專利名稱：kahalalide F及相關(guān)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及kahalalide化合物、尤其涉及kahalalide F及相關(guān)化合物以及這類化合物的合成途徑。
因此，依照Scheuer等的kahalalide F結(jié)構(gòu)是 同時，Reinhart教授也指定了5-Val和2-Thr的各個位置(K.L.Rinehart，私人通信)。而對于2Thr和3Val，他的指定與Scheuer教授的指定一致，對于最后的2Val卻存在差異。因而，在Rinehart的指定中，側(cè)鏈內(nèi)的兩個相鄰纈氨酸可被轉(zhuǎn)換，所述結(jié)構(gòu)為式(I) 式(I)現(xiàn)在該結(jié)構(gòu)已被認可并且在本文中再次被證實，即kahalalide F的正確結(jié)構(gòu)式為式(I)。
該結(jié)構(gòu)是復雜的，包含六個氨基酸作為環(huán)部分，而七個氨基酸的環(huán)外鏈具有一個末端?；ｋm然還沒有足夠量減慢了臨床試驗計劃，但是kahalalide F(I)是一種極其有效而罕見、來源于海洋的抗腫瘤藥。
其它kahalalide化合物是已知的，例如我們可提到Hamann，M.T.等，J.Org.Chem.，1996，“kahalailde來源于海洋軟體動物Elysiarufescens及其藻類食物羽藻(Bryopsis sp.)的生物活性肽”，第61卷，第6594-6660頁。除kahalalide F之外，該文章還給出了kahalalide A-E的結(jié)構(gòu)。kahalalide K在JNat.Prod.1999，62，1169中有報道，而kahalalideO在J Nat Prod 2000，63，152中有報道。這些其它kahalalide化合物的結(jié)構(gòu)見下式 所述環(huán)狀kahalalide具有一個氨基酸環(huán)和一個以酰基封端的側(cè)鏈。
kahalalide具有各種各樣的生物活性，特別是抗腫瘤活性和抗結(jié)核病活性。
相配的是，本發(fā)明模擬物具有與天然存在的母體kahalalide不同的以下特征中的至少一個特征有1-7個、尤其是1-3個、更尤其是1個或2個、最尤其是1個氨基酸與母體化合物的氨基酸不同；在母體化合物的側(cè)鏈酰基內(nèi)有1-10個、尤其是1-6個、更尤其是1-3個、最尤其是1個或2個另外的亞甲基；在母體化合物的側(cè)鏈?；腥笔?-10個、尤其是1-6個、更尤其是1-3個、最尤其是1個或2個亞甲基；
在所述母體化合物的側(cè)鏈酰基中添加或缺失1-6個、尤其是1-3個、更尤其是1個或3個取代基。
對于環(huán)狀kahalalide，所述氨基酸的添加或缺失可以在所述環(huán)內(nèi)或者在所述側(cè)鏈內(nèi)。
本發(fā)明的實施例是與kahalalide F相關(guān)并且具有下式的化合物 式II其中當應用時，Aaa1、Aaa2、Aaa3、Aaa4、Aaa6和Aaa7獨立地為L或D構(gòu)型的α-氨基酸；其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7各自獨立地為H或選自烷基、芳基、芳烷基的有機基團及其具有以下基團的取代衍生物羥基、巰基、氨基、胍基、鹵基；其中X1獨立地為O、S或N；其中當應用時，R2獨立地為H或選自烷基和芳烷基的有機基團；其中當應用時，Aaa5獨立地為L或D構(gòu)型的氨基酸；其中X2獨立地為選自鏈烯基、烷基、芳基、芳烷基的有機基團及其具有羥基、巰基的取代衍生物，獨立地為H或選自烷基、芳基、芳烷基的有機基團及其具有以下基團的取代衍生物羥基、巰基、氨基、胍基、鹵基；其中R8獨立地具有以下結(jié)構(gòu)式III、I或V 式III 式IV 式V其中R9、R10和R11各自獨立地為H或選自烷基、芳基、芳烷基的有機基團及其具有以下基團的取代衍生物羥基、巰基、氨基、胍基、羧基、甲酰胺基、鹵基；R9和R10可以形成相同環(huán)的部分；當應用時，R9可以為其連接的碳提供S構(gòu)型或R構(gòu)型；n為0-6。也可改變氨基酸的限定，以考慮到脯氨基和類似的氨基酸(包括羥脯氨基)。式(III)、(IV)和(V)可以相互混合，以在一個以上的這些結(jié)構(gòu)式中得到由重復單位構(gòu)成的側(cè)鏈。
在一種修飾中，六氨基酸環(huán)的環(huán)氨基酸Aaa-6和Aaa-5中的一個或多個被缺失，或者在Aaa-6和Aaa-1之間添加氨基酸Aaa-7，以便獲得具有四、五或七環(huán)氨基酸的環(huán)。優(yōu)選六環(huán)氨基酸。
本發(fā)明還涉及生成kahalalide F化合物及相關(guān)結(jié)構(gòu)的合成方法。
優(yōu)選的實施方案優(yōu)選的化合物與kahalalide F(I)相關(guān)，其中在式(II)中，Aaa-1是D-別-Thr-Thr(X1＝O，R1＝CH3)，Aaa-2是D-別-Ile-Ile(R3＝1-甲基丙基)，Aaa-3是D-Val(R4＝異丙基)，Aaa-4是Phe(R5＝芐基)，Aaa-5是Z-Dhb(X2＝C＝CHCH3，具有Z構(gòu)型)，Aaa-6是L-Val(R6＝異丙基)，Aaa-7是D-別-Ile-Ile(R7＝1-甲基丙基)，R8含有下式(式VI)的六肽衍生物 式VI其它優(yōu)選的化合物類似地與其它kahalalide相關(guān)，并且具有與這類化合物一樣的氨基酸和側(cè)鏈。參考所述kahalalide的已知結(jié)構(gòu)。優(yōu)選本發(fā)明的化合物模擬天然kahalalide，在所述分子中的一個或多個位點具有修飾、插入或消除。
尤其優(yōu)選的是具有與天然環(huán)狀kahalalide化合物的氨基酸相同、但在側(cè)鏈上不同、尤其是在酰基部分不同的化合物。這類差異可以包括或多或少的亞甲基、通常最多兩個亞甲基的改變，以及或多或少的取代基、特別是添加鹵素例如氟取代基。
本文所用的術(shù)語“有機基團”是指分為脂族基、環(huán)基或脂族基和環(huán)基組合(例如芳烷基)的烴基。在本發(fā)明的正文中，術(shù)語“脂族基”是指飽和或不飽和直鏈或支鏈烴。該術(shù)語用來包括例如烷基、鏈烯基和鏈炔基。
術(shù)語“烷基”是指飽和直鏈或支鏈烴基，包括例如甲基、乙基、異丙基、異丁基、叔丁基、庚基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基、2-甲基丁基、5-甲基己基、9-甲基-3-癸基等，特別是具有一個支鏈甲基的烷基。所述烷基適宜較長，即具有1-20個碳原子、更通常1-15個或1-10個碳原子；或者可以較短，即具有1-6個或1-3個碳原子?；鶊FR11適于長碳鏈，一般而言，所有其它烷基最好為短碳鏈。
術(shù)語“鏈烯基”是指具有一個或多個碳-碳雙鍵的不飽和、直鏈或支鏈烴基，例如乙烯基。所述鏈烯基適宜具有2-8個或2-4個碳原子。
術(shù)語“鏈炔基”是指具有一個或多個碳-碳三鍵的不飽和、直鏈或支鏈烴基。所述鏈炔基適宜具有2-8個或2-4個碳原子。
術(shù)語“環(huán)基”是指分為脂環(huán)基、芳族基或雜環(huán)基的閉環(huán)烴基。術(shù)語“脂環(huán)基”是指其特性類似于脂族基的環(huán)烴基，適宜具有4-10個碳原子的單環(huán)或雙環(huán)。術(shù)語“芳族基”或“芳基”是指單環(huán)或多環(huán)芳族烴基，適宜具有5-10個碳原子的單環(huán)或雙環(huán)。術(shù)語“雜環(huán)基”是指閉環(huán)烴，其中所述環(huán)內(nèi)的一個或多個原子是除碳以外的元素(例如1-3個氮、氧、硫中的一個或多個)，適宜具有4-10個環(huán)原子的單環(huán)或雙環(huán)。
正如本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的，較大程度的取代不僅被耐受，而且通常是可行的。預先考慮在本發(fā)明化合物上有取代。作為簡化在本申請中所用的某些術(shù)語的討論和敘述的工具，術(shù)語“基團”和“部分”用以區(qū)分允許取代或可以被取代的化學種類與不允許或不可以被如此取代的化學種類。因此，當術(shù)語“基團”用來描述化學取代基時，所述化學物質(zhì)包括未取代的基團和例如在所述鏈內(nèi)具有O原子、N原子或S原子的基團以及羰基或其它常規(guī)取代。在術(shù)語“部分”用來描述化合物或取代基的情況下，僅包括未取代的化學物質(zhì)。例如，短語“烷基基團”不僅包括純開鏈飽和烴烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、異丁基等，而且包括帶有本領(lǐng)域已知的其它取代基的烷基取代基，所述其它取代基例如羥基、烷氧基、氨基、羧基、甲酰胺基、鹵原子、氰基、硝基、烷基磺酰基等。因此，“烷基基團”包括醚基、鹵代烷基、醇類、硫醇類、羧基、胺類、羥基烷基類、磺基烷基類等。目前優(yōu)選鹵代烷基。另一方面，短語“烷基部分”限于僅包括純開鏈飽和烴烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、異丁基等等。
在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，我們提供一種式(A)化合物 其中具有相鄰相應的-N-和-CO-的Aa1至Aa6中的每個代表α或β氨基酸、最好是α氨基酸，X為Aa1的連接基團，優(yōu)選選自氨基、羥基或硫羥基，更優(yōu)選羥基，R為任選包括一個或多個α或β氨基酸、最好是α氨基酸的基團。在一個變體中，-CO-Aa6-N-可以不存在，也可能與-CO-Aa5-N-一起不存在，或者基團-CO-Aa7-N-可以插入在Aa6和Aa1之間。
所述氨基酸可以是L構(gòu)型或D構(gòu)型。所述構(gòu)型最好與kahalalide化合物、尤其是kahalalide F中的相應氨基酸一樣。Aa1至Aa7中的一個或多個最好對應于天然kahalalide或其同類物中的相同位置上的氨基酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，每個氨基酸與kahalalide F中的相同。因此，優(yōu)選Aa1為D-別-Thr，Aa2為D-別-Ile，Aa3為D-Val，Aa4為Phe，Aa5為Z-Dhb，Aa6為L-Val。
在使用同類物的情況下，合適的同類物具有取代氨基酸，其中顧及所述天然kahalalide(例如kahalalide F)中的相應氨基酸的結(jié)構(gòu)，進行所述取代。蘇氨酸的取代物包括絲氨酸和其它同系物以及半胱氨酸及同系物。異亮氨酸的取代物包括其它具有非極性基團的氨基酸，包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸以及類似物和同系物。在該方面，式(A)中的氮原子-N-的顯示不排除環(huán)形成的可能性，例如當與脯氨酸一起存在時。纈氨酸的取代物包括異亮氨酸和其它具有非極性基團的氨基酸，包括類似物和同系物。苯丙氨酸的取代物包括色氨酸和酪氨酸。Dhb的取代物包括其它具有這種亞鏈烯基(alkenylidene)取代基的氨基酸，包括具有C3或更大側(cè)鏈的氨基酸以及類似物和同系物。
