專利名稱：削弱hiv－1增殖的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的涉及用于抑制有癥狀或無癥狀的感染患者中的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)增殖的組合物和方法，以及削弱之前未被感染的受試者中初次感染后HIV-1的增殖，從而盡可能減少發(fā)展成AIDS的組合物和方法。
正在積極地研究用HIV-1 Tat蛋白作為潛在的AIDS疫苗用于免疫接種。在已報道的研究中，已使用HXB/LAV HIV-1 Tat序列作為免疫原，該序列要么以重組蛋白質(zhì)〔A.Cadaro等人，Nat.Med.，5643-650(1999)〕、要么以DNA疫苗〔S.Calarota等，Lancet，3511320-5(1998)〕、要么以未激活的蛋白質(zhì)(Tat類毒素)〔S.S.Cohen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(19)10842-10847(1999)；A.Gringeri等人，J.Hum.Virol.，1293-8(1998)〕，要么以DNA疫苗表達(dá)滅活Tat〔E.Caselli等人，J.Immunol.，1625631-5638(1999)〕用作免疫原。用完整的Tat序列進(jìn)行免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫。也可參見M.C.Rhe等人，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Virol.，10408-416(1995)；C.J.Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，948116-8120(1997)；以及其它文獻(xiàn)。
1992年9月3日出版的國際專利申請WO92/14755涉及Tat蛋白，以及能結(jié)合該Tat蛋白的整聯(lián)蛋白細(xì)胞表面受體。與整聯(lián)蛋白結(jié)合的兩條Tat序列為-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-[SEQ ID NO1]和-GLY-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-[SEQ ID NO2]。這些序列是堿性區(qū)域或結(jié)構(gòu)域，是整聯(lián)蛋白的優(yōu)先結(jié)合位點。本說明書證明，許多對應(yīng)于這些Tat序列的肽和相應(yīng)的整聯(lián)蛋白在體外阻斷了細(xì)胞與Tat包被的平板的結(jié)合，抗體對適當(dāng)?shù)恼?lián)蛋白也一樣。但是，本說明書還顯示，這些試劑并沒有阻斷細(xì)胞對功能性Tat的攝取(參見WO92/14755中的實施例9)，從而使所提出的有利于HIV感染治療的作用機(jī)制無效。在此國際申請中描述的Tat序列與本發(fā)明的肽免疫原不同。
已容易地在動物中產(chǎn)生Tat蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，這些抗體顯示能阻斷Tat蛋白質(zhì)的體外攝取(如參見D.Brake等人，J.Virol.，64962(1990)；D.Mann等人，EMBO J.，101733)1991)；J.Abraham等人，同上；P.Auron等人，同上；M.Haye等人，同上；G.Zauli等人，同上〕。最近的報道表明，加到組織培養(yǎng)基中的Tat蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體削弱了HIV-1的體外感染〔L.Steinaa等人，Arch.Virol.，139263(1994)；M.Re等人，同上；G.Zauli等人，J.Acq.Imm.Def.Syndr.Hum.Retrovirol.，10306(1995)〕。
本發(fā)明者自己的出版物〔G.Goldstein，Nature Med.，2960(1996)；和1995年11月30日出版的國際專利申請WO95/31999.)綜述了表明HIV-1 Tat蛋白從感染細(xì)胞中分泌以及被感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞攝取對于HIV-1的感染性具有重要性的證據(jù)。先前的研究還表明，Tat蛋白的抗體在體外阻斷了Tat的攝取，并抑制了體外感染性。哺乳動物的主動免疫被認(rèn)為誘導(dǎo)了針對HIV01 Tat蛋白的抗體，此抗體可作為潛在的AIDS疫苗。還可參見Goldstein等人，《免疫了合成的HIV-1 Tat肽并感染了嵌合的猿/人免疫缺陷病毒(SHIV33)的獼猴中慢性血漿病毒血的最小化》(Minimization of chronic plasma viremia in rhesus macaques immunized withsynthetic HIV-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/humanimmunodeficiency virus(SHIV33))，Vaccine，182789(2000)。
發(fā)明者的其它出版物，1999年1月21日出版的國際專利申請WO99/02185和1999年4月6日出版的美國專利第5,891,994號(本文將這兩篇文獻(xiàn)納入作為參考)，揭示了用被兔免疫系統(tǒng)識別為表位的Tat序列治療和預(yù)防HIV-1感染的新概念。與上述在先公開內(nèi)容不同，這些出版物涉及治療性的和免疫原性的組合，需要至少兩條包含“表位I”序列的Tat肽或多肽，較佳是所有4條，該“表位I”序列跨越第4(或5)到第10位Tat氨基酸殘基，其序列如下-Asp-Pro-X7-Leu-Glu-Pro-[SEQ ID NO3]或R1-Val-Asp Pro-X7-Leu-Glu-Pro-R2[SEQ ID NO4]，其中X7是Arg、Lys、Ser或Asn。這些組合物誘導(dǎo)與大多數(shù)HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體，并削弱HIV-1的增殖。根據(jù)此出版物，可將其它某些包含“表位II”肽或多肽的Tat序列加到此組合物中，該“表位II”肽或多肽跨越Tat的第41-50位氨基酸殘基，為R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4[SEQ ID NO5]，其中，X42選自Gly或Ala?；蛘?，也可將跨越Tat第56-62位氨基酸殘基的“表位III”肽或多肽加到此組合物中，該肽或多肽為R5-Arg-Arg-X58-Z59-A60-Y61-Ser-R6[SEQID NO6]，其中X58選自Ala、Pro、Ser和Gln；Y61選自Asp、Gly和Ser；Z59選自Pro和His；A60選自Gln和Pro?；蛘撸€可將跨越Tat第62-73位氨基酸殘基的“表位IV“肽或多肽加到此組合物中，該肽或多肽為R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8[SEQ ID NO7]，其中，X64選自Asn和Thr，Y67選自Ala和Val。該組合物自身也可用于誘導(dǎo)針對HIV-1多種變體的大量Tat序列特征的抗體。所產(chǎn)生的這些組合物或抗體可用作針對這些多種變體的疫苗或預(yù)防性處理。
盡管關(guān)于HIV-1疾病發(fā)展的知識不斷積累，但本領(lǐng)域仍需要在預(yù)防性和治療性方面開發(fā)治療HIV-1的組合物和方法，這些組合物和方法能用于減少HIV-1的病毒水平，以治療和可能預(yù)防隨后的、通常致命的AIDS疾病。
另一方面，上述組合物還含有一種或多種額外的肽或多肽，這些肽或多肽代表對應(yīng)于HIV-1 Tat第5到第12位氨基酸殘基的其它氨基酸序列。這些任選的氨基酸序列將在下文詳細(xì)描述。這些序列較佳是從具有Tat蛋白變體的HIV-1株中的該位置上獲得。
另一方面，本發(fā)明提供一種上述組合物，該組合物含有含至少兩種必需的表位I的肽或多肽(較佳含有額外的表位I肽)，被靈長類動物識別，該組合物還含有一種或多種HIV-1 Tat表位II、III和/或IV。表位II、III和IV是國際專利出版物WO99/02185中描述的HIV-1 Tat肽的式子，本文將該出版物的內(nèi)容納入作為參考。這類組合物可與適當(dāng)?shù)腍IV-1 Tat肽組合，以便提供一種誘導(dǎo)與約95％以上的所有已知的HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體。
又一方面，本發(fā)明提供一種抗體組合物，該組合物含有至少一種抗體，該抗體較佳是產(chǎn)生于靈長類動物，特異性地與式R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]的肽或多肽結(jié)合，其中，Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn；X9選自Glu和Asp；Z12選自Lys和Asn；R1選自氫、低級烷基、低級烷酰基，和任選地被低級烷基或低級烷?；〈拈L1個到約5個氨基酸的序列；R2是游離羥基、酰胺，和任選地被酰胺取代的1個或長約5個以內(nèi)的額外的氨基酸的序列。這種抗體組合物較佳含有至少兩種抗體，即一種與Y7是Arg、Z12是Lys的表位I變體結(jié)合的抗體，和至少另一與Y7是Asn、Z12是Asn的第二種表位I變體結(jié)合的第二種抗體。針對除了這兩種列舉的變體外的其它變體的其它抗體也可包含在此組合物中。組合物中的這些抗體與靈長類動物的免疫系統(tǒng)識別的表位I序列結(jié)合，該表位出現(xiàn)在HIV-1 Tat蛋白的多種變體上。這些抗體包括各種抗體構(gòu)建物，如單克隆抗體，見下文詳述。
又一方面，本發(fā)明提供一種抗體，具體是單克隆抗體，該抗體特異性地與靈長類動物識別的HIV Tat蛋白的表位結(jié)合，該表位含有-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-[SEQ ID NO9]的氨基酸序列，其中Y7、X9和Z12的定義同上。
另一方面，本發(fā)明提供一種抗體組合物，該組合物含有至少一種識別表位II肽的抗體，該表位的序列為-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ IDNO10]，其中X42是Gly或Ala，該表位與先前所述的抗體識別的-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ ID NO11]的表位不同。較佳的是，該組合物含有一種都能識別X42是Gly和X42是Ala的兩種肽。這些抗體較佳是在靈長類動物中產(chǎn)生。組合物中的這些抗體與靈長類動物免疫系統(tǒng)識別的表位II序列結(jié)合，該表位出現(xiàn)在HIV-1 Tat蛋白的多種變體上。這些抗體包括各種抗體構(gòu)建物，詳見下文。
又一方面，本發(fā)明提供一種抗體，較佳是單克隆抗體，該抗體識別表位II肽序列-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ ID NO10]，其中X42是Gly或Ala，該表位與先前所述的抗體識別的-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ IDNO11]的表位不同。
另一方面，本發(fā)明提供一種重組的或合成的基因，該基因順序地編碼含有上述R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]表位I的肽或多肽的至少兩種變體的肽或多肽。在這種合成基因中，兩種變體中至少一種其Y7必須為Arg，Z12必須為Lys，并且這兩種變體中至少有另一種其Y7和Z12都必須是Asn。任選地，這種合成基因含有被靈長類動物免疫系統(tǒng)識別的羧基末端表位II肽?；蛘撸撝亟M的或合成的基因含有7條或8條優(yōu)選的靈長類動物識別的表位I氨基酸序列，這些序列將在下文鑒別。該合成基因可含有被間隔序列分開的各氨基酸序列，或者可在開放讀框中與載體蛋白質(zhì)表達(dá)各條肽/多肽。如果間隔區(qū)被融合到靈長類動物識別的表位I序列中，那么該合成基因可被該間隔區(qū)而從載體蛋白質(zhì)中分開，在重組蛋白質(zhì)的羧基末端留下表位II序列。另外的實施例包括上述式子一起融合并與載體蛋白質(zhì)融合的多種表位I肽。
又一方面，本發(fā)明提供一種合成分子，如載體，該分子含有上述合成基因，該基因可操作性地連接于調(diào)控核酸序列，此調(diào)控核酸序列指導(dǎo)并控制該合成基因的產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明提供一種重組微生物，如病毒或共生菌，該微生物包含上述合成基因或合成分子。這種微生物能在宿主中表達(dá)該基因或分子的產(chǎn)物的多份拷貝。
本發(fā)明的又一方面是用于誘導(dǎo)與大量的已知HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體的藥物組合物，如大于95％、較佳是大于99％的已知Tat蛋白。誘導(dǎo)產(chǎn)生的這些抗體可削弱HIV-1的增殖。該藥物組合物在藥學(xué)上可接受的載體中含有至少一種上述重組的或合成的肽/多肽組合物；或者上述合成的基因/分子；或者上述重組的微生物。
本發(fā)明的又一方面是用于削弱HIV-1增殖的藥物組合物，該組合物含有上述抗體組合物或單克隆抗體組合物。
在本發(fā)明的又一方面，減少HIV-1病毒水平的方法涉及使人或其它靈長類動物暴露于上述誘導(dǎo)抗體的藥物組合物中，主動誘導(dǎo)與大多數(shù)HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體，削弱該病毒在體內(nèi)的增殖。此方法適用于具有感受態(tài)免疫系統(tǒng)的HIV-1感染者，或者未受感染的或長期感染當(dāng)無癥狀的受試者。該方法誘導(dǎo)與HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體，該抗體減少HIV-1的任何初始急性感染期間病毒的增殖，并進(jìn)一步將導(dǎo)致AIDS的慢性病毒血癥減少到最低程度。
另一方面，本發(fā)明提供一種減少HIV-1病毒水平的方法，該方法能對HIV-1感染激發(fā)有效或快速的免疫應(yīng)答的人給予含有上述抗體組合物的藥物組合物。該方法可涉及長期給予該組合物。
