專利名稱：含有低聚糖的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有下式低聚糖或這些低聚糖混合物作為活性組分的藥物組合物式(I)所示新低聚糖、其混合物及其制備方法 在式(I)中，n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4、R5、R6和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，R2和R7相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)或COCH3基團(tuán)，而M是鈉、鈣、鎂或鉀。
這些低聚糖因此含有偶數(shù)糖。
在式(I)中，R4和R6優(yōu)選地是氫原子。
G.H.LEE及其同事在《色譜雜志》(J.Chromat.)，212，65-73(1981)中已經(jīng)描述過式(I)所示低聚糖，其中n等于0，或者R1、R6和R8代表氫原子，R7代表SO3M基團(tuán)或COCH3基團(tuán)，M是鈉，或者R1和R6代表氫原子，R7代表COCH3基團(tuán)，R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R6代表氫原子，R1、R7和R8分別代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，但是他們沒有說明這些產(chǎn)品的任何藥學(xué)性能。
MW McLEAN及其同事在《Eur.J.Biochem.》1984，145，607中描述過式(I)所示低聚糖，其中n等于0，或者R6和R7代表氫原子，R1和R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R1、R6和R7代表氫原子，R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，但是未說明這些產(chǎn)物的任何藥學(xué)活性。
優(yōu)選的藥物組合物是含有式(I)所示低聚糖的組合物，其中-n是0-10的整數(shù)，特別地0-6的整數(shù)，更特別地1-6的整數(shù)，
-R1、R2、R3、R5、R7和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，特別地R1、R2、R3、R5、R7和R8是SO3M基團(tuán)，-M是鈉。
特別優(yōu)選的藥物組合物是含有式(I)所示低聚糖的組合物，其中-n等于0，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R6是氫原子，M是鈉，-n等于1，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，-n等于2，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，-n等于3，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，-n等于4，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
式(I)所示低聚糖是新的并且構(gòu)成本發(fā)明的一部分，但不包括其中n等于0，或者R1、R6和R8代表氫原子，R7代表SO3M基團(tuán)或COCH3基團(tuán)，M是鈉，或者R1和R6代表氫原子，R7代表COCH3基團(tuán)，R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R6代表氫原子，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R6和R7代表氫原子，R1和R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R1、R6和R7代表氫原子，R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉的式(I)所示低聚糖。
通過堿金屬硼氫化物或季銨硼氫化物與下式所示低聚糖作用可以制備式(I)所示低聚糖 式中n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4、R5、R6和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，R2和R7相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)或COCH3基團(tuán)，M是鈉、鈣、鎂或鉀。
在整個反應(yīng)期間，反應(yīng)在含水介質(zhì)中，在溫度約25℃，pH7-10，優(yōu)選地9-10的條件下進(jìn)行。通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉溶液保持pH不變。通過酸化反應(yīng)介質(zhì)，例如通過添加醋酸，直到pH4-5為止可停止該反應(yīng)。
作為堿金屬硼氫化物，可以列舉硼氫化鋰、硼氫化鈉和硼氫化鉀。
作為季銨硼氫化物，可以列舉四丁基硼氫化銨。
式(II)低聚糖可以采用下述方法得到通過對肝素進(jìn)行酶的解聚作用，或通過對肝素芐酯或半合成肝素芐酯進(jìn)行堿的解聚作用所得到的低聚糖(III)混合物，經(jīng)凝膠色譜分離。
這種色譜分離使用裝有聚丙烯酰胺-瓊脂糖類凝膠，例如可以商標(biāo)Ultrogel ACA202R(Biosepra)從市場上購得的凝膠的柱。優(yōu)選地，使用聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠柱組。柱的使用數(shù)量可根據(jù)體積、凝膠和待分離低聚糖進(jìn)行調(diào)整。用含有磷酸鹽緩沖液和氯化鈉的溶液洗脫混合物。優(yōu)選地，磷酸鹽緩沖液是含有0.1摩爾/升氯化鈉的0.02摩爾/升NaH2PO4/Na2HPO4(pH7)溶液。采用紫外光譜法(254nm)和離子法(IBF)檢測不同的餾分。這樣得到的餾分然后可以任選地，例如根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法采用SAX(強(qiáng)陰離子交換)色譜進(jìn)行純化，特別是根據(jù)下述文獻(xiàn)描述的方法進(jìn)行純化K.G.Rice和R.J.Linhardt，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)，190，219-233(1989)，A.Larnkjaer，S.H.Hansen和P.B.Ostergaard，《碳水化合物研究》，266，37-52(1995)和專利WO90/01501(實(shí)施例2)。然后，將這些餾分凍干，再使用凝膠柱，例如Séphadex G 10R凝膠柱(Pharmacia Biochemicals)進(jìn)行脫鹽。