Aa1最好具有下式 其中Raa1為攜帶連接基團X的側(cè)鏈。側(cè)鏈的實例包括烷基、芳基和芳烷基，尤其是烷基，更通常是1-4個、例如2個碳原子的烷基。優(yōu)選支鏈烷基。連接基團X適宜為氧，并且Aa1最好衍生自蘇氨酸，但可以使用硫、氨基(未取代或用烷基、芳基或芳烷基取代)和其它接頭?；鶊FX適宜為Aa1中的唯一極性基團。Aa1可以是外消旋的、L構(gòu)型或D構(gòu)型，但最好為D構(gòu)型。
Aa2最好具有下式 其中Raa2為諸如以下的側(cè)鏈烷基、芳基和芳烷基，尤其是烷基，更通常是1-5個、例如3個碳原子的烷基。優(yōu)選支鏈烷基，如在異亮氨酸中。在Aa2中適宜不存在極性取代基。Aa2可以是外消旋的、L構(gòu)型或D構(gòu)型，但最好為D構(gòu)型。
Aa3最好具有下式 其中Raa3為諸如以下的側(cè)鏈烷基、芳基和芳烷基，尤其是烷基，更通常是1-5個、例如3個碳原子的烷基。優(yōu)選支鏈烷基，如在纈氨酸中。相配的是在Aa3中適宜不存在極性取代基。Aa3可以是外消旋的、L構(gòu)型或D構(gòu)型，但最好為D構(gòu)型。
Aa4最好具有下式 其中Raa4為諸如以下的側(cè)鏈烷基、芳基和芳烷基，尤其是芳烷基，更通常是7-10個、例如7個碳原子的芳烷基。優(yōu)選芐基，如在苯丙氨酸中。在Aa4中適宜不存在極性取代基。Aa4可以是外消旋的、L構(gòu)型或D構(gòu)型，但最好為L構(gòu)型。
Aa5最好具有下式 其中Raa5a和Raa5b分別選自氫或諸如以下的側(cè)鏈烷基、芳基和芳烷基，尤其是烷基，更通常是1-4個、例如1個碳原子的烷基。Raa5a最好為氫，得到Z構(gòu)型，如在優(yōu)選的a，b-二脫氫-a-氨基丁酸中。在Aa5中適宜不存在極性取代基。Aa5可以是外消旋的、L構(gòu)型或D構(gòu)型，但最好為L構(gòu)型。
Aa6最好具有下式 其中Raa6為諸如以下的側(cè)鏈烷基、芳基和芳烷基，尤其是烷基，更通常是1-5個、例如3個碳原子的烷基。優(yōu)選支鏈烷基，如在纈氨酸中。在Aa6中適宜不存在極性取代基。Aa6可以是外消旋的、L構(gòu)型或D構(gòu)型，但最好為L構(gòu)型。
氨基酸Aa1至Aa7可以依照式(II)中的基團Aaa-1至Aaa-7定義。
側(cè)鏈R最好包含5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-別-Ile或其同類物，包括類似物和同系物。同類物的實例包括通式(Rt)m-(氨基酸)n-的同類物，m+n不為零，其中Rt代表端基，適宜為烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、雜芳基、雜烷基、脂環(huán)基或其它端基，-(氨基酸)n-代表任選的氨基酸鏈。
末端烷基適宜具有1-12個碳原子、更通常具有4-10個碳原子，并且可以被取代，最好是支鏈烷基。實例包括丁基、戊基、己基、庚基、辛基和其它帶有1個或多個甲基或乙基或更長側(cè)鏈基團的烷基(最好是1-6個碳原子的烷基，尤其是5-甲基己基)和在遠離與分子其余部分的連接點之處具有分支的其它烷基。合適的取代基包括鹵素、羥基、烷氧基、氨基、羧基、甲酰胺基、氰基、硝基、烷基磺?；?、烷氧基、烷氧基烷基、芳基烷基芳基、雜環(huán)基、脂環(huán)基、芳基、芳烷基和其它本文列舉的基團。合適時，這類取代基可以帶有其它取代基，例如甲苯基。目前最優(yōu)選鹵素取代基，尤其是1個或多個、例如1-3個氟原子。其它端基可以依照本文給出的指引來選擇，包括脂環(huán)基、芳烷基、芳基、雜環(huán)基或其它基團，可能具有1個或多個(尤其是1-3個)取代基。
側(cè)鏈R-CO-N-可以在所述氮上具有氫或者具有取代基，例如烷基、芳基或芳烷基。
合適的側(cè)鏈同類物利用依照前面給出的原則選擇的取代氨基酸，就所述分子的環(huán)部分中的這些氨基酸而論，選擇異亮氨酸、纈氨酸或蘇氨酸的替代物，并且鳥氨酸的替代物包括賴氨酸、組氨酸、精氨酸；脯氨酸的替代物包括丙氨酸和其它非極性氨基酸，例如甘氨酸、異亮氨酸和其它前面列舉的氨基酸。鏈R通常具有0-10個、更優(yōu)選4-8個、例如5個、6個或7個、尤其是7個氨基酸殘基。如果超過7個氨基酸，則超過的氨基酸最好為天然存在的氨基酸、特別是本文列舉的那些氨基酸。
可以使用外消旋的氨基酸或L氨基酸或D氨基酸。優(yōu)選的是如果氨基酸存在于側(cè)鏈R中，則它們中的一個或多個為天然存在的側(cè)鏈已知的構(gòu)型。對于所述環(huán)六肽，氨基酸殘基為構(gòu)型DLDDLLD。末端烷基適宜具有1-12個碳原子、更通常4-10個碳原子，并且可以被取代，最好為支鏈烷基。合適的取代基包括鹵素、羥基、烷氧基、氨基、羧基、甲酰胺基、氰基、硝基、烷基磺?；推渌疚牧信e的基團。目前最優(yōu)選鹵素取代基。
更通常的是，側(cè)鏈R-CO-N-可以依照式(II)化合物(包括具有式(III)、式(IV)和式(V)中限定的氨基酸的混合物的化合物)中的側(cè)鏈R8-NH-CHR7-CO-NH-定義。
雖然參考kahalalide F描述了優(yōu)選的特征，但是通過應用相同原理來設(shè)計其它kahalalide模擬物，可以提供本發(fā)明的其它優(yōu)選化合物。因此，所述氨基酸和側(cè)鏈可以被改變，最好是同時在極性和非極性基團之間保持疏水-親水平衡。
本發(fā)明的化合物具有有用的生物活性，包括抗腫瘤活性。
因此，本發(fā)明提供治療受癌癥影響的任何哺乳動物、特別是人類的方法，所述方法包括給予所述受影響的個體治療有效量的本發(fā)明化合物或其藥用組合物。
本發(fā)明也涉及藥用制劑及其制備方法，所述藥用制劑含有作為有效成分的一種或多種本發(fā)明化合物。
藥用組合物的實例包括具有合適組合物或者口服、局部或胃腸外給藥用的任何固體劑型(片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑等)或液體劑型(溶液劑、混懸劑或乳劑)，并且它們可以含有所述純化合物或者與任何載體或其它藥理學活性化合物組合。這些組合物當胃腸外給予時可能必須是無菌的。
給予本發(fā)明的化合物或組合物可以通過任何合適的方法進行，例如靜脈內(nèi)輸注、口服制劑、腹膜內(nèi)給予和靜脈內(nèi)給予。我們建議使用輸注的時間至多24小時，更優(yōu)選2-12小時，最優(yōu)選2-6小時。尤其理想的是進行治療的輸注時間短，而不用在醫(yī)院過夜。然而可以輸注12-24小時或者如有需要甚至更長時間?？梢砸赃m當?shù)拈g隔為例如2-4周來進行輸注?？梢酝ㄟ^脂質(zhì)體或納米球包囊、以緩釋制劑或通過其它標準的給藥方式給予含有本發(fā)明化合物的藥用組合物。
所述化合物的準確劑量可以隨具體的制劑、應用模式和待治療的具體部位、宿主和腫瘤而變化。也應該考慮其它因素如年齡、體重、性別、飲食、給藥時間、排泄率、宿主狀況、藥物組合、反應敏感性和疾病的嚴重程度。在最大耐受劑量范圍內(nèi)可以連續(xù)給藥或周期性給藥。
本發(fā)明的化合物和組合物可以與其它藥物一起使用，以提供聯(lián)合療法。所述其它藥物可以構(gòu)成所述組合物的一部分，或者作為獨立組合物提供，用于在相同或不同時間給藥。不具體限制其它藥物的身份，合適的候選藥物包括a)具有抗有絲分裂效應的藥物、尤其是靶向細胞骨架元件的藥物，包括微管調(diào)節(jié)劑例如taxane藥物(例如紫杉酚、紫杉醇、taxotere、docetaxel)、鬼臼毒素或長春花生物堿(長春新堿、長春堿)；b)抗代謝藥，例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他濱、嘌呤類似物(例如噴司他丁、甲氨喋呤)；c)烷化劑，例如氮芥類(例如環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺)；d)靶向DNA的藥物，例如antracycline藥物阿霉素、多柔比星、表阿霉素(pharmorubicn)、表柔比星(epirubicin)；e)靶向拓撲異構(gòu)酶的藥物，例如依托泊苷；f)激素和激素激動劑或拮抗劑，例如雌激素、抗雌激素(他莫昔芬及相關(guān)化合物)以及雄激素、氟他胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林、環(huán)丙孕酮(cyprotrone)或奧曲肽；g)靶向腫瘤細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的藥物，包括諸如herceptin的抗體衍生物；h)烷化藥物，例如鉑類藥物(順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、卡鉑(paraplatin))或亞硝基脲；i)潛在影響腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，例如基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑；j)基因治療和反義藥物；k)抗體療法；l)來源于海洋的其它生物活性化合物、特別是海鞘素類例如海鞘素743或didemnin例如aplidine；m)類固醇類似物，尤其是地塞米松；n)消炎藥，尤其是地塞米松；和o)止吐藥，尤其是地塞米松。
本發(fā)明也延伸至用于治療方法的本發(fā)明化合物，并且延伸至應用所述化合物制備用于治療癌癥的組合物。
另外，預計本發(fā)明的化合物也具有抗結(jié)核病活性。
本發(fā)明也提供制備本發(fā)明化合物(包括kahalalide F)的方法，所述方法包括在Aa3和Aa4之間環(huán)合。我們發(fā)現(xiàn)在該位置上的環(huán)合為一種優(yōu)良工藝?？梢栽诃h(huán)合之前或之后對所述分子進行其它修飾，包括在Aa1上形成側(cè)鏈或延伸側(cè)鏈，和/或在所述氨基酸上去除保護基和/或修飾取代基。
因此，所述方法可以通過下述方案舉例說明 其中R’為基團R-CO-N-或其前體，并且其中所述氨基酸中的一個或多個可以具有保護基，并且其中Aa3的-COOH和/或Aa4的-NH2可任選地被保護、活化或衍生化。采用前體或保護、活化或衍生化的這類方法其本身完全是常規(guī)的，不需要其它細節(jié)來實施所述方法。
可以從原料開始以對映體和立體控制的快速方式、利用固相合成法實施本發(fā)明的方法，在固相合成法中在全部合成操作期間將進行構(gòu)建的分子與不溶性支持體結(jié)合。因而，可以通過用合適溶劑洗滌所述分子-樹脂而簡單地去除過量的試劑和可溶性副產(chǎn)物。因此，可以使用大量過量的可溶性試劑，以便驅(qū)動所述反應在短時間內(nèi)完成，避免外消旋化(當應用時)和其它次級反應。所述方法也適合于自動化。
本發(fā)明合成方法的優(yōu)選實施方案盡可能示于方案1中，該方案涉及式(II)化合物的生成。
