專利名稱：：抗干擾素(ifn)反應的肺炎病毒非結(jié)構蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及采用肺炎病毒NS1蛋白和/或NS2蛋白或編碼肺炎病毒NS1蛋白和/或NS2蛋白的核酸，來制造減弱干擾素(IFN)介導的免疫反應的藥物制劑。本發(fā)明進一步涉及重組肺炎病毒，特別是對宿主干擾素(IFN)介導的免疫反應的抗性增強、減弱或缺乏的呼吸道合胞病毒(RSV)，對干擾素(IFN)介導的免疫反應的抗性增加的重組病毒，以及在藥物制劑(如，疫苗)中使用這些病毒。已有技術的描述牛呼吸道合胞病毒(BRSV)是牛犢呼吸道疾病最重要的病原體，會造成重大的經(jīng)濟損失(40；45)。的牛犢中發(fā)生的免疫反應和病理類似于人呼吸道合胞病毒(HRSV)造成癥狀，而HRSV仍是造成全世界嬰幼兒嚴重毛細支氣管炎與肺炎的主要原因(9)。HRSV和BRSV以及相關病毒(小鼠肺炎病毒(PVM))的分子克隆，不僅確定了BRSV與HRSV之間的緊密關系，同時揭示出，由于它們與副粘病毒科其它成員有著本質(zhì)性的不同，導致了在副粘病毒科內(nèi)建立了肺炎病毒亞科(36；37)。在這一亞科中，RSV病毒和PVM構成了肺炎病毒屬，而鳥肺炎病毒(APV)至今仍是變肺炎病毒屬的唯一成員。對于Mononegavirales目所有的成員，約15kb的RSV和PVM的基因組RNA存在于核糖核蛋白(RNP)復合體中，作為基因順序轉(zhuǎn)錄的模板(25；49)。10個轉(zhuǎn)錄單位所表達的11種蛋白質(zhì)以3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’的順序排列(5；9；30；31)。編碼的蛋白質(zhì)包括五個RNP相關蛋白質(zhì)核蛋白(N)、磷蛋白(P)、RNA聚合酶的大催化亞基(L)以及由M2基因兩個重疊開放閱讀框中的第一個編碼的轉(zhuǎn)錄延伸因子(M2-1)(8；17；27；38)。M2轉(zhuǎn)錄單位的第二個開放閱讀框(M2-2)編碼了一種如(1)所描述的非必需蛋白質(zhì)，它可能參與調(diào)控RNA的合成(4；28)。三種病毒蛋白質(zhì)與病毒包膜相關融合蛋白F、假定的吸附蛋白G以及小型疏水性蛋白SH?；蚪M3’末端位置上存在的兩個非結(jié)構蛋白的基因，將肺炎病毒屬的成員與Mononegavirales目的其它成員區(qū)別開了。由于它們的位置接近于3’末端，各NS基因被過度轉(zhuǎn)錄。編碼的蛋白質(zhì)可在被感染的細胞中被檢知(10；16)。BRSV的NS基因分別編碼了具有136個和124個氨基酸的多肽。將來自A、B亞型HBSV的NS蛋白進行比較可知，NS1蛋白氨基酸的同源性分別為69％和68％，NS2蛋白氨基酸的同源性分別為84％和83％(5；34)。PVM的NS1和NS2蛋白與RSV的NS基因之間沒有明顯的同源性(大約20％相同)，但卻有類似的功能。然而，沒有明顯的跡象表明所產(chǎn)生的序列在病毒的生命周期中具有NS蛋白的功能。有報道說，HRSV的NS1蛋白與M蛋白相關，而NS2蛋白與RSV的結(jié)構蛋白沒有可檢測的相關性，這說明NS1與NS2有不同的功能(16；47)。最近，有試驗提出，NS1對病毒RNA的轉(zhuǎn)錄有抑制作用，試驗中讓人造的HRSV的小基因組分別在NS1存在與不存在的情況下生長。此外，在同一研究中還發(fā)現(xiàn)了NS2的抑制作用，但NS2的這種作用是很不顯著的(3)。最近建立的從cDNA中制造(“回收”)感染性的負鏈RNA病毒的方法(11)，使得重組人(8；29)和牛(5)RSV的生產(chǎn)以及在上述病毒中研究單個蛋白的功能成為可能?？纱婊畹腘S2基因缺失突變體的成功制備證實，在細胞培養(yǎng)中NS2對病毒的復制不是必需的(5；43)。mRNA的模式和相對數(shù)量以及在感染細胞中制得的全長的RNA沒有顯著的改變。然而，缺失突變體是減毒的，與原來的病毒相比，其生長速率較慢且感染性病毒效價較低。因此，盡管NS2是非必需的，它卻是一種能以目前還未知的機制實質(zhì)性地支持病毒生長的輔助因子。然而，至今為止，NS蛋白的功能仍是未知的。發(fā)明概述本發(fā)明的依據(jù)是，RSV和RSV相關病毒，尤其是肺炎病毒屬(RSV和PVM)的病毒(所有這些下文中將稱其為“RSV”)的NS1和/或NS2蛋白對IFN介導的免疫反應有拮抗作用。本發(fā)明涉及使用RSV的NS1和/或NS2蛋白或編碼RSVNS1蛋白的核酸序列或編碼RSVNS2的核酸序列，以制造用于減弱IFN(尤其是IFN-α和/或IFN-β)介導的免疫反應的藥物制劑。本發(fā)明的另一方面涉及在動物中減弱IFN介導的免疫反應的方法，包括施用RSVNS1和/或NS2蛋白或編碼RSVNS1蛋白的核酸或編碼RSVNS2蛋白的核酸。特別地，本發(fā)明涉及使用RSV的NS1和/或NS2蛋白或編碼這些蛋白質(zhì)的核酸，通過抑制IFN介導的抗病毒反應以改變IFN介導的免疫反應。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，將RSVNS1蛋白與NS2蛋白聯(lián)合使用以制造藥物制劑，或?qū)⒕幋aRSVNS1蛋白的核酸序列與編碼RSVNS2蛋白的核酸序列聯(lián)合使用以制造藥物制劑，用以減弱IFN介導的免疫反應。本發(fā)明所用的“聯(lián)合”是指同時施用或相繼施用。本發(fā)明的另一個方面，RSVNS1和/或NS2蛋白被用來在IFN介導的免疫反應中保護不相關的病毒。較好的是，RSVNS1和/或NS2蛋白是BRSVNS蛋白。NS1和NS2蛋白以協(xié)同的方式保護不相關的病毒。本發(fā)明使用的“不相關的病毒”是指不表達RSVNS1和/或NS2蛋白的病毒。在一個優(yōu)選的實施方案中，這種病毒是狂犬病病毒。較好的是，RSVNS1和/或NS2蛋白由病毒核酸表達。另一方面，本發(fā)明的藥物制劑含有RSVNS1和/或NS2蛋白或編碼RSVNS1蛋白的核酸序列和/或編碼RSVNS2的核酸序列，它可減弱IFN介導的免疫反應，并且進一步包括疫苗。較好的是，與藥物制劑一起施用這種疫苗可以降低疫苗被用藥個體排斥。本發(fā)明還涉及使用改變的RSVNS1和/或NS2蛋白，來制造可調(diào)節(jié)IFN介導的免疫反應的藥物制劑。在一個優(yōu)選的實施方案中，這種改變提高了NS1和/或NS2蛋白對IFN的調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明涉及使用帶有編碼NS1和/或NS2的修飾核酸序列的重組RSV來制造疫苗，其中，修飾減弱或消除了病毒逃避IFN介導的免疫反應的能力。在優(yōu)選的實施方案中，編碼NS1和/或NS2的修飾核酸序列與所述的重組RSV是同源或異源的。更好的是，其中使用的重組RSV來自人、牛RSV或來自PVM。此外，本發(fā)明包括有可改變宿主范圍的RSV類，其中編碼RSVNS1和/或NS2的核酸序列被編碼能感染所需宿主的不同RSV的NS1和/或NS2的核酸序列所替代，還包括產(chǎn)生這些有著可改變宿主細胞取向的RSV類的方法。發(fā)明詳述為更詳細地研究RSV蛋白質(zhì)的功能，產(chǎn)生了缺少NS1基因或NS1和NS2基因都缺少的BRSV的缺失突變體，并在不同的細胞系中研究了它們的表現(xiàn)。在MDBK細胞(對wtBRSV感染非常敏感，且wtBRSV的效價高于所有其它的被測細胞系)被感染后觀察到了第一種現(xiàn)象，即NS缺失突變體對宿主細胞因子的敏感性有所提高。然而，缺少一種或兩種NS基因的病毒在MDBK細胞中生長得很差，而在其它細胞系(如Vero或BSR)中，NS基因的缺乏卻僅僅使感染效價降低了10倍。共培養(yǎng)試驗證實，作為決定性宿主細胞因子的I型干擾素是由BRSV感染的MDBK細胞產(chǎn)生的。顯然，在被感染的MDBK培養(yǎng)物中，通過自分泌和旁分泌細胞的刺激可誘導抗病毒狀態(tài)。盡管wtBRSV能夠抵消這種反應，但NS缺失突變體都沒有這種功能。另一方面，Vero細胞缺少I型干擾素基因(15；46)，這樣病毒感染就不會誘導抗病毒狀態(tài)且使NS缺失突變體能夠生長。盡管Vero細胞不能產(chǎn)生干擾素，但它們可以通過IFN-α受體(IRNAR)復合體以JAK/STAT介導信號的方式對外源干擾素的刺激產(chǎn)生反應。感染的MDBK分泌的牛干擾素在Vero“反應者”細胞中誘導抗病毒反應，使NS缺失突變體的生長受到抑制，而對wtBRSV卻不然。將Vero細胞和與IFNAR結(jié)合可封閉IFN的抗體一起溫育可以防止MDBK上清液引起的抗病毒反應。因此，在抗病毒反應的誘導過程中MDBK細胞上清液中唯一的活性組分是IFN-α和/或IFN-β。在用MDBK細胞上清液處理的Vero細胞中，對NS缺失突變體的抑制效果很弱(使雙缺失突變體最多減少7倍)，這與MDBK細胞中對NS缺失突變體的嚴格抑制是沒有可比性的。