采用SAX色譜進(jìn)行純化時，這些凍干物可任選地通過簡單沉淀進(jìn)行純化，或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，特別地根據(jù)專利FR2548672描述的方法進(jìn)行分離。一般地，根據(jù)下述方案操作待純化的凍干餾分在25℃溶于約10個體積蒸餾水中。通過添加甲醇或乙醇，沉淀所希望的低聚糖，同時采用HPLC色譜(高效液相色譜)控制其富集。添加甲醇或乙醇是根據(jù)所述低聚糖要達(dá)到的純度和產(chǎn)率決定的。同樣地，這種操作可使用原始凍干溶液分多個相繼步驟進(jìn)行。為此，分小份再添加不溶劑(甲醇或乙醇)，在每次添加步驟后分離所得到的沉淀。這樣制備的沉淀可采用HPLC色譜分析。根據(jù)希望達(dá)到的純度和產(chǎn)率，將適當(dāng)?shù)某恋眇s分合并。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，待純化的凍干餾分可以溶于10-200體積含有0-30％醋酸鈉的水中。醋酸鈉的百分含量需要根據(jù)待處理低聚糖的性質(zhì)(尺寸因素)預(yù)先加以調(diào)節(jié)。通過添加甲醇，沉淀所希望的低聚糖，同時采用HPLC色譜(高效液相色譜)控制其富集。甲醇的添加根據(jù)所述低聚糖要達(dá)到的純度和產(chǎn)率決定。同樣地，這種操作可使用原始凍干溶液分多個相繼步驟進(jìn)行。為此，分小份再添加不溶解劑(甲醇)，在每次添加后分離所得到的沉淀。這樣制備的沉淀可采用HPLC色譜分析。根據(jù)希望達(dá)到的純度和產(chǎn)率，將適當(dāng)?shù)某恋眇s分合并。
對于n＝0、1或2的式(II)所示中間產(chǎn)物，優(yōu)選使用通過酶的解聚作用得到的混合物(III)。
可使用肝素酶I(EC 4.2.2.7)，在pH7磷酸鹽緩沖液中，在氯化鈉和BSA(牛血清白蛋白)存在下，在溫度10-18℃，優(yōu)選地15℃下進(jìn)行這種解聚作用8-10天，優(yōu)選地9天。例如通過將反應(yīng)介質(zhì)加熱到100℃達(dá)2分鐘停止這種解聚作用，采用凍干方法回收該混合物。優(yōu)選地，每25克肝素使用7UI肝素酶。磷酸鹽緩沖液一般在0.1摩爾/升氯化鈉存在下含有0.05摩爾/升NaH2PO4/Na2HPO4(pH7)。BSA濃度一般是2％。
對于n＝0、1、2、3或4的式(II)所示中間體，優(yōu)選使用通過肝素芐酯的解聚作用所得到的混合物(III)。
根據(jù)在專利US 5 389 618、EP 40 144、FR 2 548 672中描述的方法可以制備肝素芐酯。酯化率優(yōu)選地是50-100％。更優(yōu)選地，酯化率是70-90％。
這種解聚作用可在含水介質(zhì)中，使用堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化銫)或季銨氫氧化物(例如四丁基氫氧化銨)，優(yōu)選地以濃度為0.1-0.2摩爾/升，在溫度40-80℃下進(jìn)行5-120分鐘。在一種優(yōu)選方式中，在溫度60-70℃下，使用0.15摩爾/升氫氧化鈉溶液進(jìn)行5-15分鐘。通過加入如醋酸之類的酸進(jìn)行中和可停止該解聚反應(yīng)。在每體積醋酸鈉加入10重量％后，通過加入甲醇，優(yōu)選地每1個體積反應(yīng)介質(zhì)為2個體積，可沉淀低聚糖混合物，然后過濾。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，化學(xué)解聚后得到的低聚糖混合物呈含水溶液形式，可使用具有適當(dāng)標(biāo)稱截止極限的膜(Millipore銷售的再生纖維素的Pellicon類)通過超濾進(jìn)行富集；膜的類型應(yīng)按照待回收的富集低聚糖種類進(jìn)行調(diào)整。對于n＝0的低聚糖(II)，使用標(biāo)稱截止極限1kDa的膜，對于n＝1的低聚糖(II)，使用1kDa或3kDa膜，對于n＝3或4的低聚糖(II)，使用5kDa膜。在這種操作過程中，回收滲透液，排掉剩余物。因此，富集產(chǎn)物的部分可以是開始低聚糖混合物的50-10％，同時保留至少80％所希望的低聚糖。
對于n＝0-25的式(II)所示中間體，優(yōu)選使用用半合成的硫酸化多糖芐酯通過解聚作用所得到的混合物(III)。根據(jù)在專利WO94/29352和WO96/14425中描述的方法，使用由K5多糖得到的半合成硫酸化多糖制備半合成硫酸化多糖芐酯。酯化、解聚和回收的條件與前面針對肝素芐酯所描述的條件相同。
在所有上述方法中，原始肝素可以來自豬、綿羊、山羊或牛，可以來自動物的粘液、肺或皮。
優(yōu)選地，使用豬、綿羊粘液的肝素或牛肺的肝素，更優(yōu)選地，使用豬粘液或牛肺的肝素。
式(I)所示低聚糖具有消炎性質(zhì)，于是可以用于預(yù)防或治療與涉及產(chǎn)生例如一氧化氮(NO)細(xì)胞毒素物質(zhì)的炎癥過程相關(guān)的疾病，特別當(dāng)中性白細(xì)胞或巨噬細(xì)胞遷移并在組織中被激活時，它們釋放出其細(xì)胞毒素物質(zhì)的誘導(dǎo)形式。動脈血管豐富的這種組織在愈合或痙攣后，在局部缺血的組織部位產(chǎn)生中性白細(xì)胞遷移、活化和粘附。這些局部缺血可以出現(xiàn)在腦部(腦血管意外傷害)，或者在心肌(心肌梗塞)，或者在下肢(所謂周圍局部缺血)部位。于是，式(I)低聚糖可以用于預(yù)防和/或治療其中腦的炎癥起著可能導(dǎo)致死亡的有害作用的神經(jīng)變性疾病，其中可以列舉腦局部缺血、心肌局部缺血(心肌梗塞)、周圍的局部缺血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，特別是頭蓋骨、脊柱和顱-脊創(chuàng)傷，多發(fā)性硬化、神經(jīng)病疼痛和周圍神經(jīng)病，運(yùn)動神經(jīng)元疾病，其中包括肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、漸進(jìn)式脊柱萎縮、嬰兒肌肉萎縮和主側(cè)索硬化、神經(jīng)愛滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈癥和特別在關(guān)節(jié)部位的某些骨關(guān)節(jié)炎形式。
根據(jù)M.YAMASHITA及其同事，《Eur.J.Pharmacol》，338，2，151-158(1997)或J.E.SHELLITO及其同事，《Am.J.Respir.CellMol.Biol.》13，1，45-53(1995)描述的方案，在使用來自大腸桿菌的脂多聚糖(LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生NOx(亞硝酸鹽和硝酸鹽)的試驗(yàn)中，在活體內(nèi)證明了這些產(chǎn)品的消炎活性。