方案1 I和衍生物和類似物如上述方案1所示，合成kahalalide F(I)和衍生物和類似物的優(yōu)選方法基于固相方法，參見例如Lloyd-Williams，P等，ChemicalApproaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，CRC Press，BocaRaton(FL)，1997。
方案1的方法包括下列序貫步驟(a)將Fmoc-氨基酸(Aaa3)加到含有超強酸不穩(wěn)定性柄或接頭(例如氯三苯甲基、聚烷氧基芐基等)的固相支持體(例如聚苯乙烯、接枝到聚苯乙烯上的聚乙烯等)上，形成酯鍵；
(b)采用Fmoc/tBu策略用三個氨基酸(Aaa2、Aaa1、Aaa7)延伸所述肽鏈。對于I，X1＝OH并且在不進行保護的條件下引入。當X1=NH2時，在Alloc保護下引入；(c)采用Alloc/tBu策略摻入(Aaa6)；(d)采用Fmoc/tBu策略用其余的氨基酸和R11-COOH通過Aaa7延伸所述肽鏈；(e-1)采用Alloc/tBu策略用兩個氨基酸[Aaa5(OH，H)、Aaa4]通過Aaa6延伸所述肽鏈。與Aaa5連接的OH未被保護；(e-2)在固相內(nèi)脫水，得到具有Aaa5的肽；或者(e′-1)摻入二肽Alloc-Aaa4-Aaa5-OH，所述二肽已在溶液中混合并脫水；(f)當所述肽仍錨定至固相支持體時去除Aaa4的Alloc基團；(g)當應用時，從所述固相支持體切下側(cè)鏈被保護的肽；(h)在溶液中使肽環(huán)化；(i)去除TFA不穩(wěn)定的側(cè)鏈保護基。
應該認識到，保護基的具體選擇并不嚴格，其它選擇可以廣泛利用。例如Bzl型基團可以代替tBu/Boc；Boc可以替代Fmoc；Fmoc可以替代Alloc；Wang樹脂可以替代氯三苯甲基。所述方法優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選方法示于方案1中。如其中所示，以及如下文實施例中更加詳細的討論，該方法如下進行最好在DIEA存在下，將Fmoc-Aaa3-OH摻到氯三苯甲基-聚苯乙烯樹脂中，參見Barlos，K.；Gatos，D.；Schfer，W.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1991，30，590-593，保持取代水平約為0.15-0.5mmol/g。應用較高加載量使終產(chǎn)物中存在末端肽，參見Chiva，C.；Vilaseca，M.；Giralt，E.；Albericio，F(xiàn).J.Pept.Sci.1999，5，131-140。
用哌啶-DMF(2∶8，v/v)(1×1min，3×5min，1×10min)去除Fmoc基團。在DMF中將Fmoc-、Alloc-Aaa-OH和R11-COOH(5當量)與HATU-DIEA(5∶10)偶聯(lián)90分鐘，參見Carpino，LA.；E1-Faham，A.；Minor，C.A.；Albericio，F(xiàn).J.Chem.Soc.，Chem.Commun.1994，201-203。偶聯(lián)后，進行茚三酮試驗，如果為陽性，則以相同條件重復所述偶聯(lián)反應，否則所述過程繼續(xù)往下進行。在脫保護、偶聯(lián)之間洗滌，再采用每次10ml溶劑/g樹脂，用DMF(5×0.5min)和CH2C12(5×0.5min)進行脫保護步驟。
用等摩爾量的DIPCDI和0.7當量的DMAP，當X1＝O時摻入Alloc-Aaa6-OH(7當量)達2小時。將該偶聯(lián)步驟重復兩次。
在PhSiH3(10當量)存在下，在Ar氛圍下，用Pd(PPh3)4(0.1當量)去除Alloc基團，參見Gómez-Martínez，P.；Thieriet，N.；Albericio，F(xiàn).；Guibé，F(xiàn).J.Chem.Soc.Perkin I 1999，2871-2874。
在CuCl(60當量)存在下，在CH2Cl2-DMF(10∶2)中，在固相中用EDC(水溶性碳二亞胺，100當量)進行脫水6天。EDC/CuCl已經(jīng)用于在溶液中使乳鏈菌肽片段內(nèi)的Thr殘基脫水。Fukase，K.；Kitazawa，M.；Sano，A.；Shimbo，K.；Horimoto，S.；Fujita，H.；Kubo，A.；Wakamiya，T.；Shibe，A.Bull.Chem.Soc.Jpn.1992，65，2227-2240。
將在溶液中用Alloc-Aaa4-OH和H-Aaa5(OH，H)-OtBu與EDC制備、脫水后用TFA處理的二肽Alloc-Aaa4-Aaa5-OH(5當量)與HATU-DIEA(5∶10)偶聯(lián)16小時，然后再偶聯(lián)3小時。其它基于HOBt的偶聯(lián)試劑諸如HBTU或DIPCDI-HOBt的應用已導致所述二肽的不完全摻入。
用TFA-CH2Cl2(1∶99)完成從所述樹脂切下被保護的肽(5×30sec)。
在CH2Cl2-DMF中，用DIPCDI-HOBt(3∶3當量)進行環(huán)化步驟達2小時。也可以使用其它方法，例如DMF中的PyBOP/DIEA(3∶6當量)。
用TFA-H2O(95∶5)進行最后的脫保護達1小時。
本發(fā)明的實施例縮寫氨基酸所用的縮寫以及肽的命名采用IUPAC-IUB生物化學命名委員會的規(guī)則，參見J.Biol.Chem.1972，247，977-983。使用下面的其它縮寫4-AcBut-OH，4-乙酸基丁酸；AcButBut-OH，4-(4-乙酰氧基丁酰氧基)-丁酸；ACH，a-氰基-4-羥基肉桂酸；Alloc，烯丙氧基羰基；Boc，叔丁氧羰基；t-Bu，叔丁基；But-OH，丁酸；Cl-TrtCl-樹脂，2-氯三苯甲基氯-樹脂；Dap，2，3-二氨基丙酸；4-DiMeABut-OH，N，N-二甲基-4-氨基丁酸；3，3-DiMeBut-OH，3，3-二甲基丁酸；DHB，2，5-二羥基苯甲酸；Z-Dhb，a，b-二脫氫-a-氨基丁酸；DIEA，N，N-二異丙基乙胺；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；EDC，1-乙基-3-(3′-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；Etg，乙基甘氨酸；ESMS，電噴霧質(zhì)譜法；FABMS，快速原子轟擊質(zhì)譜法；Fmoc，9-芴基甲氧羰基；HATU，六氟合磷氫酸N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶-1-基-亞甲基]-N-甲基甲銨N-氧化物；HBTU，六氟合磷氫酸N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亞甲基]-N-2-甲基甲銨N-氧化物；2-Hedo-OH，2，4-己二烯酸；Hep-OH，庚酸；HOAc，乙酸，HOAt，1-羥基-7-氮雜苯并三唑(3-羥基-3H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶)；HOBt，1-羥基苯并三唑；IBut-OH，異丁酸；3-MeBut-OH，3-甲基丁酸；5-MeHex-OH，5-甲基己酸；MeOH，甲醇；4-MePen-OH，4-甲基戊酸；NMM，N-甲基嗎啉；4-HOBut，4-羥基丁酸；(b-OH)Phe-OH，b-羥基苯丙氨酸；Lit-OH，石膽酸；Pal，棕櫚酸；D-Phe-OH，a，b-二脫氫苯丙氨酸；PyAOP，鏻六氟合磷氫酸7-氮雜苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡咯烷基)；PyBOP，六氟合磷氫酸苯并三唑-1-基-N-氧基-三(吡咯烷基)鏻；SPS，固相合成；TFA，三氟乙酸；Tico-OH，二十四烷酸。氨基酸符號表示L-構(gòu)型，除非另有說明。所有的溶劑比為體積/體積，除非另有說明。
通用方法。Cl-TrtCl-樹脂、被護Fmoc-氨基酸衍生物、HOBt、PyBOP、HATU均得自PerSeptive Biosystems(Framingham，MA)，Bachem(Bubendorf，瑞士)，NovaBiochem(Lufelfingen，瑞士)。Alloc-氨基酸基本上依照Dangles等所述(參見Dangles，O.；Guibé，F(xiàn).；Balavoine，G.；Lavielle，S.；Marquet.A.J.Org.Chem.1987，52，4984-4993)進行制備，和5-MeHex-OH通過丙二酸合成制備。DIEA、DIPCDI、EDC、哌啶、TFA得自Aldrich(Milwaukee，WI)。DMF和CH2Cl2得自SDS(Peypin，法國)。乙腈(HPLC級)得自Scharlau(Barcelona，西班牙)。所有的商業(yè)試劑和溶劑除DMF和CH2Cl2外均照原樣使用，DMF和CH2Cl2用氮氣吹氣，以去除揮發(fā)性雜質(zhì)(DMF)，然后經(jīng)活化的4分子篩(Merck，Darmstadt，德國)(DMF)或CaCl2(CH2Cl2)保存待用。溶液反應在圓底燒瓶中進行。有機溶劑萃取液經(jīng)無水硫酸鎂干燥，然后減壓和＜40℃下去除溶劑。
固相合成在裝有聚乙烯多孔圓盤的聚丙烯注射器(20，10ml)中進行。溶劑和可溶性試劑通過抽吸去除。用哌啶-DMF(2∶8，v/v)(1×1min，3×5min，1×10min)去除Fmoc基團。在脫保護、偶聯(lián)之間洗滌，再采用每次10ml溶劑/g樹脂，用DMF(5×0.5min)和CH2Cl2(5×0.5min)進行脫保護步驟。肽合成轉(zhuǎn)變和洗滌在25℃下進行。在固相上進行的合成通過在用TFA-H2O(9∶1)切割60分鐘后獲得的中間體的HPLC控制，一等份(約10mg的肽基-樹脂HPLC柱子[Kromasil C18(條件A-F)/C4(條件G，H)]反相柱，4.6×250mm，10mm)得自Akzo Nobel(Bohum，瑞典)。分析型HPLC在Shimadzu儀器上進行，所述儀器包括兩個溶劑傳遞泵(LC-6A型)、自動注射器(SIL-6B型)、可變波長檢測器(SPD-6A型)、系統(tǒng)控制器(SCL-6B型)和繪圖儀(C-R6A型)。UV檢測在220nm下進行，H2O(+0.45％TFA)中線性梯度的CH3CN(+0.036％TFA)以1.0ml/min流速洗脫(條件A)30分鐘內(nèi)從1∶9至10∶0；(條件B)30分鐘內(nèi)從3∶7至10∶0；(條件C)30分鐘內(nèi)從1∶19至19∶1；(條件D)30分鐘內(nèi)從45∶55至90∶10；(條件E)30分鐘內(nèi)從45∶55至6∶4；(條件F)等度1∶1；(條件G)30分鐘內(nèi)從3∶7至1∶0；(條件H)30分鐘內(nèi)從1∶1至1∶0。
