLAK)2的結(jié)果與CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)的結(jié)果相似(數(shù)據(jù)未示出)。用HPP-1處理的皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體形態(tài)如下在用60uM HPP-1(ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2)或未定向的D(KLAKLAK)2處理后，在增殖的細(xì)胞中評(píng)定皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體形態(tài)。在用所述肽處理24和72小時(shí)后，將皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞在37℃用100nM線粒體染色劑MitoTracker RedTM(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)和500nM核染色劑DAPI(Molecular Probes，Inc.)溫育30分鐘進(jìn)行染色。隨后使用熒光顯微鏡檢方法(100×)在倒置顯微鏡下(Nikon)，使用3×濾光波長設(shè)置觀測線粒體。
用D(KLAKLAK)2處理24小時(shí)的皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體保持正常的形態(tài)，而用每種原型處理的那些細(xì)胞的線粒體形態(tài)發(fā)生變化。尤其地，在細(xì)胞聚集之前，用CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2或ACDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2處理的細(xì)胞大約80％發(fā)生明顯的線粒體形態(tài)改變。最后，在72小時(shí)可以見到用CNGRC-GG-D(KLAKLLAK)2(HPP-1)處理的皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞程序死亡的特征性形態(tài)學(xué)變化，包括核濃縮和破裂(Ellerby等，如前，1997)。通過分析caspase活性證實(shí)細(xì)胞程序死亡情況(見圖3b；Ellerby等，如前，1997)。用HPP-1處理的KS1767和MDA-MB-435細(xì)胞的存活力嵌合的HPP-1對(duì)衍生自Kaposi′s肉瘤的KS1767細(xì)胞的毒性與對(duì)皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移毒性一樣(表1；Hemier等，AIDS 8575-581(1994))。相反，HPP-1對(duì)MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞的毒性低將近一個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)。KS1767細(xì)胞，是內(nèi)皮的起源，類似血管發(fā)生性內(nèi)皮細(xì)胞而且結(jié)合CNGRC肽(SEQ ID NO8)，而MDA-MB-435細(xì)胞不這樣(Samaniego等，Amer.J.Path.1521433-1443(1998)；Arap等，如前，1998)。
總之，這些結(jié)果表明HPP-1在皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)線粒體溶脹和細(xì)胞程序死亡。實(shí)施例3歸巢的促細(xì)胞程序死亡肽的體內(nèi)活性這個(gè)實(shí)施例表明CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)抑制腫瘤生長及延長攜帶腫瘤的動(dòng)物的存活時(shí)間。這個(gè)實(shí)施例還表明CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2抑制視網(wǎng)膜新血管化。A.CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)的體內(nèi)活性如下在體內(nèi)用攜帶人MDA-MD-435乳腺癌異種移植體的裸鼠測試HPP-的活性。簡而言之，在2月齡的雌性裸鼠(Jackson Labs；BarHarbor，ME)中建立MDA-MB-435和C8161衍生的腫瘤異種移植體，如Arap等，如前，1998所述。在用在蒸餾水中制備的2，2，2-三溴乙醇(Aldrich；Milwaukee，WI)和2-甲基-丁醇(Aldrich)的混合物將小鼠麻醉之后，將所述肽通過尾靜脈以250ug/周/小鼠的劑量，以200ul體積緩慢地施用。在麻醉下用測徑器對(duì)腫瘤進(jìn)行三維測定，并用于計(jì)算腫瘤體積(Pasqualini等，如前，1996)。
如圖4a所示，腫瘤體積比對(duì)照組平均小一個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)照組是用非定向的CARAC-GG-D(KLAKLAK)2和非偶聯(lián)的D(KLAKLAK)2和CNGRC(SEQ ID NO8)肽混合物進(jìn)行處理的。如圖4b的進(jìn)一步所示，HPP-1處理組比對(duì)照組的存活期長。一些HPP-1處理的小鼠比對(duì)照組多活幾個(gè)月，表明HPP-1即抑制原發(fā)腫瘤生長又抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。組織病理學(xué)分析證實(shí)腫瘤體系明顯破壞及腫瘤內(nèi)細(xì)胞普遍死亡，這表明細(xì)胞死亡幾乎就是細(xì)胞程序死亡和壞死。在相似的實(shí)驗(yàn)中，HPP-1也有效地抗衍生自人黑素瘤細(xì)胞系C8161的腫瘤(Welch等，Int.J.Cancer 47227-237(1991))。
這些結(jié)果表明歸巢促細(xì)胞程序死亡綴合物如CNGRC-GG-D(KLAKLAK)2(HPP-1)在體內(nèi)具有強(qiáng)抗腫瘤活性。B.CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2的體內(nèi)活性在新生小鼠中用氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管發(fā)生。隨后將小鼠用單一的13ug靜脈內(nèi)劑量的載體(每組一只動(dòng)物)；CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2；或未綴合的CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)和D(KLAKLAK)2的對(duì)照混合物處理。4天后，測定每種處理的視網(wǎng)膜新血管數(shù)。
圖5所示的結(jié)果表明與用單獨(dú)的載體處理的小鼠(1列；黑條)或用未定向的促細(xì)胞程序死亡肽處理的小鼠(3列，陰影線條)相比，視網(wǎng)膜新血管數(shù)在用歸巢促細(xì)胞程序死亡肽CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2(2列，斑紋條)處理的小鼠中減少。尤其地，在用歸巢促細(xì)胞程序死亡肽CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2處理的小鼠中，血管發(fā)生應(yīng)答只是在對(duì)照小鼠中發(fā)生應(yīng)答的30-40％。