在T0時刻，往雄性CD1鼠(Charles河，25-35克)體內(nèi)通過藥團(tuán)靜脈內(nèi)注射0.5毫克/千克低聚糖，在T+15分鐘皮下注射1或2毫克/千克低聚糖。在T+30分鐘給藥100毫克/千克來自大腸桿菌(SigmaL3129，血清型:0127:B8)的脂多聚糖(LPS)。在T+3小時，再次皮下注射1或2毫克/千克低聚糖。在T+5小時30分鐘，采用眼穿刺回收血漿試樣，在按照下述方式用硝酸鹽還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽后，采用Griess比色法測定血清中的NOx(硝酸鹽和亞硝酸鹽)濃度12毫升血漿試樣與88毫升去離子水混合，在黑暗中用40毫升磷酸鹽緩沖液(0.31M，pH7.5)、20毫升β-NADPH(還原性的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)(0.86mM)、20毫升FDA(黃素腺嘌呤二核苷酸)(0.11mM)和20毫升硝酸還原酶(2U/毫升)(Boehringer Mannheim)在室溫下培養(yǎng)1小時。添加10毫升硫酸鋅(1M)以便沉淀蛋白質(zhì)，混合后，試樣在20000克下離心5分鐘。最后，50毫升上清液與100毫升Griess試劑(1％磺胺在磷酸/萘基乙二胺混合物中，0.1％在去離子水中(V/V))在室溫下培養(yǎng)10分鐘。使用微板分光光度計在540nm處讀取光密度；每個點(diǎn)測量兩次。硝酸鉀和亞硝酸鈉用作該比色法的標(biāo)準(zhǔn)。
在這個試驗(yàn)中，本發(fā)明的低聚糖對50％以上NOx的生成產(chǎn)生抑制作用。
另外，式(I)的低聚糖增加了運(yùn)動神經(jīng)元的存活率和促進(jìn)其生長，因此在預(yù)防和/或治療運(yùn)動神經(jīng)元疾病中，例如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、漸進(jìn)式脊柱萎縮、嬰兒肌肉萎縮和主側(cè)索硬化是特別有效的。
人們知道，如果在沒有營養(yǎng)的支持(例如BDNF，NT5)下進(jìn)行這些培養(yǎng)，運(yùn)動神經(jīng)元的培養(yǎng)物會因細(xì)胞程序死亡而消失?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的低聚糖能使運(yùn)動神經(jīng)元存活和生長。根據(jù)下述方案，使用星形細(xì)胞和無神經(jīng)營養(yǎng)因子的運(yùn)動神經(jīng)元的共培養(yǎng)物試驗(yàn)這種活性運(yùn)動神經(jīng)元富集培養(yǎng)使用R.L.SCHNAAR和A.E.SCHAFFNER，《神經(jīng)科學(xué)雜志》(J.Neurosci.)，1，204-217(1981)描述的離心法，和W.CAMU和C.E.HENDERSON，《神經(jīng)科學(xué)與方法雜志》(J.Neurosci.Methods)，44，59-70(1992)改進(jìn)的離心法，制備富集運(yùn)動神經(jīng)元的培養(yǎng)物。無菌解剖E15大鼠胚胎脊髓，取出背部脊索。然后，切斷這些背部脊索，在添加有0.05％胰蛋白酶的PBS(磷酸緩沖鹽水氯化鈉137mM，氯化鉀2.68mM、磷酸氫二鈉6.45mM、磷酸二氫鉀1.47mM)中，在37℃培養(yǎng)15分鐘。在添加0.1％胎牛血清白蛋白(BSA)和0.1毫克/毫升DNA酶的培養(yǎng)介質(zhì)中，通過用1毫升移液管端部搗碎完成細(xì)胞分離。細(xì)胞懸浮液于6.5％(重量/體積)之碘苯甲酰氨基葡萄糖在L15介質(zhì)(由GibcoBRL銷售)中的帶上展開，在500克下離心15分鐘。收集含有運(yùn)動神經(jīng)元的界面帶，稀釋在L15介質(zhì)中，然后在預(yù)先涂布了鼠的anti-IgG和MC192雜交瘤細(xì)胞(Chandler CE及其同事，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)，259，6882(1984))上清液的培養(yǎng)箱中，于室溫下培養(yǎng)45分鐘。懸浮細(xì)胞用L15介質(zhì)洗滌，在緩慢攪拌下用MC192雜交瘤細(xì)胞上清液洗脫。在L15介質(zhì)中添加碳酸氫鈉(22mM)、輔白蛋白(0.1毫克/毫升)、腐胺(0.1mM)、胰島素(5微克/毫升)、亞硒酸鈉(31nM)、葡萄糖(20mM)、黃體酮(21nM)、青霉素(110UI/毫升)和鏈霉素(100微克/毫升)，在培養(yǎng)箱中，在單層星細(xì)胞上展開這些運(yùn)動神經(jīng)元，其密度達(dá)到每24毫米為650個細(xì)胞。培養(yǎng)物保持在37℃與5％CO2的潮濕氣氛中。
脊髓星細(xì)胞的培養(yǎng)根據(jù)稍微改進(jìn)的R.P.SANETO和J.DE VELLIS在《神經(jīng)化學(xué)，實(shí)踐途徑》(Neurochemistry，a practical approach)(A.J.TURNER和H.S.St JOHN)，IRL出版社，牛津-華盛頓DC，第27-63頁(1987)中描述的方法，使用鼠胚胎獲得星細(xì)胞。無菌解剖脊髓，除去髓膜和脊神經(jīng)節(jié)。五至十個脊髓轉(zhuǎn)移到PBS(磷酸鹽緩沖鹽水氯化鈉137mM，氯化鉀2.68mM、磷酸氫二鈉6.45mM、磷酸二氫鉀1.47mM)中，切后再在添加0.25％胰蛋白酶的PBS中于37℃培養(yǎng)25分鐘。通過添加10毫升改進(jìn)的Dubelcco-Eagle介質(zhì)(DMEM)，其中添加了10％牛胎血清(FCS)，停止酶處理，離心收集細(xì)胞。使用1毫升移液管端部進(jìn)行另一個機(jī)械分離步驟。在10％FCS的DMEM中，按照每25毫升培養(yǎng)介質(zhì)為1.5×106細(xì)胞的密度展開細(xì)胞。在試管中2天后，在整個研究期間每天都加培養(yǎng)物。當(dāng)?shù)玫娇梢娂?xì)胞單層時，這些培養(yǎng)物按照每分鐘250轉(zhuǎn)攪拌48小時，次日，用胞核嘧啶阿拉伯糖苷(10-5摩爾)處理這些單層達(dá)48小時。從研究開始，對于25毫升培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)板上擴(kuò)增星細(xì)胞單層，達(dá)到密度為每35毫米五個為止。
脊髓星細(xì)胞培養(yǎng)物由98％以上對膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)具有免疫活性的細(xì)胞組成。
星細(xì)胞單層或者只與PBS(對照)接觸，或者與濃度為0.1-10納克/毫升待試驗(yàn)產(chǎn)品的PBS溶液接觸24小時。然后，用DMEM洗滌星細(xì)胞單層，與其中添加有運(yùn)動神經(jīng)元的培養(yǎng)介質(zhì)一起保持2小時。加料后兩小時的2-3天期間還往培養(yǎng)介質(zhì)再添加載體和待試驗(yàn)產(chǎn)品。