本發(fā)明的又一方面包括生產(chǎn)上述組合物的方法，以及用這些組合物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的又一方面是用于測量和檢測用上述組合物免疫產(chǎn)生的抗體的滴度和特異性的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒較佳包括上述兩種所需的表位I肽，以及被靈長類動物識別的表位I的額外肽、可能的額外的表位II到IV的肽，以及包被的固相載體、用于檢測抗體與這些肽結(jié)合的標(biāo)記試劑，和用于引起或檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的信號的各種各樣的底物和裝置，以及用于獲取血樣的常規(guī)裝置、適當(dāng)?shù)牟《竞推渌\斷性檢測成分。
又一方面，本發(fā)明提供一種檢測免疫了本發(fā)明組合物的受檢者中抗體的滴度和反應(yīng)模式的方法。該方法包括使受檢者的生物體液的稀釋度(如血清)與結(jié)合了本發(fā)明表位I序列的一種或多種肽的平板或珠培育，該平板或珠還可任選地結(jié)合表位II到IV；洗去未結(jié)合的生物材料；測量與具有標(biāo)記的試劑的肽結(jié)合的任何抗體，如與酶結(jié)合的抗人免疫球蛋白。根據(jù)使用的標(biāo)記物的類型，通過加入與酶反應(yīng)的底物，可進(jìn)一步激發(fā)由該標(biāo)記物產(chǎn)生的信號，如產(chǎn)生顏色變化。在此試驗設(shè)計中也可使用其它常規(guī)的標(biāo)記物。
在以下對本發(fā)明優(yōu)選的實施例進(jìn)行的詳細(xì)描述中，將對本發(fā)明其它的方面和優(yōu)點進(jìn)行進(jìn)一步的描述。


圖1B是靈長類動物抗血清針對截短的檢測肽上較大的線性表位I肽的ELISA滴度圖，以與較大肽結(jié)合的最高百分比表示。相應(yīng)的檢測肽的N末端或C末端氨基酸以單個字母編碼顯示在各個柱下面。
圖2A是是兔抗血清針對截短的檢測肽上的線性表位II肽的ELISA滴度圖，以與較大肽結(jié)合的最高百分比表示。相應(yīng)的檢測肽的N末端或C末端氨基酸以單個字母編碼顯示在各個柱下面。
圖2B是靈長類動物抗血清針對截短的檢測肽上較大的線性表位II肽的ELISA滴度圖，以與較大肽結(jié)合的最高百分比表示。相應(yīng)的檢測肽的N末端或C末端氨基酸以單個字母編碼顯示在各個柱下面。
圖3A闡述五價表位I/表位II HIV-1 Tat免疫源性構(gòu)建物的設(shè)計，以三個字母的氨基酸編碼表示[SEQ ID NO12]。
圖3B八價的一般表位I的設(shè)計，以三個字母的氨基酸編碼表示[SEQ IDNO13]。
圖3C闡述單價的一般表位II免疫源性構(gòu)建物的設(shè)計，以三個字母的氨基酸編碼表示[SEQ ID NO14]。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明通過提供誘導(dǎo)未感染受檢者或者早期感染HIV-1、仍能激發(fā)對免疫原的免疫應(yīng)答的受檢者產(chǎn)生抗體，從而提供一種解決上述問題的方法，所述抗體與大量(即，大于95％，較佳大于99％)的已知HIV-1 Tat蛋白變體反應(yīng)。術(shù)語“Tat序列(或蛋白)變體”指含有Tat蛋白氨基酸殘基的多肽或肽，或者從另一HIV-1株Tat蛋白得到的基本上類似于表I的[SEQ ID NO15]的共有序列的序列。各變體可與該共有序列不同，和/或與其它變體不同，不同之處在于對表位I到IV感興趣的殘基中至少有一個氨基酸改變。當(dāng)將具有這種改變的變體加到本發(fā)明的組合物中時，這種變化可提供對具體的Tat表位相同或不同的抗原特異性。
由本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可抑制HIV-1的增殖，這防止了疾病進(jìn)一步發(fā)展成艾滋病(AIDS)。抗體組合物也可用于未能激發(fā)針對HIV-1感染的有效或快速的免疫應(yīng)答的感染的或未感染的人中。這些組合物能與大量的Tat蛋白反應(yīng)，從而減少HIV-1的病毒水平。這些抗體用于治療性或預(yù)防性范圍，以控制暴露于在感染后產(chǎn)生免疫學(xué)上不同的Tat蛋白的HIV-1株中，或者受其感染的大人群中AIDS的發(fā)展。
本發(fā)明的組合物包含肽和蛋白質(zhì)，或者編碼誘導(dǎo)針對靈長類動物中的Tat的抗體的肽和多肽的核酸序列，所述“肽和蛋白質(zhì)”以靈長類動物針對其而發(fā)展抗體的HIV-1 Tat蛋白的表位提供的肽為基礎(chǔ)。這些誘導(dǎo)的抗體反過來削弱HIV-1的增殖。
HIV-1 Tat蛋白由兩個外顯子產(chǎn)生外顯子1編碼72個氨基酸(AA)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可在沒有剪接的情況下表達(dá)，或者它可已由外顯子2編碼的大約15-32個氨基酸剪接。HIV-1 Tat外顯子1序列出現(xiàn)在表I中，該序列是以在普通B亞型中發(fā)現(xiàn)的31種已知的HIV-1株〔NIH Los Alamos數(shù)據(jù)庫〕的Tat蛋白序列為基礎(chǔ)的共有序列。這些出現(xiàn)變化的氨基酸位置以小寫字母表示。在表I的[SEQ IDNO15]中，位置73上的氨基酸殘基是HIV-1 Tat的外顯子2的第一個Pro。由于外顯子1的72個氨基酸產(chǎn)物能單獨(dú)在細(xì)胞中被攝取并被激活，所以需要使抗體與該72個氨基酸的肽反應(yīng)，并阻斷其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。HIV-1 Tat在外顯子1[SEQ IDNO15]的第22位和第37位之間含有富含半胱氨酸的區(qū)域，并在Cys21和Cys37之間有一個共價鍵，產(chǎn)生了復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)?？茖W(xué)文獻(xiàn)指出，這個區(qū)域并沒有顯示出免疫源性。針對Tat的顯性抗體是該線性的N末端富含Pro的區(qū)域(第1-21個氨基酸)和線性的堿性區(qū)域(第44-65個氨基酸)，以及報道為第62-73個氨基酸的額外抗體。
本發(fā)明者先前已鑒別了Tat變體的外顯子1[SEQ ID NO15]的N末端線性序列1-21(22個氨基酸)中兔抗體(抗原序列)識別的表位，即結(jié)合區(qū)域，并已定義了HIV-1 Tat中的4種B細(xì)胞表位。如先前在國際專利出版物WO99/02185中所述，此較大序列的免疫源性區(qū)域被兔免疫系統(tǒng)識別。這些區(qū)域在下面表I中的外顯子1的共有序列中被鑒別表位I由兔抗體鑒別為外顯子1的第2到10位上的9個氨基酸序列。表位II鑒別為外顯子1第43到50位上的8個氨基酸序列。表位III鑒別為外顯子1第56-62位上的7個氨基酸序列。表位IV鑒別為Tat第62-43位上的12個氨基酸序列，包括外顯子2的第一個Pro(第73個氨基酸)以及與表位III重疊的第62位上的Ser。
表1——共有Tat序列Met Glu ProVal asp pro arg Leu Glu Pro Trp lysHis Pro Gly Ser1 10Gln Pro lys thr ala cys thr asn Cys Tyr Cys Lys lys Cys Cys phe20 30his Cys gln val Cys Phe ile thrLys gly Leu gly Ile Ser Tyr Gly40Arg LysLys Arg Arg Gln Arg arg arg ala pro gln asp Ser gln thr50 60his Gln val ser Leu ser Lys gln[SEQ ID NO15]70但是，在本發(fā)明中，發(fā)明者已檢測了尤其是靈長類動物的B細(xì)胞識別的表位I的氨基酸序列中令人驚訝的轉(zhuǎn)移。在表I中，被靈長類動物識別的表位I和II序列是劃有下劃線的。靈長類動物識別的表位I跨越了Tat的第5到第12個氨基酸。被靈長類動物B細(xì)胞識別的表位II的序列跨越第41到第50個氨基酸。如WO99/02185中所報道，表位III和IV是在兔子中識別相同的表位，本文將其納入作為參考。
A.靈長類動物識別的表位I免疫源性組合物在一個實施例中，本發(fā)明提供含有靈長類動物免疫系統(tǒng)識別的肽或多肽的至少兩種變體的組合物，(為本發(fā)明的目的)該組合物在暴露于這些序列的靈長類動物體內(nèi)引起特殊的體液免疫應(yīng)答。這些靈長類動物識別的表位I氨基酸序列對應(yīng)于表1的Tat共有序列[SEQ ID NO15]的第5到12個氨基酸殘基，衍生自許多“Tat序列變體”。靈長類動物識別的表位I定義了下述通式的肽R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]，其中，Y7是Arg、Lys、Ser或Asn；X9是Glu或Asp；Z12是Lys或Asn。這個式子允許有各種各樣的哺乳動物表位I肽變體。本發(fā)明的組合物必須含有至少一種其Y7是Arg、Z12是Lys的肽變體，以及至少另一種其Y7和Z12都是Asn的第二肽變體。
出現(xiàn)在上述靈長類動物識別的表位I的式子中的指定氨基酸是最小的反應(yīng)性靈長類動物表位I序列。由該式子定義的用于本發(fā)明的方法中以產(chǎn)生針對該最小表位I序列的抗體的每種免疫原，可以是較大的氨基酸序列。例如，這些最小表位I氨基酸可側(cè)接其它氨基酸，這樣整個表位I免疫源性序列的長度為8到約25個氨基酸。側(cè)接氨基酸的同一性對于該表位I免疫原的生物學(xué)功能并不是必需的。具體而言，靈長類動物識別的表位I序列的N末端上的額外氨基酸不影響免疫源性。因此，對于每種靈長類動物識別的表位I肽，N末端R1可以是未修飾的N末端氨基酸上的游離氫，或者是低級烷基(即，C1-C10烷基)，或者是低級C1-C10烷?；?，如乙?；?。R1也可包括長1到約5個氨基酸的序列，該序列任選地被低級烷基或低級烷?；〈?。較佳的是，R1代表2個氨基酸。在一個實施例中，R1是Val，這樣得到Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ ID NO37]的序列，其中Y7、X9和Z12的定義同上。在另一實施例中，R1是-X2-Pro-Val-，這樣得到X2-Pro-Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ ID NO38]的序列，其中，X2是Glu或Asp，Y7、X9和Z12的定義同上。較佳的是，R1代表3個氨基酸。
靈長類動物識別的表位I最小序列的C末端上的額外氨基酸可增強(qiáng)抗體滴度。雖然C末端R2可以是該C末端氨基酸上的簡單的游離羥基，但是它也可以是C末端酰胺。但是，為了增強(qiáng)滴度，R2較佳是長1到約14個，較佳約4個額外氨基酸，并在羧基末端酰胺化的序列。在一個優(yōu)選的實施例中，R2是-His-Pro-Gly-Ser-酰胺，這樣得到Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-His-Pro-Gly-Ser[SEQ IDNO16]的序列，其中，Y7、X9和Z12的定義同上。
較佳的是，本發(fā)明的組合物除了上述鑒別的兩種必需的肽外，還包含靈長類動物識別的表位I式的至少5種或6種不同的氨基酸序列。最佳的是，該組合物含有7種或8種變體氨基酸序列，詳見下文。該組合物還可含有其它肽或多肽序列，各條序列含有不同的X9、Y7和Z12組合。如下面的實施例所證明，由于在靈長類動物識別的表位I中具有3個抗原變異性的位點，本發(fā)明的優(yōu)選組合物可含有足量的靈長類動物識別的表位I的肽，從而通過包括下述兩種“必需”的肽而包含了95％的所有已知B分化體和非B分化體HIV-1 Tat變體R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO17]；和R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO18]；以及1到5種下述額外的表位I肽Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO19]；R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO20]；R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO21]；R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO22]；和R1-Asp＝Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO23]；以及視需要，稀罕的變體R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO24]。
本發(fā)明靈長類動物識別的表位I組合物可含有許多額外肽或多肽，該肽或多肽含有對應(yīng)于SEQ ID NO15的第5到第12個氨基酸殘基的序列，但它們從沒有與針對該靈長類動物識別的表位I組合物的抗體交叉反應(yīng)的其它Tat變體衍生得到。本發(fā)明的表位I組合物可含有以任何順序排列的5種或5種以上不同表位I肽的多份拷貝。在一個實施例中，上述7種或所有8種氨基酸序列[SEQ ID NO17-24]至少有一份拷貝存在。
本發(fā)明這些肽或多肽由合成或重組產(chǎn)生。任選的氨基酸(如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化合物間隔區(qū)可包含在這些肽的末端中，以用于將這些肽連接于載體。這種組合物可以取一種或多種上述表達(dá)為與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的合成肽的肽的形式。或者，組合物可含有多個表位I肽，每條肽表達(dá)為多抗原肽，并任選地與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)。或者，選擇的肽可順次連接，并在重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中表達(dá)。例如，上述8個明確鑒別的序列順次連接，它們之間可以有或沒有間隔區(qū)氨基酸，以形成較大的重組蛋白質(zhì)?；蛘?，該重組蛋白質(zhì)可與載體蛋白質(zhì)按讀框融合?？蓪⑦@些靈長類表位I組合物設(shè)計成誘導(dǎo)與95％以上的HIV-1 Tat蛋白的已知變體反應(yīng)的抗體，該Tat蛋白包括HIV-1 B進(jìn)化枝和非B進(jìn)化枝的Tat蛋白。
