專利名稱：青光眼的診斷和治療藥物的制作方法
1.發(fā)明背景青光眼青光眼是一組眼病，其特征在于視神經(jīng)變性。它是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)失明的首要原因。發(fā)生青光眼的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素是家族史。業(yè)已闡釋了幾種不同的青光眼遺傳方式。
原發(fā)性先天性青光眼或嬰兒青光眼是一種遺傳性疾病，其特征在于眼內(nèi)房水回流系統(tǒng)發(fā)育異常，導(dǎo)致眼內(nèi)壓增高，glove或角膜增大(即眼積水)，視神經(jīng)損傷，最終導(dǎo)致視覺(jué)損害。
原發(fā)性開角型青光眼(POAG)是一種常見(jiàn)疾病，其特征在于視神經(jīng)萎縮，導(dǎo)致視野缺損，最終失明。根據(jù)發(fā)病年齡和臨床表現(xiàn)的不同，POAG又主要被分為兩組。青年發(fā)病的POAG通常在較大兒童或青年期發(fā)病，進(jìn)展迅速，病情嚴(yán)重，伴隨較高的眼內(nèi)壓。該型POAG對(duì)醫(yī)學(xué)治療反應(yīng)較差，通常需要進(jìn)行眼科手術(shù)治療。成年或晚發(fā)型POAG是青光眼中最常見(jiàn)的類型。其癥狀較青年發(fā)病的POAG為輕，發(fā)展也更加緩慢，發(fā)病年齡不定，通常在40歲以后。該型POAG的眼內(nèi)壓輕度或中度升高，對(duì)于常規(guī)監(jiān)測(cè)的醫(yī)學(xué)治療反應(yīng)滿意。不幸的是，由于該病的進(jìn)展比較緩慢而且沒(méi)有痛感，因此通常都是在視神經(jīng)已經(jīng)發(fā)生不可逆性損傷后才被發(fā)現(xiàn)。
兩種類型的POAG通常都與眼內(nèi)壓升高有關(guān)，而眼內(nèi)壓升高是由于房水通過(guò)小梁網(wǎng)回流時(shí)受到抑制導(dǎo)致的。POAG中人小梁網(wǎng)(HTM)的病理生理學(xué)特征在于細(xì)胞外基質(zhì)組分增加，而小梁網(wǎng)細(xì)胞數(shù)量減少。因此，有可能是由于HTM細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、功能或數(shù)量上的缺陷影響了POAG的發(fā)病機(jī)理。POAG的病理生理學(xué)還涉及人鞏膜篩板(HLC)細(xì)胞，業(yè)已顯示該細(xì)胞擁有的蛋白表達(dá)模式與HTM類似(Steely et al.(2000)Exp.Eye Res 7017-30)。因此，POAG的常見(jiàn)起因可能在于對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜損傷最具作用的兩種組織。因此，為了了解POAG的分子發(fā)病機(jī)理并制定獨(dú)特治療方式，確定并了解HTM和HLC的分子控制機(jī)制至關(guān)重要。
業(yè)已顯示，培養(yǎng)的HTM細(xì)胞表達(dá)多種生長(zhǎng)因子受體mRNA，而且，業(yè)已顯示，這些表達(dá)的受體具有功能，因?yàn)閼?yīng)用外源性生長(zhǎng)因子可以引起生理反應(yīng)(Wordinger et al.(1998)Invest Ophthalmol Vis Sci 391575-89)。在體內(nèi)，這些受體可能通過(guò)房水中存在的生長(zhǎng)因子(aquecrine/旁分泌)或小梁網(wǎng)細(xì)胞本身合成或局部釋放的生長(zhǎng)因子(自分泌)來(lái)激活。實(shí)際上，業(yè)已顯示，多種TGF-b同工型可以顯著抑制EGF刺激的小梁網(wǎng)細(xì)胞增殖，而FGF-1，TGF-a，EGF，IL-1a，IL-1b，HGF，TNF-a，PDGF-AA和IGF-1可以顯著刺激細(xì)胞外酸化(ibid)。通過(guò)高親和力受體作用的特定生長(zhǎng)因子可能涉及HTM正常微環(huán)境的維持，也可能涉及POAG的發(fā)病機(jī)理。
對(duì)分子病理學(xué)的一種深入探討源于這樣的觀察結(jié)果，即可以在人和動(dòng)物中誘導(dǎo)眼內(nèi)高壓的糖皮質(zhì)激素能夠改變培養(yǎng)HTM細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)(Wilson et al.(1993)Current Eye Res 12783-93)。這些細(xì)胞骨架改變包括肌動(dòng)蛋白微絲重組形成交聯(lián)的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)(CLANs)，而這種結(jié)構(gòu)改變可能是導(dǎo)致眼內(nèi)高壓的最終生理學(xué)改變(Clark et al.(1993)JGlaucoma 4183-88)。實(shí)際上，降壓類固醇四氫可的松業(yè)已顯示可以降低由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的眼內(nèi)高壓的眼內(nèi)壓(IOP)，而且還可以抑制這些糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的HTM細(xì)胞骨架方面的改變(Clark et al.(1996)InvOphthal & Vis Sci 37805-813)。
美國(guó)專利5,925,748，5,916,778和5,885,776披露了與GLC1A基因突變相關(guān)的青光眼診斷方法，以及鑒定青光眼治療的實(shí)驗(yàn)方法，所述青光眼治療方法調(diào)節(jié)GLC1A基因編碼的MYOC蛋白活性。
Wnt信號(hào)通路Wnt基因家族編碼在分化和發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用的分泌型配體蛋白。該家族包括至少15種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物基因，包括果蠅體節(jié)極性基因wingless以及一種脊椎動(dòng)物同系物integrated，Wnt的名字就是從上述兩種基因衍生的。Wnt蛋白似乎可以使很多發(fā)育和平衡過(guò)程變得容易。例如，脊椎動(dòng)物Wnt1似乎在體節(jié)誘導(dǎo)肌節(jié)和建立中腦邊界的過(guò)程中表現(xiàn)積極(見(jiàn)McMahon and Bradley(1990)Cell 621073；Ku and Melton(1993)Development 1191161；Stern et al.(1995)Development 1213675)。在脊椎動(dòng)物原腸胚形成過(guò)程中，Wnt3a，Wnt5a和Wnt5b在原條中的表達(dá)是獨(dú)立而又有所重疊的。在原條區(qū)域，Wnt3a是唯一一種能夠產(chǎn)生背部(體節(jié))中胚層的Wnt蛋白，而Wnt3a無(wú)效等位基因的純合小鼠沒(méi)有形成前肢的尾部體節(jié)。在脊椎動(dòng)物肢體建立極性方面，Wnt基因也非常重要，正如業(yè)已顯示的非脊椎動(dòng)物同系物wingless，在昆蟲肢體發(fā)育過(guò)程中可以建立極性。在兩種情況下，還與刺猬蛋白(Hedgehog)家族成員有相互作用。
Wnt信號(hào)通路包括多種涉及Wnt/無(wú)翅蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)，并與刺猬蛋白發(fā)育通路緊密相聯(lián)。在果蠅中的無(wú)翅-刺猬蛋白(wingless-hedgehog)通路中，分泌型無(wú)翅蛋白通過(guò)卷曲蛋白受體與鄰近細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用。然后卷曲蛋白受體激活Dishelveled蛋白，阻斷Zeste-white-3激酶對(duì)Armadillo蛋白(一種β-連環(huán)蛋白)的抑制作用?；罨腁rmadillo蛋白可以與高遷移率組(HMG)蛋白LEF/TCF(淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子)作用，促進(jìn)細(xì)胞核表達(dá)刺猬蛋白(hh)基因。刺猬蛋白是一種分泌型蛋白質(zhì)，可以通過(guò)另一個(gè)受體——Patched蛋白與鄰近Wnt/無(wú)翅蛋白活化細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)合。刺猬蛋白與Patched受體的結(jié)合，激活細(xì)胞核表達(dá)無(wú)翅蛋白，然后該蛋白分泌，進(jìn)一步加強(qiáng)與鄰近刺猬蛋白分泌細(xì)胞的相互信號(hào)作用。因此，Wnt/無(wú)翅蛋白-刺猬蛋白相互信號(hào)系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，使兩種鄰近細(xì)胞的分化決定更加容易。這導(dǎo)致了分化界線的穩(wěn)定，其中一邊組織分泌刺猬蛋白，而另一邊組織則產(chǎn)生無(wú)翅蛋白。實(shí)際上，細(xì)胞表面通過(guò)影響一個(gè)細(xì)胞與另一個(gè)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)的差異粘附，在發(fā)育和平衡過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。而且，一旦細(xì)胞差異粘附發(fā)生，Wnt/無(wú)翅蛋白-刺猬蛋白的過(guò)程作用就會(huì)使鄰近細(xì)胞層之間的后續(xù)信號(hào)更加容易。
這種Wnt/無(wú)翅蛋白分界對(duì)于果蠅體節(jié)和附器的產(chǎn)生以及哺乳動(dòng)物腦和肢體的細(xì)分非常重要(Ingham(1994)Curr Biol 41；Niswander et al.(1994)Nature 371609；Wilder and Perrimon(1995)Development 121477)。在非洲爪蟾(Xenopus)中，眼原基和耳泡的原腸胚形成后，卷曲蛋白-2受體(xfz2)高度表達(dá)，在雞中，Wnt基因家族中的一個(gè)特別成員Wnt13，業(yè)已顯示在晶狀體和睫狀邊緣的色素和非色素層增殖上皮中表達(dá)(Jasoni et al.(1999)Dev Dyn 215215)。相互作用的Wnt/無(wú)翅蛋白-刺猬蛋白通路在正常分化的體節(jié)組織的維持方面具有作用。例如，在人類中，體節(jié)組織patched基因的散發(fā)失能突變可以導(dǎo)致人類腫瘤中最常見(jiàn)類型的基底細(xì)胞癌。而且，patched基因的可遺傳突變還可導(dǎo)致基底細(xì)胞痣綜合征，該綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，特征在于發(fā)育異常，包括肋骨和顱面部改變以及惡性腫瘤(Hahn et al.(1996)Cell 85841；Johnson et al.(1996)Science 2721668)。
最近，業(yè)已顯示，與哺乳動(dòng)物Wnt受體卷曲蛋白同源的被稱為分泌型或可溶性卷曲蛋白相關(guān)蛋白5(SFRP5)的蛋白質(zhì)優(yōu)先由脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)表達(dá)(Chang et al.(1999)Hum Mol Genet 8575)。而且，另一種SFRP，SFRP2業(yè)已顯示，由內(nèi)核層細(xì)胞特異性表達(dá)。結(jié)果是視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞暴露于兩種相反梯度的SFRP分子下。由于卷曲蛋白相關(guān)蛋白不含跨膜區(qū)，它們被認(rèn)為是一種分泌型、可溶性受體，通過(guò)正常七次跨膜卷曲蛋白受體與Wnt信號(hào)系統(tǒng)發(fā)生作用。實(shí)際上，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和多種上皮細(xì)胞中高度表達(dá)的一種sFRP——FrzA可以與Wnt-1蛋白特異性結(jié)合，從而通過(guò)卷曲蛋白受體阻斷Wnt-1信號(hào)(Dennis et al.(1999)J Cell Sci 1123815)。