這些結(jié)果表明歸巢促細(xì)胞程序死亡肽如CDCRGDCFC-GG-D(KLAKLAK)2可以選擇性抑制血管發(fā)生性應(yīng)答如視網(wǎng)膜新血管化。實(shí)施例4體內(nèi)淘選這個(gè)實(shí)施例闡述了制備噬菌體文庫和使用體內(nèi)淘選方法篩選此文庫，以鑒別表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體的方法。A.制備噬菌體文庫使用融合5載體構(gòu)建噬菌體展示文庫，如Koivunen等所述(如前，1995；Koivunen等，如前，1994b)。制備編碼稱為CX5C(SEQ IDNO9)，CX6C(SEQ ID NO10)，CX7C(SEQ ID NO11)和CX3CX3CX3C(SEQ ID NO12)肽的文庫，其中C表示半胱氨酸，XN表示各個(gè)選擇的氨基酸的給定數(shù)。當(dāng)所述肽中存在至少兩個(gè)半胱氨酸殘基時(shí)，這些文庫可以展示環(huán)狀的肽。另外，還構(gòu)建不含有選定的氨基酸殘基的文庫。這種文庫產(chǎn)生初級(jí)的線性肽，盡管環(huán)狀肽也隨機(jī)發(fā)生。
還構(gòu)建一個(gè)基于序列CXXXNGRXX(SEQ ID NO13)的偏倚文庫。另外，在一些情況中，通過在NGR序列兩側(cè)摻入半胱氨酸殘基，使CXXXNGRXX(SEQ ID NO13)文庫進(jìn)一步偏倚，即成為CXXCNGRCX(SEQ ID NO14；見表2)。
使用構(gòu)建的寡核苷酸產(chǎn)生含有選定半胱氨酸殘基的文庫，這樣C由密碼子TGT編碼，XN由NNK編碼，其中N是A，C，G和T的等摩爾混合物，K是G和T的等摩爾混合物。這樣，由CX5C(SEQID NO9)表示的肽可以用具有序列TGT(NNK)5TGT(SEQ ID NO14)的寡核苷酸表示。通過3次PCR擴(kuò)增，純化及在融合5載體中連于編碼基因III蛋白的核酸，產(chǎn)生雙鏈的寡核苷酸，這樣，基于表達(dá)，所述肽作為融合蛋白呈遞于基因III蛋白的N末端。
將所述載體通過電穿孔轉(zhuǎn)染入MC1061細(xì)胞中。將細(xì)菌在存在20ug/ml四環(huán)素的情況下培養(yǎng)24小時(shí)，然后從用聚乙二醇沉淀兩次的上清中收集噬菌體。每個(gè)文庫含有大約5×109至5×1019個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU；單獨(dú)的重組噬菌體)。B.體內(nèi)淘選噬菌體將腫瘤移植到小鼠體內(nèi)，如以下實(shí)施例5和6所述。將含有1×109-1×1014TU的噬菌體文庫混合物在200ul DMEM中稀釋，然后注射入麻醉的小鼠的尾靜脈中(AVERTIN(0.015ml/g)；見美國專利No.5,622,699；Pasqualini和Ruoslahti，如前，1996)。在1-4分鐘后，將小鼠速凍于液氮中。為回收噬菌體，將小鼠尸體在室溫部分解凍1小時(shí)，收集腫瘤和對(duì)照器官并稱重，然后在1ml DMEM-PI(含有蛋白酶抑制劑(PI)的DMEM)；苯甲基磺酰氟(PMSF；1mM)，抑蛋白酶肽(20ug/ml)，亮抑蛋白酶肽(1ug/ml))中研磨。
或者，在將文庫導(dǎo)入小鼠后，通過心臟灌注終止循環(huán)。簡而言之，將小鼠用AVERTIN麻醉，然后將心臟暴露并將通過0.5mm套管與10cc注射器連接的0.4mm針頭插入左心室中。在右心房作一切口，緩慢施用5-10ml的DMEM，灌注整個(gè)機(jī)體大約需要5-10分鐘以上的時(shí)間。通過組織學(xué)分析直接監(jiān)測灌注效力。
將腫瘤和器官樣品用冰凍的含有1％胎牛血清白蛋白(BSA)的DMEM-PI沖洗3次，然后用1ml K91-kan細(xì)菌直接溫育1小時(shí)。將10ml含有0.2ug/ml四環(huán)素的NZY培養(yǎng)基(NZY/tet)加入細(xì)菌培養(yǎng)物中，將混合物在37℃搖瓶中溫育1小時(shí)，然后將10ul或100ul等分鋪板于含有12.5ug/ml四環(huán)素的瓊脂鋪板(tet/瓊脂)中。將回收自腫瘤的含有噬菌體的各個(gè)集落在5ml NZY/tet中生長16小時(shí)。集合得自各個(gè)集落的細(xì)菌培養(yǎng)物，并將噬菌體純化及如上述再注射入小鼠中，進(jìn)行第二次體內(nèi)淘選。通常地，還進(jìn)行第三次體內(nèi)淘選。從得自最后一次體內(nèi)淘選的各個(gè)細(xì)菌集落中純化噬菌體DNA，測定編碼由選擇的噬菌體表達(dá)的肽的DNA序列(見Koivunen等，如前，1994b)。實(shí)施例5通過對(duì)乳腺腫瘤體內(nèi)淘選鑒別腫瘤歸巢肽整個(gè)實(shí)施例表明可以對(duì)乳腺腫瘤進(jìn)行體內(nèi)淘選，以鑒別歸巢各種腫瘤的腫瘤歸巢肽。
將人435乳腺癌細(xì)胞(Price等，癌癥研究50717-721(1990))接種于裸鼠乳房脂肪層中。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到大約1cm時(shí)，進(jìn)行噬菌體定向?qū)嶒?yàn)，其中將表達(dá)特異性肽的噬菌體施用于攜帶腫瘤的小鼠，或者進(jìn)行體內(nèi)淘選。將攜帶乳腺腫瘤的小鼠注射表達(dá)CX3CX3CX3C(SEQ ID NO12)肽文庫的1×109噬菌體，其中X3表示單獨(dú)選擇的3組隨機(jī)氨基酸。使噬菌體循環(huán)4分鐘，然后將小鼠麻醉，在麻醉下在液氮中速凍，及取出腫瘤。從腫瘤中分離噬菌體并進(jìn)行兩次體內(nèi)淘選。
表2來自回收自人乳腺癌的噬菌體的肽CGRECPRLCQSSC (2*) CNGRCVSGCAGRC (3)CGEACGGQCALPC (20) IWSGYGVYW (21)PSCAYMCIT (22) WESLYFPRE (23)SKVLYYNWE (24) CGLMCQGACFDVC (25)CERACRNLCREGC (26) CPRGCLAVCVSQC (27)CKVCNGRCCG (28)CEMCNGRCMG (29)CPLCNGRCAL (30)CPTCNGRCVR (31)CGVCNGRCGL (32)CEQCNGRCGQ (33)CRNCNGRCEG (34)CVLCNGRCWS (35)CVTCNGRCRV (36)CTECNGRCQL (37)CRTCNGRCLE (38)CETCNGRCVG (39)CAVCNGRCGF (40)CRDLNGRKVM (41)CSCCNGRCGD (42)CWGCNGRCRM (43)CPLCNGRCAR (44)CKSCNGRCLA (45)CVPCNGRCHE (46)CQSCNGRCVR (47)CRTCNGRCQV (48)CVQCNGRCAL (49)CRCCNGRCSP (50)CASNNGRVVL (51)CGRCNGRCLL (52)CWLCNGRCGR (53)CSKCNGRCGH (54)CVWCNGRCGL (55)CIRCNGRCSV (56)CGECNGRCVE (57)CEGVNGRRLR (58)CLSCNGRCPS (59)CEVCNGRCAL (60)CGSLVRC (5)GRSQMQI (61) HHTRFVS (62)SKGLRHR (63) VASVSVA (64) WRVLAAF (65)KMGPKVW (66) IFSGSRE (67) SPGSWTW (68)NPRWFWD (69) GRWYKWA (70) IKARASP (71)SGWCYRC (72) ALVGLMR (73) LWAEMTG (74)CWSGVDC (75) DTLRLRI (76) SKSSGVS (77)IVADYQR (78) VWRTGHL (79) VVDRFPD (80)LSMFTRP (81) GLPVKWS (82) IMYPGWL (83)CVMVRDGDC (84) CVRIRPC (85) CQLAAVC (86)CGVGSSC (87) CVSGPRC (88) CGLSDSC (89)CGEGHPC (90) CYTADPC (91) CELSLISKC (92)CPEHRSLVC (93) CLVVHEAAC (94) CYVELHC (95)CWRKFYC (96) CFWPNRC (97) CYSYFLAC (98)CPRGSRC (99) CRLGIAC (100) CDDSWKC (101)CAQLLQVSC (102)CYPADPC (103) CKALSQAC (104)CTDYVRC (105) CGETMRC (106)*-括號(hào)中的數(shù)字表示SEQ ID NO。