這可能由許多因素造成。大概用牛源的異源IFN刺激來自靈長類動物的Vero細胞不及用MDBK刺激有效。與人類中的情況類似，不同類型的牛IFN-α(2-8型)和IFN-β(1-3型)已經(jīng)被確定，它們有不同的生物學活性(7)。另外，Vero細胞的抗病毒機制也不及MDBK有效?；罨那冶桓腥镜木奘杉毎?已知較其它細胞能夠分泌較大量的I型干擾素)的上清液使Vero“接受者”細胞中NS缺失突變體的減少提高至50倍。用重組人IFN-αA/D或IFN-β刺激Vero細胞，NS缺失突變體的復制可以劑量依賴的方式被抑制，其中，500單位幾乎可以完全抑制復制活性。因此，通過本發(fā)明，可以證明RSV蛋白是IFN介導的宿主細胞反應的拮抗劑。另外，采用其它的負鏈RNA病毒(狂犬病病毒)作為表達RBSV產(chǎn)生的NS基因的載體，兩種NS蛋白NS1和NS2的活性顯示出可以提高IFN對不相關病毒的抗性。另一個發(fā)現(xiàn)是，NS1和NS2蛋白可以來自不同的RSV。總之，RSVNS蛋白一個重要的生物學功能是，它們參與保護病毒抵抗細胞的干擾素介導的抗病毒機制(IFN拮抗效應)。另外，出人意料的發(fā)現(xiàn)是，將兩種NS蛋白聯(lián)合使用，所述IFN拮抗效應會成倍增加。這是在抵抗干擾素方面兩種病毒蛋白協(xié)同作用的第一個例子。病毒蛋白質(zhì)在其天然宿主細胞中克服固有免疫反應的適應過程被認為是確定病毒宿主范圍的一個很重要的因素，且可以防止病毒通過物種屏障(13；23；26)。例如，猿病毒5的V蛋白(SV5)在靈長類細胞中能夠抑制干擾素效應基因的活性，但在鼠類細胞中卻沒有此功能(14)。這可能是防止小鼠甚至SCID小鼠產(chǎn)生SV5感染的相關機制(13)。最近，HRSV(BRSV的人的等價者)被報道可在人類細胞中抵抗IFN誘導的抗病毒活性(2)，并且，根據(jù)我們的結(jié)果，我們認為HRSVNS蛋白在人類細胞中是拮抗IFN反應最理想的蛋白質(zhì)，且優(yōu)于在不同來源細胞中所得到的結(jié)果。實際上，NS蛋白使宿主對RSV感染的易感性所起的作用可以解釋為什么這些緊密相關的病毒對宿主范圍有嚴格的限制。BRSV和HRSV可以進入人、牛以及鼠細胞；NS蛋白抵抗宿主特異性防御機制能力的不同確定了病毒是否會被排斥。這也被早期的發(fā)現(xiàn)所支持。盡管HRSV在初生小鼠胚胎(ME)細胞中的生長明顯受到限制，在向培養(yǎng)基中添加抗鼠IFN血清后產(chǎn)生的病毒會增加，且感染可擴展到整個單細胞層(26)。另外，與BRSV相比，重組BRSV(其表面蛋白G和F被HRSV的表面蛋白替代，以使它們?nèi)菀走M入靈長類細胞)在黑猩猩中的復制只有些許提高。然而，感染仍然十分有限，且不足以產(chǎn)生保護作用以抵抗同源HRSV的試驗感染(6)。從我們的觀察中，我們認為，BRSVNS蛋白在抵抗靈長類防御機制方面的低有效性是決定宿主范圍的主要因素。因此，我們的結(jié)論對于有關有效減毒的RSV活疫苗的設計有重要意義。缺少NS1或NS2基因或兩種基因同時缺少，將使過度減毒的病毒無法逃避任何干擾素反應。另外，可以設計含有能夠逃避牛和人固有防御機制的中間體的疫苗(這是由于就在不同的RSV(例如，BRSV和HRSV)之間相互交換NS蛋白)，特別是產(chǎn)生BRSV和HRSV疫苗。此外，可以在僅能部分消除IFN抑制活性的NS蛋白中引入突變體。另外，依照本發(fā)明，RSVNS1和/或NS2蛋白或編碼NS1和/或NS2蛋白的核酸序列也可用來制造藥物制劑，以減弱IFN介導的免疫反應。在一個優(yōu)選的實施方案中，RSVNS1與NS2蛋白聯(lián)合使用以制造藥物制劑。藥物制劑包括可在動物或人體中改變IFN介導的免疫反應的有效量的NS1和/或NS2，以及藥學上可接受的載體或稀釋劑。可以用常規(guī)的技術制造藥物制劑。例如，本發(fā)明的藥物制劑可以通過將所需量的RSVNS1和/或NS2蛋白或編碼RSVNS1蛋白的核酸序列或編碼RSVNS2的核酸序列與滅菌的等滲溶液(用合適的緩沖液將其pH值調(diào)至6.0左右)相混合而制造。本發(fā)明的藥物制劑可以包括常規(guī)的組分，比如藥學上可接受的載體或稀釋劑(例如，鹽水、pH調(diào)節(jié)劑、緩沖液、防腐劑等)。這些組分可由精通本技術的技術人員來選擇。本發(fā)明的“IFN”這一術語優(yōu)先是指I型干擾素，即IFN-α和IFN-β。這里，“IFN介導的免疫反應”這一術語是指由干擾素(尤其是IFN-α和IFN-β)的活性誘導的免疫作用和/或抗病毒作用，這種作用是作為(例如)對病毒感染的反應(如增加MHC糖蛋白的表達)、抗病毒機制激活的反應(如破壞被病毒感染的細胞)、或是病毒的復制被抑制的反應?！癐FN介導的免疫反應的減弱”意味著免疫作用和/或抗病毒作用被減弱，這種作用是由干擾素(尤其是IFN-α和IFN-β)的活性誘導的，例如作為對病毒感染的反應(如增加MHC糖蛋白的表達)、抗病毒機制激活的反應(如破壞被病毒感染的細胞)、或是病毒的復制被抑制的反應。本發(fā)明的“IFN拮抗活性”意味著免疫作用和/或抗病毒作用被減弱或消除，這種作用是由干擾素(尤其是IFN-α和IFN-β)的活性誘導的，例如，作為對病毒感染的反應(如增加MHC糖蛋白的表達)、抗病毒機制激活的反應(如破壞被病毒感染的細胞)、或是病毒的復制被抑制的反應。本發(fā)明的“修飾的”或“改變的”術語涉及用作參照的野生型。這里使用的“核酸序列”是指核苷酸堿基的各種連續(xù)序列，并且可以包括核糖核酸或脫氧核糖核酸。較好的是，核酸序列是cDNA?！芭cRSV同源或異源的編碼NS1和/或NS2的核酸序列”是指編碼NS1和/或NS2的核酸序列來自于相同或不同種類的RSV，或來自于肺炎病毒屬的其它病毒，例如PVM。對RSVNS1和/或NS2蛋白順序的修飾包括一個或多個氨基酸的取代、缺失和插入。較好的是，修飾對蛋白質(zhì)在減弱IFN介導的免疫反應或拮抗IFN方面的生物學活性沒有影響。本發(fā)明的各種氨基酸插入變體包括，氨基和/或羧基末端融合以及內(nèi)部序列有一個或多個氨基酸插入。氨基酸插入變體是那些在蛋白質(zhì)內(nèi)的特殊位點引入一個或多個氨基酸的變體；然而結(jié)合對所得產(chǎn)物進行的合適的篩選也可能隨機插入。缺失變體是以序列中有一個或多個氨基酸的缺失為特征的。取代的氨基酸變體是那些從序列中至少移去一個殘基，并在原來的位置上用另一殘基替代的蛋白質(zhì)。較好的是，未修飾的NS1或NS2蛋白的序列與野生型至少有40％的同源性，更好是至少50％，再好是至少80％或至少90％，最好是95％。優(yōu)選的修飾發(fā)生在物種間非保守的位置上。較好的，這種類型的修飾包括用另一種有類似尺寸和極性的氨基酸取代一種氨基酸。可能發(fā)生的取代類型可以首先被用來分析不同生物的同源蛋白質(zhì)之間氨基酸取代的頻率?；谶@些分析，保守性取代被定義為在下列基團中發(fā)生的取代1.小型脂肪族的非極性或弱極性氨基酸Ala，Ser，Thr(Pro，Gly)2.帶有負電荷的氨基酸及其酰胺類Asn，Asp，Glu，Gln3.帶有正電荷的氨基酸His，Arg，Lys4.大型脂肪族的極性氨基酸Met，Leu，Ile，Val(Cys)5.大型芳香族氨基酸Phe，Tyr，Trp。有三種氨基酸被寫在括號中，這是因為它們在蛋白質(zhì)結(jié)構中有特殊的作用。Gly是唯一沒有側(cè)鏈的氨基酸，因此可賦予肽鏈柔性。Pro有特殊的幾何形狀，可強烈限制鏈的柔性。Cys可以參與二硫鍵。另外，以上詳述的修飾可以被引入RSVNS1或RSVNS2的蛋白質(zhì)序列中，這將使蛋白質(zhì)減弱IFN介導的免疫反應或拮抗IFN的生物學活性增強或降低。附圖簡述圖1.(A)重組BRSV基因組的示意圖。顯示了與病毒基因組(vRNA)(黑色帶)相關的轉(zhuǎn)錄物(灰色帶)和蛋白質(zhì)編碼區(qū)域(白色帶)的位置。放大的部分比較了全長病毒和NS缺失突變體的結(jié)構。前導RNA以水平線標出；還指出了各個核苷酸的相對位置以及用于克隆的限制位點。(B)重組狂犬病病毒(RV)的結(jié)構，帶有遺傳標記的位于RVG和L基因之間的BRSVNS1或BRSVNS2ORF(開放性閱讀框)。圖2.重組BRSV中NS1和NS2轉(zhuǎn)錄物的缺失。被所述病毒感染的BSR細胞的全長RNA在感染后2-4天被分離，并用Northern雜交法進行分析(使用的探針包括NS1、NS2、NS1對NS2以及N基因)。標出了NS1、NS2以及NmRNA的位置。圖3.與在BSR細胞中相比，MDBK細胞中NS缺失突變體的毒性更弱。融合的BSRT7-5(A)和MDBK(B)單細胞層以0.01的MOI(感染復數(shù))被BRSV(黑色圓圈)、BRSVΔNS1(白色方塊)、BRSVΔNS2(黑色三角)或BRSVΔNS1/2(白色圓圈)感染。