2.發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了確定某個(gè)研究對(duì)象是否傾向于發(fā)生青光眼的新方法和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法基于測(cè)定下述物質(zhì)的相對(duì)水平或活性，所述物質(zhì)包括卷曲蛋白相關(guān)蛋白(FRP)、無(wú)翅蛋白(Wnt)信號(hào)通路組分、Wnt信號(hào)激活基因或Wnt信號(hào)激活基因的基因產(chǎn)物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，應(yīng)用源于研究對(duì)象的小梁網(wǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該方法包括在適宜細(xì)胞中測(cè)定基因損傷的存在或缺如，所述基因損傷的特征在于具有至少下述特征之一(i)編碼卷曲蛋白相關(guān)蛋白(FRP-1)的基因、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因發(fā)生突變；(ii)FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因錯(cuò)誤表達(dá)；(iii)FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子存在錯(cuò)誤或突變，所述錯(cuò)誤或突變導(dǎo)致異常表達(dá)。
在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，診斷方法包括確定至少下述一種現(xiàn)象的存在(a)野生型FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因中存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失；(b)野生型FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因中存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加；(c)野生型FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因中存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代；(d)野生型FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因中存在染色體整體重排；(e)FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄信使RNA(mRNA)水平發(fā)生變化；(f)FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄mRNA中存在非野生型剪接模式；(g)FRP、Wnt信號(hào)蛋白或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的水平或活性異常。
例如，可以通過(guò)下述方法檢測(cè)基因損傷(i)提供含寡核苷酸的探針和引物，所述寡核苷酸可以與以下核酸的正義或反義序列雜交，所述核酸為FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因(野生型或突變型)，或其片段，或者與FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的天然相關(guān)5’或3’側(cè)翼序列；(ii)將探針或引物與含有源于研究對(duì)象生物學(xué)樣本的適宜核酸混合；以及(iii)通過(guò)探針或引物與核酸雜交，測(cè)定基因損傷的存在或缺如。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，診斷方法和/或試劑盒應(yīng)用一套引物擴(kuò)增(如通過(guò)PCR或LCR)可能包括突變的FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的至少一個(gè)區(qū)域，然后分析擴(kuò)增產(chǎn)物與正常野生型編碼序列之間存在的不同突變或基因表達(dá)水平。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，診斷方法和/或試劑盒應(yīng)用探針，在適宜嚴(yán)格的條件下，測(cè)定其與生物學(xué)樣本中互補(bǔ)核酸序列的雜交能力，其中，含有野生型FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的探針沒(méi)有與樣本核酸進(jìn)行雜交的能力，提示在樣本核酸中存在突變；或者含有突變型FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因的探針具有與樣本核酸進(jìn)行雜交的能力，提示在樣本核酸中存在突變。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以應(yīng)用多種方法，包括免疫探測(cè)和生化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定FRP、Wnt信號(hào)組分或由Wnt信號(hào)激活表達(dá)的基因編碼的蛋白質(zhì)的水平或活性。
應(yīng)用本文描述的實(shí)驗(yàn)方法和試劑盒獲得的信息(單獨(dú)或結(jié)合其他與青光眼發(fā)生相關(guān)的基因缺陷信息或環(huán)境因素)在確定一個(gè)無(wú)癥狀個(gè)體是否已經(jīng)或者容易發(fā)生青光眼時(shí)非常重要。此外，這些信息還提供了更加個(gè)性化的預(yù)防或治療該病的方法。
另一方面，本發(fā)明還提供了為青光眼防治確定治療方法的體外或體內(nèi)試驗(yàn)篩查測(cè)試化合物。在一個(gè)特殊優(yōu)選實(shí)施方案中，該治療方法促進(jìn)Wnt信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是一個(gè)結(jié)合試驗(yàn)，主要包括以下步驟(a)形成反應(yīng)混合物，包括(i)FRP或Wnt信號(hào)多肽，(ii)FRP或Wnt信號(hào)多肽的結(jié)合配體，以及(iii)測(cè)試化合物；以及(b)測(cè)定FRP或Wnt信號(hào)多肽與結(jié)合蛋白的相互作用。在有化合物存在的情況下，F(xiàn)RP或Wnt信號(hào)多肽與結(jié)合蛋白的相關(guān)作用存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(增強(qiáng)或抑制)，提示為Wnt信號(hào)的潛在激動(dòng)劑(擬態(tài)劑或增強(qiáng)劑)或拮抗劑(抑制劑)。反應(yīng)混合物可以是無(wú)細(xì)胞蛋白制劑如重建蛋白混合物或細(xì)胞裂解物、培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)、或者含有表達(dá)結(jié)合配體的異種核酸的重組細(xì)胞。
另一個(gè)示例實(shí)施方案提供了一種篩檢測(cè)試化合物的試驗(yàn)方法，可以用來(lái)鑒定能夠促進(jìn)或增強(qiáng)Wnt信號(hào)和/或基因表達(dá)的試劑，所述基因由小梁網(wǎng)細(xì)胞的Wnt信號(hào)調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，篩檢試驗(yàn)方法包括將轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因的細(xì)胞與測(cè)試化合物混合，然后測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)水平，其中，所述報(bào)告基因與啟動(dòng)子操作相連，并由高遷移率組(HMG)蛋白調(diào)節(jié)(如淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子)。報(bào)告基因可以編碼，例如產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的基因產(chǎn)物，所述可檢測(cè)信號(hào)如顏色、熒光、發(fā)光、細(xì)胞活性、減少細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求、細(xì)胞生長(zhǎng)和耐藥。例如，報(bào)告基因編碼的基因產(chǎn)物可以選自氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，熒光素酶，β半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。
另一方面，本發(fā)明描述了治療青光眼的方法，包括將適宜的細(xì)胞(如小梁網(wǎng)細(xì)胞)與有效劑量的化合物混合，所述化合物可以促進(jìn)小梁網(wǎng)基因的表達(dá)，所述基因涉及Wnt信號(hào)，或由Wnt信號(hào)調(diào)節(jié)。優(yōu)選化合物是小分子的核酸(包括反義或三體分子以及核酶)，蛋白，肽或擬肽。特別優(yōu)選的化合物是卷曲蛋白相關(guān)蛋白(FRP)拮抗劑。特別優(yōu)選的拮抗劑是抑制或降低細(xì)胞內(nèi)FRP表達(dá)水平的反義、核酶或三體分子。其他優(yōu)選FRP拮抗劑是抗體，它可以減少或抑制FRP與Wnt的結(jié)合。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)在下面的發(fā)明詳述和權(quán)利要求中將變得更加清晰。
3.附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了人卷曲蛋白相關(guān)蛋白(FRP-1)的cDNA序列(序列1)。
圖2顯示了人FRP-1的氨基酸序列。
圖3圖示了Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路。圖3(a)顯示了基于FRP與Wnt的結(jié)合導(dǎo)致的基因表達(dá)抑制。圖3(b)顯示了Wnt刺激基因表達(dá)。Wnt與卷曲蛋白(Fz)的結(jié)合可以激活disheveled蛋白(Dsh)，該蛋白反過(guò)來(lái)防止糖原合酶激酶3(GSK3)與蛋白激酶C(APC)的結(jié)合，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的積聚，而β-連環(huán)蛋白的積聚反過(guò)來(lái)可以使與轉(zhuǎn)錄因子、T細(xì)胞因子(TCF)的相互作用變得更加容易，促進(jìn)基因表達(dá)。
4.發(fā)明詳述4.1.概述總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即卷曲蛋白相關(guān)蛋白-1(FRP-1)在青光眼患者的小梁網(wǎng)(TM)中上調(diào)。盡管不希望受到限制，但據(jù)認(rèn)為，Wnt信號(hào)通路如圖3(b)所示在TM中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)小梁網(wǎng)細(xì)胞重要的功能，而FRP-1可以如圖3(a)所示拮抗正常的Wnt信號(hào)，因此干擾TM細(xì)胞功能。
4.2.定義為方便起見(jiàn)，下面給出了本說(shuō)明書、實(shí)施例和后附權(quán)利要求中采用的某些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的含義。
本文所用術(shù)語(yǔ)“異?！笔侵富虍a(chǎn)物水平或生物活性的改變，這種改變只存在于青光眼組織或細(xì)胞中，但不存在于非青光眼組織或細(xì)胞中。例如，異常高水平的卷曲蛋白相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物與青光眼患者青光眼性小梁網(wǎng)細(xì)胞的相關(guān)性高于與正?；颊叻乔喙庋坌孕×壕W(wǎng)細(xì)胞的相關(guān)性。而且，Wnt通路組分生物活性的異常低下與正常患者小梁網(wǎng)細(xì)胞相關(guān)。
如用于多肽如FRP的活性的術(shù)語(yǔ)“異?；钚浴笔侵概c野生型或天然多肽活性不同的活性，或者與健康個(gè)體中多肽活性不同的活性。多肽活性的異常可以是因?yàn)樗^天然對(duì)應(yīng)物活性更強(qiáng)。此外，活性異常還可以因?yàn)樗^天然對(duì)應(yīng)物活性更弱，或其活性與天然對(duì)應(yīng)物活性無(wú)關(guān)?；钚援惓＿€可以是活性的改變。例如，一種異常肽可以與不同的靶肽發(fā)生相互作用。具有異常FRP活性的細(xì)胞可以是因?yàn)榫幋aFRP的基因過(guò)量表達(dá)或表達(dá)不足。