靈長類動物識別的表位I組合物證明具有在經(jīng)免疫的免疫感受態(tài)靈長類動物(即，未感染的人，或者無癥狀的被感染的人)中誘導(dǎo)針對95％以上、較佳99％以上的HIV-1 Tat蛋白的已知變體的主動體液免疫應(yīng)答(即抗體)的生物學(xué)活性。這種治療的最終結(jié)果是HIV-1急性感染后其增殖的削弱。這種削弱阻止了與發(fā)展成AIDS相關(guān)的HIV-1的高血清轉(zhuǎn)化后血漿水平。HIV感染的無癥狀期中抗體的主動誘導(dǎo)可減少病毒的增殖，降低血清的病毒負(fù)荷，并減少發(fā)展成AIDS的可能性。含有至少兩種必需的靈長類動物識別的表位I免疫原，較佳含有那些表位I序列[如SEQ ID NO17-24]的7種或8種序列的組合物，可引起HIV-1的普通B亞型的294種已知Tat序列中的約95％，以及所有56種已測序的非B HIV-1亞型的Tat蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答〔Esther Guzman博士惠贈，Los Alamos NIAID HIV數(shù)據(jù)庫；Genbank數(shù)據(jù)庫〕。
B.含有額外表位的免疫源性組合物在另一實施例中，本發(fā)明提供其它的組合物，這些組合物使用兩種或兩種以上靈長類動物識別的表位I序列與至少一種表位II序列組合，并任選地使用一種或多種表位III或IV肽。這些被兔免疫系統(tǒng)識別的HIV-1 Tat表位II、III和IV在國際專利申請WO99/02185中有詳細(xì)描述，本文將該申請的內(nèi)容納入作為參考。
簡言之，表位II序列在暴露于表位II序列的靈長類動物體內(nèi)引起特異性的體液免疫應(yīng)答。靈長類動物識別的表位II定義為式R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4[SEQ ID NO5]的肽，其中X42是Gly或Ala。被靈長類動物免疫系統(tǒng)識別的最小表位是該式子的明確鑒別的氨基酸的表位，即-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-(SEQ ID NO15的第41到第50個氨基酸)。這也是目前表位II的優(yōu)選免疫原的序列。X42是Gly的這種免疫原誘導(dǎo)產(chǎn)生與X42是Ala的序列交叉反應(yīng)的抗體。這種抗體可與95％以上的已知HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)/交叉反應(yīng)。這種表位II序列在大量已知的HIV-1 Tat變體中沒有抗原變異性。N末端R3可表示未修飾N末端氨基酸Lys上的氫，或者R3可以是低級烷基，或者是低級烷?；?，如Lys上的取代基乙?；?。R3也可包括長1到約5個氨基酸的序列，該序列任選地被低級烷基或低級烷酰基取代。C末端R4可表示為該C末端氨基酸的游離羥基，或者R4可以是該C末端氨基酸上的酰胺。R4可包括額外的非極性氨基酸，如間隔區(qū)?？梢允褂眠@樣的間隔區(qū)例子gly-ser-gly-ser，結(jié)果得到Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser[SEQ ID NO25]的序列，其中X42是Gly或Ala。但是，R4不可以是堿性氨基酸-Lys-Arg-Arg-，這個序列天然存在于Tat序列中，出現(xiàn)在表位II式子中的最后一個氨基酸之后。在294種B進(jìn)化枝Tat變體中發(fā)現(xiàn)的這種表位II序列被靈長類動物識別(如WO99/02185中所報道，兔的免疫系統(tǒng)識別得自SEQ ID NO15的第43到第50個氨基酸的表位)。
當(dāng)在其它序列中存在時，表位II的免疫源性差。因而，為了獲得最佳的免疫源性，將這種序列制備成融合到、或偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)的合成肽；或者制備成多抗原肽，任選地偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)。或者，可使表位II表達(dá)為重組蛋白質(zhì)的C末端序列，該序列可任選地與載體蛋白質(zhì)在其氨基末端序列按讀框融合。在本發(fā)明的組合物中，表位II肽較佳單獨(dú)存在，或者與一種或多種靈長類動物識別的表位I肽組合。
簡單地描述，并如WO99/02185中所述，表位III定義為式R5-Arg-Arg-X58-Z59-A60-Y61-Ser-R6[SEQ ID NO6]的肽，其中X58可以是Ala、Pro、Ser或Gln；Y61可以是Asp、AsnGly或Ser；Z59選自Pro或His；A60可以是Gln或Pro。表位IV定義為式R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8[SEQ ID NO7]的肽，其中，X64可以是Asn或Thr，Y67可以是Ala和Val。
因此，本發(fā)明的組合物，即含有上述鑒別的氨基酸序列的肽/多肽，當(dāng)提供給人時，可用于大多數(shù)HIV-1株的細(xì)胞外Tat蛋白的免疫學(xué)阻斷。這些組合物起到?jīng)Q定性地減少病毒的長期增殖的功能，并允許對該病毒進(jìn)行有效的免疫控制。
各表位的免疫原較佳設(shè)計為誘導(dǎo)產(chǎn)生與各表位最高比例的天然變體反應(yīng)的抗體。對于諸如靈長類動物識別的表位I之類的表位，可將多份拷貝的免疫原加到合成的或重組的免疫原中，以增強(qiáng)免疫源性，并產(chǎn)生較高效價的抗體。此外，可將兩種或兩種以上表位的免疫原組合，以擴(kuò)展其覆蓋范圍，因為各表位的序列變化獨(dú)立地產(chǎn)生。因此，舉個例子，本發(fā)明的組合物含有兩種必需的靈長類動物識別的表位I肽，以及4種或5種上述明確鑒別的在末端具有Cys的其它表位I肽，該末端與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)?；蛘撸芍苽涠嗫乖?，任選地與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，并組合形成本發(fā)明的組合物?；蛘?，可使用兩種或兩種以上免疫原的混合物。
可制備本發(fā)明的靈長類動物識別的表位I免疫原，該免疫原可有或沒有任何表位II、III或IV或其它任選的免疫原，并將其以各種形式用于免疫源性組合物中，例如，化學(xué)合成的肽或重組的肽、多肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白或融合肽。
1.偶聯(lián)于載體的重組的或合成的肽/蛋白質(zhì)作為一個實施例，本發(fā)明的組合物可以是合成的或重組產(chǎn)生的肽，它含有至少兩種必需的靈長類動物識別的表位I免疫源性氨基酸序列(以及額外的其它表位I序列)，它還含有偶聯(lián)于所選擇的載體蛋白質(zhì)的一種或多種表位II/III/IV免疫源性氨基酸序列。在本發(fā)明組合物的這個實施例中，有或沒有側(cè)接序列的多種上述靈長類動物識別的表位I氨基酸序列，可順次組合在多肽中，并與相同的載體偶聯(lián)?；蛘?，表位I、II、III或IV免疫原可作為肽單獨(dú)與相同的或不同的載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，然后將所得的免疫原-載體構(gòu)建物一起混合，形成單一的組合物?？刹捎没瘜W(xué)合成的常規(guī)方法合成，或者通過在選擇的宿主細(xì)胞中表達(dá)重組，從而制得這些序列，也可采用現(xiàn)在常規(guī)的方法制備。
對于這個實施例，載體蛋白質(zhì)最好是可增強(qiáng)選擇的免疫原的免疫源性的蛋白質(zhì)或其它分子。這種載體可以是具有輔助作用的較大分子。常規(guī)的蛋白質(zhì)載體的例子包括但不限于大腸桿菌Dnak蛋白、半乳糖激酶(galK，它在細(xì)菌中催化半乳糖代謝的第一步)、遍在蛋白、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。類毒素(即，編碼天然毒素的序列，有足夠的修飾，以減少其毒性)，如白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素也可用作載體。類似地，可使用各種細(xì)菌熱激蛋白，如分枝桿菌hsp-70。谷胱甘肽還原酶(GST)是另一有用的載體。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可易于選擇適當(dāng)?shù)妮d體。
在特別合乎要求的免疫原-載體蛋白質(zhì)構(gòu)建物中，所述兩種必需的表位I免疫原和3-6種額外的靈長類動物識別的表位I免疫原和任選的免疫源性肽/多肽可共價連接于分枝桿菌大腸桿菌熱激蛋白70(hsp)(K.Suzue等人，J.Immunol.，156873(1996)〕。在另一合乎要求的實施例中，通過將含有免疫原的肽或多肽序列共價連接于白喉類毒素，可形成該組合物。
2.多抗原肽在另一實施例中，所述肽或多肽表位免疫原和任何選擇的任選免疫原可以多抗原肽(“MAP”，也指八聚體的賴氨酸核心肽)構(gòu)建物的形式?？刹捎肨am，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855409-5412(1988)中所述的MAP系統(tǒng)來設(shè)計這種構(gòu)建物。這個系統(tǒng)利用賴氨酸殘基的核心基質(zhì)，在該基質(zhì)上，如下述文獻(xiàn)中所述合成本發(fā)明相同的靈長類動物識別的表位I的多份拷貝D.Posnett等人，J.Biol.Chem.，263(4)1719-1725(1988)；J.Tam，《采用多抗原肽方法化學(xué)限定的合成免疫原和疫苗》(Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the MultipleAntigen Peptides Approach)，Vaccine Research and Developments，第1卷，W.Koff和H.Six編輯，第51-87頁(Marcel Deblau，Inc.，紐約，1992)。各MAP含有僅一種肽的多份拷貝。因此，含有MAP的組合物將含有至少兩種、較佳約7種MAP。一種MAP將具有連接于各賴氨酸核心的第一必需肽或多肽表位I免疫原；第二種MAP將具有連接于各賴氨酸核心的第二必需肽或多肽表位I免疫原。還有其它的MAP，它們具有上述不同的靈長類動物識別的表位I氨基酸序列，也可包括在組合物中?？墒褂枚喾N不同的MAP，以獲得表位I、II、III或IV序列的任何所需組合。較佳的是，這些MAP構(gòu)建物與其它的T細(xì)胞刺激性序列結(jié)合，或者作為藥物組合物，與T細(xì)胞刺激性試劑(如已知的佐劑)一同給藥。
3.間隔區(qū)在上述任一種組合物中，如肽/多肽-載體構(gòu)建物或MAP，每種肽/多肽免疫原或者免疫原中的各條氨基酸序列可任選地被稱為“間隔區(qū)”的氨基酸序列分開。間隔區(qū)是長1到約4個氨基酸的序列，它插入兩條序列之間，允許在它們之間連接而對該免疫原的三維結(jié)構(gòu)沒有不利的影響。間隔區(qū)也可含有限制性內(nèi)切酶切割位點，以在需要時分離序列。對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，合適的間隔區(qū)或連接物是已知的，并易于設(shè)計和選擇。較佳的間隔區(qū)是含有Gly和/或Ser氨基酸的序列。
F.本發(fā)明的核酸組合物，包括合成的或重組產(chǎn)生的基因本發(fā)明的其它實施例包括編碼上述靈長類動物識別的表位I肽/多肽組合物的核酸序列，包括上述組合物的肽和多肽免疫原，以及與載體蛋白融合的那些肽和多肽。這些核酸序列也可包括編碼載體蛋白的序列。
因此，本發(fā)明一個優(yōu)選的實施例是順序地編碼至少兩種必需的靈長類動物識別的表位I免疫源性的肽/多肽的“合成基因”。注意到雖然該基因是“合成的”，但它可根據(jù)需要采用化學(xué)合成或重組的方法設(shè)計。較佳的是，合成基因編碼7種或所有8種明確鑒別的靈長類動物識別的表位I氨基酸序列[SEQ ID NO17-24]。合成基因還可編碼表位II或III免疫原的任何選擇，條件是該表位II或III肽與該靈長類動物識別的表位I序列的C末端融合，并且在它自己的C末端上并沒有被進(jìn)一步修飾。合成基因可編碼所述兩種必需表位I氨基酸序列的多份拷貝，或者額外的多種不同的免疫原或氨基酸序列的拷貝，或者多種不同的免疫原或氨基酸系列的多份拷貝。合成基因可與編碼載體蛋白質(zhì)的核酸序列一起編碼開放讀框中的選擇的氨基酸序列，或者與該核酸序列融合后編碼所述氨基酸序列。合成基因的另一特征是，它可以編碼編碼免疫原的各序列之間的間隔區(qū)，和/或編碼免疫原的序列與編碼載體蛋白的序列之間的間隔區(qū)。
本發(fā)明的合成基因也可以是合成的或重組的分子的一部分。合成分子可以是核酸構(gòu)建物，如含有在編碼調(diào)節(jié)性元件如啟動子、終止信號等的核酸序列的操作性控制下，含有編碼蛋白質(zhì)、肽、多肽、融合蛋白或融合肽的合成基因的載體或質(zhì)粒。這類合成分子可以用于重組產(chǎn)生多肽/肽免疫原組合物?？刹捎没瘜W(xué)合成方法制備合成基因或合成分子，或者，較佳的是采用重組技術(shù)。例如，合成基因或分子可含有指的定宿主細(xì)胞的種類的某些優(yōu)選密碼子。
合成基因或分子較佳以DNA的形式用于各種方法中。例如，可用這些合成的核酸序列在宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中體外表達(dá)本發(fā)明的肽/多肽。表達(dá)的免疫原在適當(dāng)?shù)募兓?，可加到藥物制劑或疫苗中?；蛘撸蓪⒈景l(fā)明的合成基因或合成分子以所謂的“裸DNA”的形式直接給予哺乳動物，較佳是人，以在患者中體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)/肽免疫原。例如可參見J.Cohen，Science，2591691-1692(1993年3月19日)；E.Fynan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011478-11482(1993年12月)；和J.A.Wolff等人，Biotechniques，11474-485(1991)，本文將上述所有文獻(xiàn)的內(nèi)容都納入作為參考。合成分子如載體或質(zhì)?？捎糜谥苯幼⑷氩溉閯游锼拗髦?。這會使宿主細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，并接著將該蛋白質(zhì)引向免疫系統(tǒng)，從而體內(nèi)誘導(dǎo)抗體形成。