在經(jīng)過第三次淘選后，將噬菌體定量并確定由克隆的噬菌體表達(dá)的肽序列?？寺〉氖删w表達(dá)各種不同的肽，包括表2所示那些肽。相似地，篩選CX7C(SEQ ID NO11)和CX5C(SEQ ID NO9)文庫，并鑒別歸巢乳腺腫瘤的肽(表2)。這些結(jié)果表明對(duì)乳腺腫瘤的體內(nèi)淘選可以鑒別腫瘤歸巢分子。實(shí)施例6將表達(dá)RGD肽的噬菌體在體內(nèi)定向于腫瘤將人435乳腺癌細(xì)胞接種于裸鼠的乳房脂肪層中。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到大約1cm時(shí)，將表達(dá)特異性的含有RGD的肽的噬菌體施用于攜帶腫瘤的小鼠。用攜帶通過移植人黑素瘤C8161細(xì)胞或移植小鼠B16黑素瘤細(xì)胞形成的腫瘤的裸鼠也可以獲得與如下所述相似的結(jié)果。
將表達(dá)含有RGD的肽CDCRGDCFC(SEQ ID NO1；見Koivunen等，如前，1995)的1×109個(gè)噬菌體或?qū)φ?無插入體)噬菌體，靜脈內(nèi)(iv)注射至小鼠體內(nèi)，并使其循環(huán)4分鐘。然后將小鼠速凍或在麻醉下通過心臟灌注，切取各種器官包括腫瘤，腦和腎，并對(duì)器官中存在的噬菌體進(jìn)行定量(見美國專利No.5,622,699；Pasqualini和Ruoslahti，如前，1996)。
與在腦和腎臟中相比，表達(dá)CDCRGDCFC(SEQ ID NO1)肽的噬菌體在乳腺腫瘤中的表達(dá)大約多2-3倍，表明CDCRGDCFC (SEQID NO1；RGD噬菌體)肽使所述噬菌體選擇性歸巢乳腺腫瘤。在一個(gè)平行研究中，將表達(dá)各種不同肽的未選擇的噬菌體注射至攜帶腫瘤的小鼠中，并檢測各種器官中噬菌體存在情況。與在腫瘤中相比，在腎臟中存在噬菌體非常多，在腦中較少一些。因此，表達(dá)RGD的噬菌體在腫瘤中比未選擇的噬菌體濃縮80倍。這些結(jié)果表明表達(dá)含有RGD的肽的噬菌體歸巢腫瘤，可能歸因于αvβ3整聯(lián)蛋白在腫瘤中形成的血管上的表達(dá)。
歸巢乳腺腫瘤的肽的特異性是通過競爭實(shí)驗(yàn)證實(shí)的，其中與表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體一起注射500ug游離肽ACDCRGDCFCG(SEQ ID NO16；見Pasqualini等，如前，1997)，使腫瘤中噬菌體的數(shù)量降低大約10倍，而與失活的對(duì)照肽GRGESP(SEQ ID NO17)一起注射基本沒有作用。這些結(jié)果表明展示可結(jié)合在血管發(fā)生性血管上表達(dá)的整聯(lián)蛋白的肽的噬菌體，可選擇性在體內(nèi)歸巢器官或組織如含有這種血管的腫瘤。實(shí)施例7對(duì)腫瘤歸巢肽進(jìn)行免疫組織學(xué)分析這個(gè)實(shí)施例提供了一種通過免疫組織學(xué)檢測鑒別腫瘤歸巢分子定位的方法。
表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體的定位是在組織切片中通過免疫化學(xué)方法鑒別的，所述切片是在將表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體(肽-噬菌體)施用于攜帶腫瘤的小鼠后5分鐘或24小時(shí)后獲得的。針對(duì)施用肽-噬菌體后5分鐘獲得的樣品，將小鼠用DMEM灌注并切除各種器官包括腫瘤，固定于Bouin′s溶液中。針對(duì)在施用24小時(shí)后獲得的樣品，在循環(huán)中沒有肽-噬菌體殘留，因此不需灌注。制備組織切片并與抗M13(噬菌體)反應(yīng)(Pharmacia Biotech；見美國專利No.5,622,699；Pasqualini和Ruoslahti，如前1996)。使用過氧化物酶綴合的二級(jí)抗體(Sigma；St.Louis MO)，根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)進(jìn)行觀測結(jié)合的抗M13抗體。
如實(shí)施例6所揭示，將表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體CDCRGDCFC(SEQ ID NO1；RGD噬菌體)，經(jīng)靜脈內(nèi)施用于攜帶乳腺腫瘤的小鼠體內(nèi)。另外，將此RGD噬菌體施用于攜帶小鼠黑素瘤或人Kaposi′s肉瘤的小鼠體內(nèi)。如上述終止噬菌體循環(huán)及處死小鼠，并收集腫瘤，腫瘤附近的皮膚樣品，腦，腎，肺和肝樣品。
對(duì)噬菌體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色示出RGD噬菌體積聚在乳腺腫瘤以及黑素瘤和Kaposi′s肉瘤的血管中，而在對(duì)照器官中只有少量或沒有RGD噬菌體積聚。
使用表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體CNGRCVSGCAGRC(SEQ IDNO3；NGR噬菌體)進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)，這個(gè)噬菌體是在抗通過MDA-MB-435形成的腫瘤進(jìn)行的體內(nèi)淘選鑒別的。在這些實(shí)驗(yàn)中，將NGR噬菌體或不表達(dá)肽的對(duì)照噬菌體施用于攜帶腫瘤的小鼠體內(nèi)，所述腫瘤是由MDA-MB-435乳腺癌或人SLK Kaposi′s肉瘤異種移植體形成的，然后將小鼠如上述處死，收集腫瘤以及對(duì)照器官，包括腦，淋巴結(jié)，腎，胰腺，子宮，乳房脂肪層，肺，小腸，皮膚，骨骼肌，心臟和腎盂，膀胱，及輸尿管的上皮。制備組織學(xué)樣品并通過如上述免疫染色進(jìn)行檢測。
在得自施用NGR噬菌體4分鐘后處死的小鼠的樣品中，對(duì)乳腺腫瘤和Kaposi′s肉瘤的血管的免疫染色均進(jìn)行觀測。在施用無插入體的對(duì)照噬菌體的小鼠的內(nèi)皮中觀測到非常少的或沒有染色。在得自施用NGR噬菌體后24小時(shí)處死的小鼠的樣品中，腫瘤樣品的染色遍布于血管外側(cè)，及乳腺腫瘤實(shí)質(zhì)和Kaposi′s肉瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)。
再一次，在從施用無插入體的對(duì)照噬菌體的小鼠的這些腫瘤中制備的樣品中，觀測到很少的或沒有染色。另外，在施用NGR噬菌體的對(duì)照小鼠的各種對(duì)照器官中也只觀測到很少的或沒有染色。
在其它實(shí)驗(yàn)中，在將表達(dá)NGR腫瘤歸巢肽的噬菌體NGRAHA(SEQ ID NO6)或CVLNGRMEC(SEQ ID NO7)，施用于攜帶腫瘤的小鼠后，獲得相似結(jié)果。同樣，如下所述，施用表達(dá)GSL腫瘤歸巢肽的噬菌體CLSGSLSC(SEQ ID NO4)獲得相似結(jié)果，這種噬菌體是通過體內(nèi)淘選黑素瘤鑒別的(見實(shí)施例8)。
這些結(jié)果證實(shí)腫瘤歸巢肽選擇性歸巢腫瘤，尤其腫瘤的血管，而且例如通過體內(nèi)抗乳腺腫瘤淘選而鑒別的腫瘤歸巢肽，也選擇性歸巢其它腫瘤，包括Kaposi′s肉瘤和黑素瘤。另外，這些結(jié)果證實(shí)免疫組織化學(xué)分析提供了一種鑒別表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體的定位的常規(guī)方法。實(shí)施例8通過體內(nèi)抗黑素瘤淘選鑒別腫瘤歸巢肽通過進(jìn)行體內(nèi)抗移植的小鼠黑素瘤的淘選，檢測體內(nèi)淘選方法鑒別腫瘤歸巢肽的普遍適應(yīng)性。
攜帶黑素瘤的小鼠是通過移植B16B15b小鼠黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，所述黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生高度血管化的腫瘤。將B16B15b小時(shí)黑素瘤細(xì)胞皮下注射到裸鼠(2個(gè)月大)的乳房脂肪層中，并使腫瘤生長直至直徑為大約1cm。