肽樣品的MALDI-TOF-和ES-MS分析采用CHCA或DHB基體在PerSeptive Biosystems Voyager DE RP中以及在Micromass VG-quattro分光計中進行。肽-樹脂樣品在12 N HCl-丙酸(1∶1)水溶液中在155℃下水解1-3小時，然后不含肽的樣品在6 N HCl水溶液中在155℃下水解1小時。隨后在Beckman System 6300自動分析儀中進行氨基酸分析。1H-NMR(500MHz，200MHz)和13C-NMR(50MHz)波譜法在Bruker DMX-500(11.7 T)和Varian Gemini 200(4.7 T)中進行?；瘜W位移(d)以自TMS向低場位移的百萬分之幾表示。偶合常數(shù)以赫茲表示。kahalalide F(I)實施例1H-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
將Cl-TrtCl-樹脂(1g，1.35mmol/g)置于20ml裝有聚乙烯濾片的聚丙烯注射器中。然后用CH2Cl2(5×0.5min)洗滌，然后加入Fmoc-D-Val-OH(92mg，0.27mmol，0.2當量)和DIEA(471ml，2.7mmol，2當量)的CH2Cl2(2.5ml)溶液，將混合物攪拌1小時。攪拌15分鐘后，通過加入MeOH(800ml)終止反應。Fmoc-D-Val-O-TrtCl-樹脂進行以下洗滌/處理用CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)、哌啶-CH2Cl2-DMF(1∶9.5∶9.5，1×10min)、哌啶-DMF(1∶4，1×15min)、DMF(5×0.5min)、異丙醇(2×1min)、DMF(5×0.5min)、MeOH(2×1min)，然后經(jīng)真空干燥。通過AAA計算的載荷為0.15mmol/g。
實施例2Fmoc-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Alloc)-D-別-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
在DMF(2.5ml)中，用HATU(285mg，0.75mmol，5當量)和DIEA(261mg，1.5mmol，10當量)，將Fmoc-D-別-Ile-OH(265mg，0.75mmol，5當量)、Fmoc-D-別-Thr-OH(游離羥基)(256mg，0.75mmol，5當量)和Fmoc-D-別-Ile-OH(265mg，0.75mmol，5當量)依次加到以上獲得的H-D-Val-O-TrtCl-樹脂中。在所有情況下，在偶聯(lián)90分鐘后，茚三酮試驗均為陰性。如通用方法中所述去除Fmoc基團并進行洗滌。在DMAP(12.8mg，0.105mmol，0.7當量)存在下，將Alloc-Val-OH(211mg，1.05mmol，7當量)與DIPCDI(163mg，1.05mmol，7當量)偶聯(lián)。該偶聯(lián)步驟在相同條件下重復兩次。一等份的肽基-樹脂用TFA-H2O(9∶1)處理60分鐘，蒸發(fā)后獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(條件A，tR25.9min)顯示純度＞98％。ESMS，C45H63N5O11的計算值849.5。實測值m/z850.1[M+H]+。
實施例35-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Alloc)-D-別-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
去除Fmoc基團后，在DMF(2.5ml)中用HATU(285mg，0.75mmol，5當量)和DIEA(261mg，1.5mmol，10當量)，將Fmoc-Orn(Boc)-OH(341mg，0.75mmol，5當量)、Fmoc-D-Pro-OH(253mg，0.75mmol，5當量)、Fmoc-D-Val-OH(255mg，0.75mmol，5當量)、Fmoc-Val-OH(255mg，0.75mmol，5當量)、Fmoc-Thr(tBu)-OH(298mg，0.75mmol，5當量)、Fmoc-D-Val-OH(255mg，0.75mmol，5當量)和5-MeHex-OH(98mg，0.75mmol，5當量)依次加到上述肽基-樹脂(實施例2)中。在所有情況下，在偶聯(lián)90分鐘后，茚三酮試驗或氯醌(摻入D-Val后)試驗均為陰性。如通用方法中所述去除Fmoc基團，并進行洗滌。一等份的肽基-樹脂用TFA-H2O(9∶1)處理60分鐘，蒸發(fā)后獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(條件B，tR17.2min)顯示純度＞82％。ESMS，C66H116N12O17的計算值1,348.9。實測值m/z 1,350.0[M+H]+。
實施例45-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Thr-Phe-Alloc)-D-別-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
在PhSiH3(185μl，1.5mmol，10當量)存在下，在Ar氛圍下，用Pd(PPh3)4(17.3mg，0.015mmol，0.1當量)去除Alloc基團。在DMF(2.5ml)中，用HATU(285mg，0.75mmol，5當量)和DIEA(261mg，1.5mmol，10當量)將Fmoc-Thr-OH(游離羥基)(256mg，0.75mmol，5當量)和Alloc-Phe-OH(187mg，0.75mmol，5當量)依次加到上述肽基-樹脂(實施例3)中。在所有情況下，在偶聯(lián)90分鐘后，茚三酮試驗都為陰性。如通用方法中所述去除Fmoc基團并進行洗滌。一等份的肽基-樹脂用TFA-H2O(9∶1)處理60分鐘，蒸發(fā)后獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC顯示經(jīng)HPLC(條件B，tR17.8min)的純度＞70％。ESMS，C79H132N14O20的計算值1,597.0。實測值m/z 1,598.2[M+H]+。
實施例55-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-別-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂(通過在固相中脫水)。
上述肽基-樹脂(實施例4)用EDC(2.88g，15mmol，100當量)、CuCl(891mg，9mmol，60當量)和CH2Cl2-DMF(10∶2)(12ml)處理6天。在用DMF、CH2Cl2和DMF充分洗滌后，在PhSiH3(185μl，1.5mmol，10當量)存在下，在Ar氛圍下，用Pd(PPh3)4(17.3mg，0.015mmol，0.1當量)去除Alloc基團。通過AAA計算的終荷載為0.11mmol/g(92％總收率)。一等份的肽基-樹脂用TFA-H2O(9∶1)處理60分鐘，蒸發(fā)后獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(條件B，tR17.2min)顯示純度＞70％。ESMS，C75H126N14O17的計算值1,495.0。實測值m/z 1,496.0[M+H]+。
實施例65-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Tbr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-別-Ile-D-Val-OH。
用TFA-CH2Cl2(1∶99)(5×30sec)從所述樹脂(0.5g，55.9μmol)切下被保護的肽。將合并的濾液減壓蒸發(fā)至干，然后凍干，得到80.2mg(48.5μmol，87％收率)題述化合物，根據(jù)HPLC(條件B，tR25.7min)檢查的純度＞70％。ESMS，C84H142N14O19的計算值1,651.1。實測值m/z1,652.3[M+H]+。
實施例7kahalalide F(I)。
將被保護的肽(實施例6)(40.0mg，24μmol)溶于DMF(25ml)中，然后加入PyBOP(37.8mg，73μmol，3當量)和DIEA(25ml，145μmol，6當量)。將混合物攪拌1小時，然后在減壓下通過蒸發(fā)去除溶劑。將被保護的環(huán)肽溶于TFA-H2O(19∶1，5ml)中，將混合物攪拌1小時。在減壓下通過蒸發(fā)去除溶劑，然后加入H2O(5ml)，凍干。該粗產(chǎn)物通過中壓層析(Vydac C1815-20μm，300 ，240×24mm)、在5小時(各300ml溶劑)用20％-60％乙腈(+0.05％TFA)的水(+0.05％TFA)溶液線性梯度以120ml/h純化，在220nm檢測，得到題述產(chǎn)物(5.0mg，3.4μmol，14％收率)。MALDI-TOF-MS，C75H124N14O16的計算值1,477.9。實測值m/z，1,478.7[M+H]+，1,500.6[M+Na]+，1,516.5[M+K]+。該產(chǎn)物通過HPLC[條件D(tR12.5min)，E(tR17.4min)和F(tR12.1min)]與真正的kahalalide F樣品一起共洗脫。所述化合物的1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)譜與天然產(chǎn)物相同(表1中所示數(shù)據(jù))。
表1

實施例7bis5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例7的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間題述產(chǎn)物作為副產(chǎn)物獲得。該產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.4min，條件B)和ESMS表征，C75H124N14O16的計算值1,477.9。實測值m/z 1,501.3[M+Na]+，1,517.3[M+K]+。kahalalide F(I)實施例8Alloc-Phe-Thr-OtBu。
將H-Thr-OtBu·HCl(3.1g，15mmol，1.3當量)溶于CH2Cl2(30ml)中，然后加入DIEA(2.9ml，17mmol，1.5當量)，將混合物攪拌30分鐘，然后加入Alloc-Phe-OH(2.8g，11mmol，1當量)和EDC(2.8g，15mmol，1.3當量)的CH2Cl2(35ml)溶液，將反應物攪拌18小時，有機反應混合物用H2O(3×25ml)洗滌，干燥(硫酸鎂)并真空濃縮。所得油狀物(4.12g)經(jīng)快速層析[CHCl3-MeOH-HOAc(9∶1∶0.2)]純化，得到題述產(chǎn)物(3.25g，8mmol，71％收率)，該產(chǎn)物經(jīng)分析型HPLC表征(tR20.9min，純度＞98％；條件C)；ESMS，C21H30N2O6的計算值406.2。實測值m/z 408.0[M+H]+；1H-NMR(200MHz，CDCl3)7.1-7.3(5H，m，Ar)；6.89(1H，d，J＝8.8 Hz，NH)；5.7-5.9(1H，m，CH烯丙基)；5.56(1H，d，J＝8.0Hz，OH)；5.2-5.3(2H，m，CH2g-烯丙基)；4.52(2H，d，J＝5.4Hz，CH2a-烯丙基)；4.45(1H，dd，J＝8.4Hz，2.8Hz，a-CH Thr)；4.22(1H，dq，J＝6.2Hz，J＝3.0Hz，b-CH Thr)；3.0-3.2(2H，m，b-CH2Phe)；1.47(9H，s，tBu)；1.15(3H，d，J＝6.6Hz，g-CH3Thr)；13C-NMR(50MHz，CDCl3)172.2(CO)，169.5(CO)；156.0(CO)；136.1(Cq，Ar)；132.5(CH，烯丙基)；129.3(CH，Ar)；128.5(CH，Ar)；126.9(CH，Ar)；117.7(CH2，烯丙基)；82.7(Cq，tBu)；68.5(b-CH Thr)；65.9(CH2，烯丙基)；58.0(a-CH Thr)；56.2(a-CH Phe)；38.3(b-CH2Phe)；28.0(CH3，tBu)；20.8(g-CH3Thr)。