G.表達(dá)合成基因的微生物在本發(fā)明的又一方面，可將本發(fā)明所述合成基因或分子加到非致病性微生物中。所得的微生物，在給予哺乳動物宿主時，在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的組合物，并使其增殖，從而誘導(dǎo)特異性抗體形成。例如，攜帶本發(fā)明所述組合物或合成基因，并用于給予哺乳動物患者的非致病性重組病毒或共生菌可采用常規(guī)的方法制得，并從已知的非致病性微生物中選擇得到。
可用于將合成分子外源傳送給患者，和/或用于將合成基因攜帶到患者體內(nèi)的共生菌包括但不限于鏈球菌屬(Streptococcus)(如格氏鏈球菌S.Gordonii〕、大腸桿菌屬、芽胞桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和酵母菌屬(Saccharomyces)的各種菌株。
可被工程改造成將合成基因攜帶到宿主細(xì)胞中的合適的非致病性病毒包括痘病毒(如牛痘)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、金絲雀痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。許多的這類非致病性病毒通常用于人的基因治療，并用作其它疫苗制劑的載體，并且為本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所熟知。
H.本發(fā)明組合物的制備或生產(chǎn)可采用已知的化學(xué)合成技術(shù)，如Merrifield，L.Amer.Chem.Soc.，852149-2154(1963)中所述的技術(shù)，以常規(guī)的方式制備本發(fā)明的組合物、含有本發(fā)明靈長類動物識別的表位I以及任選地含有一種或多種表位II、III或IV的單獨(dú)的多肽/肽、本發(fā)明的合成基因和合成分子。或者，可采用重組DNA技術(shù)，通過在宿主微生物或細(xì)胞中克隆和表達(dá)攜帶編碼含有至少兩種必需的靈長類動物識別的表位I序列肽/多肽的序列，從而可制備本發(fā)明的組合物，該肽/多肽任選地具有其它免疫原和任選的載體蛋白。可以合成的方式制備表位I和任選的免疫原的編碼序列(W.P.C.Stemmer等人，Gene，16449(1995))，或者采用已知的技術(shù)從病毒RNA衍生得到，或者從可獲得的含有cDNA的質(zhì)粒得到。
可采用這些技術(shù)的組合。例如，可將采用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)的順序免疫原的裝配用于合成基因的生產(chǎn)，用定點誘變用于提供免疫原的所需序列。然后重組產(chǎn)生合成基因的產(chǎn)物。所有這些操作都可采用常規(guī)的方法進(jìn)行。
使用合成基因或分子克隆和表達(dá)本發(fā)明的肽/多肽組合物的系統(tǒng)包括使用各種微生物和細(xì)胞，這些微生物和細(xì)胞在重組技術(shù)中是周知的。例如，這些包括大腸桿菌、芽胞桿菌、鏈霉菌和酵母菌以及哺乳動物、酵母和昆蟲細(xì)胞的各種菌株。因此，合適的載體是已知的，并可從私人或公共實驗室和保藏中心獲得，也可以從商業(yè)的賣主獲得。目前，最優(yōu)選的宿主是哺乳動物細(xì)胞，如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS-1細(xì)胞。這些宿主可與痘病毒載體(如牛痘或豬痘)一起使用。選擇用于轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物生產(chǎn)和純化的其它合適的宿主細(xì)胞和方法可由本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員參考已知的技術(shù)進(jìn)行。例如尤其可參見Gething和Sambrook，Nature，293620-625(1981)。其它優(yōu)選的系統(tǒng)包括桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和載體。
當(dāng)采用常規(guī)的重組方法生產(chǎn)時，本發(fā)明的組合物，即含有靈長類動物識別的表位I免疫原和任選的免疫原的多肽/肽，可采用常規(guī)的裂解技術(shù)從細(xì)胞內(nèi)容物中分離，或者采用常規(guī)的方法(如色譜法)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離。例如可參見Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，紐約(1989)。任一用于生產(chǎn)作為DNA疫苗的肽/多肽成分的合適的質(zhì)粒和病毒載體對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員來說都是已知的，并且不是本發(fā)明的限制。參見Sambrook等人，同上，以及上述蛋白質(zhì)生產(chǎn)中引用的參考文獻(xiàn)。還可參見1994年1月20日出版的國際專利申請PCTWO94/01139。簡言之，將編碼選擇的肽/多肽的DNA插入含有其它任選的側(cè)接序列的載體或質(zhì)粒中，該側(cè)接序列可以是啟動子、mRNA前導(dǎo)序列、起始位點和其它能指導(dǎo)該DNA在體內(nèi)或體外增殖和表達(dá)的調(diào)節(jié)性序列。這些載體使患者細(xì)胞受到感染，并使合成基因序列在體內(nèi)表達(dá)，或者使該序列在體外表達(dá)為蛋白質(zhì)/肽或融合蛋白/肽。
可將所得的組合物配制成具有任何數(shù)量的任選免疫原的靈長類動物識別的表位I組合物，并根據(jù)功效進(jìn)行體內(nèi)試驗篩選。這種試驗使用該組合物免疫動物如猴，然后評估針對HIV-1的Tat蛋白或?qū)?yīng)于變體Tat序列的合成檢測肽的抗體的效價(如下面的實施例所示)。
I.本發(fā)明的抗體組合物本發(fā)明的抗體組合物或配體結(jié)合組合物包括至少一種特異性地與式-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ ID NO9]表位I結(jié)合的抗體，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn，X9選自Glu和Asp，Z12選自Lys和Asn。較佳的是，如本文所述，這種抗體組合物包括至少兩種或兩種以上特異性地與至少兩種必需的表位I序列結(jié)合的抗體或配體。產(chǎn)生針對表位I的兩種必需序列R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO17]和R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO18]的抗體(或其它結(jié)合配體)。因此，該組合物的抗體結(jié)合出現(xiàn)在HIV-1 Tat蛋白的多種變體上的HIV Tat蛋白。產(chǎn)生針對上式表位I中其它序列的額外抗體或配體。
在一個實施例中，如上文所述，針對結(jié)合本發(fā)明表位I肽或多肽的分離的抗體也是本發(fā)明的一個方面。這種多克隆抗體組合物通常如下產(chǎn)生用上述含有所述兩種必需表位I免疫原的肽/多肽，和其它靈長類動物識別的表位I免疫原和任選的免疫原的組合物免疫哺乳動物，較佳是靈長類動物。特別可以用作免疫原的是七價的靈長類動物識別的表位I免疫原(即，沒有罕見的變體)或八價的免疫原(如下文實施例3中所述的合成基因或融合蛋白)，和/或單價表位II免疫原×即，單一的表位II肽，任選地結(jié)合于載體)。除了在靈長類動物中產(chǎn)生外，這類抗體也可在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，包括所謂的“人源化”轉(zhuǎn)基因小鼠。但是，產(chǎn)生針對本發(fā)明組合物的多克隆抗體的合乎要求的宿主包括人。可采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)監(jiān)測暴露于表位I組合物中的哺乳動物產(chǎn)生的這類多克隆抗體的效價，如采用酶聯(lián)免疫吸附測定。如果需要，可從哺乳動物分離抗體分子，如從全血、血漿或血清中分離，然后采用常規(guī)的技術(shù)進(jìn)一步從免疫的哺乳動物的血漿或血清中純化。常規(guī)的收集技術(shù)尤其可包括血漿去除法、A蛋白色譜法。這類多克隆抗體組合物自身可以用作本發(fā)明的藥物組合物。
或者，可從哺乳動物中獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，然后用這些細(xì)胞來制備其它形式的抗體或配體，如單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體，由篩選噬菌體展示產(chǎn)生的配體、它們的抗體片段和混合物，以及合成抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和完整的人抗體。產(chǎn)生這些類型的配體的制備技術(shù)是已知的，可采用靈長類動物識別的表位I和任選的免疫原的公開的氨基酸序列來產(chǎn)生配體自身。例如可參見Kohler和Milstein(1975)，Nature，256495-497；Kozbor等人(1983)，Immunol.Today，472；Cole等人，1985，《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁；Harlow等人，《抗體——實驗室手冊》(Antibodies A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8610029-10032(1989)；Hodgson等人，Bio/Technology，9421(1991)；出版號為WO92/04381的國際PCT申請PCT/GB9I/01554和出版號為WO93/20210的國際PCT申請PCT/GB93/00725。
例如，在另一實施例中，單克隆抗體特異性地與含有由表位I式定義的任何較大免疫原的HIV Tat蛋白的最小表位I序列結(jié)合，該表位I序列為-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ ID NO9]，其中可變的氨基酸和R基團(tuán)的定義同上。作為一個實施例，單克隆抗體特異性地與氨基酸序列-Asp-Pro-Asn-Leu-X9-Pro-Trp-Asn-[SEQ ID NO26]結(jié)合，其中X9是Glu或Asp。特異性地與上述式子定義的最小表位I序列結(jié)合的其它一些單克隆抗體是本發(fā)明的一部分。
在本發(fā)明的另一實施例中，單克隆抗體特異性地與含有氨基酸序列-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys[SEQ ID NO10]的最小表位II序列結(jié)合，其中，X42是Gly或Ala，該表位II作為從表位-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ IDNO11]獲得的不同表位，被先前所述的抗體識別。較佳的是，抗體組合物含有與X42是Gly的肽和X42是Ala的肽交叉反應(yīng)的一種抗體。這些抗體較佳在靈長類動物中產(chǎn)生。還有一些特異性地與上述式子定義的最小表位II序列結(jié)合的單克隆抗體也是本發(fā)明的一部分。
可通過使用本發(fā)明靈長類動物識別的HIV-1 Tat表位篩選重組組合的免疫球蛋白庫(如抗體噬菌體展示)，以分離結(jié)合HIV-1 Tat的免疫球蛋白庫成員，從而開發(fā)其它的抗-Tat抗體〔W.D.Huse等人，Science，2461275-1281(1988))。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示庫的試劑盒可從市售獲得，如Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System)，目錄號27-9400-01；Strategene噬菌體展示試劑盒(Strategene Phage Display kits)等。例如可參見美國專利第5,223,409號、國際出版物WO92/09690、WO90/02909等。類似地，可采用已知的技術(shù)開發(fā)嵌合抗體〔尤其是Morrison等人，(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851；Takeda等人，Nature，313.452(1984)〕。嵌合抗體是其不同部分從不同的動物種類得到的分子。還可采用常規(guī)的方法，使用本發(fā)明的多克隆或單克隆抗體的可變部分制備單鏈抗體〔例如可參見美國專利第4,946,778號和第4,704,692號〕?？贵w片段如Fab、F(ab′)2和Fv片段及其庫也可用在本發(fā)明的各個方面。
這些抗體/配體組合物合乎要求地結(jié)合于大多數(shù)已知的HIV-1 Tat蛋白變體(如95％以上，較佳是99％以上的已知的Tat蛋白變體)，并阻止了這些Tat蛋白進(jìn)一步支持HIV-1的增殖。這些組合物可包含多種不同的抗體的混合物，這些抗體結(jié)合從HIV-1的多種菌株得到的HIV-1 Tat蛋白表位序列。因此，這些抗體可用于下面的藥學(xué)方法和制劑中。
J.本發(fā)明的藥物組合物作為本發(fā)明的另一方面，用于誘導(dǎo)與大多數(shù)(如95％以上，較佳99％以上)已知的HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)，并削弱HIV-1的增殖的抗體的藥物組合物可包含本發(fā)明所述的至少兩種必需的靈長類動物識別的表位I肽或多肽作為其活性制劑，并較佳還含有額外的表位I肽。幾種合乎要求的組合物包含下述成分(a)含有至少兩種必需的，較佳至少7種靈長類動物識別的表位I氨基酸序列[SEQ ID NO17-24]的肽/多肽免疫原；(b)還含有表位II、III或IV氨基酸序列的任一種，較佳是單價表位II免疫原的(a)的肽/多肽免疫原；(c)編碼所述兩種必需的靈長類動物識別的表位I序列、較佳是7種表位I序列[SEQ ID NO17-24]以及上述任意序列的合成或重組產(chǎn)生的基因；(f)含有(c)的合成基因的合成分子；(g)攜帶上述合成基因或合成分子的重組病毒；(h)攜帶上述合成基因或合成分子的共生菌。