如上所述進(jìn)行體內(nèi)淘選。
將大約1×1012轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的表達(dá)CX5C(SEQ ID NO9)，CX6C(SEQ ID NO10)or CX7C(SEQ ID NO11)文庫的噬菌體，經(jīng)靜脈內(nèi)注射，并使其循環(huán)4分鐘。然后將小鼠在液氮中速凍或在麻醉下將液氮通過心臟灌注，除去腫瘤組織和腦(對(duì)照器官)，并如上述分離噬菌體。進(jìn)行3次體內(nèi)淘選。
表3來自回收自小鼠B16B15b黑素瘤的噬菌體的肽CLSGSLSC (4*) GICKDDWCQ (107)TSCDPSLCE (108)KGCGTRQCW (109)YRCREVLCQ (110)CWGTGLC (111)WSCADRTCM (112)AGCRLKSCA (113)SRCKTGLCQ (114)PICEVSRCW (115)WTCRASWCS (116)GRCLLMQCR (117)TECDMSRCM (118)ARCRVDPCV (119)CIEGVLGGC (120)CSVANSC (121) CSSTMRC (122) SIDSTTF (123)GPSRVGG (124) WWSGLEA (125) LGTDVRQ (126)LVGVRLL (127) GRPGDIW (128) TVWNPVG (129)GLLLVVP (130) FAATSAE (131) WCCRQFN (132)VGFGKAL (133) DSSLRLP (134) KLWCAMS (135)SLVSFLG (136) GSFAFLV (137) IASVRWA (138)TWGHLRA (139) QYREGLV (140) QSADRSV (141)YMFWTSR (142) LVRRWYL (143) TARGSSR (144)TTREKNL (145) PKWLLFS (146) LRTNVVH (147)AVMGLAA (148) VRNSLRN (149)*-括號(hào)中的數(shù)字表示SEQ ID NO
在回收自B16B15b腫瘤的89個(gè)克隆的噬菌體中測定氨基酸序列中插入體情況。由這些噬菌體表達(dá)的肽以兩種主要序列表示CLSGSLSC(SEQ ID NO4；測序克隆的52％)和WGTGLC(SEQ IDNO18；克隆的25％；見表3)。再次感染表達(dá)選擇的肽之一的噬菌體，相比之下噬菌體歸巢腫瘤比腦高接近3倍。
表達(dá)腫瘤歸巢肽的噬菌體在小鼠器官中的定位，也通過對(duì)腫瘤和其它各種組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行檢測(見實(shí)施例7)。在這些實(shí)驗(yàn)中，將1×109pfu的對(duì)照(無插入體)噬菌體或表達(dá)腫瘤歸巢肽CLSGSLSC(SEQ ID NO4)的噬菌體，經(jīng)靜脈內(nèi)注射入攜帶腫瘤的小鼠中，并使其循環(huán)4分鐘。
在得自用表達(dá)CLSGSLSC(SEQ ID NO4)腫瘤歸巢肽的噬菌體注射的小鼠的黑素瘤中，免疫染色明顯。黑素瘤的染色通常定位于腫瘤內(nèi)的血管，盡管一些染色也位于腫瘤實(shí)質(zhì)中。在得自用無插入體的對(duì)照噬菌體注射的小鼠的腫瘤中，或在得自用任一種噬菌體注射的小鼠的皮膚或腎樣品中，基本觀測不到染色。
然而，在肝臟sinusoids和脾中檢測到免疫染色，表明噬菌體可以非特異性地被含有RES的器官捕獲。
使用相似的方法，在攜帶SLK人Kaposi′s肉瘤的小鼠中進(jìn)行體內(nèi)淘選。
鑒別腫瘤歸巢肽并示于表4。這些結(jié)果表明體內(nèi)淘選方法是一種篩選噬菌體文庫，以鑒別表達(dá)腫瘤歸巢肽的普遍適用的方法。
表4來自回收自人KAPOSI′S肉瘤的噬菌體的肽TDCTPSRCT (150*) SWCQFEKCL (151)VPCRFKQCW (152)CTAMRNTDC (153)CRESLKNC (154) CMEMGVKC (155)VTCRSLMCQ (156)CNNVGSYC (157) CGTRVDHC (158)CISLDRSC (159) CAMVSMED (160) CYLGVSNC (161)CYLVNVDC (162) CIRSAVSC (163) LVCLPPSCE (164)RHCFSQWCS (165)FYCPGVGCR (166)ISCAVDACL (167)EACEMAGCL (168)PRCESQLCP (169)RSCIKHQCP (170)QWCSRRWCT (171)MFCRMRSCD (172)GICKDLWCQ (173)NACESAICG (174)APCGLLACI (175)NRCRGVSCT (176)FPCEGKKCL (177)ADCRQKPCL (178)FGCVMASCR (179)AGCINGLCG (180)RSCAEPWCY (181)DTCRALRCN (182)KGCGTRQCW (109)GRCVDGGCT (183)YRCIARECE (184)KRCSSSLCA (185)ICLLAHCA (186) QACPMLLCM (187)LDCLSELCS (188)AGCRVESC (189) HTCLVALCA (190)IYCPGQECE (191)RLCSLYGCV (192)RKCEVPGCQ (193)EDCTSRFCS (194)LECVVDSCR (195)EICVDGLCV (196)RWCREKSCW (197)FRCLERVCT (198)RPCGDQACE (199)CNKTDGDEGVTC (15)*括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示SEQ ID NO。實(shí)施例9對(duì)由前列腺歸巢肽和D(KLAKLAK)2組成的嵌合肽進(jìn)行定性這個(gè)實(shí)施例證實(shí)嵌合肽SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2，在全身施用后可以在前列腺組織中選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡，并可以延長具有實(shí)驗(yàn)性前列腺癌的動(dòng)物的存活時(shí)間。A.分離前列腺歸巢肽將一種X7文庫注射入小鼠中，并分離相比之下在前列腺而不是腦中優(yōu)先發(fā)現(xiàn)的序列，如WO 99/46284所述。相比之下，前列腺歸巢肽SMSIARL(SEQ ID NO207)和VSFLEYR(SEQ ID NO222)的前列腺中比在腦中分別富集34倍和17倍。通過體內(nèi)淘選鑒別的其它歸巢前列腺序列示于表5。
表5來自回收自前列腺的噬菌體的肽EVQSAKW(209) KRVYVLG(210)GRLSVQV(211) WKPASLS(212)FAVRVVG(213) LVRPLEG(214)GFYRMLG(215) EGRPMVY(216)GSRSLGA(217) RVWQGDV(218)GDELLA(219) FVWLVGS(220)GSEPMFR(221) VSFLEYR(222)WHQPL(223)SMSIARL*(207)RGRWLAL*(224)QVEEFPC(225)LWLSGNW(226) GPMLSVM(227)WTFLERL(228) VLPGGQW(229)REVKES(230) RTPAAVM(231)GEWLGEC(232) PNPLMPL(233)SLWYLGA(234) YVGGWEL(235)括號(hào)內(nèi)數(shù)字前有SEQ ID NO。*表示不止一次分離的序列。B.前列腺歸巢肽生物素綴合物的歸巢前列腺功能使用體內(nèi)篩選一種七肽噬菌體文庫，鑒別了一種前列腺歸巢肽，其在前列腺比在其它組織中濃縮35倍。這個(gè)噬菌體展示肽SMSIARL(SEQ ID NO207)。聯(lián)合注射合成的肽SMSIARL(SEQ ID NO207)，抑制攜帶SMSIARL(SEQ ID NO207)的噬菌體對(duì)前列腺的選擇性歸巢。