本文所用術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”是指這樣一種制劑，它可以直接或間接增強(qiáng)、補(bǔ)充或加強(qiáng)Wnt啟動(dòng)的基因表達(dá)，或者由Wnt調(diào)控基因編碼的蛋白的活性或水平，或者Wnt信號(hào)通路中的基因或蛋白。
術(shù)語(yǔ)“等位基因”，在本文還可與“等位基因變異體”互換使用，是指一個(gè)基因或其部分的另一種形式。等位基因占據(jù)同源染色體的相同位點(diǎn)或位置。當(dāng)一個(gè)個(gè)體攜帶某基因的兩個(gè)完全相同的等位基因時(shí)，該個(gè)體被稱為該基因或等位基因的純合子。當(dāng)一個(gè)個(gè)體攜帶某基因的兩個(gè)不同等位基因時(shí)，該個(gè)體被稱為該基因的雜合子。特定基因的等位基因間的差異可以是一個(gè)核苷酸或幾個(gè)核苷酸，還可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。某基因的等位基因還可以是含有突變的基因形式。
本文所用術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指這樣一種制劑，它可以直接或間接防止、最小化或抑制Wnt啟動(dòng)的基因表達(dá)，或者由Wnt調(diào)控基因編碼的蛋白的活性或水平，或者Wnt信號(hào)通路中的基因或蛋白。
本文所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合配體”是指一種能與特定基因產(chǎn)物通過(guò)非共價(jià)力相互作用的物質(zhì)組合物。例如，卷曲蛋白相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的“結(jié)合配體”包括能與卷曲蛋白相關(guān)蛋白基因mRNAs如FRP-1反義多核苷酸發(fā)生相互作用的物質(zhì)組合物，以及能與卷曲蛋白相關(guān)蛋白多肽如Wnt多肽發(fā)生相互作用的組合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“多肽的生物活性片段”是指一個(gè)全長(zhǎng)多肽的片段，其中該片段可以特異性模擬或拮抗相對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)野生型多肽的活性。
“細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”是可以在本文中交互使用的術(shù)語(yǔ)。應(yīng)該理解，這些術(shù)語(yǔ)不僅指特定的個(gè)體細(xì)胞，而且指這樣一種細(xì)胞的后代或潛在后代。因?yàn)樵趥鞔^(guò)程中，由于突變或環(huán)境影響會(huì)發(fā)生某些修飾，使后代細(xì)胞實(shí)際上可能與親本細(xì)胞不完全相同，但這些細(xì)胞仍屬于本文所用術(shù)語(yǔ)范疇。
“嵌合多肽”或“融合多肽”是編碼例如一種個(gè)體FRP多肽的第一種氨基酸序列與定義一個(gè)功能區(qū)(如多肽部分)的第二種氨基酸序列的融合，所述功能區(qū)與FRP多肽的任意一個(gè)功能區(qū)都不同或基本不同源。一種嵌合多肽可能存在一種異源功能區(qū)，該功能區(qū)可能存在于也表達(dá)第一種多肽的生物體內(nèi)(雖然屬于不同的多肽)，也可能是不同種類的生物體表達(dá)的“種間”“基因間”等融合多肽結(jié)構(gòu)?？偟恼f(shuō)來(lái)，融合多肽可以用通式X-FRP-Y來(lái)表示，其中FRP代表FRP衍生多肽的一部分，X和Y可以獨(dú)立缺如或代表在生物體內(nèi)與FRP序列不相關(guān)的氨基酸序列，包括天然發(fā)生的突變。
“導(dǎo)入復(fù)合體”應(yīng)該代表一種靶向工具(如可以導(dǎo)致與一種基因、蛋白、多肽或肽以高親和力與靶細(xì)胞表面結(jié)合，和/或被靶細(xì)胞的細(xì)胞或胞核增強(qiáng)攝取的分子)。靶向工具的示例包括固醇(如膽固醇)，脂質(zhì)(如陽(yáng)離子脂質(zhì)，病毒體或脂質(zhì)體)，病毒(如腺病毒，腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)或靶細(xì)胞特異性結(jié)合劑(如被靶細(xì)胞特異性受體識(shí)別的配體)。優(yōu)選的復(fù)合體在體內(nèi)非常穩(wěn)定，防止在靶細(xì)胞內(nèi)化作用前，發(fā)生顯著的解構(gòu)。但是，在適宜的條件下，該復(fù)合體可以在細(xì)胞內(nèi)裂解，使基因、蛋白、多肽或肽以功能活性的形式釋放。
眾所周知，基因可以以單拷貝或多拷貝的形式存在于個(gè)體基因組內(nèi)。這些基因副本可以完全相同，也可以存在某些修飾，包括核苷酸取代、添加、倒位或缺失，但這些基因副本仍編碼幾乎具有相同活性的多肽。因此，術(shù)語(yǔ)“編碼FRP多肽的DNA序列”是指某個(gè)個(gè)體中一個(gè)或多個(gè)基因。而且，核苷酸序列可以在不同生物個(gè)體間存在某些差異，這些存在差異的核苷酸序列被稱為等位基因。這些等位基因差異可能或不會(huì)導(dǎo)致編碼多肽的氨基酸序列差異，但編碼的多肽仍具有相同的生物活性。
“卷曲蛋白相關(guān)蛋白(FRP)”可以是與卷曲蛋白細(xì)胞外配體結(jié)合功能區(qū)相似的分泌型蛋白家族中的任意一員。FRP也指分泌型或可溶性卷曲蛋白相關(guān)蛋白(sFRP)，因?yàn)樗鼈儾缓缒すδ軈^(qū)，因此似乎可以作為Wnt蛋白的主要陰性受體發(fā)揮作用。有很多不同的脊椎動(dòng)物基因編碼FRP，這些基因包括人分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白編碼基因Frz-1(GenBank存取號(hào)AF056087)；人分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白編碼基因SFRP5(GenBank存取號(hào)AF117758)；人Frz-B基因(GenBank存取號(hào)U24163)；以及非洲爪蟾FrzA基因(GenBank存取號(hào)AF049908)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“青光眼”是指一組眼病，其特征在于視神經(jīng)變性和視野缺損，其原因通常是由于房水回流通道受阻導(dǎo)致的眼內(nèi)壓升高(慢性或開角型青光眼)，或由于虹膜與晶狀體之間的壓力導(dǎo)致的(急性或閉角型青光眼)。
“同源”或“相同”或“相似”是指在兩種肽或兩種核酸分子之間序列的相似性。同源性可以通過(guò)比較每一序列同一位置得到確定，為了比較的目的，可以進(jìn)行序列比對(duì)。當(dāng)對(duì)比序列的某一位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時(shí)，那么這些分子在該位置相同。核酸序列間同源或相似或相同的程度可以通過(guò)核酸序列中相同或匹配核苷酸位置的數(shù)量函數(shù)來(lái)計(jì)算。氨基酸序列間的相同程度可以通過(guò)氨基酸序列中相同氨基酸的數(shù)量函數(shù)來(lái)計(jì)算。氨基酸序列間的同源或相似程度可以通過(guò)氨基酸序列中氨基酸即結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸的位置的數(shù)量函數(shù)來(lái)計(jì)算。兩個(gè)核酸或多肽序列中的同源百分比可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的幾種數(shù)學(xué)運(yùn)算方法之一進(jìn)行確定(如通過(guò)BLAST序列同源軟件，該軟件可以在下述網(wǎng)址獲得http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)?！安幌嚓P(guān)”或“不同源”序列與本發(fā)明一種FRP序列的相同程度低于40％，盡管優(yōu)選相同程度低于25％。
本文所用術(shù)語(yǔ)“相互作用”包括在分子間可以檢測(cè)到的相互作用，如可以應(yīng)用例如酵母雙雜交試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)相互作用還包括分子間的“結(jié)合”相互作用。相互作用可以，例如是天然存在的蛋白-蛋白或蛋白-核酸或核酸-核酸。
本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的”如果指核酸，如DNA或RNA，是指分別從其他DNA或RNA中分離的分子，以天然來(lái)源的大分子形式存在。例如，編碼一個(gè)FRP多肽的分離核酸優(yōu)選包括不超過(guò)10千堿基(kb)的基因組DNA FRP天然緊鄰側(cè)翼核酸序列，更優(yōu)選這種天然側(cè)翼序列不超過(guò)5kb，最優(yōu)選這種天然側(cè)翼序列不超過(guò)1.5kb。本文所用術(shù)語(yǔ)分離的還指基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)的核酸或肽，或在通過(guò)重組DNA技術(shù)制備時(shí)基本不含培養(yǎng)基、以及在化學(xué)合成時(shí)基本不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)的核酸或肽。而且，“分離的核酸”還意味著包括非天然核酸片段以及在自然狀況下不存在的核酸片段。本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的”還指從其他細(xì)胞蛋白中分離的多肽，并意味著包括純化重組多肽。
本文所用術(shù)語(yǔ)“調(diào)制”是指上調(diào)(即激活或刺激(如通過(guò)激動(dòng)作用或加強(qiáng)作用))和下調(diào)(即抑制或壓制(如通過(guò)拮抗作用，減弱作用或抑制作用))。
術(shù)語(yǔ)“突變基因”是指一個(gè)基因的等位基因形式，該突變基因可以使攜帶突變基因的個(gè)體的表型相對(duì)于不攜帶該突變基因的個(gè)體發(fā)生改變。如果一個(gè)個(gè)體必須是該突變的純合子才能發(fā)生表型改變，那么該突變被稱為隱性。如果單拷貝的突變基因就足以使個(gè)體發(fā)生表型改變，那么該突變被稱為顯性。如果攜帶單拷貝突變基因的個(gè)體表型位于(該基因)純合子和雜合子之間，那么該突變被稱為共顯性。
本發(fā)明的“非人動(dòng)物”包括哺乳動(dòng)物，如嚙齒類動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、羊、狗、牛、雞、兩棲類動(dòng)物、爬行動(dòng)物、兔等。優(yōu)選的非人動(dòng)物選自嚙齒類家族，包括大鼠和小鼠，最優(yōu)選小鼠，盡管在理解和確定可以影響例如胚胎發(fā)生和組織形成的制劑時(shí)，轉(zhuǎn)基因兩棲類動(dòng)物如非洲爪蟾屬成員以及轉(zhuǎn)基因雞也可以作為很重要的研究工具。本文所用術(shù)語(yǔ)“嵌合動(dòng)物”是指體內(nèi)存在重組基因表達(dá)的動(dòng)物，或者重組基因在動(dòng)物的某些細(xì)胞但非全部細(xì)胞表達(dá)的動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“組織特異性嵌合動(dòng)物”提示，重組基因之一在某些組織而非其他組織中存在和/或表達(dá)或受到干擾。
本文所用術(shù)語(yǔ)“核酸”是指多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)，以及在適宜情況下的核糖核酸(RNA)。應(yīng)該理解，作為等價(jià)物，術(shù)語(yǔ)還包括從核苷酸類似物中制備的RNA或DNA類似物，并如下述實(shí)施方案所用，單鏈(正義或反義)和雙鏈多核苷酸。