如實施例部分所描述的那樣，每兩天測定一次感染性病毒效價。從第六天開始，BSR細胞中所有突變體的復制以及MDBK細胞中wtBRSV的復制導致大量的細胞死亡。這些數(shù)值是從兩組獨立的實驗中獲得的，每組實驗進行三次。豎線顯示了標準差。圖4.被病毒感染的VDBK細胞或感染的巨噬細胞的上清液抑制BRSVNS缺失突變體在共培養(yǎng)的Vero細胞中生長。(A)是共培養(yǎng)實驗基本原理的示意圖。MDBK細胞或被LPS刺激的牛巨噬細胞被BRSV感染，接種在Nunc″AnoporeMembrane″細胞培養(yǎng)插入物中，并和被wtBRSV、BRSVΔNS1、BRSVΔNS2、BRSVΔNS1/2感染的Vero“反應者”細胞一起培養(yǎng)。三天后，取出插入物并測定Vero細胞的感染性病毒效價。(B)中的結(jié)果顯示了包括標準差的抑制百分比，以及與對照(用未感染的MDBK或未感染、未被刺激的巨噬細胞獲得)相比的減少倍數(shù)(平均值)。數(shù)值取自6次(MDBK)和4次(巨噬細胞)共培養(yǎng)實驗。圖5.干擾素α受體(IFNA-R2)的單克隆抗體(#2)中和了MDBK或巨噬細胞產(chǎn)生的抑制因子的作用。以0.1的MOI被rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2、rBRSVΔNS1/2或wtrBRSV感染的Vero“反應者”細胞，分別和5μg/ml抗IFNAR2(#2)、MHCI(#3)、TNF-R1(#4)的單克隆抗體或在無抗體(#1)的情況下一起培養(yǎng)三小時。在存在1μg/ml各自抗體的情況下再與被感染的MDBK細胞共培養(yǎng)(實驗原理參見圖4)。在六次(#1和#2)或兩次實驗(#3和#4)中測定效價。豎線顯示了標準差。圖6.所有的BRSVNS缺失突變體都是I型IFN敏感的。將以0.1的MOI被BRSV(黑色圓圈)、BRSVΔNS1(白色方塊)、BRSVΔNS2(三角)或BRSVΔNS1/2(白色圓圈)感染的Vero細胞與所需量的重組IFN-αA/D(A)或IFN-β(B)一起培養(yǎng)。感染4天后測定感染性病毒效價。圖7.牛細胞中BRSV的IFN抗性比在靈長類動物細胞中更加顯著。使MDBK(實心柱)或Vero細胞(空心柱)以1的MOI被rBRSV感染，并用所需量的重組IFN-αA/D處理。感染3天后測定感染性病毒效價。圖8.被表達RV類的NS1和NS2感染的細胞中狂犬病病毒(RV)增強的IFN抗性。Vero(A)或MDBK細胞(B)被RVSADVB、SADVB-NS1或SADVB-NS2感染，或被SADVB-NS1和SADVB-NS2共感染。感染后立即用所需量的IFN-αA/D處理培養(yǎng)物。感染2天后測定感染性病毒效價。結(jié)果是至少四次獨立實驗的平均值和誤差，豎線顯示了標準差。圖9.1×105Hep2細胞的副份樣品，每一個樣品都在0.5mlDMEMw/oFCS中用不同的HRBS分離物感染1小時(MOI＝0.1)，隨后每個樣品都接受了0.5ml+5％FCS。然后將感染的細胞接種到4cm2的組織培養(yǎng)平板上。1、2、3和4天后從每個病毒分離物中除去當前值，通過冷凍/解凍病毒被釋放，并可以通過滴定來測定取決于感染階段的不同臨床分離物的效價。用抗RSV-F的抗體將感染的細胞染色后，通過計數(shù)可以確定pfu/ml。圖10.1×105Hep2細胞的副份樣品，每一個樣品都在0.5mlDMEMw/oFCS中用不同的HRBS分離物感染1小時(MOI＝0.1)，然后將感染的細胞接種到4cm2的組織培養(yǎng)平板上。將0、150、500、10,000U/ml的重組I型IFNA/D懸浮在另一0.5mlDMEM+5％FCS中，并在30分鐘后加入。溫育72小時后，通過冷凍/解凍處理釋放病毒，并根據(jù)感染階段通過滴定來測定不同臨床分離物的效價。用抗RSV-F的抗體將感染的細胞染色后，通過計數(shù)確定pfu/ml。圖11.重組狂犬病病毒(RV)在RVG和L基因之間的結(jié)構，帶有HRSVNS1或HRSVNS2或遺傳標記的BRSVNS1、BRSVNS2、PVMNS1或PVMNS2的各種ORF。圖12.被表達NS1和NS2的RV類感染的狂犬病病毒(RV)的增強的IFN抗性。MDBK細胞被RVSADVB、SADVB-hNS1或SADVB-hNS2感染，或與SADVB-hNS1和SADVB-hNS2共培養(yǎng)，或與SADVB-bNS1和SADVB-bNS2共培養(yǎng)。感染后立即用所需量的IFN-αA/D處理培養(yǎng)物。感染2天后測定感染性病毒效價。結(jié)果表示至少四次獨立實驗的平均值和誤差，豎線顯示了標準差。圖13.被表達NS1和NS2的RV類感染的狂犬病病毒(RV)的增強的IFN抗性。MDBK細胞被RVSADVB、SADVB-mNS1或SADVB-mNS2感染，或與SADVB-mNS1和SADVB-mNS2共培養(yǎng)，或與SADVB-bNS1和SADVB-bNS2共培養(yǎng)。感染后立即用所需量的IFN-αA/D處理培養(yǎng)物。感染2天后測定感染性病毒效價。結(jié)果表示至少四次獨立實驗的平均值和誤差，豎線顯示了標準差。圖14.含有異源NS基因的嵌合BRSV的結(jié)構。圖15.PVM/BRSV嵌合體在Vero細胞中是輕微減毒的。Vero細胞以0.1的MOI被BRSV(黑色圓圈)、BRSVhNS1bNS2(深灰色方塊)、BRSVhNS1hNS2(淺灰色方塊)、BRSVmNS1bNS2(深灰色三角)和BRSVmNS1mNS2(淺灰色三角)感染。連續(xù)四天測量感染性病毒效價。數(shù)值取自至少兩次獨立的實驗。圖16.BRSVhNS1hNS2在MDBK細胞上的生長減弱。MDBK細胞以0.1的MOI被BRSVwt(黑色圓圈)和BRSVhNS1hNS2(淺灰色方塊)感染。連續(xù)四天測量感染性病毒效價。數(shù)值取自至少兩次獨立的實驗的平均值。圖17.MDBK細胞中BRSVhNS1hNS2對I型IFN敏感。Vero(A)和MDBK(B)細胞以0.1的MOI被BRSVwt(黑色圓圈)和BRSVhNS1hNS2(淺灰色方塊)感染，隨后與所需量的重組IFN-αA/D溫育。感染3天后測定感染性病毒效價。數(shù)值取自至少兩次獨立的實驗。圖18.HRSV(hNS1；hNS2)、BRSV(bNS1；bNS2)和PVM(mNS1；mNS2)的NS1(圖18A)和NS2蛋白(圖18B)氨基酸序列的比較；GenBank編號為U35030(HRSV，Long品系)、AF092942(BRSV，ATue51908品系)和D10331(PVM)。以下的實施例是為了闡明本發(fā)明不同的實施方案，無論如何不能理解為是對本發(fā)明的限制。實施例實施例1缺少NS基因的BRSV缺失突變體的構建與補救重組BRSV(rBRSV)來自于BRSVA51908品系(美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)(33)，ATue51908變體(GenBank序列號為AF092942))，并按前述方法在MDBK細胞中培養(yǎng)(5)?？寺∪L的A51908品系BRSV(GenBank序列號為AF092942)的cDNA并構建質(zhì)粒(使T7RNA聚合酶能夠參與BRSV全長反基因組RNA或沒有NS2基因的反基因組RNA(pBRSVΔNS2)的轉(zhuǎn)錄)，這在別處已經(jīng)描述過了(5)?；趐BRSV還可以產(chǎn)生缺少NS1基因(pBRSVΔNS1)或是缺少NS1和NS2兩種基因(pBRSVΔNS1/2)的結(jié)構。通過用NotI和AseI酶切、用Klenow聚合酶補平隨后再重新連接可以從pBRSV中除去NS1基因。用這種方法可以獲得pBRSVΔNS1。為產(chǎn)生雙缺失突變體pBRSVΔNS1/2，將含有部分N基因的0.6kb的PCR片段進行擴增。為達到這個目的，使用引物NNot(+)(5’-TAGGCGGCCGCAAAAATGGCTCTTAGCAAGGTG-3’)(在N起始密碼子上游含有一個NotI限制性酶切位點(劃線部分))以及反向引物Nstu(-)(5’-TCCTTTGTATCGTTTCATTTC-3’)(與唯一的StuI限制性酶切位點(rBRSV第1671位)下游的rBRSV上第1735-1715個核苷酸相對應)。通過用NotI(rBRSV第72位)和StuI(rBRSV第1671位)消化，從pBRSV中除去NS1和NS2基因以及部分N基因后，用StuI限制性的PCR片段替代缺失的序列(圖1)。與重組wt病毒rBRSV的序列相比，NS1、NS2和NS1/NS2缺失突變體分別缺少496、509和1060個核苷酸。在所有結(jié)構中，3’末端基因的轉(zhuǎn)錄是由最初的前導序列/NS1轉(zhuǎn)錄起始信號誘導的(圖1)。