運(yùn)動神經(jīng)元的免疫化學(xué)鑒定這些細(xì)胞用4％多聚甲醛和0.1％戊二醛的PBS溶液固定(pH7.4，在4℃，15分鐘)。然后，這些培養(yǎng)物進(jìn)行洗滌，這些非特異性位點(diǎn)用2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液和0.1％Triton X100R阻斷。這些培養(yǎng)物相繼地與p75LNGRF抗體(前面引用的Chandler的文章)在4℃培育一夜，再與生物素化羊血清(1/125，Gibco)和抗生蛋白鏈菌素過氧化酶(1/200，Gibco)培育60分鐘。使用DAB/過氧化氫反應(yīng)，可目視觀測這些抗體。
培養(yǎng)物計數(shù)與統(tǒng)計分析低活性p75LNGRF的神經(jīng)營養(yǎng)素受體的免疫反應(yīng)細(xì)胞，具有其長度大于4個細(xì)胞直徑的神經(jīng)突，這些細(xì)胞被看作是活的運(yùn)動神經(jīng)元。通過在放大200倍的顯微鏡下計數(shù)在0.825厘米2表面范圍內(nèi)的標(biāo)記細(xì)胞數(shù)，可評估運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)。這些值表示為每厘米2運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)，或與對照相比，保持無營養(yǎng)因子時在培養(yǎng)物中存在的運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)的百分?jǐn)?shù)。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少三次。
采用Student檢驗(yàn)(t-檢驗(yàn))，進(jìn)行統(tǒng)計分析。
通過采用本發(fā)明的低聚糖進(jìn)行預(yù)處理，在星細(xì)胞單層上生長的運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)從20％增加到50％。
下述實(shí)施例說明式(I)所示低聚糖和中間產(chǎn)物的制備方法。
在這些實(shí)施例中，縮寫的意義如下ΔIs(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-hex吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖，四鈉鹽或ΔUAp2S-(1→4)-a-D-GlcNp2S6SIs(2-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖，四鈉鹽(2-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖，四鈉鹽或α-L-艾杜Ap2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S6SIIs(α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖，三鈉鹽或α-L-艾杜Ap-(1→4)-α-D-GlcNp2S6SIIIs(2-磺基-α-L-ido吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖，三鈉鹽或α-L-idoAp2S-(1→4)-α-D-GlcNp2S
IdoApido吡喃糖基糖醛酸GlcNp2-氨基-2-脫氧-吡喃葡糖ΔUap4-脫氧-α-L-蘇-己-eno吡喃糖基糖醛酸S硫酸鹽。
式(II)所示中間體混合物的制備實(shí)施例實(shí)施例A-采用酶解聚作用和分離制備其中n＝0、1和2的式(II)所示低聚糖。
將25克肝素溶解于250毫升含有0.05摩爾/升NaH2PO4/Na2HPO4(pH7)、0.2摩爾/升氯化鈉和2％BSA(牛血清白蛋白)的磷酸緩沖液。往該混合物添加7UI肝素酶I(EC 4.2.2.2.7)，得到的溶液冷卻到15℃，然后在整個解聚反應(yīng)期間都保持在這個溫度下。抽取等份試樣跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，采用凝膠滲透色譜進(jìn)行分析。在9天后，通過將反應(yīng)介質(zhì)加熱到100℃達(dá)兩分鐘，可停止該酶反應(yīng)。冷卻的混合物再進(jìn)行凍干。這樣得到低聚糖(III)混合物。
得到的低聚糖(III)混合物再根據(jù)下述方法進(jìn)行色譜分離該色譜法采用裝有以其名稱Ultrogel ACA 202被公知的聚丙烯酰胺-瓊脂糖的柱進(jìn)行，該混合物用含有磷酸緩沖液(0.02摩爾/升NaH2PO4/Na2HPO4)pH7和0.1摩爾/升氯化鈉的溶液洗脫。采用紫外光譜測定法(254nm)和離子測定法(IBF)進(jìn)行檢測。這些產(chǎn)物可以任選地采用SAX(強(qiáng)陰離子交換)色譜法或根據(jù)專利FR 2 548 672中描述的方法，采用分步沉淀進(jìn)行純化?；厥盏漠a(chǎn)物部分進(jìn)行凍干，再用G10Rsephadex(Pharmacia Biochemicals)凝膠裝填的柱進(jìn)行脫鹽。
采用這種方法，得到3克二糖ΔIs，1100毫克典型地含有55％Is-Is-Is、35％ΔIs-Is-IIs和10％ΔIs-Is-IIIs的六糖混合物。這后一種混合物可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行純化以便分離成各個組分，或原樣使用以便將其轉(zhuǎn)化成式(I)所示還原衍生物。
實(shí)施例B-通過肝素芐酯解聚作用與分離制備式(II)所示其中n＝0、1、2、3或4的低聚糖a-制備肝素芐酯根據(jù)US 5 389 618的實(shí)施例3制備肝素芐酯b-解聚反應(yīng)將100克肝素芐酯溶解于1.9升軟化水中。該混合物在攪拌下升溫到60℃。在得到均勻溶液后，僅一次加入約35毫升23％氫氧化鈉溶液。在反應(yīng)10分鐘后，冷卻該溶液，再用80毫升約2N醋酸溶液進(jìn)行中和。往這種溶液，添加10％(重量/體積)醋酸鈉。通過添加約2個體積甲醇沉淀低聚糖混合物。沉淀經(jīng)過濾分離后，用甲醇洗滌兩次，然后在50℃減壓下干燥。干燥后，得到73.8克式(II)所示低聚糖混合物。
c-其中n＝1的低聚糖的富集將30克前面得到的低聚糖混合物溶解于約35個體積水中。這種溶液用3kDa膜(Pellicon)進(jìn)行超過濾。取出600毫升滲透液，余下的用500毫升水稀釋。繼續(xù)這種操作直到再取出450毫升滲透液為止。這兩份滲透液合并，再在減壓下濃縮至干。得到6.1克微黃白色固體。采用凝膠滲透色譜法分析固體表明，它含有約30％其中n＝1的式(II)所示低聚糖。