實施例9Alloc-Phe-Z-Dhb-OtBu。
在氮氣下將Alloc-Phe-Thr-OtBu(3.25g，8.0mmol)、EDC(9.90g，52mmol，6.5當量)和CuCl(2.14g，22mmol，2.7當量)溶于CH2Cl2-無水DMF(65ml，12∶1)中，然后將混合物在氮氣下攪拌2天。真空去除有機溶劑，然后將殘余物溶于飽和EDTA溶液(100ml)中，將其用EtOAc(3×50ml)萃取。合并的有機溶液用鹽水(3×60ml)洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，真空濃縮，得到淺黃色固體(2.8g)，經(jīng)快速層析[CHCl3-MeOH-HOAc(9∶1∶0.1)]純化后，得到題述產(chǎn)物(2.6g，6.7mmol，84％收率)，該產(chǎn)物經(jīng)分析型HPLC表征(tR23.1min，純度＞95％；條件C)；ESMS，C21H28N2O5的計算值388.2。實測值m/z389.6[M+H]+；1H-NMR(200MHz，CDCl3)7.2-7.4(5H，m，Ar)；6.69(1H，q，J＝7.4Hz，CH Dhb)；5.8-6.0(1H，m，CH烯丙基)；5.2-5.3(2H，m，CH2g-烯丙基)；4.5-4.6(2H，m，a-CH2烯丙基)；3.1-3.3(2H，m，b-CH2Phe)；1.67(3H，d，J＝7.2Hz，CH3Dhb)；1.47(9H，s，tBu)；13C-NMR(50MHz，CDCl3)168.9(CO)，163.1(CO)；156.0(CO)；136.0(Cq，Ar)；132.6，132.3(CH，烯丙基；b-CHDhb)；129.3(CH，Ar)；128.7(CH，Ar)；127.0(CH，Ar)；117.9(CH2，烯丙基)；81.7(Cq，tBu)；66.0(CH2，烯丙基)；56.3(a-CH，Phe)；38.2(b-CH2Phe)；28.0(CH3，tBu)；14.7(CH3Dhb)。
實施例10Alloc-Phe-Z-Dhb-OH。
將Alloc-Phe-Z-Dhb-OtBu(2.6g，6.7mmol)溶于TFA-CH2Cl2-H2O(90∶8∶2，5.5ml)中，然后將混合物攪拌3小時。真空濃縮有機反應物，得到題述產(chǎn)物(2.2g，6.6mmol，99％收率)，該產(chǎn)物經(jīng)分析型HPLC表征(tR17.0min，純度＞95％；條件C)；ESMS，C17H20N2O5的計算值332.1。實測值m/z 333.7[M+H]+；1H-NMR(200MHz，CD3OD)7.2-7.3(5H，m，Ar)；6.84(1H，q，J＝7.2Hz，CH Dhb)；5.8-6.0(1H，m，CH烯丙基)；5.1-5.3(2H，m，CH2g-烯丙基)；4.4-4.5(2H，m，a-CH2烯丙基)；3.2-3.3(1H，m，b-CH2Phe)；2.8-3.0(1H，m，b-CH2Phe)；1.66(3H，d，J＝7.4Hz，CH3Dhb)；13C-NMR(50MHz，CD3OD)173.1(CO)；138.5(Cq，Ar)；136.7，134.1(CH，烯丙基；b-CH Dhb)；130.3(CH，AR)；129.4(CH，Ar)；127.7(CH，ar)；117.4(CH2，烯丙基)；66.6(CH2，烯丙基)；57.8(a-CH，Phe)；39.1(b-CH2Phe)；14.1(CH3Dhb)。
實施例115-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Alloc)-D-別-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂。
將Cl-TrtCl-樹脂(0.45g，1.35mmol/g)置于10ml裝有聚乙烯濾片的聚丙烯注射器中。根據(jù)與實施例1-3所述的相同方法獲得肽基-樹脂，只是所述第一種氨基酸(Fmoc-D-Val-OH)與樹脂的偶聯(lián)使用0.3當量，而不是0.2當量。通過AAA計算的初始載荷為0.29mmol/g。一旦所述氨基酸被偶聯(lián)，則將一等份的肽基-樹脂用TFA-H2O(9∶1)處理60分鐘，蒸發(fā)后獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(條件B，tR17.3min)顯示純度＞80％。ESMS，C66H116N12O17的計算值1,348.9。實測值m/z 1,350.1[M+H]+。
實施例125-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-Alloc)-D-別-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂(通過摻入二肽)。
在PhSiH3(161μl，1.3mmol，10當量)存在下，在Ar氛圍下，將所述肽基-樹脂用Pd(PPh3)4(15.1mg，0.013mmol，0.1當量)處理，以去除Alloc基團。將Alloc-Phe-Z-Dhb-OH(217mg，0.65mmol，5當量)和HATU(249mg，0.65mmol，5當量)溶于DMF(1.25ml)，并且加入到肽基-樹脂中，然后加入DIEA(228μl，1.3mmol，10當量)，將混合物攪拌過夜。洗滌后，當茚三酮試驗為陰性時，所述偶聯(lián)用相同量的試劑重復3小時。用DMF和CH2Cl2洗滌后，一等份的肽基-樹脂用TFA-H2O(9∶1)處理60分鐘，蒸發(fā)后獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC(條件B，tR18.3min)顯示純度＞80％。MALDI-TOF-MS，C79H130N14O19的計算值1,579.0。實測值m/z 1,580.3[M+H]+，1,602.2[M+Na]+，1,618.2[M+K]+。
實施例135-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-別-Ile-D-別-Thr(Val-Z-Dhb-Phe-H)-D-別-Ile-D-Val-OH。
在PhSiH3(161μl，1.3mmol，10當量)存在下，在Ar氛圍下，用Pd(PPh3)4(15.1mg，0.013mmol，0.1當量)去除肽基-樹脂(實施例12)中的Alloc基團。通過AAA計算的終載荷為0.16mmol/g(79％總收率)。通過TFA-CH2Cl2(1∶99)從所述樹脂(235mg，37.5mmol)切下被保護的肽(5×30sec)。將合并的濾液減壓蒸發(fā)至干，然后凍干，得到40.5mg(24.5mmol，65％)題述化合物，通過HPLC(條件B，tR24.3min)檢查的純度＞80％。MALDI-TOF-MS，C84H142N14O19的計算值1,651.1。實測值m/z 1,674.8[M+Na]+，1,690.8[M+K]+。
實施例14kahalalide F(I)。
將被保護的肽(實施例13)(38.5mg，23μmol)溶于DMF(25ml)中，然后加入PyBOP(36.4mg，70μmol，3當量)和DIEA(24ml，140μmol，6當量)。將混合物攪拌1小時，然后在減壓下通過蒸發(fā)去除溶劑。將被保護的環(huán)肽溶于TFA-H2O(19∶1，5ml)，然后將混合物攪拌1小時。在減壓下通過蒸發(fā)去除溶劑，然后加入H2O(5ml)并凍干。如實施例7所述將粗產(chǎn)物純化，得到題述產(chǎn)物(3.6mg，2.4μmol，10％收率)，該產(chǎn)物與實施例7中獲得的產(chǎn)物相同。5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)(Goetz，G.等Tetrahedron，1999，第55卷，第7739-7746頁給出的kahalalide F結(jié)構(gòu))實施例155-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)(通過在固相中脫水)。
進行如實施例1-7所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，將Fmoc-Val-OH摻入到D-Pro-肽基-樹脂中，然后在去除Fmoc基團后，再摻入Fmoc-D-Val-OH。通過AAA計算的終載荷為0.106mmo/g(87％總收率)。切割收率為83％，獲得4.7mg題述化合物，在環(huán)化、脫保護和純化步驟中它代表13％總收率。該產(chǎn)物在HPLC中洗脫的時間比真正的kahalalide F樣品遲0.8-1.9分鐘[條件D(tR13.3min對12.5min)，條件E(tR18.8min對17.4min)，條件F(tR14.0min對12.1min)]。MALDI-TOF-MS，C75H124N14O16的計算值1,477.9。實測值m/z 1,478.7[M+H]+，1,500.7[M+Na]+，1,516.6[M+K]+。
所述化合物的1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)譜(表II和表III)與真正的kahalalide F樣品獲得的波譜不同。最大的差異為獲得的合成化合物，顯示出兩種構(gòu)象，這是由于L-Val-D-Pro殘基之間的順式-反式平衡所致，這在既沒有在天然產(chǎn)物中觀測到，也沒有在實施例7獲得的異構(gòu)體中觀測到。
表II(主要反式異構(gòu)體)

表III(次要順式異構(gòu)體)

實施例15bis5-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例15的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間題述產(chǎn)物作為副產(chǎn)物獲得。該產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.6min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H124N14O16的計算值1,477.9。實測值m/z 1,479.3[M+H]+，1,501.2[M+Na]+，1,517.2[M+K]+。