各種重組病毒rBRSV、rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2和rBRSVΔNS1/2可以在BSRT7/5細胞中(5)從各自的cDNA中獲得，用各個病毒的cDNA(10μg)轉(zhuǎn)染(CaPO4方案；哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒，Stratagene)T7啟動子控制的質(zhì)粒后，這種細胞可以表達T7RNA聚合酶。編碼BRSV的N和P蛋白(pTITB-N和pTITB-P，每個質(zhì)粒4μg)、以及L和M2蛋白(pTITB-L和pTITB-M2，每個質(zhì)粒2μg)的質(zhì)粒與各個病毒的cDNA一起被共轉(zhuǎn)染進約106個穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶噬菌體的BSRT7/5細胞(5)。4小時后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)并加入含有5％FCS的BHK-21介質(zhì)(Gibco)。每5天以1∶3的比例稀釋被BRSVcDNA轉(zhuǎn)染的細胞，直至可以觀察到細胞病變效應。在所有情況中(包括NS1/2雙缺失突變體)，編碼BRSVN、P、L和M2蛋白的載體質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染將導致合胞體的形成。以1∶3的比例稀釋轉(zhuǎn)染的細胞且有明顯的細胞病變效應出現(xiàn)后，就可以收獲病毒。為制造病毒母液，在無血清的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中有80％的融合的MDBK和Vero細胞以0.1的感染復數(shù)(MOI)被感染。吸附一小時后除去接種物，并在含有5％CO2的空氣中將細胞置于添加有2.5％FCS的DMEM中以37℃溫育，直至可以觀察到明顯的細胞病變效應(CPE)。通過冷凍隨后再解凍使病毒釋放。通過在微量滴定板上連續(xù)稀釋再計算轉(zhuǎn)染灶的數(shù)量可以確定在Vero細胞上的病毒效價。為了這個目的，可以用抗F融合蛋白的抗體(來自于J.A.Melero，馬德里)間接染色的方法將轉(zhuǎn)染灶染色。NS缺失突變體病毒母液的制造是在以0.1的MOI被感染的Vero細胞上進行的。以0.1的MOI感染Vero細胞后，若是rBRSV需要3天，若是NS缺失突變體則需要5天，才可以觀察到明顯的CPE。實施例2NS缺失突變體的生長先在來自BHK細胞的BSRT7/5細胞系(用來補救病毒)中分析病毒的生長特性。與親本的全長病毒相比，所有三種突變體都是減毒的，這證明為病毒復制貢獻了兩種NS蛋白。有趣的是，至于病毒在被感染細胞中的分配以及單缺失與雙缺失突變體最終的效價，卻沒有觀察到明顯的不同。以0.1的MOI感染BSRT7/5細胞并溫育6天之后，獲得的所有突變體的感染效價為2×105pfu。而親本病毒可達1×106pfu(圖3A)。通過感染Hep2或Vero細胞(后者是培養(yǎng)HRSV優(yōu)選的細胞系)也可以獲得類似的效價略有提高的結(jié)果。隨后采用牛源的細胞系MDBK，這種細胞系能優(yōu)先支持wtBRSV的生長(5)。實際上，感染6天后就可以使BRSV的效價略有提高(2×106pfu)(圖3B)。然而奇怪的是，缺失突變體在這種細胞系中的生長受到了強烈的影響。6天后，所得單缺失突變體ΔNS1和ΔNS2的效價僅為3×103pfu，這比BSR細胞中低了100倍。在感染最初6天內(nèi)，無法檢測雙缺失突變體ΔNS1/2的增殖。在細胞未被稀釋之前再溫育8天才可獲得2×102的病毒效價。盡管MDBK細胞是wtBRSV最為理想的宿主，它們顯然不能容許所有NS缺失突變體的生長，而作為wtBRSV第二理想宿主的BSR和Vero細胞對NS缺失突變體的生長卻有相對較好的支持。實施例3缺少NS基因的BRSV缺失突變體RNA的Northern雜交為進行Northern雜交，從被rBRSV或NS缺失突變體感染的細胞中分離RNA。Vero細胞以0.1的MOI被重組病毒rBRSV、rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2和rBRSVΔNS1/2感染，在觀察到明顯的CPE后(rBRSV需要3天，NS缺失突變體需要5天)分離全部的RNA。通過變性凝膠電泳將RNA分離，轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Duralon-UV，Stratagene)，并用紫外照射的方法使RNA結(jié)合在膜上。通過缺口平移(缺口平移試劑盒，Amersham)用(α-32P)dCTP(3，000Ci/mmol，Amersham)標記約有500個核苷酸長度的NS1、NS2和N基因特異性的DNA探針。將雜交濾膜暴露于使用加強屏的KodakBiomaxMS膠片，或用磷成像的方法檢測(Storm，MolecularDynamics)。對于所有的病毒都觀察到了類似的轉(zhuǎn)錄物模式，其中，病毒僅在是否存在對NS1和NS2特異的RNA方面有所不同(圖2)。由于在BRSV和HRSVNS2缺失突變體中已經(jīng)觀察到這種現(xiàn)象(5；43)，不論使用何種重組體，在所有被感染的細胞中都出現(xiàn)了類似量的NmRNA和基因組RNA。因此，NS蛋白通常主要是影響RNA的合成，而不是影響RNA復制或轉(zhuǎn)錄中的各個步驟。實施例4MDBK細胞和牛巨噬細胞產(chǎn)生的可溶性因子對NS缺失突變體生長的影響為鑒別對NS缺失突變體在MDBK細胞中的生長有明顯的選擇性抑制作用的細胞因子，首先檢測了MDBK細胞產(chǎn)生的可溶性分子是否能夠限制NS缺失突變體的生長。為了這個目的，將MDBK細胞與Vero細胞在一種裝置中共培養(yǎng)，這種裝置可通過一種不容許病毒透過但可以讓可溶性因子透過的膜將兩種細胞培養(yǎng)物分離開(圖4A)。上層平皿中的MDBK細胞是作為效應細胞，而下層平皿中的Vero細胞是作為反應者細胞。懸浮液中的Vero反應者細胞在沒有FCS的DMEM中被rBRSVΔNS1、rBRSVΔNS2或rBRSVΔNS1/2以0.1的MOI模擬感染或感染，時間是一小時。洗滌后，將5×105個細胞(每份都在含有2.5％FCS的DMEM中)接種到6孔平皿中。被10μg/mlLPS(Sigma)刺激過夜的MDBK效應細胞或牛巨噬細胞在懸浮液中被rBRSV以1的MOI感染1小時。洗滌后，1×106個細胞被接種在裝有200nmAnopore膜(Nunc)的25mm的細胞培養(yǎng)插入物中，并將其放在含有被感染的Vero“反應者”細胞的平皿中。共培養(yǎng)三天后，除去膜插入物，并用實施例1中所描述的方法測定Vero細胞的病毒效價。至少進行5次獨立的共培養(yǎng)實驗。用未被感染的MDBK效應細胞或BSR細胞作為陰性對照，實驗表明wtBRSV或NS缺失突變體在Vero反應者細胞中的生長沒有受到抑制。與BRSV感染的MDBK細胞(MOI＝1)共培養(yǎng)會對NS缺失突變體產(chǎn)生弱的但可再現(xiàn)的抑制，但對wtBRSV細胞的生長卻沒有影響(圖4B)。用NS1/2雙缺失突變體觀察到了最顯著的影響。在這種情況下，與未被感染的MDBK細胞相比，使用被感染的MDBK細胞可使效價降低約7倍。這種情況下，單缺失突變體rBRSVΔNS1和rBRSVΔNS2的效價分別降低了2倍和4倍。由于未被感染的MDBK細胞的上清液無法影響缺失突變體在Vero反應者細胞中的生長，這說明有效的MDBK因子是由病毒感染誘導的。不僅是用wtBRSV感染，而且用包括rBRSVΔNS1/2在內(nèi)的各種BRSV缺失突變體以及缺失SH基因和G基因(rBRSVΔSH/G；未公布)的突變體感染都可以誘導有效因子的分泌。此外，可以證明，用不同的RNA病毒(即狂犬病病毒)感染同樣會導致MDBK細胞中各種有效因子的誘導。這些結(jié)果都有力地說明，Vero反應者細胞中抗病毒狀態(tài)的誘導是由細胞因子(尤其是干擾素)介導的。為更詳細的研究有關的細胞因子，采用牛巨噬細胞作為效應細胞。牛巨噬細胞是從母牛和小牛的血液中分離的，方法是用Ficoll梯度離心法(Lymphoflot，Biotest，Dreieich)以1,500rpm離心，使單核細胞組分吸附在細胞培養(yǎng)燒瓶的底部。溫育過夜后，用不含F(xiàn)CS的RPMI(Gibco)沖洗三次以除去未吸附的細胞。將保留的吸附細胞(90-95％CD14陽性)在含有10％FCS的RPMI中于37℃及5％CO2下溫育。分離的牛巨噬細胞被LPS刺激過夜，并與上述Vero細胞共培養(yǎng)。在與被刺激的、病毒感染的巨噬細胞或未被刺激的巨噬細胞共培養(yǎng)后，所得全長rBRSV的量仍未改變。然而，與未被被刺激且未被病毒感染的巨噬細胞對照不同的是，可觀察到NS缺失突變體減少了30-50倍(圖4B)。