d-超濾的低聚糖混合物的分離該富集混合物采用裝有以其名稱Ultrogel ACA 202被公知的聚丙烯酰胺-瓊脂糖的柱(使用四個串聯(lián)柱，柱直徑為10厘米，高為50厘米)分離。5克通過超濾富集的混合物溶于25毫升水中，然后用0.2摩爾/升氯化鈉溶液以速度5毫升/分鐘進(jìn)行洗脫。在柱底回收多個餾分，每個餾分25毫升。采用紫外光譜測定法(254nm)和離子測定法(IBF)檢測產(chǎn)物?；厥掌渲衝＝1的產(chǎn)物餾分，凍于，然后用G10Rsephadex凝膠裝填的柱進(jìn)行脫鹽。在凍干后，得到1克四糖，它典型地含有70％式II的ΔIs-Is衍生物(R1、R2、R3、R5、R7、R8＝SO3Na；R4、R6＝H和M＝Na)。ΔIs-Is衍生物可以任選地采用SAX(強(qiáng)陰離子交換)色譜法或根據(jù)專利FR 2 548 672中描述的方法與本發(fā)明中描述的實(shí)施方案，按照分步沉淀的一種優(yōu)選方式進(jìn)行純化。
式(I)所示低聚糖的制備實(shí)施例實(shí)施例1在反應(yīng)器中，加入300毫克式(II)所示低聚糖在2毫升水中的25℃溶液，式中n等于0，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R6代表氫原子和M是鈉。在攪拌下，一次添加212毫克硼氫化鈉。這時，通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)到9-10。在12小時后，漸進(jìn)地添加醋酸，直到pH達(dá)到4-5為止。該混合物攪拌1小時，然后通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉將該溶液的pH再調(diào)節(jié)到6.7。這時，該混合物在50℃減壓下濃縮至干。濃縮物在磁力攪拌下分散在10毫升甲醇中。在沉降一夜后，用WhatmanGF/B膜過濾懸浮液。過濾器上的固體用2份10毫升蒸餾水溶解。這種溶液這時在50℃減壓下濃縮至干。得到580毫克白色固體。該固體再在磁力攪拌下分散在15毫升甲醇中。在攪拌30分鐘后，用WhatmanGF/B膜過濾懸浮液。濾餅用2份10毫升蒸餾水溶解。得到的溶液在50℃減壓下濃縮至干。這樣得到250毫克式(I)所示呈非對映異構(gòu)體混合物形式的低聚糖。式中n等于0，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R6代表氫原子和M是鈉。采用I和II標(biāo)記二糖的結(jié)構(gòu)糖，I是還原殘基和II是不飽和糖醛酸殘基[(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-葡糖醇，四鈉鹽]；(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，四鈉鹽)在D2O中質(zhì)子譜，600MHz，T＝305K，δ，以ppm計3.38(1H，m，H-2(I))，3.70和3.75(每個1H，分別dd，J＝6和12Hz和dd，J＝5和12Hz，2H-1(I))，3.86(1H，t，J＝5Hz，H-3(I))，4.13(1H，dd，J＝8和11Hz，H-6(I))，4.18(1H，m，H-4(I))，4.25(2H，m，H-6(I)和H-3(II))，4.35(1H，m，H-5(I))，4.65(1H，m，H-2(II))，5.67(1H，s，H-1(II))，6.00(1H，d，J＝5Hz，H-4(II))]。
實(shí)施例2在反應(yīng)器中，加入60毫克式(II)所示低聚糖在1.2毫升水中的25℃溶液，式中n等于1，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。在攪拌下，一次添加18毫克硼氫化鈉。這時，通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到9-10。在12小時后，漸進(jìn)地添加醋酸，直到pH達(dá)到4-5為止。該混合物攪拌1小時，然后添加5毫升甲醇。用WhatmanGF/B膜過濾懸浮液。回收的固體用甲醇洗滌兩次，每次0.5毫升。干燥后得到42毫克式(I)所示呈非對映異構(gòu)體混合物形式的低聚糖，式中n等于1，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，采用I～I(xiàn)V標(biāo)記四糖的結(jié)構(gòu)糖，I是還原殘基和IV是不飽和糖醛酸殘基[(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-D-葡糖醇，八鈉鹽]；(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，八鈉鹽)在D2O中質(zhì)子譜，400MHz，T＝298K，δ，以ppm計3.25(1H，dd，J＝10和3Hz，H-2(III))，3.37(1H，m，H-2(I))，3.59(1H，m，H-3(III))，3.75(2H，m，2H-1(I))，3.79(1H，t，J＝9Hz，H-4(III))，3.86(1H，m，H-3(I))，4.05-4.40(10H，未分辨的峰，H-4(I)/H-5(I)/2H-6(I)，H-2(II)/H-3(II)/H-4(II))，2H-6(III)，H-3(IV))，4.58(1H，m，H-2(IV))，4.60(1H，m，H-5(II))，5.27(1H，d，J＝4Hz，H-1(II))，5.42(1H，d，J＝4Hz，H-1(III))，5.47(1H，d，J＝2Hz，H-1(IV))，5.95(1H，d，J＝5Hz，H-4(IV))。
實(shí)施例3在反應(yīng)器中，加入100毫克式(II)所示低聚糖在2毫升水中的25℃溶液，式中n等于2，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。在攪拌下，一次添加20毫克硼氫化鈉。這時，通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)到9-10。在12小時后，漸進(jìn)地添加醋酸，直到pH達(dá)到4-5為止。該混合物攪拌1小時，然后通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉將pH再調(diào)節(jié)到6.7。這時該混合物用蒸餾水稀釋，其量足以達(dá)到20毫升。添加2.5克醋酸鈉，倒入3個體積甲醇。然后用WhatmanGF/B膜過濾懸浮液?；厥盏墓腆w用甲醇洗滌兩次，每次2毫升。干燥后得到61毫克式(I)所示低聚糖，式中n等于2，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，呈非對映異構(gòu)體混合物形式。