實施例165-MeHex-D-Val-Thr-D-Val-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)(通過摻入二肽)。
進行如實施例8-14所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例14的步驟中，將Fmoc-Val-OH摻入到D-Pro-肽基-樹脂中，然后在去除Fmoc基團后，再摻入Fmoc-D-Val-OH。通過AAA計算的終載荷為0.16mmol/g(79％總收率)。切割效率為78％，獲得3.4mg題述化合物，在環(huán)化、脫保護和純化步驟中它代表10％總收率。經(jīng)純化的產(chǎn)物與實施例15中獲得的產(chǎn)物相同。Hamann等的kahalalide B[5-MeHex-Tyr-環(huán)(D-Ser-Phe-D-Leu-Pro-Thr-Gly)]實施例17H-Thr(tBu)-O-TrtCl-樹脂。
將Cl-TrtCl-樹脂(0.5g，1.35mmol/g)置于10ml裝有聚乙烯濾片的聚丙烯注射器中。然后用CH2Cl2(5×0.5min)洗滌樹脂，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH(54mg，0.135mmol，0.2當量)和DIFA(235ml，1.35mmol，2當量)的CH2Cl2(1.25ml)溶液，將混合物攪拌1小時。在攪拌15分鐘后，通過加入MeOH(400ml)終止反應。Fmoc-Thr(tBu)-O-TrtCl-樹脂進行以下洗滌/處理CH2Cl2(3×0.5min)、DMF(3×0.5min)、哌啶-CH2Cl2-DMF(1∶9.5∶9.5，1×10min)、哌啶-DMF(1∶4，1×15min)、DMF(5×0.5min)、異丙醇(2×1min)、DMF(5×0.5min)、MeOH(2×1min)，然后真空干燥。通過AAA計算的載荷為0.15mmol/g。
實施例185-MeHex-Tyr-D-Ser(Gly-H)-Phe-D-Leu-Pro-Thr-OH。
在DMF(1.25ml)中，用DIPCDI(82μl，0.53mmol，7當量)和HOBt(81mg，0.53mmol，7當量)，將Fmoc-Pro-OH(178mg，0.53mmol，7當量)、Fmoc-D-Leu-OH(187mg，0.53mmol，7當量)、Fmoc-Phe-OH(204mg，0.53mmol，7當量)、Fmoc-D-Ser-OH(游離羥基)(173mg，0.53mmol，7當量)、Fmoc-Tyr(tBu)-OH(243mg，0.53mmol，7當量)和5-MeHex-OH(69mg，0.53mmol，7當量)依次加到以上獲得的H-Thr(tBu)-O-TrtCl-樹脂中。在除D-Ser外的所有情況下，在偶聯(lián)90分鐘后，茚三酮試驗都為陰性。在DIEA(184μl，1.06mmol，14當量)存在下，將Fmoc-D-Ser-OH(173mg，0.53mmol，7當量)與HATU(201mg，0.53mmol，7當量)在DMF中再偶聯(lián)90分鐘。如通用方法所述去除Fmoc基團并進行洗滌。在DMAP(8.3mg，68μmol，0.9當量)存在下，將Boc-Gly-OH(119mg，0.68mmol，9當量)與DIPCDI(105μl，0.68mmol，9當量)偶聯(lián)2.5小時。用新鮮試劑將該偶聯(lián)重復1.5小時。終荷載為0.10mmol/g，表示77％合成收率。用TFA-H2O(92∶8)從所述樹脂(525mg，54μmol)切下未保護的肽達2小時。將合并的濾液減壓蒸發(fā)至干，加入H2O(5ml)，將溶液凍干，得到43.0mg(48.0μmol，89％收率)題述化合物，經(jīng)HPLC(條件A，tR18.5min)檢查的純度＞85％。ESMS，C45H65N7O12的計算值895.5。實測值m/z896.6[M+H]+。
實施例19kahalalide B[5-MeHex-Tyr-環(huán)(D-Ser-Phe-D-Leu-Pro-Thr-Gly)]。
將未保護的肽(實施例18)(40.5mg，45μmol)溶于DMF(48ml)中，然后加入PyBOP(70mg，0.135mmol，3當量)和DIEA(47ml，0.271mmol，6當量)。將混合物攪拌2小時，然后在減壓下通過蒸發(fā)去除溶劑，加入H2O(5ml)，將溶液凍干。該粗產(chǎn)物通過中壓層析(Vydac C1815-20μm，300，240×24mm)、在5小時內(nèi)用線性梯度20％-60％乙腈(+0.05％ TFA)的水(+0.05％ TFA)溶液以120ml/h純化(每種溶劑各300ml)，于220nm檢測，得到題述產(chǎn)物(8.7mg，9.9μmol，22％收率)。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(條件A，tR21.6min)和MALDI-TOF-MS表征，C45H63N7O11的計算值877.5。實測值m/z 878.7[M+H]+，900.6[M+Na]+，916.5[M+K]+。AAAGly1.02(1)，Thr0.95(1)，Phe0.99(1)，Ser1.00(1)，Pro1.20(1)，Leu1.00(1)，Tyr0.87(1)。
實施例205-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Etg-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-4和實施例6-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例4的步驟中，用Fmoc-Etg-OH代替Fmoc-Thr-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR16.8min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H126N14O16的計算值1,479.0。實測值m/z 1,480.2[M+H]+，1,502.2[M+Na]+，1,518.0[M+K]+。
實施例20b5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-D-Etg-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-4和實施例6-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例4的步驟中，用Fmoc-D-Etg-OH代替Fmoc-Thr-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H126N14O16的計算值1,479.0。實測值m/z 1,501.0[M+Na]+，1,517.9[M+K]+。
實施例20c5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-D-Thr-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-4和實施例6-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例4的步驟中，用Fmoc-D-Thr(tBu)-OH代替Fmoc-Thr(tBu)-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR19.9min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H126N14O17的計算值1,494.9。實測值m/z1,517.4[M+Na]+，1,533.4[M+K]+。
實施例20d5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-D-別-Thr-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-4和實施例6-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例4的步驟中，用Fmoc-D-別-Thr-OH代替Fmoc-Thr(tBu)-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR18.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H126N14O17的計算值1,494.9。實測值m/z1,496.6[M+H]+，1,518.6[M+Na]+，1,534.6[M+K]+。
實施例20e5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-D-Phe-Val)。
如實施例1-7中所述的實驗方法從200mg樹脂開始，與實施例4唯一不同的是，用Fmoc-D/L-(b-OH)Phe-OH代替Fmoc-Thr-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR22.2min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C80H126N14O16的計算值1,538.95。實測值m/z 1,540.3[M+H]+，1,562.4[M+Na]+，1,578.3[M+K]+。
實施例215-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-Dpa-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例2的步驟中，用Fmoc-D-Dpa(Alloc)-OH代替Fmoc-D-別-Thr-OH，并且在摻入Alloc-Val-OH之前(與其余被保護的氨基酸一樣將其摻入)，如上所述去除Dpa中的Alloc基團。產(chǎn)物經(jīng)HPLC和ESMS表征，C74H123N15O15的計算值1,461.9。實測值m/z 1,463.3[M+H]+。
實施例22But-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用But-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR14.7min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C72H118N14O16的計算值1,435.9。實測值m/z 1,459.6[M+Na]+，1,475.6[M+K]+。