另外，在將噬菌體經(jīng)靜脈內(nèi)注射入小鼠后，對(duì)組織切片進(jìn)行的抗體染色示出SMSIARL(SEQ ID NO207)噬菌體定位于前列腺組織，但不定位于其它組織。對(duì)照噬菌體也不在前列腺中積聚。SMSIARL(SEQ ID NO207)噬菌體還歸巢大鼠前列腺組織。
如圖6所示，生物素綴合的SMSIARL(SEQ ID NO207)合成肽示出歸巢前列腺。簡而言之，將1mg生物素綴合的前列腺歸巢肽SMSIARL(SEQ ID NO207)或生物素標(biāo)記的對(duì)照肽CARAC(SEQID NO208)，經(jīng)靜脈內(nèi)注射入小鼠體內(nèi)，10分鐘后將其處死。收集前列腺和其它組織，切片并用親和素-過氧化物酶染色加工。在全身性注射綴合物之后10分鐘，生物素染色就主要在腺體內(nèi)腔中發(fā)現(xiàn)而不是在血管中。這些結(jié)果表明SMSIARL(SEQ ID NO207)肽，以及附著于其的其它基序如噬菌體或生物素，轉(zhuǎn)位于前列腺上皮然后進(jìn)入腺腔內(nèi)。C.誘導(dǎo)前列腺選擇性細(xì)胞程序死亡分析SMSIARL(SEQ ID NO207)肽將促細(xì)胞程序死亡肽KLAKLAK輸送于前列腺的能力。簡而言之，將SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2嵌合肽或?qū)φ瘴镆?50ug肽/小鼠的單一劑量施用，并對(duì)在24小時(shí)后獲得的組織進(jìn)行TUNEL染色。如圖7所示，用SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2綴合物注射的小鼠示出在其前列腺中細(xì)胞程序死亡增強(qiáng)，尤其在前列腺的毛細(xì)管內(nèi)皮及基底肌上皮細(xì)胞中。在其它組織中沒有細(xì)胞程序死亡增強(qiáng)的跡象，如在睪丸，腎或腦中。在用250ug未綴合的SMSIARL(SEQ ID NO207)和D(KLAKLAK)2的混合物注處理的陰性對(duì)照小鼠中未觀測到細(xì)胞程序死亡。D.用SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2處理TRAMP小鼠TRAMP小鼠在轉(zhuǎn)基因的影響下發(fā)生前列腺癌，如Gingrich等，如前，1996。分析SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2嵌合肽抑制TRAMP小鼠中癌癥發(fā)生的能力。將12周齡的小鼠(10只/組)接受250ug/劑的SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2肽或?qū)φ针?，隔周一次?0次。將4只無可觀測的腫瘤的小鼠，從注射后幾分鐘之內(nèi)死亡后的SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2組中除去。如圖8所示，經(jīng)SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2處理的小鼠的存活時(shí)間長于對(duì)照組小鼠。對(duì)照組是只用D(KLAKLAK)2肽或SMSIARL(SEQ ID NO207)肽處理的。因此，用定向的促細(xì)胞程序死亡的SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2化合物處理的TRAMP小鼠，在經(jīng)過幾個(gè)月之后處理的小鼠的存活時(shí)間比對(duì)照組小鼠明顯延長。E.歸巢前列腺的SMSIARL(SEO ID NO207)噬菌體結(jié)合人前列腺血管將含有正常組織和癌組織的人前列腺組織切片用109TUSMSIARL(SEQ ID NO207)噬菌體覆蓋，并用抗噬菌體抗體檢測噬菌體結(jié)合并進(jìn)行過氧化物酶染色。如圖9所示，SMSIARL(SEQ IDNO207)噬菌體結(jié)合人前列腺血管的內(nèi)皮(見a組和b組)。施用不含有肽插入體的噬菌體的實(shí)驗(yàn)組觀測到?jīng)]有內(nèi)皮細(xì)胞染色(c組)。另外，當(dāng)覆蓋層中包括0.3mg/ml可溶的SMSIARL肽(SEQ ID NO207)時(shí)，SMSIARL(SEQ ID NO207)-噬菌體染色受抑制。示于圖9的結(jié)果表明至少一些腫瘤保留歸巢肽的受體。另外，肽(SEQ IDNO207)可以結(jié)合前列腺癌內(nèi)的血管，而一些其它人體組織中的血管不被SMSIARL(SEQ ID NO207)噬菌體染色。
上述在括號(hào)中或以其它形式引用的所有雜志文章，參考資料和專利均在此并入?yún)⒖肌?br> 盡管本發(fā)明已經(jīng)參考上述實(shí)施例加以闡述，但應(yīng)意識(shí)到在不偏離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)可以對(duì)本發(fā)明加以各種修改。因此，本發(fā)明只由以下權(quán)利要求限制。
序列表<110>伯納姆研究所<120>具有促細(xì)胞程序死亡活性的嵌合前列腺歸巢肽<130>FP-LJ 5311<150>US 09/489,582<151>2000-01-21<150>PCT/US01/01362<151>2001-01-16<160>235<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>1Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys1 5<210>2<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>2Cys Gly Arg Glu Cys Pro Arg Leu Cys Gln Ser Ser Cys1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>3Cys Asn Gly Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys1 5 10<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>4Cys Leu Ser Gly Ser Leu Ser Cys1 5<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>5Cys Gly Ser Leu Val Arg Cys1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>6Asn Gly Arg Ala His Ala1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>7Cys Val Leu Asn Gly Arg Met Glu Cys1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>8Cys Asn Gly Arg Cys1 5<210>9<220><223>合成肽<400>9000<210>10<220><223>合成肽<400>10000<210>11<220><223>合成肽<400>11000<210>12<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>VARIANT<222>(1)...(13)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>12Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys1 5 10<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>VARIANT<222>(1)...(9)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>13Cys Xaa Xaa Xaa Asn Gly Arg Xaa Xaa1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<221>VARIANT<222>(1)...