僅僅用LPS刺激巨噬細胞而不用病毒感染也足以使rBRSVΔNS1/2減少約10倍。由于已知被刺激的巨噬細胞可以產(chǎn)生I型干擾素，這些實驗證實IFN-α和/或IFN-β可抑制BRSVNS缺失突變體的生長。實施例5NS基因的缺失使BRSV對I型干擾素敏感以FACS分析的方法可以證明，共培養(yǎng)實驗(參見實施例4)中，作為反應者細胞的Vero細胞可表達I型干擾素受體的α亞基(IFNAR2)(44)。為研究由被感染的MDBK細胞或巨噬細胞產(chǎn)生的IFN-α和/或IFN-β是否會介導NS缺失突變體的抑制作用，用rBRSVΔNS1/2、rBRSVΔNS2或rBRSVΔNS1/2感染Vero反應者細胞，隨后再用可封閉IFNAR2(PBL實驗室)的單克隆抗體處理。感染后立即處理反應者細胞，方法是將細胞與5μg/ml可中和小鼠抗人IFN-α/β受體鏈2(CD118)的抗體(PBL生物醫(yī)學實驗室)，或和5μg/ml可識別TNFRI或MHC-I類分子的對照抗體一起溫育。將細胞稀釋到六孔平皿后，細胞以1μg/ml含有各自的抗體，并與被感染的MDBK效應細胞溫育三天。當在含有對照抗體或沒有抗體的細胞培養(yǎng)物中觀察到NS缺失突變體的抑制作用時，在經(jīng)IFNAR2抗體處理的細胞中抑制作用就幾乎完全停止了(圖5)。由于這個結(jié)果，Vero反應者細胞的抗病毒狀態(tài)的誘導可專一地歸因于MDBK細胞或巨噬細胞產(chǎn)生的各種I型干擾素。然后用重組人I型干擾素直接分析wtBRSV和BRSV突變體在IFN刺激的細胞中的作用。為研究I型干擾素對BRSV和NS缺失突變體復制的影響，如上所述，Vero細胞或MDBK細胞被不同的病毒以0.1的MOI被感染并接種在含有2.5％FCS的DMEM的六孔平皿中。接種后，直接加入重組的通用I型干擾素(人干擾素-αA/D)或人干擾素-β(PBL生物醫(yī)學實驗室)直至濃度達到15,000U/ml。溫育三天后，用連續(xù)稀釋和將被感染的細胞間接染色(用抗F融合蛋白的抗體)的方法測定病毒效價。所有的三種NS缺失突變體對IFN誘導的細胞反應都有非常類似的以及劑量依賴的易感性，其中，1,500U可導致感染效價降低約10,000倍(圖6)。另一方面，wtBRSV對IFN處理有相對的抗性。然而，保護作用是不完全的，1,500U的IFN-α或IFN-β造成了約13倍的降低。為確定wtBRSV在牛細胞中的保護作用較在靈長類Vero細胞系中要顯著得多的可能性，我們在平行實驗中以1的MOI感染MDBK細胞和Vero細胞，并加入同樣量的IFN。在未處理的MDBK細胞和Vero細胞中，BRSV可生長至同樣的效價(分別為1.7×107pfu/ml和4×106pfu/ml)(圖7)。用IFN處理后，Vero細胞中的效價比MDBK細胞降低得快。加入10,000UIFN后，Vero細胞中的感染效價比MDBK細胞低了555倍，盡管后者已出現(xiàn)相當多的細胞損傷。NS缺失突變體強烈的抑制作用證明，MDBK細胞的抗病毒反應與Vero細胞的反應至少有同等強度。因此，MDBK細胞中wtBRSV保護作用的提高說明，BRSV賦予牛細胞的抗病毒反應要比賦予靈長類細胞的更加有效。實施例6BRSVNS1和NS2一起提高了狂犬病病毒對IFN介導的抗病毒反應的抗性BRSV各個NS基因的缺失可導致對IFN介導的細胞反應有大約相同程度的敏感性。這說明這兩種NS蛋白對于抵抗抗病毒機制都是需要的。為確定NS1和NS2的強制性的協(xié)作功能，以及查明為這兩種NS蛋白是否都可用來保護不相關的病毒，我們建立了可表達NS1(SADVB-NS1)或NS2(SADVB-NS2)的重組狂犬病病毒。含有NS1或NS2基因(圖1)的重組RV是基于全長的RVcDNA(SADL16)構建的，它在G基因(SADVB)的3’非編碼序列中含有額外的轉(zhuǎn)錄終止和再啟動序列(32)。額外的基因在減毒的狂犬病病毒SADL16的G基因和L基因之間被引入(圖1B)，這一方法對其它的基因已經(jīng)成功(12；39)。首先構建包括帶有C末端蛋白質(zhì)標記的BRSVNS1或NS2蛋白版本在內(nèi)的cDNA。然后通過PCR，使用反向引物NS1HAr-EcoRI(5’-GCAATAGAATTCCTAAGCGTAATCTGGTACATCATAAGGATAATTCAGACCAAGAAGAGT-3’)(劃線部分是EcoRI限制酶切位點)，在NS1終止密碼子之前直接引入與流感血凝素(HA)蛋白質(zhì)內(nèi)部區(qū)域相對應的額外的27個核苷酸。若為NS2，使用反向引物NS2FLr-EcoRI(5’-GCAATAGAATTCCTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTGGATTTAAATCATACTTATA-3’)(劃線部分是EcoRI限制酶切位點)引入與合成FLAG肽相對應的24個核苷酸。這些PCR片段被用來替代含有全長BRSVcDNA第1-957個核苷酸的質(zhì)粒(pBSBRSVNS1NS2)相應的序列(5)。NS1-HA基因被NotI和EcoRI切除。用Klenow聚合酶進行補平反應后，475個核苷酸的片段被引入pSADVB中緊靠額外的轉(zhuǎn)錄起始信號下游的唯一的SmaI位點。這樣就得到了pSADVB-NS1HA。用類似的方法克隆有470個核苷酸的NS2-FL片段，用AseI和EcoRI切除并用Klenow聚合酶補平后可以獲得pSADVB-NS2FL。用各自的病毒cDNA(10μg)轉(zhuǎn)染(CaPO4方案；哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒，Stratagene)T7啟動子控制的質(zhì)粒后，用前面所描述的方法(19)獲得帶有NS1或NS2基因的重組RV。編碼RVN蛋白(pTITB-N，5μg)、P蛋白和L蛋白(pTITB-P和pTITB-L，每種質(zhì)粒2.5μg)的質(zhì)粒與各種病毒的cDNA一起被共轉(zhuǎn)染進約106個穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶噬菌體的BSRT7/5細胞(5)。4小時后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并用含有10％FCS的BHK-21培養(yǎng)基(Gibco)代替。轉(zhuǎn)染6天后收集細胞培養(yǎng)物的上清液并將其加到新的BSR細胞中。用免疫染色(使用識別RV核蛋白N的FITC共軛物(Centocor))的方法檢測各種傳染性RV。從來自于各轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達RV蛋白質(zhì)N、P和L的BSRT7/5細胞中可以獲得各重組體。NS蛋白的表達對BSR細胞中各重組體的復制、生長特性以及感染效價顯然都沒有不良作用(未顯示)。為檢測所表達的BRSV各蛋白質(zhì)的活性，用親本RV(SADVB)感染Vero細胞，或用各個重組體分別感染Vero細胞，或與SADVB-NS1和SADVB-NS2這兩種重組體共轉(zhuǎn)染Vero細胞。用以前所描述的方法(18)，在懸浮液中以5的MOI分別用重組RVSADVB、SADVB-NS1和SADVB-NS2進行感染。為和SADVB-NS1和SADVB-NS2進行共轉(zhuǎn)染，對每種重組體所采用的MOI為2.5。將細胞稀釋后直接加入重組的通用I型干擾素A/D，直至濃度達到500U/ml。感染兩天后，通過連續(xù)稀釋和免疫染色(使用直接抗RV蛋白質(zhì)N(Centocor)的FITC共軛物)的方法測定病毒效價。此外在至少4次獨立實驗中，在感染兩天后還檢測了各種RV蛋白質(zhì)的表達。親本RVSADVB的生長以及一次感染中表達NS1或NS2蛋白的病毒以相同的程度被影響(圖8A)。添加50IUIFN-α后效價降低了約1個對數(shù)，且隨著IFN量的增加其效價降低得更慢。這說明Vero細胞有弱的IFN反應，或者說Vero細胞中RV對IFN介導的反應有很高的固有抗性。然而，在與表達NS1和NS2的病毒共轉(zhuǎn)染的細胞中，可以證明對病毒的復制有保護作用。病毒效價仍然明顯高于單感染，且僅以劑量依賴的方式緩慢降低。為再次確認上面的發(fā)現(xiàn)，即與Vero細胞相比，BRSV的NS蛋白可以更有效地阻斷牛細胞的抗病毒反應，在MDBK細胞中進行了平行實驗(圖8B)。與Vero細胞相比，標準的RVSADVB以及表達NS的重組體在未處理的MDBK細胞中以較低的效價復制。與Vero細胞相反，IFN的處理明顯降低了wtRV一次感染的感染效價以及表達NS的病毒。感染效價立即以3個對數(shù)下降的情況說明存在著高度有效的IFN介導的細胞反應。然而，除了這種反應，在用SADVB-NS1和SADVB-NS2共感染的細胞中，病毒的復制被完全保護直至加入150IU的IFN。