采用I到VI標(biāo)記六糖的結(jié)構(gòu)糖，I是還原殘基和VI是不飽和糖醛酸殘基[(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-ido吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-ido吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-D-葡糖醇，十二鈉鹽]；(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，十二鈉鹽)在D2O中質(zhì)子譜，600MHz，T＝305K，δ，以ppm計3.25(2H，m，H-2(III)和(V))，3.38(1H，m，H-2(I))，3.61(2H，t，J＝10Hz，H-3(III)和(V))，3.70-3.83(4H，未分辨的峰，2H-1(I)和H-4(III)和(V))，3.86(1H，t，J＝5Hz，H-3(I))，4.00(2H，m，H-5(III)和(V))，4.07(1H，m，H-4(IV))，4.08(1H，m，H-4(I))，4.10-4.45(13H，未分辨的峰，H-5(I)/2H-6(I)，H-2(II)/H-3(II)/H-4(II)，2H-6(III)，H-2(IV)/H-3(IV)，2H-6(V)，H-3(VI))，4.60(1H，s，H-2(VI))，4.62(1H，s，H-5(II))，4.78(1H，s，H-5(IV)，5.17(1H，s，H-1(IV))，5.28(1H，d，J＝4Hz，H-1(II))，5.38(1H，d，J＝3Hz，H-1(V))，5.44(1H，d，J＝3Hz，H-1(III))，5.47(1H，d，J＝2Hz，H-1(VI))，5.96(1H，d，J＝5Hz，H-4(VI))]。
實(shí)施例4在反應(yīng)器中，加入100毫克式(II)所示低聚糖在2毫升水中的25℃溶液，式中n等于3，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。在攪拌下，分兩次添加30毫克硼氫化鈉。這時，通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到9-10。在12小時后，漸進(jìn)地添加醋酸，直到pH達(dá)到4-5為止。該混合物攪拌1小時，然后通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉將pH再調(diào)節(jié)到6.7。這時該混合物用蒸餾水稀釋，其量足以達(dá)到20毫升。添加2克醋酸鈉，倒入3個體積甲醇。然后用WhatmanGF/B膜過濾懸浮液?；厥盏墓腆w用甲醇洗滌兩次，每次1毫升。干燥后得到68毫克白色固體。在HPLC(高壓液相色譜法)控制后，產(chǎn)物沒有完全被還原，再完全重復(fù)前面全部操作。在干燥后得到45毫克式(I)所示低聚糖，式中n等于3，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，呈非對映異構(gòu)體混合物形式。采用I到VIII標(biāo)記八糖的結(jié)構(gòu)糖，I是還原殘基和VIII是不飽和糖醛酸殘基[(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-葡糖醇，十六鈉鹽]；(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D--吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，十六鈉鹽)]在D2O中質(zhì)子譜，600MHz，T＝305K，δ，以ppm計3.25(3H，m，H-2(III)，H-2(V)，H-2(VII))，3.38(1H，m，H-2(I))，3.61(3H，m，H-3(III)，H-3(V)，H-3(VII))，3.70-3.83(5H，未分辨的峰，2H-1(I)和H-4(III)，H-4(V)，H-4(VII))，3.86(1H，t，J＝5Hz，H-3(I))，4.00(3H，m，H-5(III)，H-5(V)，H-5(VII)，4.08(3H，m，H-4(I)，H-4(IV)，H-4(VI))，4.10-4.45(17H，未分辨的峰，H-5(I)/2H-6(I)，H-2(II)/H-3(II)/H-4(II)，2H-6(III)，H-2(IV)/H-3(IV)，2H-6(V)，H-2(VI)/H-3(VI)，2H-6(VII)，H-3(VIII))，4.59(1H，s，H-2(VIII))，4.62(1H，s，H-5(II))，4.78(2H，s，H-5(IV)，H-5(VI))，5.17(2H，s，H-1(IV)，H-1(VI))，5.28(1H，d，J＝4Hz，H-1(II))，5.38(2H，m，H-1(V)，H-1(VII))，5.44(1H，d，J＝3Hz，H-1(III))，5.47(1H，s，H-1(VIII))，5.96(1H，d，J＝5Hz，H-4(VIII))]。
實(shí)施例5在反應(yīng)器中，加入65毫克式(II)所示低聚糖在1.2毫升水中的25℃溶液，式中n等于4，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。在攪拌下，一次添加18毫克硼氫化鈉。這時，通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到9-10。在12小時后，漸進(jìn)地添加醋酸，直到pH達(dá)到4-5為止。該混合物攪拌1小時，然后通過添加0.5摩爾/升氫氧化鈉將pH再調(diào)節(jié)到6.7。這時該混合物用3毫升10％醋酸鈉水溶液稀釋，倒入3個體積甲醇(12毫升)。然后過濾懸浮液?；厥盏墓腆w用3毫升甲醇洗滌。干燥后得到54毫克式(I)所示低聚糖，式中n等于4，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉，呈非對映異構(gòu)體混合物形式。采用I到X標(biāo)記十糖的結(jié)構(gòu)糖，I是還原殘基和X是不飽和糖醛酸殘基[(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-2-磺基氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-葡糖醇，二十鈉鹽]；(4-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇-4-吡喃己糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-6-O-磺基-2-磺基氨基-D-甘露醇，二十鈉鹽)]在D2O中質(zhì)子譜，600MHz，T＝303K，δ，以ppm計3.23(4H，m，H-2(III)，H-2(V)，H-2(VII)，H-2(IX))，3.35(1H，m，H2(I))，3.59(4H，m，H-3(III)，H-3(V)，H-3(VII)，H-3(IX))，3.65-3.80(6H，m)，3.85(1H，m，H-3(I))，3.90-4.40(29H，m)，4.57(1H，m，H-2(X))，4.59(1H，m，H-5(II))，4.75(3H，m，H-5(IV)，H-5(VI)，H-5(VIII))，5.15(3H，m，H-1(IV)，H-1(VI)，H-1(VIII))，5.25(1H，m，H-1(II))，5.37(3H，m，H-1(V)，H-1(VII)，H-1(IX))，5.42(1H，m，H-1(III))，5.45(1H，m，H-1(X))，5.93(1H，d，J＝5Hz，H-4(X))。