術(shù)語(yǔ)“與序列x公布的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列”是指序列x的核酸鏈的互補(bǔ)鏈核苷酸序列。本文所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)鏈”可以與術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”互換使用。核酸互補(bǔ)鏈可以是編碼鏈的互補(bǔ)鏈，也可以是非編碼鏈的互補(bǔ)鏈。當(dāng)所指為雙鏈核酸時(shí)，序列x的核酸的互補(bǔ)鏈?zhǔn)侵妇哂行蛄衳核酸序列鏈的互補(bǔ)鏈，或者具有序列x互補(bǔ)鏈的核苷酸序列的任意核酸。當(dāng)所指具有序列x核苷酸序列的核酸是單鏈時(shí)，該核酸的互補(bǔ)鏈?zhǔn)蔷哂信c序列x核苷酸序列互補(bǔ)序列的核酸。核苷酸序列及其互補(bǔ)序列總是以5’到3’的順序給出。
術(shù)語(yǔ)“多態(tài)性”是指一個(gè)基因或其部分(如等位基因變異體)有超過(guò)一種的形式共同存在。一個(gè)基因的某部分，存在至少兩種不同的形式，即兩種不同的核苷酸序列，就被稱為“基因的多態(tài)區(qū)”。多態(tài)區(qū)可以是一個(gè)核苷酸，該核苷酸在不同的等位基因中表現(xiàn)不同。多肽區(qū)的長(zhǎng)度也可以是幾個(gè)核苷酸。
“多態(tài)性基因”是指具有至少一個(gè)多態(tài)區(qū)的基因。
本文所用術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指一個(gè)DNA序列，可以調(diào)節(jié)與啟動(dòng)子操作性連接的所選DNA序列的表達(dá)，從而影響細(xì)胞中所選DNA序列的表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)包括“組織特異性”啟動(dòng)子，即只在特定細(xì)胞中(如特定組織的細(xì)胞)影響所選DNA序列表達(dá)的啟動(dòng)子。該術(shù)語(yǔ)還包括所謂的“瀉露型”啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子不僅調(diào)節(jié)所選DNA主要在一種組織中的表達(dá)，而且可以導(dǎo)致該DNA也在其他組織表達(dá)。該術(shù)語(yǔ)還包括非組織特異性啟動(dòng)子和構(gòu)建表達(dá)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)啟動(dòng)子(即表達(dá)水平可以控制)。
在本文中，當(dāng)指含氨基酸的基因產(chǎn)物時(shí)，“蛋白”、“多肽”和“肽”是可以互換使用的。
術(shù)語(yǔ)“重組蛋白”是指本發(fā)明應(yīng)用重組DNA技術(shù)制備的多肽，通常情況下，編碼FRP多肽的DNA被插入到適宜的表達(dá)載體中，然后再應(yīng)用該載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，產(chǎn)生異源蛋白。而且，在用于重組FRP基因時(shí)，短語(yǔ)“衍生于”是指包括在“重組蛋白”含義之內(nèi)，那些蛋白具有天然FRP多肽的氨基酸序列，或者與通過(guò)突變產(chǎn)生的多肽相似的氨基酸序列，所述突變包括天然形式多肽的取代或缺失(包括截短)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“小分子”是指一種組合物，其分子量小于大約5kD，優(yōu)選小于大約4kD。小分子可以是核酸，肽，多肽，擬肽，碳水化合物，脂質(zhì)或其他有機(jī)(含碳)或無(wú)機(jī)分子。很多制藥公司都擁有廣泛的化學(xué)和/或生物學(xué)混合物文庫(kù)，通常是真菌、細(xì)菌或藻類提取物，可以應(yīng)用本發(fā)明任意一種試驗(yàn)方法進(jìn)行篩選，鑒定可以調(diào)制FRP或Wnt信號(hào)生物活性的化合物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”或“特異性檢測(cè)”是指本發(fā)明核酸分子與脊椎動(dòng)物優(yōu)選FRP基因的至少大約6，12，20，30，50，100，150，200，300，350，400或425個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的能力。
在本說(shuō)明書中所用的遺傳學(xué)術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”是指DNA序列，如起始信號(hào)、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，可以誘導(dǎo)或調(diào)控與其操作性連接的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
本文所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是指如通過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將核酸導(dǎo)入受體細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指一個(gè)過(guò)程，在該過(guò)程中，細(xì)胞的基因型由于細(xì)胞攝取外源性DNA或RNA而發(fā)生改變，并且，例如，轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)重組形式的FRP多肽，或者，在反義表達(dá)轉(zhuǎn)移基因的情況下，天然形式的FRP多肽的表達(dá)受到破壞。
本文所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”是指業(yè)已導(dǎo)入到細(xì)胞中的核酸序列(編碼，如FRP多肽之一，或反義轉(zhuǎn)錄物)。轉(zhuǎn)基因可以與其導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞部分或完全異源，即不同，或者與其導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞的內(nèi)源性基因同源，但是該基因應(yīng)該被設(shè)計(jì)成插入或被插入到動(dòng)物基因組中，插入方式應(yīng)該可以改變其插入細(xì)胞的基因組(如，它可以在某位點(diǎn)插入，使之與天然基因不同，或者它的插入可以導(dǎo)致基因敲除)。轉(zhuǎn)基因還可以游離基因的形式存在于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因還可以包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控細(xì)胞和其他核酸，如內(nèi)含子，它們對(duì)于所選核酸的最優(yōu)化表達(dá)可能是必需的。
“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指任何動(dòng)物，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物、鳥類或兩棲類動(dòng)物，在這些動(dòng)物中，動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞含有通過(guò)少為干預(yù)導(dǎo)入的異源核酸，如通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，通過(guò)周密的基因操作直接或間接導(dǎo)入前體細(xì)胞，如通過(guò)微注射或注射重組病毒。術(shù)語(yǔ)基因操作不包括經(jīng)典雜交，或體外受精，而是主要指重組DNA分子的導(dǎo)入。該分子可以整合到染色體中，也可以是染色體外的可復(fù)制DNA。
本文所用術(shù)語(yǔ)“治療”意欲包括病況或疾病的至少一個(gè)癥狀的治愈或改善。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠?qū)⑴c之連接的另一核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)移的核酸分子。優(yōu)選載體的一種類型是游離基因，即能夠在染色體外進(jìn)行復(fù)制的核酸。優(yōu)選的載體是那些能夠使與它們連接的核酸進(jìn)行自主復(fù)制并表達(dá)的核酸。能夠指導(dǎo)與它們操作性連接的基因表達(dá)的載體在本文被稱為“表達(dá)載體”?？偟恼f(shuō)來(lái)，在重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體的常用形式是“質(zhì)粒”，所述質(zhì)粒通常指環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，以載體的形式不會(huì)與染色體結(jié)合。在本說(shuō)明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可以交互使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明意欲包括其他形式的表達(dá)載體，這些載體可以發(fā)揮同等功效，并在本領(lǐng)域眾所周知。
術(shù)語(yǔ)“野生型等位基因”是指一個(gè)基因的等位基因，當(dāng)該基因以雙拷貝形式存在于個(gè)體時(shí)，導(dǎo)致野生型表型。一個(gè)特定基因可以有幾種不同的野生型等位基因，因?yàn)榛蛑心承┖塑账岬母淖儾粫?huì)影響一個(gè)個(gè)體的表型，所述個(gè)體攜帶兩個(gè)拷貝的核苷酸發(fā)生變化的基因。
“Wnt信號(hào)組分”是指涉及Wnt信號(hào)通路的蛋白或蛋白編碼基因。這些蛋白的示例包括Wnt，卷曲蛋白(Fz)，disheveled(Dsh)，糖原合酶激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)，β-連環(huán)蛋白以及高遷移率組(HMG)蛋白(如LEF/TCF(淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子))。
“Wnt蛋白”是指由一大組哺乳動(dòng)物基因包括Wnt3a，Wnt5a和Wnt5b編碼的蛋白。
4.3.青光眼的預(yù)后和診斷基于本文公開的發(fā)現(xiàn)，即某些青光眼患者FRP水平升高，可以發(fā)展出多種青光眼診斷方法。某些診斷方法可以檢測(cè)核酸序列中存在的突變，這些突變可以導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)母咚紽RP。這些診斷方法可以基于已知的人FRP cDNA核酸序列或編碼的氨基酸序列進(jìn)行開發(fā)，所述核酸序列如圖1所示，所述氨基酸序列如圖2所示。其他診斷方法可以基于人FRP的基因組序列或調(diào)控FRP表達(dá)的基因序列進(jìn)行開發(fā)。另外一些診斷方法可以基于在mRNA水平的FRP基因表達(dá)水平的變化進(jìn)行開發(fā)。含有人FRP基因組序列的質(zhì)粒于＿＿＿＿保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，給予的ATCC保藏號(hào)為＿＿＿＿＿。
其他診斷方法還可檢測(cè)Wnt信號(hào)蛋白或編碼Wnt信號(hào)蛋白的基因的活性和水平。例如，診斷方法可以這樣開發(fā)，即檢測(cè)不適宜的低水平Wnt信號(hào)活性，包括例如，導(dǎo)致Wnt信號(hào)組分功能發(fā)生異常的突變，所述Wnt信號(hào)組分包括卷曲蛋白(Fz)，disheveled(Dsh)，糖原合酶激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)，β-連環(huán)蛋白，高遷移率組(HMG)蛋白(如LEF/TCF(淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子))以及刺猬蛋白(Hh)。此外，還可應(yīng)用基于非核酸的技術(shù)，檢測(cè)任何Wnt信號(hào)蛋白量或特異性活性的改變。