通過分析RV蛋白質(zhì)的合成可以確定這些結(jié)果。在未處理的細胞中，所有的重組體產(chǎn)生了類似量的RV蛋白，而在用IFN處理的細胞中，只有共感染才能進行顯著的蛋白質(zhì)合成，直至加入多于150-200IU的IFN(未顯示)。上面提到的結(jié)果顯示，兩種BRSVNS蛋白不僅可以使BRSV對IFN介導的抗病毒反應有抗性，而且使另一種不相關的病毒也有這種功能。此外，結(jié)果證實這兩種NS蛋白對于產(chǎn)生IFN拮抗作用而言是必需的且是足夠的。實施例7人RSV(HRSV)臨床分離物的干擾素抗性為顯示HRSV也有抗干擾素的防御機制，用就診病人的臨床分離物進行了實驗。分離物是從與魯爾大學(波鴻)的Werchau教授合作進行的多中心研究(multicenterstudy)中獲得的。四種分離物來自于在德國的各醫(yī)院中被診斷患有“毛細支氣管炎”的病人(#61；#86；#109和#110，第一組)，三種分離物來自于被診斷患有“障礙性支氣管炎”的病人(#104；#112和#162，第二組)。為防止這些臨床分離物對各細胞系產(chǎn)生適應性，將它們在Hep2細胞上傳代培養(yǎng)了兩次，然后再用在以后的實驗中。用Hep2細胞確定了這些分離物的生長曲線。第一組中的#61；#86和#109分離物以及第二組中的#104分離物在Hep2細胞中生長得很快且在3天后獲得了類似的高感染效價(在3×106和4×107pfu/ml之間)，第一組中的#110分離物以及第二組中的#104和#162分離物的生長明顯減慢，3天后所得效價僅為3×104pfu/ml(圖9)。在初生呼吸道上皮細胞中也觀察到了這些生長上的不同#61、#86、#109和#112顯然導致了合胞體的形成，對于分離物#110、#104以及#162，經(jīng)過同樣的感染階段后只有單細胞感染可以被檢測出(未顯示)。為確定各個分離物對干擾素的抗性，用不同的分離物感染(MOI＝0.1)Hep2細胞，時間是一小時，然后以150-5,000U/ml的濃度使用重組的I型干擾素A/D。溫育72小時后，用終點滴定的方法測定各個臨床分離物的病毒效價。這樣可以觀察到，所有的臨床HRSV分離物不論其生長速率如何，都受到了保護從而免于重組的I型IFN的抗病毒作用。只有當IFN濃度非常高時(5,000U/ml)，不同的臨床HRSV分離物的復制能力僅僅降低了10倍(圖10)。這些數(shù)據(jù)顯示，所有的臨床HRSV分離物都能夠抵抗高濃度重組I型IFN的抗病毒作用，且這與Long實驗室品系的HRSV至少能達到同樣的程度(參見圖7)。用RT-PCR擴增分離物的NS1和NS2基因，從而可以確定它們的序列。兩個基因都被確定是高度保守的，這證實了IFN分析的結(jié)果。與Long品系HRSV和各分離物相比，NS1和NS2蛋白兩者在氨基酸序列上只發(fā)生了輕微的不同。HRSV(Long)的NS2蛋白和臨床分離物#104、112、61和110的NS1蛋白是完全一樣的。與HRSV(Long)的序列相比，分離物#162、86和109中的每一個都有一個氨基酸被取代(#86N(76)S，#162V(82)M，#109E(91)G)。所有臨床分離物的NS2蛋白在氨基酸序列上都是一樣的，有別于HRSV(Long)有兩個取代物DN(7，8)GT和T(21)I。因此，HRSV(Long)的NS蛋白和基因分別被用于進一步的實驗。實施例8人RSV(HRSV)的NS1和NS2蛋白一起提高了狂犬病病毒對IFN介導可抗病毒反應的抗性為證實HRSV的兩種NS蛋白都對I型IFN有拮抗作用，且這種功能可轉(zhuǎn)移到另一種不相關病毒，我們建立了表達HRSV(Long品系)的NS1(SADVB-hNS1)或NS2(SADVB-hNS2)重組狂犬病病毒。帶有額外的NS1或NS2基因的重組RV(圖11)是基于全長的RVcDNA(SADL16)構建的，它在G基因(SADVB)的3’非編碼序列中含有額外的轉(zhuǎn)錄終止和再啟動序列(32)。額外的基因在減毒的狂犬病病毒SADL16的G基因和L基因之間被引入(圖1B)，這在BRSV的NS基因中已經(jīng)描述過。通過RT-PCR可以獲得這兩種HRSV基因的cDNA。為了這個目的，從被HRSV(Long)感染的Vero細胞中分離出全部RNA。對于NS1基因使用下面的引物hNS1-NcoI5’(5’-ATTGACCATGGGCAGCAATTCATT-3’；第一鏈合成并PCR)以及hNS1-EcoR15’(5’-ATTGAGAATTCTTATGGATTAAGATCAAA-3’)，對于NS2基因引物是hNS2-NcoI5’(5’-ATTGACCATGGACACAACCCACA-3’)以及hNS2-EccRI3’(5’-ATTGAGAATTCTTATGGATTGAGATCATA-3’)。用限制性內(nèi)切酶NotI和EcoRI限制性切割之后，這些PCR片段被克隆進以同樣方式酶切的TIT質(zhì)粒(pTIT-hNS1，pTIT-hNS2)。然后，以hNS1-Not5’(5’-TATGAAGCGGCCGCCCCCTCTCTTCTTTCTACAGAAAATGGGCAGCAATTCATTGAG-3’)和hNS1-EcoRI3’作為引物以PCR的方法使NS1基因從pTIT-hNS1中擴增，然后用限制性內(nèi)切酶NotI和EcoRI消化。用Klenow聚合酶進行補平反應后，片段被引入pSADVB中緊靠額外的轉(zhuǎn)錄起始信號下游唯一的SmaI位點。這樣就得到了pSADVB-hNS1。用引物hNS2-AseI5’(5’-ATACTTATTAATTGGGGCAAATAAATCAGTTCCCCAACCAGCCATGGACACAACCCACAATG-3’)以及hNS2-Acc65I3’(5’-ATAAATGGTACCAAAAGATAACACTGTGTGAATTAAATTTTGAAAAGTGCTTATGGATTGAGATCATACTTG-3’)從pTIT-hNS2中擴增NS2基因，用AseI和EcoRI酶切并用Klenow聚合酶補平之后就可以用與hNS1基因類似的方法克隆NS2基因。這樣就得到了pSADVB-hNS2(圖11)。在用各自的病毒cDNA(10μg)轉(zhuǎn)染(CaPO4方案；哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒，Stratagene)T7啟動子控制的質(zhì)粒后，用以前所描述的方法(19)可以獲得含有HRSVNS1或NS2基因的重組RV。編碼RVN蛋白(pTITB-N，5μg)、P蛋白和L蛋白(pTITB-P和pTITB-L，每種質(zhì)粒2.5μg)的質(zhì)粒與各種病毒的cDNA一起被共轉(zhuǎn)染進約106個穩(wěn)定表達T7RNA聚合酶噬菌體的BSRT7/5細胞(5)。4小時后，除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并用含有10％FCS的BHK-21培養(yǎng)基(Gibco)代替。轉(zhuǎn)染6天后收集細胞培養(yǎng)物的上清液并將其加到新的BSR細胞中。用免疫染色(使用識別RV核蛋白N的FITC共軛物(Centocor))的方法檢測傳染性RV。HRSVNS蛋白的表達對BSR細胞中各重組RV的復制、生長特性以及感染效價顯然沒有不良作用(未顯示)。為檢測所表達的HRSV各蛋白質(zhì)的活性，用親本RV(SADVB)感染MDBK細胞，或用各個重組體分別感染MDBK細胞，或與SADVB-hNS1和SADVB-hNS2這兩種重組體共轉(zhuǎn)染MDBK細胞。用以前所描述的方法(18)，在懸浮液中以5的MOI分別用重組RVSADVB、SADVB-hNS1和SADVB-hNS2進行感染。為和SADVB-hNS1和SADVB-hNS2進行共轉(zhuǎn)染，對每個重組體所采用的MOI為2.5。將細胞稀釋后以50-500U/ml的濃度直接加入重組的通用I型干擾素A/D。感染兩天后通過連續(xù)稀釋和免疫染色(使用直接抗NRV蛋白質(zhì)(Centocor)的FITC共軛物)的方法測定感染效價。IFN的處理明顯降低了wtRV和表達hNS的各種病毒一次感染的感染效價。僅僅加入50UIU的IFN-α導致感染效價降低了3個數(shù)量級。然而，在用SADVB-hNS1和SADVB-hNS2共感染的細胞中，病毒的復制明顯受到了保護直至加入150IU的IFN(圖11)。這些結(jié)果證明，兩種HRSVNS蛋白不僅可以拮抗IFN的細胞反應，而且使另一種不相關的病毒對IFN介導的抗病毒反應也有抗性。此外，結(jié)果進一步證實這兩種NS蛋白對于產(chǎn)生IFN拮抗效應而言是必需的且是足夠的。實施例9鼠肺炎病毒(小鼠的肺炎病毒；PVM)的NS1和NS2蛋白一起提高了狂犬病病毒對IFN介導的抗病毒反應的抗性為證實PVM的兩種NS蛋白也可介導I型IFN抗性，且這種功能可轉(zhuǎn)移到狂犬病病毒，我們建立了表達PVM的NS1(SADVB-mNS1)或NS2(SADVB-mNS2)重組狂犬病病毒。