選擇的活性成分存在于藥學(xué)上可接受的載體中，并且該組合物可含有額外的成分。含有本發(fā)明組合物的藥劑可含有其它的活性制劑，如MAP的T細(xì)胞刺激劑、佐劑和免疫刺激性細(xì)胞因子，如IL-12，以及其它已知的細(xì)胞因子，用于蛋白質(zhì)/肽組合物。所有這些藥物組合物都可降低哺乳動物的病毒水平。
作為藥物組合物，含有靈長類動物識別的表位I肽或核酸序列以及任選的免疫原系列與藥學(xué)上可接受的載體混合，以給予哺乳動物，用于預(yù)防或治療病毒感染。蛋白質(zhì)/肽可組合成單一的藥物制品用于給藥。用于本發(fā)明的免疫源性蛋白質(zhì)組合物的合適的藥學(xué)上可接受的載體對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是已知的。這類載體包括如鹽水、緩沖鹽水、選擇的佐劑，如氫氧化鋁和氫氧化鎂的水性懸浮液、脂質(zhì)體、水中油乳液和其它的載體。合適的佐劑也可用于本發(fā)明含有蛋白質(zhì)的組合物中。用于指導(dǎo)DNA、質(zhì)粒核酸或重組載體給藥的合適的載體包括但不限于鹽水，或蔗糖、魚精蛋白、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、聚賴氨酸、聚陽離子、蛋白質(zhì)、CaPO4或亞精胺。例如可參見PCT申請WO94/01139和上面引用的參考文獻(xiàn)。肽/多肽組合物和合成的基因或分子能在免疫的宿主哺乳動物(如人)的體內(nèi)引起能阻斷從HIV-1得到的多種(約95％到約99％)已知的細(xì)胞外Tat蛋白變體的免疫應(yīng)答，從而降低病毒水平。
另一可用于削弱HIV-1的增殖的藥物組合物包含一種抗體組合物，該抗體組合物含有一種或多種上面已詳細(xì)描述的抗體。在藥物組合物中，抗體可存在于鹽水溶液或者其它合適的載體中。抗體組合物能使提供即時的、外源提供的Tat的阻斷。
本發(fā)明并不受到常規(guī)的、生理學(xué)上可接受的載體、佐劑或用于上述類型的藥物制備中的其它成分的限制。由上述成分制備具有適當(dāng)?shù)膒H、等滲性、穩(wěn)定性和其它常規(guī)特征的這些藥學(xué)上可接受的組合物都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
K.本發(fā)明的方法——削弱HIV-1的增殖根據(jù)本發(fā)明，減少HIV-1的病毒水平的方法涉及使人暴露于上述誘導(dǎo)Tat抗體的藥物組合物中，主動誘導(dǎo)與多種(如，95％以上，較佳在99％以上)已知的HIV-1Tat蛋白反應(yīng)的抗體，并在體內(nèi)削弱該病毒的增殖。這種方法適用于具有活性的免疫系統(tǒng)的HIV感染的受試者，或者用于未感染受試者的主動免疫。該方法誘導(dǎo)與HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體，減少HIV-1的初始急性感染期間的病毒增殖，并使導(dǎo)致AIDS的慢性病毒血癥減到最小程度。這種方法也降低感染受試者中長期的病毒增殖，也使發(fā)展成AIDS的可能性減到最小程度。使用這些方法可控制長期的HIV-1感染，提供一種不產(chǎn)生抗性的新的治療機(jī)制。針對Tat的抗體抑制HIV-1準(zhǔn)種類的復(fù)制而與它們產(chǎn)生的Tat無關(guān)，因為細(xì)胞外的Tat蛋白沒有與病毒的復(fù)制部分結(jié)合。因此，對于Tat抗體可對非反應(yīng)性的逃逸型Tat變體產(chǎn)生選擇性壓力這方面沒有顯而易見的機(jī)制。
根據(jù)本方法，這些藥物組合物較佳含有肽/多肽組合物、合成的基因或分子、重組的病毒或共生重組菌。較佳的是，這些組合物含有七價的合成基因或融合蛋白(沒有表位I的罕見變體)或?qū)嵤├?的八價的合成基因或融合蛋白，并任選地含有單價的表位II肽。藥物組合物的這些活性成分，每一種都主動地誘導(dǎo)暴露的人中抗Tat抗體的形成，該抗體阻斷Tat從感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未感染的細(xì)胞。這種作用減少感染的多重性，并阻斷HIV-1病毒擴(kuò)長的爆發(fā)，從而降低病毒水平。在已經(jīng)感染的患者中，這種減少病毒水平的方法可減少慢性病毒血癥和向AIDS的發(fā)展。在未感染的人中，給予本發(fā)明的組合物可減少急性感染，并從而使導(dǎo)致AIDS的慢性病毒血癥減到最小程度。
本發(fā)明的另一方面是，向?qū)IV-1感染不能引起有效的或快速的免疫應(yīng)答的人給予含有上述抗體組合物的藥物組合物，從而減少HIV-1的病毒水平。該方法可涉及長期給予該組合物。這些適合用本方法治療的患者是由疾病產(chǎn)生的免疫妥協(xié)的并且不能引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的HIV-1感染患者。在HIV感染的后期階段，產(chǎn)生有效的抗體效價的可能性很小，這是由于與該疾病相關(guān)的免疫削弱的緣故。這些患者還包括HIV-1感染的孕婦、感染的母親的新生兒，以及具有推定暴露的未免疫患者(如，不當(dāng)心被HIV-1感染的人用過的針“扎”過的人)。
對于這些患者，在本發(fā)明的方法中，較佳將藥物組合物用作本發(fā)明的抗體組合物。該抗體組合物包含在其它哺乳動物中制得的多克隆抗體組合物，較佳是在正常的人中制得，或者，該抗體是上述其它形式的抗體，如單克隆抗體等。這些抗體組合物以被動的免疫治療給予，以抑制病毒的增殖，并降低病毒負(fù)荷。與從HIV-1得到的多種已知的Tat蛋白反應(yīng)的外源抗體使患者即時阻斷Tat從病毒感染的細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到其它感染的或未感染的細(xì)胞中。根據(jù)本方法，可采用長期的治療方案用抗體組合物對患者進(jìn)行長期的治療。
在上述各種方法中，以適當(dāng)?shù)耐緩浇o予本發(fā)明的組合物，如皮下、口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、經(jīng)鼻或吸入給藥。目前優(yōu)選的給藥途徑是免疫用(主動誘導(dǎo))組合物的肌肉內(nèi)給藥，和抗體(被動治療)組合物的靜脈內(nèi)(i.v.)、皮下(s.c.)或肌肉內(nèi)(i.m.)給藥。重組病毒載體或裸DNA較佳是肌肉內(nèi)給予，但是，其它某些重組病毒載體和/或活的共生菌可口服給予。
根據(jù)患者的年齡、體重、性別、總的身體狀況等選擇本發(fā)明各種疫苗劑量中的蛋白質(zhì)、肽或核酸序列的量。需要用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(較佳是保護(hù)性應(yīng)答)的活性成分的量，或者在患者中產(chǎn)生外源效果而沒有明顯的不利副作用的活性成分的量，根據(jù)所使用的藥物組合物和任選存在的(用于含有蛋白質(zhì)的組合物的)佐劑而改變。
通常，對于含有蛋白質(zhì)/肽、融合蛋白、MAP或偶聯(lián)蛋白質(zhì)的組合物或者抗體組合物，各劑量將含有約50μg到約20mg的肽/多肽免疫原/毫升無菌溶液。更佳的劑量可以是約500μg的免疫原。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員也可考慮其它的劑量范圍。給予最初劑量之后，可在需要時任選地進(jìn)行重復(fù)的激發(fā)。
本發(fā)明的抗體組合物可用于長期治療由于針扎或母體感染而患急性感染的風(fēng)險的受檢者。這類“急性”感染的劑量頻率可以i.v.、s.c.或i.m.方式每日給藥到每周給藥1次或2次，持續(xù)約6周。本發(fā)明的抗體組合物也可用作感染患者或晚期HIV患者的長期治療。在感染患者中，長期給藥的頻率可以i.v.、s.c.或i.m.方式每日給藥到每月1次或2次，可根據(jù)免疫原的半衰期給藥(如約7-21天)。但是，這些感染患者的長期治療的持續(xù)時間預(yù)計是不確定的，并且是長期的。
或者，本發(fā)明的組合物可設(shè)計用于直接給予作為“裸DNA”本發(fā)明的合成基因或分子。由于具有蛋白質(zhì)免疫源性組合物，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可選擇并調(diào)節(jié)DNA和載體組合物中的成分的量以及給藥方式(如注射或鼻內(nèi))。通常，每種劑量將包含約50μg到約1mg的編碼免疫原的DNA/毫升無菌溶液。
對于含有合成基因或分子的重組病毒，劑量范圍可以是含有濃度為1×107-1×1010pfu/ml的本發(fā)明重組病毒的約20-50ml的鹽水溶液。較佳的人用劑量約為上述濃度的20ml鹽水溶液。但應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可根據(jù)重組病毒的特性和傳送給宿主的免疫原的構(gòu)成改變這種劑量。
攜帶要傳送給患者的合成基因或分子的共生菌的量，其范圍通常約為103-1012個細(xì)胞/kg。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可根據(jù)所要使用的細(xì)菌，和含有表位I和由該活細(xì)菌傳送的任選免疫原的具體組合物而改變這些劑量。
因此，將本發(fā)明的組合物設(shè)計成使用未感染的哺乳動物(如人)的選擇病毒來延遲感染或使感染減到最小。因而，這些組合物可用作疫苗?？筎at蛋白抗體并不與診斷試驗中用來檢測感染后血清轉(zhuǎn)化的HIV-1蛋白質(zhì)反應(yīng)。因此，用本發(fā)明的組合物治療的受試者將不會受到HIV-1感染的假陽性測試的影響，并且，如果經(jīng)治療的受試者感染了HIV-1，仍有檢測到血清轉(zhuǎn)化的可能性。
對哺乳動物給予本發(fā)明的組合物，不論是含有蛋白質(zhì)/肽的組合物還是編碼免疫原的新穎的核酸序列，都可提供根本上不同的AIDS接種策略，因為這樣可使約95％以上，較佳約99％以上的HIV-1的已知Tat蛋白變體受到生物學(xué)阻斷，從而降低病毒水平，并減少HIV-1的增殖。
與用于抵抗這些病毒的其它治療和預(yù)防方法相反，使用含有Tat免疫原的組合物具有特別合乎要求的優(yōu)點。由于Tat蛋白的阻斷在細(xì)胞外不加選擇地抑制所有的HIV準(zhǔn)種類或菌株的增殖，所以這種阻斷并沒有對用于突變病毒變體選擇的母體病毒產(chǎn)生選擇性壓力。因此，阻斷患者細(xì)胞對Tat蛋白的攝取不僅減少病毒血的水平，而且這種阻斷還以排除“逃避變體”的方式進(jìn)行。
此外，本發(fā)明包括一種主動治療無癥狀HIV-1感染的病毒血癥患者的方法，因為在患病期間，細(xì)胞外的Tat蛋白有可能對持久的感染和在此HIV-1感染階段存在的免疫異常產(chǎn)生影響。由本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)的抗體對細(xì)胞外Tat蛋白的阻斷可以更有效的免疫控制減少病毒血癥，并延遲或阻止疾病向AIDS發(fā)展。
本發(fā)明上述機(jī)制可用于阻止病毒感染的過程，并產(chǎn)生所需的臨床結(jié)果。更具體地說，本發(fā)明的組合物通過阻斷未感染細(xì)胞對Tat蛋白的進(jìn)一步攝取，能減少已經(jīng)感染了病毒的患者的病毒血癥。本發(fā)明的組合物，不論是單獨(dú)使用還是與HIV感染患者的其它治療方案一起使用，都有助于減少病毒血癥，并阻止臨床惡化。
對于這些治療用途，給藥的制劑和方式基本上與上面特別指出的相同，并且可與用于特殊的病毒感染的其它常規(guī)治療一起或同時進(jìn)行。對于治療用途或預(yù)防性用途，需要反復(fù)給予免疫用組合物，如每年激發(fā)一次，或者以其它的間隔時間激發(fā)。
L.本發(fā)明的診斷試劑盒上述肽和多肽也可用作測量和檢測由接種上述組合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的效價和特異性的試劑盒中的試劑。本發(fā)明的試劑盒可包括上述至少兩種必需的表位I肽，較佳是兩種或兩種以上靈長類動物識別的表位I和任選的免疫原。在一個實施例中，各肽在其N末端上具有蛋白質(zhì)生物素和間隔區(qū)，如-Ser-Gly-Ser-Gly-[SEQID NO27]。或者，該肽在其C末端上可具有間隔區(qū)，如-Gly-Ser-Gly-Ser-[SEQ IDNO39]，以及蛋白質(zhì)生物胞素。這些實施例使這些肽結(jié)合于抗生物素蛋白包被的固相載體如平板或珠。診斷檢測領(lǐng)域中熟練的技術(shù)人員已知的其它結(jié)合試劑也可用于相同的目的。試劑盒中還提供了標(biāo)記的試劑，這類試劑檢測抗體與固定的表位肽(如山羊抗人免疫球蛋白等)的結(jié)合。試劑上的標(biāo)記物可選自許多已知的診斷用標(biāo)記物，如放射性化合物、熒光化合物和蛋白質(zhì)、比色酶等。因此，試劑盒還包含各種各樣的試劑和用于讀取標(biāo)記物的裝置(如某些與酶標(biāo)記物反應(yīng)以產(chǎn)生顏色信號的底物等)、用于采取血樣的裝置，以及適當(dāng)?shù)钠亢推渌\斷檢測用成分。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員還易于選擇其它常規(guī)的診斷用成分用于此試劑盒。
這些試劑盒和試劑可用于檢測接種了本發(fā)明組合物的受試者中抗體的效價和反應(yīng)性方式的方法。用于測定由免疫產(chǎn)生的針對Tat免疫原的抗體的存在和/或效價的方法包括以下步驟使從免疫的受試者獲得的生物樣品(如體液，較佳是血液、血清或血漿，但也有可能是尿、唾液和其它液體或組織)與一種或多種靈長類動物識別的表位I和任選的免疫原的結(jié)合序列接觸，該結(jié)合序列較佳是固定在固相載體上，如平板或珠。用于本方法的靈長類動物識別的表位I和任選的結(jié)合序列可以是未修飾的最小表位結(jié)合區(qū)域。