實施例22bisBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例22的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR16.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C72H118N14O16的計算值1,435.9。實測值m/z 1,459.5[M+Na]+，1,475.5[M+K]+。
實施例233-MeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用3-MeBut-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR15.9min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C73H120N14O16的計算值1,449.9。實測值m/z 1,473.2[M+Na]+，1,489.2[M+K]+。
實施例23bis3-MeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例23的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.0min，條件B)和ESMS表征，C73H120N14O16的計算值1,449.9。實測值m/z 1,473.3[M+Na]+，1,489.4[M+K]+。
實施例243，3-DiMeBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用3，3-DiMeBut-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR16.3min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H122N14O16的計算值1,463.9。實測值m/z 1,487.4[M+Na]+，1,503.6[M+K]+。
實施例24bis3，3-DiMeBut-D-Val-Thr-VAl-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例24的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.6min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H122N14O16的計算值1,463.9。實測值m/z 1,487.3[M+Na]+，1,503.3[M+K]+。
實施例254-MePen-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用4-MePen-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR16.5min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H122N14O16的計算值1,463.9。實測值m/z 1,487.7[M+Na]+，1,503.6[M+K]+。
實施例25bis4-MePen-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例25的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.8min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H122N14O16的計算值1,463.9。實測值m/z 1,487.8[M+Na]+，1,503.6[M+K]+。
實施例26Hep-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用Hep-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.5min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H124N14O16的計算值1,477.9。實測值m/z 1,501.4[M+Na]+，1,517.5[M+K]+。
實施例26bisHep-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例26的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR18.9min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C75H124N14O16的計算值1,477.9。實測值m/z 1,501.6[M+Na]+，1,517.7[M+K]+。
實施例27Pal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用Pal-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR22.1min，條件G)和MALDI-TOF-MS表征，C84H142N14O16的計算值1,603.1。實測值m/z 1,626.9[M+Na]+，1,642.9[M+K]+。
實施例27bisPal-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例27的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR23.2min，條件G)和MALDI-TOF-MS表征，C84H142N14O16的計算值1,603.1。實測值m/z 1,626.8[M+Na]+，1,642.8[M+K]+。
實施例27a4-DiMeABut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用4-DiMeABut-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HpLC(tR12.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H123N15O16的計算值1,477.9。實測值m/z 1,478.6[M+H]+，1,500.6[M+Na]+，1,516.6[M+K]+。
實施例27b2-Hedo-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用2-Hedo-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR15.8min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H118N14O16的計算值1,458.9。實測值m/z 1,460.0[M+H]+，1,482.0[M+Na]+，1,497.9[M+K]+。
實施例27c4-AcBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用4-AcBut-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR18.2min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C74H120N14O18的計算值1,492.9。實測值m/z 1,493.7[M+H]+，1,515.8[M+Na]+，1,531.7[M+K]+。
實施例27d4-HOBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Om-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用4-HOBut-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR16.6min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C72H118N14O17的計算值1,450.9。實測值m/z 1,451.6[M+H]+，1,473.6[M+Na]+，1,489.6[M+K]+。
實施例27eAc-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用HOAc代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C70H114N14O16的計算值1,406.9。實測值m/z 1,407.8[M+H]+，1,429.8[M+Na]+。
實施例27fTFA-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例27e的制備(在環(huán)化步驟期間的三氟乙?；?trifluoroacetylion))期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR14.7min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C70H111F3N14O16的計算值1,460.8。實測值m/z 1,462.0[M+H]+，1,484.1[M+Na]+，1,500.0[M+K]+。
實施例27gAcButBut-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用AcButBut-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR14.1min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C78H126N14O20的計算值l,578.9。實測值m/z 1,581.2[M+H]+，1,602.2[M+Na]+，1,618.2[M+K]+。
實施例27hIBut-D-別-Ile-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用Fmoc-D-別-Ile-OH代替5-MeHex，去除Fmoc基團，然后用IBut-OH?；．a(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR15.3min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C78H129N15O17的計算值1,548.0。實測值m/z 1,548.8[M+H]+，1,570.8[M+Na]+，1,586.8[M+K]+。
實施例27iLit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用Lit-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR13.1min，條件H)和MALDI-TOF-MS表征，C92H150N14O17的計算值1,723.1。實測值m/z 1,724.6[M+H]+，1,746.6[M+Na]+，1,761.5[M+K]+。