兩種PVM基因的cDNA是由Warwick大學(英國)的AndrewEaston惠予提供的(GenBank編號為D10331；圖18)。還根據(jù)SADVB構建了帶有額外的NS1或NS2基因的重組RV(圖11)(32；參見實施例6和8)。額外的基因在RVSADL16的G基因和L基因之間被引入(圖1B)，這在BRSV的NS基因中已經(jīng)描述過。通過PCR，在NS1基因緊靠轉(zhuǎn)錄終止密碼子之前的位置上引入編碼流感血凝素(HA)蛋白(HAtag)內(nèi)部區(qū)域的額外的27個核苷酸，就可以擴增兩種NS蛋白的基因。在緊靠NS2基因終止密碼子上游的地方引入編碼合成FLAG肽(FLAGtag)的24個核苷酸。對于NS1基因使用下面的引物mNS1-NotIEcoRV5’(5’-AATGATATCGCGGCCGCCCCCTCTCTTCTTTCTACAGAAATGGGCTGTAATGTGATGATG-3’)以及mNS1ha-EcoRI/V3’(5’-AATGATATCGAATTCTTAAGCGTAATCGGTACATCATAAGGATAACCACTGATCAGCTCTAC-3’)，對于PVM的NS2基因引物是mNS2-AseIEcoRV5’(5’-AATGATATCATTAATTGGGGCAAATAAATCAGTTCCCCAACCAGCCATGTCCACAGCTATGAACAAG-3’)以及mNS2fl-EcoRI/V3’(5’-AATGATATCGAATTCTCATTTATCGTCATCATCTTTATAGTCATCATCATCCTCATC-3’)。用限制性內(nèi)切酶EcoRV消化后，然后將這些PCR片段引入pSADVB中緊靠額外的轉(zhuǎn)錄起始信號下游的唯一的SmaI位點。這樣就獲得了pSADVB-mNS1和pSADVB-mNS2(圖11)。從來自于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達RV蛋白質(zhì)N、P和L的BSRT7/5細胞中可以獲得含有PVMNS1或NS2基因的重組RV，這在實施例6和8中已經(jīng)描述過了。NS蛋白的表達對BSR細胞中重組體的復制、生長特性以及感染效價顯然沒有不良作用(未顯示)。為評定所表達的PVM蛋白質(zhì)的活性，用親本RV(SADVB)感染MDBK細胞，或用各個重組體分別感染MDBK細胞，或與SADVB-mNS1和SADVB-mNS2這兩種重組體共感染MDBK細胞。用以前所描述的方法(18)，在懸浮液中以5的MOI分別用重組RVSADVB、SADVBmNS1和SADVB-mNS2進行感染。為與SADVB-mNS1和SADVB-mNS2進行共感染，對每個重組體所采用的MOI為2.5。將細胞稀釋后以50-500U/ml的濃度直接加入重組的通用I型干擾素A/D。感染兩天后，通過連續(xù)稀釋和免疫染色(使用直接抗NRV蛋白質(zhì)(Centocor)的FITC共軛物)的方法測定病毒效價。IFN的處理明顯降低了wtRV和表達hNS的各病毒一次感染的感染效價。然而，在用SADVB-mNS1和SADVB-mNS2共感染的細胞中，病毒的復制明顯受到了保護直至加入100IU的IFN(圖13)。這些結(jié)果證明，兩種PVMNS蛋白能夠拮抗IFN的細胞反應，并且使不相關的病毒對IFN介導的抗病毒反應也有抗性。由于PVMNS蛋白與HRSV的那些蛋白質(zhì)的同源性只有17％(對NS1)和20％(對NS2)，IFN拮抗功能是無法預見的。就像BRSV和HRSV的NS蛋白一樣，對于PVM而言，這兩種NS蛋白對于產(chǎn)生IFN拮抗作用同樣是必需的且是足夠的。實施例10制造含有異源NS基因的重組BRSV通過用其它肺炎病毒的NS基因替換已有的BRSV基因，我們進一步構建了重組的嵌合BRSV。為制造用HRSV或PVM的NS1基因替代BRSVNS1基因的重組BRSV，我們使用了含有全長BRSVcDNA第1-957個核苷酸的質(zhì)粒(5)，此外在它NS1基因中第311個核苷酸上還有一個EcoRI限制性位點(pbNS1EcoRIbNS2)。這樣，用NotI和EcoRI限制性內(nèi)切酶消化可以除去NS2基因完整的編碼區(qū)域。對HRSVNS1使用hNS1-NotI5’和hNS1-EcoRI3’引物，對PVMNS1使用mNS1-NotIEcoRV5’和mNS1ha-EcoRI3’引物，通過PCR可以擴增HRSV和PVM的NS1基因，用NotI和EcoRI限制性酶消化后將基因引入質(zhì)粒中，這樣就可以獲得phNS1bNS2和pmNS1bNS2。隨后，用NotI和AccI消化這兩個質(zhì)粒，所得片段分別有1094個核苷酸(hNS1bNS2)和1043個核苷酸(mNS1bNS2)，將得到的片段分別插入BRSV的全長cDNA中。這樣就獲得了rBRSVhNS1bNS2和rBRSVmNS1bNS2(圖14)。為制造帶有異源NS2基因(rBRSVbNS1hNS2和rBRSVbNS1mNS2)的BRSV，先用限制性酶Acc65I切割pNS1NS2(5)，然后用限制性酶AseI除去部分含有bNS2基因由446個核苷酸組成的片段。然后在片段的這樣位點分別引入hNS2或mNS2基因。通過PCR產(chǎn)生這些片段，對HRSVNS2基因用hNS2-AseI5’和hNS2-Acc65I3’作為引物，或者是對PVMNS2基因用mNS2-AseIEcoRV5’和mNS2-Acc65I3’(5’-ATAAATGGTACCAAAAGATAACACTGTGTGAATTAAATTTTGAAAAGTGCTCATTTATCGTCATCATCTTTATAG-3’)作為引物。隨后用限制性酶AseI和Acc65I消化這些片段并將它們引入pNS1NS2以獲得pbNS1hNS2和pbNS1mNS2，然后用限制性酶NotI和Acc65I消化這些質(zhì)粒，并將所得片段(bNS1hNS2有949個核苷酸，bNS1mNS2有1069個核苷酸)插入全長的BRSVcDNA中，這樣就可以獲得rBRSVbNS1hNS2和rBRSVbNS1mNS2(圖14)。為分別制造含有HRSV和PVM兩種NS基因的重組BRSV，先用限制性酶Acc65I切割質(zhì)粒phNS1bNS2和pmNS1bNS2，然后部分用限制性酶AseI切割。隨后將HRSVNS2基因和PVMNS2基因的上述片段引入各自的質(zhì)粒中，這樣就得到了phNS1hNS2和pmNS1mNS2。同樣，用限制性酶NotI和Acc65I消化這些質(zhì)粒，并將所得片段(hNS1hNS2有1094個核苷酸，mNS1mNS2有1163個核苷酸)插入全長的BRSVcDNA中。這樣就可以獲得rBRSVhNS1hNS2和rBRSVmNS1mNS2(圖14)。各種活體重組病毒rBRSVhNS1bNS2、rBRSVbNS1hNS2和rBRSVhNS1hNS2以及rBRSVmNS1bNS2、rBRSVbNS1mNS2和rBRSVmNS1mNS2可以在BSRT7/5細胞中(5)由各自的cDNA獲得，這需要先用各個病毒的cDNA(10μg)轉(zhuǎn)染(CaPO4方案；哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒，Stratagene)T7啟動子控制的質(zhì)粒。編碼BRSV的N和P蛋白(pTITB-N和pTITB-P，每種質(zhì)粒4μg)、以及L和M2蛋白(pTITB-L和pTITB-M2，每種質(zhì)粒2μg)的質(zhì)粒與各個病毒的cDNA一起被共轉(zhuǎn)染進約106個穩(wěn)定表達T7噬菌體RNA聚合酶的BSRT7/5細胞(5)。4小時后，除去轉(zhuǎn)染介質(zhì)并加入含有5％FCS的BHK-21培養(yǎng)基(Gibco)。每5天以1∶3的比例稀釋被BRSVcDNA轉(zhuǎn)染的細胞，直至可以觀察到細胞病變效應。在所有情況中，編碼BRSVN、P、L和M2蛋白質(zhì)的載體質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染作用可導致合胞體的形成。以1∶3的比例稀釋轉(zhuǎn)染細胞且有清楚的細胞病變效應出現(xiàn)后，就可以收獲病毒。為制造病毒母液，在無血清的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中有80％的融合Vero細胞以0.1的感染復數(shù)(MOI)被感染。吸附一小時后除去接種物，并將細胞在含有5％CO2的空氣中于添加有2.5％FCS的DMEM中以37℃溫育，大約4天后可以觀察到明顯的細胞病變效應(CPE)。通過冷凍隨后再解凍處理釋放病毒。通過在微量滴定板上連續(xù)稀釋再計算轉(zhuǎn)染灶的數(shù)量可以確定在Vero細胞上的病毒效價。