本發(fā)明的藥物含有至少一種式(I)所示低聚糖或式(I)所示低聚糖混合物作為活性組分，呈組合物形式，其中它與任何其他在藥學(xué)上可接受的惰性的或生理活性的產(chǎn)品組合。本發(fā)明的藥物可以通過靜脈內(nèi)、皮下、口服、直腸、局部或肺部(吸入)給藥。
用于靜脈或皮下給藥的無菌組合物一般是水溶液。這些組合物還可以含有添加劑，特別是潤濕劑、等滲劑、乳化劑、分散劑或穩(wěn)定劑?？梢远喾N方式，例如通過往該組合物加入滅菌劑、滅菌過濾、輻照進(jìn)行滅菌。它們還可以制備成無菌固體組合物形式，這些組合物可以在使用時溶于無菌水中或任何其他可注射無菌介質(zhì)中。
作為用于口服給藥的固體組合物，可以使用片劑、丸劑、粉劑(明膠膠囊、扁囊)或顆粒劑。在這些組合物中，在氬氣流下，活性組分與一種或多種惰性稀釋劑，例如淀粉、纖維素、糖、乳糖或二氧化硅混合。這些組合物還可以含有除稀釋劑外的其他物質(zhì)，例如一種或多種潤滑劑，像硬脂酸鎂或滑石，促進(jìn)口腔吸收的劑，著色劑、包衣(糖衣丸)或清漆。
作為用于口服給藥的液體組合物，可以使用藥學(xué)上可接受的溶液、懸液、乳液、糖漿和酏劑，它們含有惰性稀釋劑，例如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油。這些組合物可以含有除稀釋劑外的其他物質(zhì)，例如潤濕產(chǎn)品、甜味劑、增稠劑、芳香劑或穩(wěn)定劑。
用于直腸給藥的組合物是栓劑或直腸用膠囊，除活性產(chǎn)品外，它們含有賦形劑，例如可可油、半合成甘油酯或聚乙二醇。
用于局部給藥的組合物例如可以是膏、洗劑、洗眼劑、漱口劑、滴鼻劑或氣霧劑。
這些劑量取決于所要達(dá)到的效果、治療時間和所采用的給藥方式；這些劑量一般是皮下用藥每天每千克0.5-10毫克，即體重60千克的成人每天3-60毫克。
一般地，醫(yī)生將根據(jù)待治療者的年齡、體重和所有其他固有因素決定適當(dāng)劑量。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明低聚糖在制備用于預(yù)防或治療與牽涉產(chǎn)生亞硝酸鹽氧化物(NO)的炎癥過程相關(guān)疾病或用于運(yùn)動神經(jīng)元存活和生長的藥物方面的應(yīng)用。
式(I)所示低聚糖在制備用于預(yù)防和治療腦、心肌或周圍血管局部缺血、骨關(guān)節(jié)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、頭蓋骨、脊柱和顱-脊創(chuàng)傷，多發(fā)性硬化、神經(jīng)病疼痛和周圍神經(jīng)精神病，運(yùn)動神經(jīng)元疾病，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、神經(jīng)愛滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈癥的藥物時，本發(fā)明是特別有利的。
本發(fā)明還涉及預(yù)防或/或治療與牽涉產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)，例如亞硝酸鹽氧化物(NO)的炎癥過程相關(guān)疾病和與運(yùn)動神經(jīng)元存活和生長相關(guān)疾病的方法。式(I)所示低聚糖因此可以用于預(yù)防和/或治療其中腦的炎癥起著可能導(dǎo)致死亡的有害作用的神經(jīng)變性疾病，其中可以列舉腦局部缺血、心肌局部缺血(心肌梗塞)、周圍局部缺血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，特別是頭蓋骨、脊柱和顱-脊創(chuàng)傷，多發(fā)性硬化、神經(jīng)病疼痛和周圍神經(jīng)病，運(yùn)動神經(jīng)元疾病，如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、漸進(jìn)式脊柱萎縮、嬰兒肌肉萎縮和主側(cè)索硬化、神經(jīng)愛滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈癥和特別在關(guān)節(jié)部位的某些骨關(guān)節(jié)炎形式。
本發(fā)明還涉及運(yùn)動神經(jīng)元疾病的預(yù)防和/或治療方法，例如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、漸進(jìn)式脊柱萎縮、嬰兒肌肉萎縮和主側(cè)索硬化。
權(quán)利要求
1.含有下式所示低聚糖或這些低聚糖混合物作為活性組分的藥物組合物 式中n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4、R5、R6和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基，R2和R7相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)或COCH3基團(tuán)，而M是鈉、鈣、鎂或鉀。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中含有其中R4和R6代表氫原子的式(I)所示低聚糖或這些低聚糖混合物。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中含有式中n是0-10的整數(shù)的式(I)所示低聚糖或這些低聚糖混合物。
4.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中含有式中n是0-6的整數(shù)的式(I)所示低聚糖或這些低聚糖混合物。
5.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中含有式中n是1-6的整數(shù)的式(I)所示低聚糖或這些低聚糖混合物。
6.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于0，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R6是氫原子，M是鈉。
7.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于1，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
8.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于2，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