一旦該生物樣品暴露在固定的肽中足夠的時間后，洗滌該支持物，以從該生物樣品中除去未與肽結(jié)合的任何材料。這一洗滌步驟在診斷檢測中是常用的，并且用鹽水進(jìn)行。如果針對表位I和任選的免疫原或它們的組合的抗體由于上述治療而在受試者中產(chǎn)生，那么固定的肽已與生物樣品中的抗體結(jié)合。此后，將標(biāo)記的試劑加到支持物上的材料中，以檢測固相載體上的肽與上述生物樣品中的抗體的結(jié)合。較佳的是，這種試劑是抗-人免疫球蛋白，如山羊抗-人免疫球蛋白。如上所述，標(biāo)記物選自大范圍的常用診斷用標(biāo)記物。在一個實施例中，標(biāo)記物可以是比色酶，這種酶在與底物接觸后產(chǎn)生可檢測的顏色信號。顏色的存在和/或強(qiáng)度提供治療受試者中抗體誘導(dǎo)的證據(jù)。這種檢測可用于測定免疫的功效，以及用于監(jiān)測患者的免疫狀態(tài)。
選擇具體的檢測步驟以及各種可檢測的標(biāo)記系統(tǒng)對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是已知的。這種選擇是常規(guī)的，且并不限制本發(fā)明。
M.本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明組合物的一個優(yōu)點是，本發(fā)明的組合物中需要少量的免疫原與普通B亞型的HIV-1的95％-99％以上的已知Tat蛋白變體發(fā)生交叉反應(yīng)。如以下實施例中所述，含有兩種必需的靈長類動物識別的表位I氨基酸序列以及六種額外的表位I序列的靈長類動物識別的表位I免疫源性組合物與普通B亞型的HIV-1的95％Tat蛋白交叉反應(yīng)，以及與從較少見的非B亞型HIV-1獲得的所有56種Tat蛋白序列交叉反應(yīng)。因此，單一的組合物可有效地用于預(yù)防或治療由可能遇到的大量的HIV-1株引起的感染。
此外，在鑒別針對所需的結(jié)合的Tat的準(zhǔn)確表位之后(即SEQ ID NO15的第5-12個氨基酸)，可采用本文所述的方法易于鑒別從新產(chǎn)生的HIV-1株或新發(fā)現(xiàn)的株得到的新的合乎要求的Tat肽免疫原，并將其包含在組合物中。這種適應(yīng)性使本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防性地針對將來鑒別出來的HIV-1的任何新株。結(jié)合本文所述的內(nèi)容，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員有望能易于將新的Tat免疫原組合(和編碼它們的核酸構(gòu)建物)加到組合物中。
例如，采用常規(guī)技術(shù)如PCR和高密度寡核苷酸陣列〔M.J.Kozal等人，NatureMed.，2753(1996)〕，使本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能獲得代表HIV-1株和亞型的臨床分離物的變體的HIV-1 Tat蛋白的大陣列。使用這些技術(shù)可測定HIV-1 B亞型以及不發(fā)達(dá)國家中發(fā)現(xiàn)的其它亞型的其它變體，這些變體到目前還沒有研究透徹。新的Tat序列的測定將使得相應(yīng)的肽可作為免疫原簡便地加到本發(fā)明的組合物中，從而誘導(dǎo)針對HIV-1的其它稀有的Tat蛋白的抗體反應(yīng)。
使用針對對應(yīng)于各種Tat變體的合成肽而產(chǎn)生的抗體進(jìn)行的交叉反應(yīng)性研究可用于消除對使用其序列變化在免疫學(xué)上是沉默的Tat變體進(jìn)行免疫的需求，因為這些肽被抗體強(qiáng)烈地結(jié)合在共有序列或其它變體上。
下面的實施例闡述了制備本發(fā)明的組合物和利用這些組合物誘導(dǎo)針對免疫宿主中的病毒Tat蛋白的抗體的較佳方法。這些實施例僅僅是闡述性的，并不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1——與HIV-1 Tat蛋白中靈長類動物識別的表位I的抗體結(jié)合所必需的最小Tat蛋白氨基酸序列的免疫學(xué)研究、序列變化以及針對這些序列的抗血清的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性A.合成肽和共軛物采用固相合成技術(shù)，在衍生化的聚乙烯載體上合成所述合成肽〔R.M.Valerio等人，Int.J.Peptide Res.，44158-165(1994)〕。用氨基末端Cys和酰胺化C末端合成免疫用肽，加入該氨基末端以促進(jìn)與載體蛋白的偶聯(lián)。用氨基末端生物素-Ser-Gly-Ser-Gly-序列[SEQ ID NO27]和C末端上游離酸官能合成檢測肽，將其用于ELISA檢測，以檢測反應(yīng)性和交叉反應(yīng)性。采用高壓液相層析(HPLC)純化經(jīng)由半胱氨酰側(cè)鏈以5-8的肽-載體比例共價偶聯(lián)于白喉類毒素(DT)載體蛋白的免疫用肽〔A.C.J.Lee等人，Molec.Immunol.，17749(1980)〕，使用分析性HPLC和質(zhì)譜法測得純度大于95％，所使用的檢測肽的純度大于50％。
B.免疫在純凈水中溶解肽共軛物，用完全福氏佐劑(CFA)或不完全福氏佐劑(IFA)以1∶1的比例乳化〔《抗體--實驗室手冊》(ANTIBODIES-A LABORATORYMANUAL)，E.Harlow和P.Lane編輯，Cold Spring Harbor Laboratoty(1998)〕。向每種靈長類動物給予的總體積是1ml，這1ml中含有100μg與DT偶聯(lián)的肽。
如下用IFA/CFA中的抗原免疫作為病毒攻擊的一部分的獼猴。對幾種靈長類動物使用免疫用肽，最初用共軛物的CFA溶液肌肉內(nèi)(IM)注射，接著用共軛物的IFA溶液IM加強(qiáng)2周。在第1次注射之前，先采取血樣，然后在加強(qiáng)注射后3到5周后采取更多的血樣。
C.ELISA效價如H.M.Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813998(1983)所述進(jìn)行ELISA檢測。抗體效價是在背景上產(chǎn)生1.0 OD單位的吸光度的血清稀釋度的倒數(shù)。使用2-3份血清的幾何平均效價(GMT)計算各個反應(yīng)，或者僅從一些猴子免疫獲得單一的血清。
兔與猴中的這種ELISA檢測的結(jié)果分別顯示在圖1A和1B中。這些ELISA結(jié)果證明，針對加了表位I的免疫原的靈長類動物抗體與序列-Asp-Pro-Arg7-Leu-Glu9-Pro-Trp-Lys12-[SEQ ID NO15的第5-12個氨基酸]反應(yīng)。如下面所述，位置7、9和12表示靈長類動物識別的這種表位I肽的共同變體。
D.表位中的氨基酸系列的多樣性分析從GenBank和Los Alamos人逆轉(zhuǎn)錄病毒和AIDS數(shù)據(jù)庫〔HUMANRETROVIRUSES和AIDS 1996，由Los Alamos國家實驗室的理論生物學(xué)和生物物理學(xué)組(Theoretical Biology and Biophysics Group of the Los Alamos NationalLaboratory)出版，Los Alamos，NM；以及由Los Alamos實驗室的Esther Guzman從GenBank友情提供的額外序列)檢索HIV-1 Tat第一外顯子序列。不完整的序列和具有終止密碼子或?qū)е乱拼a的堿基刪除的序列被刪除，由相同的隔離種群具有明顯相同的重復(fù)序列的序列也被刪除。記錄下表位中這些位置上的氨基酸的變化，并將其匯總。
E.變體之間的抗原交叉反應(yīng)性采用ELISA，在共有序列和具有共同氨基酸變體的序列上測定針對表位共有序列的抗血清的效價，以測定氨基酸多態(tài)對抗原性的影響。
F.序列中的變化評價靈長類動物識別的表位I共有序列的最大頻率和被靈長類動物的識別。為這些肽評價從294種B進(jìn)化枝(I)病毒得到的294種HIV-1 Tat蛋白和56種非B進(jìn)化枝(II)病毒的HIV-1 Tat蛋白中的抗原和序列保守性，并將結(jié)果匯總在表II-VI中。
表II和III的第一行表示最大頻率的共有序列。中間的那些行是在各位置上的5％以上序列(如果有多條序列的話)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的百分比發(fā)生率。各表的最后一行是總的發(fā)生率，包括在5％以上的序列(如果有多條序列的話)中產(chǎn)生的氨基酸。表II中所有這些選擇在抗原性上產(chǎn)生不同的表位(＜25％交叉反應(yīng)性)；表III中所有的選擇除了氨基酸4這一項外其余的也和表II中的一樣。
表II表位I——294種B進(jìn)化枝

表III表位I——56種非B進(jìn)化枝

如表II和III中所示，靈長類動物識別的表位I具有潛在的16倍抗原多態(tài)，但B進(jìn)化枝存在一種主要的抗原，非B進(jìn)化枝存在另一種主要的抗原。5種其它的變體占了已知Tat變體的95％以上。參見表IV和V；標(biāo)有星號的序列表示在B進(jìn)化枝和非B進(jìn)化枝中都存在。
表VI——B進(jìn)化枝(294種序列)

表V——非B進(jìn)化枝(56種序列)

表VI顯示表位I的位置7變體的抗原交叉反應(yīng)性差、位置9變體的抗原區(qū)別和抗血清對在位置7和12上都有變化的GluProValAspProAsn7LeuGlu9Pro-TrpAsn12[SEQ ID NO13的第225-235個氨基酸]和GluProValAspProArg7LeuGlu9Pro-TrpLys12[SEQ ID NO15的第2-12個氨基酸]的非常缺乏的交叉反應(yīng)性。該表還顯示Glu9和Asp9變體的抗原區(qū)別。
表VI——猴抗血清對具有Tat氨基酸位置7、9和12變化的檢測肽上的表位I免疫原的ELISA反應(yīng)性

實施例2——與HIV-1 Tat蛋白中靈長類動物識別的表位II的抗體結(jié)合所必需的最小Tat蛋白氨基酸序列的免疫學(xué)研究、序列變化以及針對這些序列的抗血清的免疫學(xué)交叉反應(yīng)性采用與實施例1相同的方法，在猴子中結(jié)合的抗體的表位II范圍內(nèi)，測定294種B進(jìn)化枝和56種非B進(jìn)化枝HIV-1 Tat序列的氨基酸序列變化的發(fā)生率。結(jié)果列在表VII和VIII中。這兩個表的第一行是共有共有序列。中間幾行是在各位置上的5％以上序列(如果有多條序列的話)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸的百分比發(fā)生率。各表的最后一行是總的發(fā)生率，包括在5％以上的序列(如果有多條序列的話)中產(chǎn)生的氨基酸。Tat位置42上的氨基酸變體在抗原性上是交叉反應(yīng)的。
表VII表位II——294種B進(jìn)化枝

表VIII表位II——56種非B進(jìn)化枝

如表VII和VIII所揭示，表位II顯示出幾乎完整的抗原保守性。
測量針對檢測肽內(nèi)具有Tat Gly42或Ala42(變體)的檢測肽上的表位II免疫原的猴抗血清的ELISA反應(yīng)性，其結(jié)果列在表IX中。參見分別顯示兔和猴的結(jié)果比較的圖2A和2B。
表IX

實施例3用于無癥狀的HIV-1感染的人單克降抗體治療的發(fā)展用適量的偶聯(lián)于白喉類毒素載體蛋白的表位II免疫原Cys-Gly-Ser-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-酰胺[SEQ ID NO34]免疫市售獲得的抗體人源化的小鼠。在鏈霉抗生物素蛋白包被的平板上，用生物素-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-OH[SEQ ID NO35]篩選雜交瘤，選擇具有亞毫微摩爾結(jié)合親和力并且不與互補(bǔ)的受體結(jié)合的IgG單克隆抗體。在重組的HIV-1 Tat蛋白上確定特異性。
由于該單克隆抗體針對的是非自身的抗原，所以要考慮常規(guī)的臨床前生產(chǎn)、純化和安全性測試。人單克隆抗體在人中具有20天的半衰期，而在內(nèi)部CD3上被廣泛消耗的小鼠單克隆抗體OKT3則有18小時的半衰期。5mg OKT3的日劑量在人中維持約1微克/ml的低水平。因此，5mg的抗-Tat單克隆抗體的兩周一次劑量預(yù)計將足以維持類似的低水平，這個水平超過所估計的感染受試者中達(dá)到1ng/ml的HIV-1 Tat蛋白的最大循環(huán)水平的50倍克分子以上。
現(xiàn)在，對血漿病毒負(fù)荷的控制是HIV-1治療功效的可接受標(biāo)準(zhǔn)。在無癥狀HIV-1感染受試者中易于測定抗-Tat單克隆抗體的功效，這種測定最初要進(jìn)行4周的療程。這種方案可用于未治療的患者、由于各種原因?qū)е翲AART方案失敗的患者，或者由HAART治療控制的患者，這一治療有4周的結(jié)束時間(如果HAART終止的話，病毒負(fù)荷將迅速回彈)。血漿病毒負(fù)荷減少了2-3個對數(shù)，從而減到LOD(50個病毒RNA拷貝/mL)以下，這一結(jié)果支持了使用單克隆抗體進(jìn)行的單一治療法，這一結(jié)果是在很長的時間跨度內(nèi)評估的。減少超過1個對數(shù)(90％)，但沒有低于LOD的結(jié)果表明，可將單克隆抗體用作治療成分。實施例4——預(yù)防患者向AIDS發(fā)展的普通疫苗的發(fā)展A.合成基因的構(gòu)建圖3A闡述編碼四種表位I多態(tài)的拷貝加上四種表位II的拷貝的合成基因，該表位I被用于檢測兔的抗體應(yīng)答，該合成基因在大腸桿菌中與大腸桿菌DnaK(HSP70)表達(dá)為線性融合蛋白。當(dāng)用表位特異性的兔抗血清在ELISA中測試這種表達(dá)的蛋白質(zhì)時，測得它含有所有的抗原表位。但是，當(dāng)用它們免疫兔或猴時，所有的表位I變體都是免疫源性的，而表位II不是。因此，表位II最佳用作偶聯(lián)于適當(dāng)?shù)妮d體蛋白的合成肽共軛物。
圖3B闡述構(gòu)建一種新穎的八價合成基因，使其靈長類動物識別的表位I范圍內(nèi)的多態(tài)性的基礎(chǔ)上，按讀框加到8種靈長類動物識別的表位I多態(tài)中
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO17]R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ IIDNO19]R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO22]R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO20]R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO24].