(9)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>14Cys Xaa Xaa Cys Asn Gly Arg Cys Xaa1 5<210>15<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>15Cys Asn Lys Thr Asp Gly Asp Glu Gly Val Thr Cys1 5 10<210>16<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>16Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly1 5 10<210>17<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>17Gly Arg Gly Glu Ser Pro1 5<210>18<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>18Trp Gly Thr Gly Leu Cys1 5<210>19<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>19Gly Ala Cys Val Phe Ser Ile Ala His Glu Cys Gly Ala1 5 10<210>20<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>20Cys Gly Glu Ala Cys Gly Gly Gln Cys Ala Leu Pro Cys1 5 10<210>21<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>21Ile Trp Ser Gly Tyr Gly Val Tyr Trp1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>22Pro Ser Cys Ala Tyr Met Cys Ile Thr1 5<210>23<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>23Trp Glu Ser Leu Tyr Phe Pro Arg Glu1 5<210>24<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>24Ser Lys Val Leu Tyr Tyr Asn Trp Glu1 5<210>25<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>25Cys Gly Leu Met Cys Gln Gly Ala Cys Phe Asp Val Cys1 5 10<210>26<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>26Cys Glu Arg Ala Cys Arg Asn Leu Cys Arg Glu Gly Cys1 5 10<210>27<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>27Cys Pro Arg Gly Cys Leu Ala Val Cys Val Ser Gln Cys1 5 10<210>28<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>28Cys Lys Val Cys Asn Gly Arg Cys Cys Gly1 5 10<210>29<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>29Cys Glu Met Cys Asn Gly Arg Cys Met Gly1 5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>30Cys Pro Leu Cys Asn Gly Arg Cys Ala Leu1 5 10<210>31<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>31Cys Pro Thr Cys Asn Gly Arg Cys Val Arg1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>32Cys Gly Val Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu1 5 10<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>33Cys Glu Gln Cys Asn Gly Arg Cys Gly Gln1 5 10<210>34<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>34Cys Arg Asn Cys Asn Gly Arg Cys Glu Gly1 5 10<210>35<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>35Cys Val Leu Cys Asn Gly Arg Cys Trp Ser1 5 10<210>36<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>36Cys Val Thr Cys Asn Gly Arg Cys Arg Val1 5 10<210>37<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>37Cys Thr Glu Cys Asn Gly Arg Cys Gln Leu1 5 10<210>38<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>38Cys Arg Thr Cys Asn Gly Arg Cys Leu Glu1 5 10<210>39<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>39Cys Glu Thr Cys Asn Gly Arg Cys Val Gly1 5 10<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>40Cys Ala Val Cys Asn Gly Arg Cys Gly Phe1 5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>41Cys Arg Asp Leu Asn Gly Arg Lys Val Met1 5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>42Cys Ser Cys Cys Asn Gly Arg Cys Gly Asp1 5 10<210>43<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>43Cys Trp Gly Cys Asn Gly Arg Cys Arg Met1 5 10<210>44<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>44Cys Pro Leu Cys Asn Gly Arg Cys Ala Arg1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>45Cys Lys Ser Cys Asn Gly Arg Cys Leu Ala1 5 10<210>46<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>46Cys Val Pro Cys Asn Gly Arg Cys His Glu1 5 