目前可以應(yīng)用多種方法檢測(cè)基因和基因產(chǎn)物的異常水平或活性。例如，有很多方法可以用來(lái)檢測(cè)人多態(tài)性位點(diǎn)的特異性等位基因。檢測(cè)特異性多態(tài)性等位基因的優(yōu)選方法部分有賴于該多態(tài)性的分子特征。例如，多態(tài)性位點(diǎn)的多種等位基因形式可能只是DNA中單個(gè)堿基對(duì)的差異。這些單核苷酸多態(tài)性(或SNPs)是遺傳變異的主要貢獻(xiàn)者，包括所有已知多態(tài)性的大約80％，它們?cè)谌祟惢蚪M中的密度預(yù)計(jì)平均為1/1000堿基對(duì)。SNPs是最常見(jiàn)的二等位基因——僅以兩種不同的形式存在(盡管在理論上可能在一個(gè)SNP中存在高達(dá)4種不同的形式，對(duì)應(yīng)于DNA中存在的4種不同的核苷酸堿基)。但是，SNPs是比其他多態(tài)性更穩(wěn)定的突變，使它們適于在標(biāo)記物和未知變異體間存在連鎖不平衡時(shí)進(jìn)行相關(guān)研究，所述未知變異體可以用來(lái)繪制致病突變圖譜。此外，由于典型的SNPs僅有兩個(gè)等位基因，可以應(yīng)用簡(jiǎn)單的增/減試驗(yàn)方法(plus/minus assay)而不是長(zhǎng)度測(cè)定法進(jìn)行基因型分析，使它們更容易進(jìn)行自動(dòng)分析。
有多種方法可以用來(lái)檢測(cè)個(gè)體中存在的特定單核苷酸多態(tài)性。該領(lǐng)域的進(jìn)步業(yè)已提供了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便而且便宜的大規(guī)模SNP基因型分析技術(shù)。最近，例如，業(yè)已披露了幾種新技術(shù)，包括動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)，微板試驗(yàn)診斷凝膠電泳(MADGE)，焦磷酸的熒光檢測(cè)，寡核苷酸特異性結(jié)合，TaqMan系統(tǒng)以及多種DNA“芯片”技術(shù)，如Affymetrix SNP芯片。這些方法需要擴(kuò)增靶基因區(qū)，典型的通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。其他新開發(fā)的方法基于通過(guò)侵入性裂解產(chǎn)生小信號(hào)分子，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析或固定掛鎖探針和滾環(huán)擴(kuò)增，可能會(huì)逐漸消除對(duì)PCR的需求。下面將簡(jiǎn)要介紹幾種本領(lǐng)域已知的檢測(cè)特異性單核苷酸多態(tài)性的方法。應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法包括所有這些可用方法。
業(yè)已發(fā)展出幾種方法，使單核苷酸多態(tài)性的分析變得容易。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用專門的耐核酸外切酶的核苷酸檢測(cè)單堿基多態(tài)性，所述耐核酸外切酶的核苷酸如Mundy，C.R.(美國(guó)專利號(hào)4,656,127)所披露。根據(jù)該方法，將與緊鄰多態(tài)性位點(diǎn)3’端的等位基因序列互補(bǔ)的引物與源于特定動(dòng)物或人的靶分子進(jìn)行雜交。如果靶分子上的多態(tài)性位點(diǎn)含有與耐特定核酸外切酶的核苷酸衍生物互補(bǔ)的核苷酸，那么該衍生物就會(huì)整合到雜交引物的末端。這種整合使引物也耐核酸外切酶，并因此可以進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)闃颖局心屯馇忻傅难苌锾攸c(diǎn)已知，因此發(fā)現(xiàn)引物變得耐核酸外切酶就提示，靶分子多態(tài)性位點(diǎn)中存在的核苷酸與反應(yīng)中應(yīng)用的核苷酸衍生物互補(bǔ)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于它不需要測(cè)定大量無(wú)關(guān)序列數(shù)據(jù)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用基于解決方案的方法來(lái)檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)核苷酸的特點(diǎn)。Cohen，D.et al(法國(guó)專利2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087)。如Mundy在美國(guó)專利號(hào)4,656,127中披露的方法，應(yīng)用的引物與緊鄰多態(tài)性位點(diǎn)3’端的等位基因序列互補(bǔ)。該方法應(yīng)用標(biāo)記的二脫氧核苷酸衍生物測(cè)定該位點(diǎn)的核苷酸特點(diǎn)，如果該二脫氧核苷酸衍生物與多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸互補(bǔ)，它就會(huì)整合到引物末端。
Goelet，P.et al.(PCT申請(qǐng)?zhí)?2/15712)描述了另一種被稱為GeneticBit Analysis或GBATM的方法。Goelet，P.et al.的方法應(yīng)用標(biāo)記終止子和引物的混合物，所述引物與多態(tài)性位點(diǎn)的3’端序列互補(bǔ)。因此，可以通過(guò)預(yù)測(cè)靶分子多態(tài)性位點(diǎn)中存在的核苷酸測(cè)定整合的標(biāo)記終止子，所述核苷酸與標(biāo)記終止子互補(bǔ)。與Cohen et al(法國(guó)專利2,650,840；PCT申請(qǐng)?zhí)朩O91/02087)所述方法不同，Goelet，P.et al.的方法優(yōu)選異相試驗(yàn)，在試驗(yàn)中，引物或靶分子被固定在固相基質(zhì)上。
最近，業(yè)已描述了幾種在DNA中檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的引物指導(dǎo)性核苷酸整合法(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids.Res.177779-7784(1989)；Sokolov.B.P.，Nucl.Acids.Res.183671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 8；684-692(1990)；Kuppuswamy，M.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)881143-1147(1991)；Prezant，T.R.et al.，Hum.Mutat.1159-164(1992)；Ugozzoli，L.et al.，GATA 9107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208171-175(1993))。這些方法與GBATM不同的地方在于，它們?nèi)加匈囉跇?biāo)記脫氧核苷酸整合到多態(tài)性位點(diǎn)堿基存在差異的部位。在這種形式下，因?yàn)樾盘?hào)的強(qiáng)弱與整合脫氧核苷酸的數(shù)量成正比，因此，發(fā)生于相同核苷酸runs的多態(tài)性導(dǎo)致的信號(hào)與run長(zhǎng)度成正比(Syvanen，A.-C.，et al.，Amer.J.Hum.Genet.5246-59(1993))。
對(duì)于導(dǎo)致蛋白翻譯永久性終止的突變，蛋白截短試驗(yàn)(PTT)提供了一種有效的診斷方法(Roest，et al.，(1993)Hum.Mol.Genet.2；1719-21；van der Luijt，et al.，(1994)Genomics 201-4)。對(duì)于PTT，首先從可用組織中分離RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)PCR擴(kuò)增感興趣片段。然后將逆轉(zhuǎn)錄PCR的產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，所用引物含有RNA多聚酶啟動(dòng)子和啟動(dòng)真核細(xì)胞翻譯的序列。感興趣區(qū)域擴(kuò)增后，整合到引物中的獨(dú)特功能區(qū)可以進(jìn)行隨后的體外轉(zhuǎn)錄和PCR產(chǎn)物翻譯。翻譯產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，出現(xiàn)截短的肽信號(hào)提示存在導(dǎo)致蛋白永久性終止的突變。在該技術(shù)的改良方案中，當(dāng)感興趣靶區(qū)域源于單一外顯子時(shí)，可以應(yīng)用DNA(而非RNA)作為PCR模板。
可以應(yīng)用任何類型的細(xì)胞或組織獲得核酸樣本，用于本文描述的診斷方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA樣本可以獲取自體液，例如應(yīng)用已知技術(shù)(如靜脈穿刺抽血)獲取自血液，或唾液。此外，核酸試驗(yàn)還可在干燥樣本(如毛發(fā)或皮膚)中進(jìn)行。
診斷方法還可以直接在組織切片(固定和/或冰凍)上原位進(jìn)行，所述組織切片源于活檢或切除術(shù)獲得的患者組織，這樣就不需要進(jìn)行核酸純化了。在這些原位方法中，核酸制劑可以用作探針和/或引物(見(jiàn)例如，Nuovo，G.J.，1992，PCR in situ hybridizationprotocols and applications，Raven Press，NY)。
除了這些主要集中于一種核酸序列檢測(cè)的方法外，在這些檢測(cè)方案中還可評(píng)價(jià)某些特征。例如，可以應(yīng)用差異顯示方法、Northern分析和/或RT-PCR產(chǎn)生指紋特征。
一種優(yōu)選檢測(cè)方法是等位基因特異性雜交法，所用探針與Wnt信號(hào)組分的至少一個(gè)等位基因區(qū)域重疊，并在突變或多態(tài)性區(qū)域周圍存在大約5，10，20，25或30個(gè)核苷酸，所述Wnt信號(hào)組分可以提示青光眼。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將幾種能夠與涉及青光眼的等位基因變異體特異性雜交的探針粘附于固相支持物上，如“芯片”(能夠支持高達(dá)大約250,000個(gè)寡核苷酸)?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法使寡核苷酸與固體支持物結(jié)合，包括平版印刷術(shù)。應(yīng)用含有寡核苷酸的這些芯片進(jìn)行突變檢測(cè)分析的方法，又被稱為“DNA探針檢測(cè)”，如Cronin et al.(1996)HumanMutation 7244所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，芯片含有一個(gè)基因至少一個(gè)多態(tài)性區(qū)域的所有等位基因變異體。然后將固相支持物與測(cè)試核酸混合，檢測(cè)與特異性探針的雜交。因此，在一個(gè)簡(jiǎn)單的雜交試驗(yàn)中，可以鑒定一個(gè)或多個(gè)基因的很多等位基因變異體的身份。
這些技術(shù)在分析前還包括核酸擴(kuò)增步驟。擴(kuò)增技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)眾所周知，包括但不限于克隆，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，特異性等位基因多聚酶鏈反應(yīng)(ASA)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，巢式多聚酶鏈反應(yīng)，自主序列復(fù)制系統(tǒng)(Guatelli，J.C.et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878)，轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh，D.Y.et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)，以及Q-β復(fù)制酶(Lizardi，P.M.et al.，1988，Bio/Technology 61197)。
擴(kuò)增產(chǎn)物可以多種方式進(jìn)行試驗(yàn)分析，包括大小分析，大小分析后的限制性酶切分析，在反應(yīng)產(chǎn)物中探測(cè)特異性標(biāo)記寡核苷酸引物，等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交，等位基因特異性5’外切酶檢測(cè)，測(cè)序，雜交等。