實施例27jTFA-Lit-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例27i的制備(在環(huán)化步驟期間的三氟乙?；?期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.1min，條件H)和MALDI-TOF-MS表征，C94H159F3N14O18的計算值1,819.1。實測值m/z 1,820.6[M+H]+，1,842.6[M+Na]+，1,858.6[M+K]+。
實施例27kTIco-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，用TIco-OH代替5-MeHex。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR16.8min，條件H)和ES-MS表征，C92H158N14O16的計算值1,715.2。實測值m/z 858.2[M+H]+/2，1,171.8[M+H]+。
實施例28H-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
從200mg樹脂開始，進行如實施例1-7中所述的實驗方法，唯一不同的是，在實施例3的步驟中，不摻入5-MeHex，并且用Fmoc-D-Val-OH代替Fmoc-D-Val-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR11.6min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C68H112N14O15的計算值1,364.8。實測值m/z1,388.3[M+Na]+，1,404.3[M+K]+。
實施例28bisH-D-Val-Tbr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例28的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR12.9min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C68H112N14O15的計算值1,364.8。實測值m/z 1,388.4[M+Na]+，1,404.4[M+K]+。
實施例295-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。
方案2 合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-Orn(Boc)-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR23.9min，條件A)和MALDI-TOF-MS表征，C70H114N12O15的計算值1,362.9。實測值m/z 1,386.4[M+Na]+，1,402.4[M+K]+。
實施例29bis5-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
在實施例29的制備(在環(huán)化步驟期間的外消旋化)期間作為副產(chǎn)物獲得的產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)HPLC和MALDI-TOF-MS表征。
實施例305-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-Orn(Boc)-OH和Fmoc-D-Pro-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR20.3min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C65H107N11O14的計算值1,265.8。實測值m/z 1,288.5[M+Na]+，1,304.5[M+K]+。
實施例315-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-D-Pro-OH和Fmoc-D-Val-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR20.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C60H98N10O13的計算值1,166.7。實測值m/z 1,190.9[M+Na]+，1,206.9[M+K]+。
實施例325-MeHex-D-Val-Thr-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-D-Pro-OH、Fmoc-D-Val-OH和Fmoc-Val-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR24.6min，條件A)和MALDI-TOF-MS表征，C55H89N9O12的計算值1,067.7。實測值m/z1,068.7[M+H]+，1,090.6[M+Na]+，1,106.5[M+K]+。
實施例335-MeHex-D-Val-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-D-Pro-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR19.8min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C51H82N8O10的計算值966.6。實測值m/z 990.7[M+Na]+，1007.2[M+K]+。
實施例345-MeHex-D-別-Ile-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-Om(Boc)-OH、Fmoc-D-Pro-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH和Fmoc-D-Val-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR22.0min，條件B)和MALDI-TOF-MS表征，C46H73N7O9的計算值867.6。實測值m/z 890.6[M+Na]+，906.6[M+K]+。
實施例355-MeHex-環(huán)(D-別-Thr-D-別-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-Val)。
實驗方法基本上如實施例1-7中所述，但依照方案2。合成從200mg樹脂開始，但不摻入Fmoc-D-別-Ile-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-D-Pro-OH、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH和Fmoc-D-Val-OH。產(chǎn)物經(jīng)HPLC(tR17.1min，條件B)和ESMS表征，C40H62N6O8的計算值754.5。實測值m/z 755.7[M+H]+，777.7[M+Na]+，793.7[M+K]+。生物活性按照Berjeron等，Biochem and Bioph Res.Comm.，1984，121，3，848-854的方法獲得的下表中的結(jié)果，證明了本發(fā)明化合物的生物活性。所述細胞系為P388，鼠淋巴瘤；A549，人肺癌；HT-29，人結(jié)腸癌；MEL-28，人黑素瘤；DU-145，人前列腺癌。
表kahalalide F同類物



**當鏈有指定末端時化合物的鏈與化合物7中的相同，但具有5-MeHex的指定取代。
表kahalalide F同類物的細胞毒性衍生物的IC50(微摩爾)值


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權(quán)利要求
1.一種天然kahalalide的模擬物，所述模擬物是一種具有基于天然kahalalide的結(jié)構(gòu)、但在以下方面中的一個或多個方面不同的生物活性化合物至少一個氨基酸與所述母體化合物中存在的氨基酸不同；除所述母體化合物側(cè)鏈?；械膩喖谆膺€有至少一個額外的亞甲基；從所述母體化合物側(cè)鏈?；腥笔е辽僖粋€亞甲基；至少一個取代基添加到所述母體化合物側(cè)鏈酰基上；從所述母體化合物側(cè)鏈?；腥笔е辽僖粋€取代基。
2.一種權(quán)利要求1的化合物，所述化合物在結(jié)構(gòu)上基本上與選自以下的kahalalide相似kahalalide A、kahalalide B、kahalalide C、kahalalide D、kahalalide E、kahalalide F、kahalalide G、kahalalide H和kahalalide J。
3.一種權(quán)利要求2的化合物，所述化合物模擬kahalalide F，但在所述側(cè)鏈上與kahalalide F不同。
4.一種權(quán)利要求3的化合物，所述化合物在所述側(cè)鏈上具有至少一個額外的取代基。
5.一種權(quán)利要求4的化合物，所述化合物包括至少一個鹵素取代基。
6.一種權(quán)利要求2-5中任一項的化合物，所述化合物模擬kahalalide F，但在所述側(cè)鏈氨基酸上與kahalalide F不同。
7.一種權(quán)利要求2-5中任一項的化合物，所述化合物模擬kahalalide F，但在一個環(huán)氨基酸上與kahalalide F不同。
8.一種制備kahalalide F模擬物的方法，所述方法包括依照以下方案的環(huán)合 其中R’為基團R-CO-N或其前體，并且其中所述氨基酸中的一個或多個氨基酸可以具有保護基，并且其中Aa3的-COOH和/或Aa4的-NH2可以任選地被保護、活化或衍生化。
9.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含一種kahalalide模擬物和一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。
10.一種治療癌癥的方法，所述方法包括給予有效量的通過權(quán)利要求8的方法制備的kahalalide模擬物或者kahalalide F。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備kahalalide F的方法，所述方法產(chǎn)生其它具有有用生物活性的kahalalide模擬化合物。
文檔編號A61K38/00GK1422278SQ0180774
公開日2003年6月4日 申請日期2001年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月9日
發(fā)明者F·阿貝利西奧, E·吉拉爾特, J·C·吉梅內(nèi)滋, A·洛佩滋, I·曼扎納雷斯, I·羅德里古斯, M·羅尤 申請人:法馬馬有限公司