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO21]R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO18]和R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO23]表位I序列被含有Gly和/或Ser殘基的二肽間隔區(qū)分開。該基因如W.P.C.Stemmer等人，Gene，.16449(1995)中所述的那樣裝配。簡言之，有20個核苷酸(nt)重疊的頂鏈60-聚體寡核苷酸(寡聚物)和底鏈寡聚物與兩個端50-聚體一起合成。使這些60-聚體在雜交條件下一起培育，并采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來填滿該序列，并使其擴(kuò)增。然后加入端50-聚體，進(jìn)行PCR完成裝配，并在瓊脂糖凝膠上分離全長基因。測序該基因，發(fā)現(xiàn)它在實際表位內(nèi)具有正確的序列。通過消除稀有的變體R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO24]，可構(gòu)建類似的七價基因。
B.融合蛋白的表達(dá)然后用限制性酶切割上述基因，并按讀框?qū)⑵洳迦牒邪缀眍惗舅匦蛄?HSP70)的合適的表達(dá)載體中。將該載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌，分離表達(dá)該蛋白質(zhì)的菌落。使分離的菌落生長，并誘導(dǎo)其表達(dá)。鑒別從表達(dá)該融合蛋白的菌落中得到的蛋白質(zhì)。采用常規(guī)的方法純化所得蛋白質(zhì)。
圖3C闡述采用類似的技術(shù)任選地制備作為具有載體蛋白(如白喉類毒素)的合成肽的共軛物的單價表位II免疫原。
C.評價表位在融合蛋白中正確表達(dá)及其誘導(dǎo)抗-Tat抗體的功效的試驗如以上A節(jié)和B節(jié)所述，將Y7是Arg、Asn、Lys或Ser，X9是Glu和Z12是Lys的的4種表位I變體和兩種表位II變體構(gòu)建為合成基因，并使其表達(dá)為融合蛋白。為測定各表位是否在融合蛋白中表達(dá)為可被靈長類動物抗血清識別的形式，采用常規(guī)的方法，通過ELISA測試針對對應(yīng)于表位I序列的合成肽而產(chǎn)生的靈長類動物抗血清。平板最初直接用該融合蛋白包被，然后將其暴露在100μg/ml的抗血清(如兔抗血清)溶液中，已知該抗血清與表位I和II反應(yīng)。由各肽32,000以上的效價可看出，變體表位序列可以被針對相應(yīng)的合成肽的抗體識別的構(gòu)型表達(dá)。
為了評價多價免疫原的免疫源性，用融合蛋白的IFA溶液免疫猴。然后在表位I和II的合成肽上評價猴抗血清。產(chǎn)生了針對表位I變體的較大效價，即對Y7是Arg、Z12是Lys的表位I的效價為28,000，對Y7是Asn和Z12是Lys的表位I的效價為16,000，對Y7是Lys和Z12是Lys的表位I的效價為37,000效價，以及對Y7是Ser和Z12是Lys的表位I的效價為4,000。針對表位II的效價為700，表明這種表位最好是作為偶聯(lián)于載體的合成肽用于免疫。
實施例5檢測接種誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的效價和特異性的方法和試劑盒為了研究經(jīng)本發(fā)明的疫苗免疫后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體的效價和特異性，可采用一種檢測方法。在這種檢測的一個實施例中，使用實施例1所述的含有靈長類動物識別的表位I序列的肽(根據(jù)免疫用疫苗的組成)來開發(fā)測量接種的受試者中抗體的效價和反應(yīng)性模式的試劑盒。
這些肽在其N末端與生物素-Ser-Gly-Ser-Gly-[SEQ ID NO36]合成。各肽分別被包涂到抗生物素蛋白包被的平板上，以序列-Ser-Gly-Ser-Gly-[SEQ ID NO27]為間隔區(qū)，以確保相關(guān)的肽序列外部緊靠抗生物素蛋白的生物素結(jié)合囊。然后使平板與測試血清的稀釋液培育，洗滌，用針對人的免疫球蛋白的試劑(如山羊抗-人免疫球蛋白)直接用酶標(biāo)記來測定抗體結(jié)合。使用一種試劑與該酶反應(yīng)，產(chǎn)生比色信號(R&D試劑盒插入)。
對本發(fā)明進(jìn)行的大量修改和變動都包括在上述內(nèi)容中，這些修改和變動對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的。對本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行的這些修改和改動都包括在附帶的權(quán)利要求的范圍中。
序列表<110> 西蒙有限公司(Thymon L.L.C.)G.戈爾茨坦(Goldstein，Gideon)<120> 削弱HIV-1增殖的方法和組合物<130> GGP3APCT<150> US 09/561,366<151> 2000-04-28<160> 39<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 9<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 1Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5<210> 2<211> 6<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 2Gly Arg Gly Asp Ser Pro1 5<210> 3<211> 6<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<400> 3Asp Pro Xaa Leu Glu Pro11 5<210> 4<211> 7<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Val可任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (4)..(4)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<220><221> MOD_RES<222> (7)..(7)<223> Pro被任選地酰胺化<400> 4Val Asp Pro Xaa Leu Glu Pro1 5<210> 5<211> 10<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Lys任選地被低級烷基或烷酰基修飾<220><221> MOD_RES<222> (2)..(2)<223> Xaa可以是Gly或Ala<220><221> MOD_RES<222> (10)..(10)<223> Lys被任選地酰胺化<400> 5Lys Xaa Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5 10<210> 6<211> 7<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Arg任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> Xaa可以是Ala、Pro、Ser或Gln<220><221> MOD_RES<222> (4)..(4)<223> Xaa可以是Pro或His<220><221> MOD_RES<222> (5)..(5)<223> Xaa可以是Gln或Pro<220><221> MOD_RES<222> (6)..(6)<223> Xaa可以是Asp、Asn、Gly或Ser<220><221> MOD_RES<222> (7)..(7)<223> Ser可被任選地酰胺化<400> 6Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser1 5<210> 7<211> 12<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Ser任選地被低級烷基或烷酰基修飾<220><221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> Xaa可以是Asn或Thr<220><221> MOD_RES<222> (6)..(6)<223> Xaa可以是Ala或Val<220><221> MOD_RES<222> (12)..(12)<223> Pro被任選地酰胺化<400> 7Ser Gln Xaa His Gln Xaa Ser Leu Ser Lys Gln Pro1 5 10<210> 8<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<220><221> MOD_RES<222> (5)..(5)<223> Xaa可以是Glu或Asp<220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Xaa可以是Lys或Asn，并可被任選地酰胺化<400> 8Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa1 5<210> 9<211> 8<212> PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<220><221> MOD_RES<222> (5)..(5)<223> Xaa可以是Glu或Asp<220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Xaa可以是Lys或Asn<400> 9Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa1 5<210> 10<211> 10<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (2)..(2)<223> Xaa可以是Gly或Ala<400> 10Lys Xaa Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5 10<210> 11<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 11Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5<210> 12<211> 260<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD-RES<222> (1)..(1)<223> Glu連接于DnaK(HSP70)<400> 12Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val1 5 10 15Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg20 25 30Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro35 40 45Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly50 55 60Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro65 70 75 80Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro85 90 95Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Ser Leu Glu100 105 110Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys115 120 125Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys GlySer Glu130 135 140Pro Val Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp145 150 155 160Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu165 170 175Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp180 185 190Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser195 200 205Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Ser Gly Ser Lys Gly Leu210 215 220Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Ser Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ile Ser225 230 235 240Tyr Gly Arg Lys Ser Gly Ser Lys Gly Leu GlyI1e Ser Tyr Gly Arg245 250255Lys Ser Gly Ser260<210> 13<211> 380<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Glu連接于DnaK(HSP70)<400> 13Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val1 5 10 15Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg20 25 30Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro35 40 45Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly50 55 60Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro65 70 75 80Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro85 90 95Asn Leu Glu Pro Trp Lys Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro100 105 110Ser Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu115 120 125Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys130 135 140Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu145 150 155 160Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp165 170 175Pro Asn Leu Ala Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu180 185 190Ala Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Ala Pro Trp195 200 205Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Ala Pro Trp Asn Gly Ser210 215 220Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val225 230 235 240Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn245 250 255Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro260 265 270Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly275 280 285Ser Glu Pro Val Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro290 295 300Val Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro305 310 315 320Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu325 330 335Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn340 345 350Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu355 360 365Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser370 375 380<210> 14<211> 13<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Cys偶聯(lián)于白喉類毒素<220><221> MOD_RES<222> (13)..(13)<223> Lys連接于酰胺<400> 14Cys Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5 10<210> 15<211> 72<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 15Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Pro Gln Asp Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln65 70<210> 16<211> 12<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (3)..(3)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<220><221> MOD_RES<222> (5)..(5)<223> Xaa可以是Glu或Asp<220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Xaa可以是Lys或Asn<220><22l> MOD_RES<222> (12)..(12)<223> Ser連接于酰胺<400> 16Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa His Pro Gly Ser1 5 10<210> 17<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Lys被任選地酰胺化<400> 17Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys1 5<210> 18<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Asn被任選地酰胺化<400> 18Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn1 5<210> 19<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷酰基修飾<220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Lys被任選地酰胺化<400> 19Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys1 5<210> 20<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Lys被任選地酰胺化<400> 20Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys1 5<210> 21<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Lys被任選地酰胺化<400> 21Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys1 5<210> 22<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Asn被任選地酰胺化<400> 22Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn1 5<210> 23<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Asn被任選地酰胺化<400>23Asp Pro Asn Leu Asp Pro Trp Asn1 5<210> 24<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Asp任選地被低級烷基或烷?；揎?amp;lt;220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Asn任選地被酰胺化<400> 24Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn1 5<210> 25<211> 14<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Lys可任選地被低級烷基或烷酰基修飾<220><221> MOD_RES<222> (2)..(2)<223> Xaa可以是Gly或Ala<400> 25Lys Xaa Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Gly Ser Gly Ser1 5 10<210> 26<211> 8<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (5)..