基于PCR的檢測(cè)方法包括同時(shí)多重?cái)U(kuò)增多種標(biāo)記物。例如，本領(lǐng)域眾所周知，可以選擇PCR引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在大小上互不重疊，可以同時(shí)進(jìn)行分析。此外，還可以應(yīng)用不同標(biāo)記的引物擴(kuò)增不同的標(biāo)記物，使每一種產(chǎn)物可以區(qū)別檢測(cè)。當(dāng)然，基于雜交的檢測(cè)方法使樣本中的多種PCR產(chǎn)物可以進(jìn)行區(qū)別檢測(cè)。其他技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的，允許對(duì)多種標(biāo)記物進(jìn)行多重分析。
在一個(gè)僅為舉例說(shuō)明的實(shí)施方案中，方法包括以下步驟(i)從患者中收集細(xì)胞樣本，(ii)從樣本細(xì)胞中分離核酸(例如基因組，mRNA或兩者的混合物)，(iii)將核酸樣本與一種或多種引物混合，在能夠發(fā)生雜交和等位基因擴(kuò)增的條件下，所述引物能與提示青光眼的Wnt信號(hào)組分的至少一個(gè)等位基因的5’和3’雜交，以及(iv)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。這些檢測(cè)方案對(duì)于分子數(shù)量非常低的核酸分子的檢測(cè)尤為重要。
在研究試驗(yàn)的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)限制性酶切圖譜的變化可以鑒定提示青光眼的Wnt信號(hào)組分的異常水平或活性。例如，分離、擴(kuò)增(任選)樣本和對(duì)照DNA，然后應(yīng)用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化，通過(guò)凝膠電泳測(cè)定片段長(zhǎng)度。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的多種測(cè)序反應(yīng)直接進(jìn)行等位基因測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)示例包括那些基于由Maxim and Gilbert((1977)Proc.Natl Acad Sci USA 74560)或Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Natl Acad Sci USA 745463)開發(fā)的技術(shù)。還應(yīng)該考慮，在進(jìn)行研究試驗(yàn)時(shí)(見(jiàn)，例如Biotechniques(1995)19448)，可以應(yīng)用多種自動(dòng)測(cè)序方法，包括質(zhì)譜測(cè)序(見(jiàn)例如PCT公開內(nèi)容WO94/16101；Cohen et al.(1996)Adv Chromatogr 36127-162；and Griffin et al.(1993)Appl BiochemBiotechnol 38147-159)。很明顯，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，在某些實(shí)施方案中，測(cè)序反應(yīng)只需檢測(cè)一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核酸堿基的發(fā)生。例如，可以進(jìn)行A-Track等，例如在只檢測(cè)一個(gè)核酸時(shí)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用裂解制劑保護(hù)劑(如核酶，羥胺或四氧化鋨聯(lián)合哌啶)來(lái)檢測(cè)RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA雜合雙鏈中的錯(cuò)配堿基(Myers，et al.(1985)Science 2301242)。通常說(shuō)來(lái)，“錯(cuò)配裂解”領(lǐng)域的技術(shù)始于雜合雙鏈的提供，所述雜合雙鏈由含有野生型等位基因和樣本的雜交(標(biāo)記)RNA或DNA形成。然后應(yīng)用能夠裂解雙體分子中單鏈區(qū)域的制劑處理該雙鏈雙體分子，在對(duì)照和樣本鏈之間由于堿基錯(cuò)配會(huì)有這樣的單鏈區(qū)域存在。例如，RNA/DNA雜交分子可以應(yīng)用RNase來(lái)處理，而DNA/DNA雜交分子則可應(yīng)用S1核酶處理，消化錯(cuò)配區(qū)域。在其他實(shí)施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA雙體分子可以應(yīng)用羥胺或四氧化鋨聯(lián)合哌啶來(lái)處理，消化錯(cuò)配區(qū)域。消化錯(cuò)配區(qū)域后，在變性聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)分子大小分離消化獲得的物質(zhì)，確定突變位點(diǎn)。見(jiàn)，例如Cotton et al(1988)Proc.Natl Acad Sci USA 854397；and Saleeba et al(1992)Methods Enzymol.217286-295。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)照DNA或RNA經(jīng)標(biāo)記，便于檢測(cè)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用能夠在雙鏈DNA中識(shí)別錯(cuò)配堿基的一種或多種蛋白(即所謂的“DNA錯(cuò)配修復(fù)”酶)用于錯(cuò)配裂解反應(yīng)。例如，大腸桿菌的mutY酶可以裂解G/A錯(cuò)配中的A，而源于Hela細(xì)胞的胸苷DNA糖基化酶可以裂解G/T錯(cuò)配中的T(Hsu et al.(1994)Carcinogenesis151657-1662)。根據(jù)一個(gè)示例實(shí)施方案，一種適宜探針可以與源于測(cè)試細(xì)胞的cDNA或其他DNA雜交。然后應(yīng)用DNA錯(cuò)配修復(fù)酶處理該雙體分子，應(yīng)用電泳等策略檢測(cè)如果可能有的裂解產(chǎn)物。見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,459,039。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用電泳遷移率的變化鑒定可以提示青光眼的Wnt信號(hào)組分的異常水平或活性。例如，可以應(yīng)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)在突變和野生型核酸之間檢測(cè)電泳遷移率的差異(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad.Sci USA 862766，還見(jiàn)Cotton(1993)Mutat Res285125-144；and Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 973-79)。樣本和對(duì)照位點(diǎn)等位基因的單鏈DNA片段變性再?gòu)?fù)性。單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)根據(jù)序列而有所變化，導(dǎo)致的電泳遷移率的改變可以檢測(cè)甚至單個(gè)堿基的變化。DNA片段可以標(biāo)記，也可以應(yīng)用標(biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)。方法的敏感性可以通過(guò)應(yīng)用RNA(而非DNA)得到加強(qiáng)，在RNA中，二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)序列變化更敏感。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，研究方法根據(jù)電泳遷移率的變化，應(yīng)用雜合雙體分析來(lái)分離雙鏈雜合雙體分子(Keen et al.(1991)Trends Genet75)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用變性梯度凝膠電泳法(DGGE)在含有梯度變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)等位基因的遷移(Myers et al.(1985)Nature313495)。當(dāng)應(yīng)用DGGE作為分析方法時(shí)，DNA應(yīng)經(jīng)修飾，以確保它沒(méi)有完全變性，例如通過(guò)PCR添加一個(gè)大約40bp的高熔富GC的GC發(fā)夾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在變性制劑梯度中應(yīng)用溫度梯度，鑒定對(duì)照和樣本DNA的遷移率差異(Rosenbaum and Reissner(1987)BiophysChem 26512753)。
檢測(cè)等位基因的其他示例技術(shù)包括但不限于選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴(kuò)增或選擇性引物延伸。例如，制備寡核苷酸引物，該引物中含有的已知突變或核苷酸變異(如等位基因變異體)被置于引物中央，然后在只允許完全匹配雜交發(fā)生的條件下將引物與靶DNA進(jìn)行雜交(Saikiet al.(1986)Nature 324163；Saiki et al(1989)Pro.Natl Acad.Sci USA 866230)。這些等位基因特異性寡核苷酸雜交技術(shù)可以在下述情況下用來(lái)檢測(cè)一個(gè)突變或多態(tài)性區(qū)域，所述情況包括當(dāng)寡核苷酸附著于雜交膜并與標(biāo)記靶DNA進(jìn)行雜交時(shí)，寡核苷酸與經(jīng)PCR擴(kuò)增的靶DNA或很多不同突變或多態(tài)性區(qū)域進(jìn)行雜交。
此外，有賴于選擇性PCR擴(kuò)增的等位基因特異性擴(kuò)增技術(shù)可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。作為特異性擴(kuò)增引物的寡核苷酸可以在分子的中心部分或引物的3’端盡頭攜帶感興趣突變或多態(tài)性區(qū)域(這樣擴(kuò)增就有賴于區(qū)別雜交)(Gibbs et al(1989)Nucleic Acids Res.172437-2448)，在適宜的條件下，可以防止錯(cuò)配的發(fā)生，或者降低多聚酶延伸反應(yīng)(Prossner(1993)Tibtech 11238)。此外，還需要在突變區(qū)域引入新的限制性酶切位點(diǎn)，建立基于裂解的檢測(cè)方法(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell Probes61)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，在某些實(shí)施方案中，可以應(yīng)用Taq連接酶進(jìn)行擴(kuò)增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88189)。在這些情況下，連接只在下述條件下發(fā)生，即5’序列的3’端完全匹配，這樣在特定位點(diǎn)檢測(cè)已知突變是否存在就可以通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增的存在或缺如來(lái)進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，等位基因變異體的鑒定通過(guò)應(yīng)用寡核苷酸連接試驗(yàn)(OLA)來(lái)進(jìn)行，如下述文獻(xiàn)所述，如美國(guó)專利號(hào)4,998,617，以及Landegren，U.et al.(1988)Science 2411077-1080。在OLA方法中，應(yīng)用兩個(gè)設(shè)計(jì)能夠與靶單鏈鄰接序列雜交的寡核苷酸。其中一個(gè)寡核苷酸與分隔標(biāo)記連接，如，生物素化分隔標(biāo)記，另一個(gè)進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。如果在靶分子中存在完全互補(bǔ)序列，寡核苷酸將會(huì)雜交，這樣他們的末端臨近并形成連接底物。連接允許應(yīng)用親和素或其他生物素配體使標(biāo)記的寡核苷酸恢復(fù)。Nickerson，D.A.et al.描述了一種結(jié)合PCR和OLA的核酸檢測(cè)試驗(yàn)方法(Nickerson，D.A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA878923-27)。在該方法中，應(yīng)用PCR獲得靶DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，然后應(yīng)用OLA檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