9.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于3，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
10.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中含有式(I)所示低聚糖，其中n等于4，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
11.下式所示低聚糖 式中n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4、R5、R6和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，R2和R7相同或不同，它們代表氫原子或SO3M或COCH3基團(tuán)，而M是鈉、鈣、鎂或鉀，但不包括其中n等于0，或者R1、R6和R8代表氫原子，R7代表SO3M或COCH3基團(tuán)，M是鈉，或者R1和R6代表氫原子，R7代表COCH3基團(tuán)，R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R6代表氫原子，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R6和R7代表氫原子，R1和R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉，或者R1、R6和R7代表氫原子，R8代表SO3M基團(tuán)，M是鈉的式(I)所示低聚糖。
12.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖，其中R4和R6代表氫原子。
13.權(quán)利要求11或12的式(I)所示低聚糖，其中n是0-10的整數(shù)。
14.權(quán)利要求11或12的式(I)所示低聚糖，其中n是0-6的整數(shù)。
15.權(quán)利要求11或12的式(I)所示低聚糖，其中n是1-6的整數(shù)。
16.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于0，R1、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R6代表氫原子，M是鈉。
17.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于1，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
18.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于2，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
19.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于3，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
20.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖，其中n等于4，R1、R2、R3、R5、R7和R8代表SO3M基團(tuán)，R4和R6代表氫原子，M是鈉。
21.權(quán)利要求11的式(I)所示低聚糖的制備方法，其特征在于堿金屬硼氫化物或季銨硼氫化物與下式所示低聚糖進(jìn)行反應(yīng) 式中n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4和R5相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，R2和R6相同或不同，它們代表氫原子或SO3M或COCH3基團(tuán)，M是鈉、鈣、鎂或鉀，分離這些低聚糖。
22.權(quán)利要求21的方法，其特征在于在含水介質(zhì)中，在溫度約25℃與pH7-10的條件下進(jìn)行該反應(yīng)。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于反應(yīng)介質(zhì)的pH是9-10。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的方法，其特征在于堿金屬硼氫化物或季銨硼氫化物是硼氫化鋰、硼氫化鈉、硼氫化鉀或四丁基硼氫化銨。
25.下式所示低聚糖或這些低聚糖混合物在制備用于預(yù)防或/或治療與牽涉產(chǎn)生亞硝酸鹽氧化物(NO)的炎癥過程相關(guān)的疾病的藥物方面的用途 式中n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4、R5、R6和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，R2和R7相同或不同，它們代表氫原子或SO3M或COCH3基團(tuán)，M是鈉、鈣、鎂或鉀。
26.權(quán)利要求25的式(I)所示低聚糖在制備用于預(yù)防和治療腦局部缺血、心肌局部缺血、周圍血管局部缺血、骨關(guān)節(jié)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，頭蓋骨、脊柱和顱-脊創(chuàng)傷，多發(fā)性硬化、神經(jīng)病疼痛和周圍神經(jīng)病，運(yùn)動神經(jīng)元疾病，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、神經(jīng)愛滋病、Alzheimer病、帕金森病和Huntington舞蹈癥的藥物方面的用途。
27.式(I)所示低聚糖或這些低聚糖混合物在制備用于預(yù)防或/或治療與運(yùn)動神經(jīng)元存活和生長相關(guān)的疾病的藥物方面的用途 式中n是0-25的整數(shù)，R1、R3、R4、R5、R6和R8相同或不同，它們代表氫原子或SO3M基團(tuán)，R2和R7相同或不同，它們代表氫原子或SO3M或COCH3基團(tuán)，M是鈉、鈣、鎂或鉀。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有右式所示低聚糖或這些低聚糖混合物作為活性組分的藥物組合物，新的式(I)所示低聚糖，它們的混合物以及它們的制備方法。
文檔編號A61P25/28GK1426419SQ01808408
公開日2003年6月25日 申請日期2001年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月28日
發(fā)明者P·默里爾, E·佩林, C·威斯科夫 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司