(5)<223> Xaa可以是Glu或Asp<400> 26Asp Pro Asn Leu Xaa Pro Trp Asn1 5<210> 27<211> 4<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 27Ser Gly Ser Gly1<210> 28<211> 9<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 28Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Asn1 5<210> 29<211> 9<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 29Val Asp Pro Asn Leu Asp Pro Trp Asn1 5<210> 30<211> 9<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 30Val Asp Pro Ser Leu Asp Pro Trp Asn1 5<210> 31<211> 9<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 31Val Asp Pro Asn Leu Asp Pro Trp Lys1 5<210> 32<211> 11<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 32Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Asp Pro Trp Lys1 5 10<210> 33<211> 10<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 33Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5 10<210> 34<211> 13<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (13)..(13)<223> C末端Lys被酰胺化<400> 34Cys Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5 10<210> 35<211> 12<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> 生物素連接于N末端Ser<400> 35Ser Gly Ser Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys1 5 10<210> 36<211> 4<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> 生物素連接于Ser<400> 36Ser Gly Ser Gly1<210> 37<211> 9<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (4)..(4)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<220><221> MOD_RES<222> (6)..(6)<223> Xaa可以是Glu或Asp<220><221> MOD_RES<222> (9)..(9)<223> Xaa可以是Lys或Asn，并可被任選地酰胺化<400> 37Val Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa1 5<210> 38<211> 11<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<220><221> MOD_RES<222> (1)..(1)<223> Xaa可以是Glu或Asp<220><221> MOD_RES<222> (6)..(6)<223> Xaa可以是Arg、Lys、Ser或Asn<220><221> MOD_RES<222> (8)..(8)<223> Xaa可以是Glu或Asp<220><221> MOD_RES<222> (11)..(11)<223> Xaa可以是Lys或Asn，并可被任選地酰胺化<400> 38Xaa Pro Val Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa1 5 10<210> 39<211> 4<212> PRT<213> 人免疫缺陷病毒1型<400> 39Gly Ser Gly Ser權(quán)利要求
1.一種組合物，它含有式R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]的肽或多肽的至少兩種變體，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn；X9選自Glu和AspZ12選自Lys和Asn；R1選自氫、低級烷基、低級烷?；烷L1到約5個氨基酸、任選地被低級烷基或低級烷酰基取代的序列；R2選自游離的羥基、酰胺，和長1到約5個額外的氨基酸、任選地被酰胺取代的序列；其中，在所述兩種變體的至少一種中，Y7是Arg和Z12是Lys，且在所述兩種變體至少另一種變體中，Y7是Asn，Z12是Asn。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述R1是Val，從而得到Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ ID NO37]的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述R1是X2-Pro-Val，其中，X2是Glu或Asp，從而得到X2-Pro-Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ IDNO381的序列，R1可任選地被低級烷基或低級烷?；〈?。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，R2是-His-Pro-Gly-Ser-[SEQ IDNO16]，它可任選地被酰胺取代。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少3條或3條以上的下述氨基酸序列R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO17]；和R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO18]；以及1種或1種以上的下述序列R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO19]R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO22]R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO20]R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO24]R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2[SEQ ID NO21]和R1Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2[SEQ ID NO23]。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述組合物還含有至少7種所述氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有所有8種所述序列。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肽或多肽是合成產(chǎn)生的。
9.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述肽或多肽是重組產(chǎn)生的。
10.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，一種或多種所述肽表達(dá)為偶聯(lián)于載體蛋白的合成肽。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，一種或多種所述肽表達(dá)為任選地偶聯(lián)于載體蛋白的多抗原肽。
12.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，一種或多種選擇的肽在重組產(chǎn)生的蛋白中表達(dá)，并可任選地按讀框與載體蛋白融合。
13.如權(quán)利要求10-12中任一項所述的組合物，其特征在于，所述載體蛋白選自大腸桿菌DnaK蛋白、GST蛋白、分枝桿菌熱激蛋白70、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、半乳糖激酶、遍在蛋白、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。
14.一種組合物，它含有(a)式R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]肽或多肽的至少兩種變體，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn；X9選自Glu和Asp；Z12選自Lys和Asn；R1選自氫、低級烷基、低級烷?；?，和任選地被低級烷基或低級烷?；〈拈L1個到約5個氨基酸的序列；其中，R2選自游離羥基、酰胺，和任選地被酰胺取代的長1個到約5個額外的氨基酸序列；其中，所述兩種變體中至少有一種的Y7是Arg、Z12是Lys，至少有另一種的Y7是Asn、Z12是Asn；(b)式R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4[SEQ ID NO5]的至少一種肽或多肽，其中X42選自Gly或Ala；R3選自氫、低級烷基、低級烷?；?，和任選地被低級烷基或低級烷?；〈拈L1個到約5個氨基酸的序列；R4選自游離羥基、酰胺，和任選地被酰胺取代的長1個到約5個額外的氨基酸序列，并排除堿性氨基酸Lys-Arg-Arg-。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述肽或多肽是合成產(chǎn)生的。
16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，所述肽或多肽是重組產(chǎn)生的。
17.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，一種或多種所述肽表達(dá)為偶聯(lián)于載體蛋白的合成肽。
18.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，一種或多種所述肽表達(dá)為任選地偶聯(lián)于載體蛋白的多抗原肽。
19.如權(quán)利要求14所述的組合物，其特征在于，一種或多種選擇的肽在重組產(chǎn)生的蛋白中表達(dá)，任選地按讀框與載體蛋白融合。
20.如權(quán)利要求17、18或19所述的組合物，其特征在于，所述載體蛋白選自大腸桿菌DnaK蛋白、GST蛋白、分枝桿菌熱激蛋白70、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、半乳糖激酶、遍在蛋白、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。
21.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求1所述的組合物、藥學(xué)上可接受的載體和任選的佐劑。
22.一種誘導(dǎo)抗-HIV-1 Tat抗體的方法，該方法包括使受試者暴露于權(quán)利要求1的有效量的組合物，該組合物有效地誘導(dǎo)與HIV-1的不同株或亞型的HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體。
23.一種方法，該方法用于產(chǎn)生削弱免疫無能的人中HIV-1增殖的組合物，它包括(a)用權(quán)利要求1的組合物免疫靈長類動物；(b)從所述經(jīng)免疫的哺乳動物中分離和純化出無菌形式的抗體，其中，所述抗體是所述組合物的成分。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述分離的抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體以及抗體片段。
25.一種方法，該方法測定由免疫Tat免疫原而誘導(dǎo)的抗體的存在與否和/或效價，它包括；(A)使從經(jīng)免疫的受試者獲得的生物樣品與結(jié)合于固相載體上的權(quán)利要求1的肽或多肽組合物接觸；(B)洗滌所述支持物，以從所述生物樣品中除去任何沒有結(jié)合于所述序列的物質(zhì)；(C)使所述支持物與結(jié)合有可檢測的標(biāo)記物的試劑接觸，其中，所述試劑檢測所述固相載體上的序列與所述生物樣品中抗體之間的結(jié)合，所述標(biāo)記物產(chǎn)生可檢測的信號。
26.一種抗體，它特異性地與式-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12[SEQ ID NO9]的表位結(jié)合，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn，X9選自Glu和Asp，Z12選自Lys和Asn。
27.如權(quán)利要求26所述的抗體，其特征在于，所述抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體以及抗體片段。
28.一種抗體組合物，它含有權(quán)利要求26所述的至少一種抗體。
29.一種抗體組合物，它含有特異性地與式R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]的肽或多肽的至少兩種變體結(jié)合的至少兩種不同的抗體，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn；X9選自Glu和Asp；Z12選自Lys和Asn；R1選自氫、低級烷基、低級烷?；?，和任選地被低級烷基或低級烷?；〈拈L1個到約5個氨基酸的序列；R2選自游離羥基、酰胺，和任選地被酰胺取代的長1個到約5個額外的氨基酸序列；其中，所述兩種變體中至少有一種的Y7是Arg、Z12是Lys，至少有另一種的Y7是Asn、Z12是Asn。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述組合物含有兩種以上不同的所述抗體的混合物，所述抗體結(jié)合多個HIV-1的病毒株的HIV-1 Tat蛋白表位序列。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其特征在于，所述抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體和抗體片段以及它們的混合物。
32.一種抗體，它特異性地與具有Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ ID NO10]氨基酸序列的表位結(jié)合，其中X42選自Gly和Ala，所述抗體與識別具有-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-[SEQ ID NO11]氨基酸序列的表位的抗體不同。
33.如權(quán)利要求32所述的抗體，其特征在于，所述抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體和抗體片段。
34.一種抗體組合物，它含有權(quán)利要求32所述的至少一種抗體。
35.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求26-34中任一項所述的抗體或抗體組合物，以及藥學(xué)上可接受的載體和任選的佐劑。
36.一種減少HIV-1病毒水平的方法，它包括對人給予權(quán)利要求26-34中任一項所述的抗體或抗體組合物。
37.一種合成基因，它含有順序編碼式R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]的肽或多肽的至少兩種變體的核酸序列，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn；X9選自Glu和Asp；Z12選自Lys和Asn；R1選自氫、低級烷基、低級烷?；?，和任選地被低級烷基或低級烷?；〈拈L1個到約5個氨基酸的序列；R2選自游離羥基、酰胺，和任選地被酰胺取代的長1個到約5個額外的氨基酸序列；其中，所述兩種變體中至少有一種的Y7是Arg、Z12是Lys，至少有另一種的Y7是Asn、Z12是Asn。
38.如權(quán)利要求37所述的合成基因，其特征在于，所述肽或多肽與載體蛋白融合。
39.如權(quán)利要求37所述的合成基因，其特征在于，所述編碼氨基酸系列的各核酸序列被間隔區(qū)序列分開。
40.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求37所述的合成基因、藥學(xué)上可接受的載體和任選的佐劑。
41.一種誘導(dǎo)抗-HIV-1 Tat抗體的方法，所述方法包括使受試者暴露于有效量的權(quán)利要求37所述的合成基因，該基因有效地誘導(dǎo)與HIV-1的不同株或亞型的HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體。
42.一種方法，該方法產(chǎn)生用于削弱免疫無能的人中HIV-1增殖的組合物，它包括(a)用權(quán)利要求37的合成基因免疫靈長類動物；(b)從所述經(jīng)免疫的哺乳動物中分離和純化出無菌形式的抗體，其中，所述抗體是所述組合物的成分。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述分離的抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體和抗體片段。
44.一種合成分子，它含有權(quán)利要求37所述的合成基因，該合成基因可操作性地連接調(diào)控核酸序列，該調(diào)控核酸序列指導(dǎo)和控制所述合成基因的產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
45.如權(quán)利要求44所述的分子，其特征在于，所述分子是質(zhì)粒。
46.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求44所述的合成分子、藥學(xué)上可接受的載體和任選的佐劑。
47.一種誘導(dǎo)抗-HIV-1 Tat抗體的方法，該方法包括使受試者暴露于權(quán)利要求44所述的有效量的合成分子，該分子有效地誘導(dǎo)與HIV-1的不同株或亞型的HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體。
48.一種方法，該方法產(chǎn)生用于削弱免疫無能的人中HIV-1增殖的組合物，它包括(a)用權(quán)利要求44的合成分子免疫靈長類動物；(b)從所述經(jīng)免疫的哺乳動物中分離和純化出無菌形式的抗體，其中，所述抗體是所述組合物的成分。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述分離的抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體和抗體片段。
50.一種微生物，它包括(a)第一合成基因，它包含編碼權(quán)利要求1所述的至少兩種肽或多肽的核酸序列，所述基因任選地與載體蛋白融合；或(b)合成分子，它包含(a)中的合成基因，該基因可操作性地與調(diào)控核酸序列連接，該調(diào)控核酸序列指導(dǎo)和控制所述合成基因的產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
51.如權(quán)利要求50所述的微生物，其特征在于，所述微生物選自能在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述基因的多拷貝產(chǎn)物的重組病毒，和能在宿主中表達(dá)所述基因的多拷貝產(chǎn)物的共生菌，其中所述病毒對人是非致病性的。
52.一種藥物組合物，它含有權(quán)利要求51所述的微生物、藥學(xué)上可接受的載體和任選的佐劑。
53.一種誘導(dǎo)抗-HIV-1 Tat抗體的方法，該方法包括使受試者暴露于有效量的權(quán)利要求50所述的微生物，該微生物有效地誘導(dǎo)與HIV-1的不同株或亞型的HIV-1 Tat蛋白反應(yīng)的抗體。
54.一種方法，該方法產(chǎn)生用于削弱免疫無能的人中HIV-1增殖的組合物，它包括(a)用權(quán)利要求50的微生物免疫靈長類動物；(b)從所述經(jīng)免疫的哺乳動物中分離和純化出無菌形式的抗體，其中，所述抗體是所述組合物的成分。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述分離的抗體選自分離的多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、篩選噬菌體展示產(chǎn)生的抗體和抗體片段。
56.一種哺乳動物宿主細(xì)胞，它含有編碼式R1-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2[SEQ ID NO8]的肽或多肽的至少兩種變體的核酸序列，其中Y7選自Arg、Lys、Ser和Asn；X9選自Glu和Asp；Z12選自Lys和Asn；R1選自氫、低級烷基、低級烷?；?，和任選地被低級烷基或低級烷?；〈拈L1個到約5個氨基酸的序列；R2選自游離羥基、酰胺，和任選地被酰胺取代的長1個到約5個額外的氨基酸序列；其中，所述兩種變體中至少有一種的Y7是Arg、Z12是Lys，至少有另一種的Y7是Asn、Z12是Asn。
全文摘要
本發(fā)明提供一種組合物，該組合物引起針對B進(jìn)化枝和非B進(jìn)化枝的HIV－1Tat蛋白的大多數(shù)(如95％以上)已知變體的抗體，它含有式R1－Asp－Pro－Y
文檔編號A61K48/00GK1426306SQ01808761
公開日2003年6月25日 申請日期2001年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月28日
發(fā)明者G·戈爾茨坦 申請人:西蒙有限公司