業(yè)已開發(fā)出幾種基于這種OLA的技術(shù)，可以用來(lái)檢測(cè)提示青光眼的Wnt信號(hào)組分的異常水平或活性。例如，美國(guó)專利號(hào)5,593,826披露了一種OLA方法，應(yīng)用具有3’氨基的寡核苷酸和5’磷酸化寡核苷酸形成一個(gè)含有氨基磷酸酯連接的結(jié)合物。在Tobe et al((1996)Nucleic Acids Res 243728)描述的另一種OLA變異方法中，OLA與PCR的結(jié)合可以在單一微升孔中測(cè)定兩種等位基因類型。通過(guò)將每種等位基因特異性引物標(biāo)記一個(gè)獨(dú)特的半抗原，即地高辛和熒光素，然后應(yīng)用半抗原特異性抗體檢測(cè)每個(gè)OLA反應(yīng)，所述抗體應(yīng)用不同的報(bào)道酶、堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記。該系統(tǒng)可以通過(guò)產(chǎn)生兩種不同顏色，以高產(chǎn)量形式檢測(cè)兩種等位基因。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案針對(duì)可以檢測(cè)青光眼易感性的試劑盒。該試劑盒含有一種或多種寡核苷酸，包括能夠與至少一個(gè)Wnt信號(hào)組分的5’和3’雜交的5’和3’寡核苷酸。為了便于隨后的分析，產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物應(yīng)該大小適宜，PCR擴(kuò)增寡核苷酸應(yīng)該能夠與25-2500個(gè)分離堿基對(duì)雜交，優(yōu)選大約100-500個(gè)分離堿基。
為了用于試劑盒，寡核苷酸可以是多種天然和/或合成組合物的任意一種，如合成寡核苷酸，限制性片段，cDNA，合成肽核酸(PNAs)等。試驗(yàn)試劑盒還可應(yīng)用標(biāo)記寡核苷酸，使試驗(yàn)中的鑒別工作變得更加容易?？梢圆捎玫臉?biāo)記示例包括放射性標(biāo)記，酶，熒光化合物，鏈霉親和素，親和素，生物素，磁性等分，金屬結(jié)合等分，抗原或抗體等分等。
試劑盒還可以任選包括DNA取樣方法。DNA取樣方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員中眾所周知，包括但不限于底物，如濾紙等；DNA純化試劑如NucleonTM試劑盒，裂解緩沖液，蛋白酶溶液等；PCR試劑如10x反應(yīng)緩沖液，熱穩(wěn)定多聚酶，dNTPs等；以及等位基因檢測(cè)方法如限制性酶，等位基因特異性寡核苷酸，來(lái)自干燥血液用于巢式PCR的變性寡核苷酸引物。
4.4.青光眼治療藥物的篩檢試驗(yàn)本發(fā)明還提供了鑒定青光眼治療藥物的篩檢方法。青光眼的治療藥物可以是任何類型的化合物，包括蛋白、肽、擬肽、小分子和核酸。核酸可以是，例如基因、反義核酸、核酶或三體分子。本發(fā)明的青光眼治療藥物可以是Wnt信號(hào)組分活性的激動(dòng)劑，或者是FRP或Wnt信號(hào)拮抗活性的拮抗劑。優(yōu)選的激動(dòng)劑包括Wnt信號(hào)組分或者表達(dá)由Wnt信號(hào)調(diào)控的基因和蛋白。
本發(fā)明還提供了鑒定青光眼治療藥物的篩檢方法，所述治療藥物能夠與FRP蛋白結(jié)合，進(jìn)而干擾其對(duì)Wnt信號(hào)的阻斷，或者治療藥物能夠與Wnt信號(hào)組分結(jié)合，進(jìn)而激動(dòng)Wnt信號(hào)組分的活性。
根據(jù)化合物類型和所需化合物活性，可以應(yīng)用多種試驗(yàn)方法鑒定本發(fā)明化合物。下面披露的是可以用來(lái)鑒定青光眼治療藥物的至少一些方法。根據(jù)基于小梁網(wǎng)基因活性的Wnt信號(hào)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)其他鑒定青光眼治療藥物的試驗(yàn)方法。
4.4.1.無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)方法可以應(yīng)用無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)方法鑒定能夠與FRP，Wnt信號(hào)組分或其配體發(fā)生相互作用的化合物。這樣的化合物能夠，例如修飾FRP，Wnt信號(hào)組分或其配體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其活性。無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)方法還可用來(lái)鑒定能夠調(diào)節(jié)FRP或Wnt信號(hào)組分與結(jié)合配體相互作用的化合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，鑒定這些化合物的無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)方法主要包括反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物在有或沒(méi)有結(jié)合配體存在的情況下，含有FRP或Wnt信號(hào)組分以及測(cè)試化合物或測(cè)試化合物庫(kù)。測(cè)試化合物可以是，例如結(jié)合配體衍生物，如生物滅活靶肽，或小分子。
因此，本發(fā)明的一個(gè)示例篩檢試驗(yàn)方法包括以下步驟，將FRP、Wnt信號(hào)組分或其功能片段、或者結(jié)合配體與測(cè)試化合物或測(cè)試化合物庫(kù)混和，然后檢測(cè)復(fù)合物的形成。為了便于檢測(cè)，可以將分子用一種特異性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，將測(cè)試化合物或測(cè)試化合物庫(kù)用另一種不同的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。測(cè)試化合物與FRP、Wnt信號(hào)組分或其功能片段、或其結(jié)合配體的相互作用可以在孵育步驟和清洗步驟后，通過(guò)測(cè)定兩種標(biāo)記的水平進(jìn)行檢測(cè)。在清洗步驟后，存在兩種標(biāo)記提示有相互作用。
分子間相互作用還可應(yīng)用實(shí)時(shí)BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor AB)進(jìn)行鑒定，該方法檢測(cè)表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SPR)，這是一種光學(xué)現(xiàn)象。檢測(cè)有賴于大分子在生物特異性界面上質(zhì)量濃度的變化，不需要對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試化合物庫(kù)可以固定在傳感器表面上，例如，形成一個(gè)流動(dòng)細(xì)胞墻。然后，含有FRP、Wnt信號(hào)組分、其功能片段、或其結(jié)合配體的溶液持續(xù)流過(guò)傳感器表面。在信號(hào)記錄儀上顯示的共振角變化就會(huì)提示相互作用的發(fā)生。該技術(shù)在例如Pharmacia編寫的BIAtechnology用戶手冊(cè)中有進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
本發(fā)明的另一個(gè)示例篩檢試驗(yàn)方法包括以下步驟(a)形成反應(yīng)混合物，包括(i)FRP或Wnt信號(hào)多肽，(ii)其結(jié)合配體，以及(iii)測(cè)試化合物；以及(b)測(cè)定FRP或Wnt信號(hào)多肽與結(jié)合蛋白的相互作用。如本文所述，F(xiàn)RP或Wnt信號(hào)組分與結(jié)合配體可以重組制備，從來(lái)源中純化，如血漿，或者化學(xué)合成。在有測(cè)試化合物存在的情況下，相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在的情況，F(xiàn)RP或Wnt信號(hào)組分與結(jié)合蛋白的相關(guān)作用存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(增強(qiáng)或抑制)，提示該測(cè)試化合物為FRP或Wnt信號(hào)生物活性的潛在激動(dòng)劑(擬態(tài)劑或增強(qiáng)劑)或拮抗劑(抑制劑)。這種試驗(yàn)方法的化合物可以同時(shí)混和。此外，F(xiàn)RP或Wnt信號(hào)組分可以首先與測(cè)試化合物混和一段適宜時(shí)間，然后將結(jié)合配體加入反應(yīng)混合物?；衔锏男Ч梢酝ㄟ^(guò)產(chǎn)生的劑量反應(yīng)曲線來(lái)評(píng)價(jià)，該劑量反應(yīng)曲線數(shù)據(jù)通過(guò)應(yīng)用不同濃度的測(cè)試化合物獲得。而且，還應(yīng)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，提供用于對(duì)比的基線值。在對(duì)照試驗(yàn)中，將分離或純化的FRP或Wnt信號(hào)組分加入含有FRP結(jié)合配體或Wnt信號(hào)組分結(jié)合配體的組合物中，然后在沒(méi)有測(cè)試化合物的條件下，定量檢測(cè)復(fù)合物的形成。
可以通過(guò)多種技術(shù)檢測(cè)FRP蛋白與FRP結(jié)合配體的復(fù)合物形成。復(fù)合物形成的調(diào)制可以應(yīng)用，例如可檢測(cè)標(biāo)記蛋白，如放射標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的FRP、Wnt信號(hào)組分或結(jié)合配體，通過(guò)免疫試驗(yàn)或者色譜法進(jìn)行定量檢測(cè)。
典型地，需要固定FRP、Wnt信號(hào)組分或其結(jié)合配體，這樣可以使復(fù)合物與一種或兩種未結(jié)合蛋白的分離變得更加容易，還可使試驗(yàn)可以自動(dòng)進(jìn)行。FRP或Wnt信號(hào)組分與結(jié)合配體的結(jié)合可以在任何適宜裝載反應(yīng)試劑的容器中進(jìn)行。示例包括微量滴定板，試管和微量離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的融合蛋白增加了一個(gè)功能區(qū)，使蛋白可以結(jié)合到基質(zhì)上。例如，谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白可以吸附到谷光甘肽sepharose珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷光甘肽衍生性微量滴定板上，然后再與結(jié)合配體例如35S標(biāo)記的結(jié)合配體，以及測(cè)試化合物結(jié)合，并在能夠形成復(fù)合物的條件下孵育混合物，例如，在生理狀態(tài)的鹽和pH的條件下，盡管可能需要稍微更嚴(yán)格一些的條件。孵育后，清洗珠子，去除任何未結(jié)合標(biāo)記，基質(zhì)固定，直接進(jìn)行放射標(biāo)記的測(cè)定(如將珠子置于閃爍劑中)，或者在隨后將復(fù)合物分離后，在上清中測(cè)定放射標(biāo)記。此外，從基質(zhì)中分離復(fù)合物，SDS-PAGE分離，然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)如下述實(shí)施例所述，從凝膠中定量珠子部分存在的FRP或Wnt信號(hào)組分或結(jié)合配體的水平。