10<210>47<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>47Cys Gln Ser Cys Asn Gly Arg Cys Val Arg1 5 10<210>48<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>48Cys Arg Thr Cys Asn Gly Arg Cys Gln Val1 5 10<210>49<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>49Cys Val Gln Cys Asn Gly Arg Cys Ala Leu1 5 10<210>50<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>50Cys Arg Cys Cys Asn Gly Arg Cys Ser1 5<210>51<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>51Cys Ala Ser Asn Asn Gly Arg Val Val Leu1 5 10<210>52<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>52Cys Gly Arg Cys Asn Gly Arg Cys Leu Leu1 5 10<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>53Cys Trp Leu Cys Asn Gly Arg Cys Gly Arg1 5 10<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>54Cys Ser Lys Cys Asn Gly Arg Cys Gly His1 5 10<210>55<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>55Cys Val Trp Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu1 5 10<210>56<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>56Cys Ile Arg Cys Asn Gly Arg Cys Ser Val1 5 10<210>57<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>57Cys Gly Glu Cys Asn Gly Arg Cys Val Glu1 5 10<210>58<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>58Cys Glu Gly Val Asn Gly Arg Arg Leu Arg1 5 10<210>59<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>59Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Pro Ser1 5 10<210>60<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>60Cys Glu Val Cys Asn Gly Arg Cys Ala Leu1 5 10<210>61<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>61Gly Arg Ser Gln Met Gln Ile1 5<210>62<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>62His His Thr Arg Phe Val Ser1 5<210>63<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>63Ser Lys Gly Leu Arg His Arg1 5<210>64<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>64Val Ala Ser Val Ser Val Ala1 5<210>65<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>65Trp Arg Val Leu Ala Ala Phe1 5<210>66<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>66Lys Met Gly Pro Lys Val Trp1 5<210>67<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>67Ile Phe Ser Gly Ser Arg Glu1 5<210>68<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>68Ser Pro Gly Ser Trp Thr Trp1 5<210>69<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>69Asn Pro Arg Trp Phe Trp Asp1 5<210>70<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>70Gly Arg Trp Tyr Lys Trp Ala1 5<210>71<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>71Ile Lys Ala Arg Ala Ser Pro1 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5<210>210<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>210Lys Arg Val Tyr Val Leu Gly1 5<210>211<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>211Gly Arg Leu Ser Val Gln Val1 5<210>212<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>212Trp Lys Pro Ala Ser Leu Ser1 5<210>213<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>213Phe Ala Val Arg Val Val Gly1 5<210>214<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>214Leu Val Arg Pro Leu Glu Gly1 5<210>215<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>215Gly Phe Tyr Arg Met Leu Gly1 5<210>216<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>216Glu Gly Arg Pro Met Val Tyr1 5<210>217<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>217Gly Ser Arg Ser Leu Gly Ala1 5<210>218<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>218Arg Val Trp Gln Gly Asp Val1 5<210>219<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>219Gly Asp Glu Leu Leu Ala1 5<210>220<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>220Phe Val Trp