為了這個目的，可以用抗F融合蛋白的抗體(SEROTEK，英國)間接染色的方法將轉(zhuǎn)染灶染色。實施例11BRSV嵌合體的生長IFN抗性具有細胞類型依賴性首先在Vero細胞中分析病毒的生長特性。由于BRSVhNS1hNS2和BRSVhNS1bNS2的行為與BRSVwt類似，與親本的全長病毒相比，BRSVmNS1mNS2和BRSVmNS1bNS2是輕微減毒的。這說明BRSVNS蛋白在病毒復制中的功能全部是由HRSVNS蛋白完成的。用Vero細胞以0.1的MOI感染隨后再溫育3天之后，兩種親本wtBRSV和兩種HRSV/BRSV嵌合體都獲得了約5×105pfu的感染效價(圖15)。另一方面，3天之后PVM/BRSV嵌合體的效價只有約4×105pfu，這說明PVMNS基因不能理想地完成病毒復制中BRSV(和HRSV)基因的功能。隨后采用牛源的細胞系MDBK，這種細胞系能較好地支持wtBRSV的生長，且與Vero細胞不同，它有功能性I型IFN系統(tǒng)(5)。這樣，與wtBRSV相比，BRSVhNS1hNS2的生長就減緩了。3天后所得效價只有4×104pfu，而BRSV卻生長至1×106pfu(圖16)。在wtBRSV最為理想的宿主細胞牛MDBK細胞中，BRSVhNS1hNS2的生長顯然減弱了，而在IFN陰性的Vero細胞中卻沒有觀察到減弱作用。然后用重組人I型干擾素來分析IFN刺激的細胞中wtBRSV和BRSVhNS1hNS2的行為。為研究I型干擾素對重組體復制的作用，如上所述，用不同的病毒以0.1的MOI感染Vero細胞或MDBK細胞，然后將它們接種在含有2.5％FCSDMEM的六孔平皿中。接種后，以500-10,000U/ml的濃度直接加入重組的通用I型干擾素(人干擾素-αA/D，PBL生物醫(yī)學實驗室)。溫育三天后，用連續(xù)稀釋和將被感染的細胞直接染色(用抗F融合蛋白的抗體)的方法測定病毒效價。在Vero細胞上沒有觀察到有關wtBRSV和BRSVhNS1hNS2之間IFN抗性方面的任何不同。當添加5000U或更多IFN后可以看到，兩種病毒的感染效價都有輕微的降低(圖17A)。相反，在MDBK細胞上，BRSVhNS1hNS2對IFN誘導的細胞反應顯示了強烈的劑量依賴敏感性，其中，低至1500U的IFN就可使感染效價降低3倍，而10,000U的IFN可使感染效價降低近30倍。另一方面，wtBRSV對IFN的處理顯示了較高的抗性。甚至10,000U的IFN-α也不會影響wtBRSV的復制能力(圖17B)。盡管Vero細胞中嵌合型BRSVhNS1hNS2對IFN的抗性與wtBRSV類似，但在牛源細胞中它不能完全防止IFN誘導的抗病毒反應。這種情況證明，與HRSVNS蛋白相比，BRSVNS蛋白能更成功地控制牛細胞的抗病毒反應。顯然，在異源宿主細胞中NS蛋白的IFN拮抗效應不是最理想的。帶有異源NS蛋白的嵌合RV病毒在活體內(nèi)是減毒的，且可作為活疫苗使用。參考資料1.Ahmadian，G，P.ChambersundA.J.Easton.1999.DetactionandcharacterizationofproteinsencodedbythesecondORFoftheM2geneofpneumoviruses.JGenVirol80(Pt8)2011-2016.2.Atreya，P.L.undSKulkarni.1999.RespiratorysyncytialvirusstrainA2isresistanttotheantiviraleffectsoftypeIinterferonsandhumanMxA.Virology261227-241.3.Atreya，P.L.，M.E.PeeplesundP.L.Collins.1998.TheNS1proteinofhumanrespiratorysyncytialvirusisapotentinhibitorofminigenometranscriptionandRNAreplication.J.Virol.721425-1461.4.Benningham，A，audP.L.Collins.1999.TheM2-2proteinofhumanrespiratorysyncytialvirusisaregulatoryfactorinvolvedinthebalancebetweenRNAreplicationandtranscription.ProcNatlAcadSciUSA9611259-11264.5.Buchholz，U.J，S.FinkeundK.K.Conzelman.1999.Generationofbovinerespiratorysyncytialvirus(BRSV)fromcDNABRSVNS2isnotessentialforvirusreplicationinissueculture，andthehumanRSVleaderregionsactsasafunctionalBRSVgenomepromoter.J.Virol73251-259.6.Buchholz，U.J，Granzow，K.Schuldt，S.S.Whitehead，B.R.MurphyundP.L.collins.2000.Chimericbovinerespiratorysyncytialviruswithglycoproteingenesubstitutionsfromhumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV)EffectonhostrangeandEvalutionasalive-attenuatedHRSVvaccine.J.Virol.741187-1199.7.Chaplin，P.J，K.R.ParsonsundR.A.collins.1996.Thecloningofcattleinterferon-Asubtypesisolatedfromthegutepitheliumofrotavirus-infectedcalves.Immunogenetics44143-145.8.Collins，P.L.，M.G.Hill，E.Camargo，H.Grosfeld，R.M.ChanockundB.R.Murphy.1995.ProductionofintectioushumanrespiratorysyncytialvirusfromclonedcDNAconfirmsanessentialroleforthetranscriptionelongationfactorfromthe5’proximalopenreadingframeoftheM2mRNAingeneexpressionandprovidesacapabilityforvaccinedevelopment.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92-11563-11567.9.Collins，P.L.，K.McIntoshundR.M.Chanock.1999.Respiratorysyncytialvirus，S.1313-1352-InB.N.Field，D.M.Knipe，P.M.Howley，R.M.Chanock，J.L.Elnik，T.P.Onath，B.Oicman，andS.E.Traus(Hrsg.)，F(xiàn)ieldvirology.Lippincott-RaVen.Philadelphia，PA.10.Collins，P.L.，undG.W.Wertz.1985.nucleotidesequencesoftheIBandICnonstructuralproteinmRNAofhumanrespiratorysyncytialvirus.Virology143442-451.11.Conzelmann，K.K.1998.Nonsegmentednegative-strandRNAvirusesGeneticsandmanipulationofviralgenomes.Annu.Rev.Genet.32123-162.12.Conzelmann，K.K.，J.H.Cox，L.G.SchneiderundH.J.Thiel.1990.MolecularcloningandcompletenucleotidesequenceoftheattenuatedraciesvirusSADB19.Virology175485-499.13.Didcock，L.，D.F.young，S.GoodbournundR.E.Randall.1999a.Sendaivirusandsimianonantiterminationproteinofrespiratorysyncytialvirusinsequentialtranscription.J.Virol735852-5864.18.Finke，S.，undK.K.Conzelmann.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