Leu Val Gly Ser1 5<210>221<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>221Gly Ser Glu Pro Met Phe Arg1 5<210>222<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>222Val Ser Phe Leu Glu Tyr Arg1 5<210>223<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>223Trp His Gln Pro Leu1 5<210>224<211>7<212>PRT<213>e人工序列<220><223>合成肽<400>224Arg Gly Arg Trp Leu Ala Leu1 5<210>225<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>225Gln Val Glu Glu Phe Pro Cys1 5<210>226<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>226Leu Trp Leu Ser Gly Asn Trp1 5<210>227<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>227Gly Pro Met Leu Ser Val Met1 5<210>228<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>228Trp Thr Phe Leu Glu Arg Leu1 5<210>229<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>229Val Leu Pro Gly Gly Gln Trp1 5<210>230<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>230Arg Glu Val Lys Glu Ser1 5<210>231<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>231Arg Thr Pro Ala Ala Val Met1 5<210>232<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>232Gly Glu Trp Leu Gly Glu Cys1 5<210>233<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>233Pro Asn Pro Leu Met Pro Leu1 5<210>234<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>234Ser Leu Trp Tyr Leu Gly Ala1 5<210>235<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成肽<400>235Tyr Val Gly Gly Trp Glu Leu1 權(quán)利要求
1.一種嵌合促細(xì)胞程序死亡的前列腺歸巢肽，其包含連接于一種抗微生物肽的前列腺歸巢肽，所述嵌合肽由前列腺組織選擇性內(nèi)在化，并對(duì)前列腺組織呈現(xiàn)高毒性，所述抗微生物肽當(dāng)不與所述前列腺歸巢肽連接時(shí)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞呈現(xiàn)低毒性。
2.權(quán)利要求1的嵌合肽，其中所述前列腺歸巢肽包含序列SMSIARL(SEQ ID NO207)，或功能等價(jià)序列。
3.權(quán)利要求1的嵌合肽，其中所述抗微生物肽具有兩親性α螺旋。
4.權(quán)利要求1的嵌合肽，其中所述抗微生物肽包含選自以下一組的一種序列(KLAKLAK)2(SEQ ID NO200)，(KLAKKLA)2(SEQ ID NO201)，(KAAKKAA)2(SEQ ID NO202)，和(KLGKKLG)2(SEQ ID NO203)。
5.權(quán)利要求1的嵌合肽，其中所述抗微生物肽包含序列D(KLAKLAK)2。
6.權(quán)利要求5的嵌合肽，包含序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
7.權(quán)利要求6的嵌合肽，由序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2組成。
8.一種將抗微生物肽在體內(nèi)定向到前列腺癌的方法，包含施用權(quán)利要求1的嵌合肽。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述前列腺歸巢肽包含序列SMSIARL(SEQ ID NO207)，或功能等價(jià)序列。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗微生物肽包含序列D(KLAKLAK)2。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述嵌合肽包含序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述嵌合肽是SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
13.一種在前列腺癌中誘導(dǎo)體內(nèi)選擇性活性的方法，包括為患有前列腺癌的個(gè)體施用權(quán)利要求1的嵌合肽。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述前列腺歸巢肽包含序列SMSIARL(SEQ ID NO207)，或功能等價(jià)序列。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述抗微生物肽包含序列D(KLAKLAK)2。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述嵌合肽包含序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述嵌合肽是SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
18.一種治療患有前列腺癌的患者的方法，包括為患者施用權(quán)利要求1的嵌合肽，從而所述嵌合肽對(duì)所述腫瘤具有選擇性毒性。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述前列腺歸巢肽包含序列SMSIARL(SEQ ID NO207)，或功能等價(jià)序列。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述抗微生物肽包含序列D(KLAKLAK)2。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述嵌合肽包含序列SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述嵌合肽是SMSIARL-GG-D(KLAKLAK)2。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有促細(xì)胞程序死亡活性的嵌合前列腺歸巢肽。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述促細(xì)胞程序死亡嵌合前列腺歸巢肽含有序列SMSIARL－GG－
文檔編號(hào)A61P31/04GK1419565SQ01806891
公開日2003年5月21日 申請(qǐng)日期2001年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
發(fā)明者埃爾基·I·羅斯拉赫蒂, 雷納塔·帕斯夸利尼, 瓦地·阿拉普, 戴爾·E·布勒德森, H·邁克爾·埃勒比 申請(qǐng)人:伯納姆研究所