其他將蛋白質(zhì)固定于基質(zhì)上的技術(shù)也可用于本研究試驗(yàn)方法。例如，可以利用生物素與鏈霉親和素的結(jié)合，固定FRP，Wnt信號(hào)組分或其同類結(jié)合配體。例如，可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，從生物素-NHS(N-羥基-琥珀酰亞胺)中制備生物素化的FRP或Wnt信號(hào)組分，然后將之固定于鏈霉親和素包被的96孔板中(Pierce Chemical)。此外，能與FRP或Wnt信號(hào)組分起反應(yīng)的抗體也可加入平板孔中，通過(guò)抗體結(jié)合可以將FRP或Wnt信號(hào)組分固定于孔中。如上所述，在有FRP或Wnt信號(hào)組分存在的平板中孵育FRP或Wnt信號(hào)組分、結(jié)合蛋白和測(cè)試化合物制劑，定量孔中形成的復(fù)合物的量。除了上述檢測(cè)GST-固定復(fù)合物的方法外，檢測(cè)這些復(fù)合物的示例方法還包括免疫檢測(cè)復(fù)合物法和酶聯(lián)試驗(yàn)，前者應(yīng)用能與FRP或Wnt信號(hào)組分結(jié)合配體起反應(yīng)的抗體，或者能與FRP或Wnt信號(hào)組分蛋白起反應(yīng)而且能與結(jié)合配體競(jìng)爭(zhēng)的抗體；后者有賴于檢測(cè)與結(jié)合配體相關(guān)的酶活性，可以是內(nèi)在活性，也可以是外在活性。在后述情況下，酶可以與結(jié)合配體化學(xué)結(jié)合，也可以與其以融合蛋白的形式出現(xiàn)。為了舉例說(shuō)明，結(jié)合配體可以與辣根過(guò)氧化物酶化學(xué)交聯(lián)，也可以與其基因融合，復(fù)合物中多肽的量可以應(yīng)用酶的發(fā)色底物，如3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽或4-chloro-l-napthol來(lái)評(píng)價(jià)。同樣，可以提供含有多肽和谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白，然后應(yīng)用1-氯-2,4-二硝基苯檢測(cè)GST活性來(lái)定量形成的復(fù)合物。
對(duì)于有賴于免疫檢測(cè)法的復(fù)合物中一種蛋白的定量過(guò)程，可以應(yīng)用抗該蛋白的抗體。此外，復(fù)合物中待檢測(cè)的蛋白質(zhì)還可能以融合蛋白的形式成為“抗原決定簇標(biāo)記”，所述融合蛋白除了FRP或Wnt信號(hào)組分序列外，還包括第二種多肽，其抗體可以容易地獲得(例如通過(guò)商業(yè)途徑)。例如，應(yīng)用針對(duì)GST等分的抗體，上述GST融合蛋白就可以用來(lái)定量結(jié)合。其他有用的抗原決定簇標(biāo)記包括myc抗原決定簇(如見(jiàn)Ellisonet al.(1991)J Biol Chem 26621150-21157)，以及pFLAG系統(tǒng)(International Biotechnologies，Inc.)或pEZZ蛋白A系統(tǒng)(Pharmacia，NJ)，所述myc該抗原決定簇包括源于c-myc的10個(gè)殘基的序列。
無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)方法還可用來(lái)鑒定能夠與FRP或Wnt信號(hào)組分發(fā)生相互作用以及能夠調(diào)制其活性的化合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，將FRP或Wnt信號(hào)組分與測(cè)試化合物混和，然后監(jiān)測(cè)FRP或Wnt信號(hào)組分的催化活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，檢測(cè)FRP或Wnt信號(hào)組分與靶肽結(jié)合的能力。
4.4.2.基于細(xì)胞的試驗(yàn)方法除了如上所述的無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)方法，本發(fā)明提供的FRP蛋白還使基于細(xì)胞的試驗(yàn)方法的產(chǎn)生變得容易，如鑒定小分子激動(dòng)劑或拮抗劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞膜外表面表達(dá)FRP蛋白的細(xì)胞與測(cè)試化合物單獨(dú)孵育，或者與測(cè)試化合物以及已知能夠與FRP發(fā)生相互作用的分子共同孵育，然后應(yīng)用例如微生理儀檢測(cè)FRP與測(cè)試化合物之間的相互作用(McConnell et al.(1992)Science 2571906)。FRP與測(cè)試化合物之間的相互作用可以通過(guò)微生理儀檢測(cè)培養(yǎng)基中酸度的變化來(lái)進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明基于細(xì)胞的試驗(yàn)方法應(yīng)用的人類細(xì)胞源于正?；蚯喙庋刍颊叩难劢M織小梁網(wǎng)。
人類小梁網(wǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)增殖允許在可重復(fù)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行該類獨(dú)特細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性研究。人類小梁網(wǎng)細(xì)胞可以從小梁網(wǎng)組織粉碎的外植體中有效生長(zhǎng)，而且培養(yǎng)細(xì)胞可以在體外通過(guò)多種途徑維持未培養(yǎng)小梁網(wǎng)細(xì)胞獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)特征。小梁網(wǎng)細(xì)胞擁有廣泛的生化和結(jié)構(gòu)特征，這些特征對(duì)于維持房水回流通路非常重要。這些特征包括小梁網(wǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)成為內(nèi)皮細(xì)胞單層，細(xì)胞表面呈非血栓性，產(chǎn)生血漿酶原激活因子，活躍的吞噬作用，以及合成粘多糖、膠原、纖連蛋白和其他結(jié)締組織元素的能力。透明質(zhì)酸酶和其他溶酶體酶的存在強(qiáng)調(diào)，人小梁網(wǎng)細(xì)胞能夠代謝透明質(zhì)酸和其他細(xì)胞外物質(zhì)。體外小梁網(wǎng)細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制可以通過(guò)下述手段進(jìn)行檢驗(yàn)，包括評(píng)價(jià)例如通路延長(zhǎng)、過(guò)氧化物暴露和細(xì)胞形態(tài)激光處理的影響。
基于小梁網(wǎng)細(xì)胞或其他類型細(xì)胞的試驗(yàn)方法還可用來(lái)鑒定化合物，這些化合物可以調(diào)制FRP基因的表達(dá)，調(diào)制FRP mRNA的翻譯，或者調(diào)制FRP mRNA或蛋白的穩(wěn)定性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠產(chǎn)生FRP的細(xì)胞，如小梁網(wǎng)細(xì)胞與測(cè)試化合物共同孵育，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生的FRP的量，并與沒(méi)有與測(cè)試化合物共同孵育的小梁網(wǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的量進(jìn)行比較。化合物對(duì)FRP的特異性可以通過(guò)多種對(duì)照分析進(jìn)行確證，如檢測(cè)一種或多種對(duì)照基因的表達(dá)。
測(cè)試化合物包括小分子，蛋白和核酸。特別是，該方法可以用來(lái)測(cè)定FRP反義分子或核酶的功效。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用與FRP基因啟動(dòng)子至少一個(gè)部位操作性連接的報(bào)道基因，通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，測(cè)試化合物對(duì)FRP基因轉(zhuǎn)錄的作用?；虻膯?dòng)子區(qū)域可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知方法從例如基因組文庫(kù)中分離。報(bào)道基因可以是編碼易于定量的蛋白質(zhì)的任何基因，如熒光素酶或CAT基因，這些基因本領(lǐng)域眾所周知。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，報(bào)道基因是能夠被Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)錄激活的天然或合成基因。例如，在Wnt誘導(dǎo)下，鋸齒蛋白(engrailed)基因被激活。而且，鋸齒蛋白表達(dá)的增加導(dǎo)致刺猬蛋白基因的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，使刺猬蛋白基因在Wnt的作用下也被激活。最后，能夠由核LEF(tcf)/β-連環(huán)蛋白激活的合成報(bào)道基因也可以成為衡量Wnt誘導(dǎo)的敏感報(bào)道基因。
如本文所述，本發(fā)明還涉及通過(guò)上述篩檢試驗(yàn)鑒定的新制劑及其治療應(yīng)用。
4.5.治療疾病的方法“青光眼治療藥物”可以是拮抗劑，也可以是激動(dòng)劑，可以是上述任何適宜制劑，包括應(yīng)用本文提供的藥物篩檢方法鑒定的分離的多肽，基因治療構(gòu)建物，反義分子，擬肽，小分子，非核酸，非肽或制劑。
本發(fā)明提供了預(yù)防或治療某個(gè)體的方法，所述個(gè)體業(yè)已罹患或可能罹患與FRP或Wnt通路組分基因表達(dá)或活性異常相關(guān)的疾病，如青光眼。
4.5.1.預(yù)防方法一方面，本發(fā)明提供了一種在個(gè)體中預(yù)防疾病或病況的方法，該方法包括給該個(gè)體應(yīng)用一種能夠調(diào)制FRP或Wnt通路組分基因表達(dá)或至少一個(gè)FRP或Wnt通路組分基因活性的制劑，所述疾病或病況與異常的FRP或Wnt通路組分基因表達(dá)或活性相關(guān)。具有罹患該疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體可以通過(guò)如本文所述的診斷或預(yù)后方法進(jìn)行鑒定。預(yù)防制劑可以在出現(xiàn)FRP或Wnt通路組分基因異常的表現(xiàn)癥狀特征之前應(yīng)用，這樣，疾病或病況就得到預(yù)防，或者其進(jìn)展得到延緩。根據(jù)異常FRP或Wnt通路組分基因的類型，例如，可以應(yīng)用FRP或Wnt通路組分基因激動(dòng)劑或FRP或Wnt通路組分基因拮抗劑制劑來(lái)預(yù)防性處理個(gè)體。預(yù)防方法與本發(fā)明的治療方法類似，將在下面的部分給予進(jìn)一步闡述。
4.5.2.治療方法通常說(shuō)來(lái)，本發(fā)明提供了一種治療疾病或病況的方法，該方法包括給個(gè)體應(yīng)用有效劑量的能夠調(diào)制FRP或Wnt通路組分基因活性的化合物，所述疾病或病況由異常的FRP或Wnt通路組分基因活性所致。能夠用來(lái)減輕涉及FRP或Wnt通路組分基因活性異常的疾病癥狀的方法包括，例如如上所述的反義，核酶，和三螺旋分子或小的有機(jī)物。適宜化合物的示例包括拮抗劑，激動(dòng)劑或本文詳述物質(zhì)的同系物。
4.5.3.有效劑量可以在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)方法檢測(cè)這些化合物的毒性和療效，如測(cè)定LD50(使群體中50％死亡的劑量)和ED50(在50％群體中治療有效的劑量)。毒性作用和治療效果的劑量比率是治療指數(shù)，可以表示為L(zhǎng)D50/ED50。優(yōu)選治療指數(shù)大的化合物。盡管可以應(yīng)用有毒副作用的化合物，但在設(shè)計(jì)給藥系統(tǒng)時(shí)應(yīng)該注意，將這些化合物定向?qū)氲绞芾劢M織部位，使其對(duì)未受累細(xì)胞的潛在危害最小化，進(jìn)而減少副作用。
在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用來(lái)制定用于人類的劑量范圍。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選位于這樣的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，所述循環(huán)濃度包括的濃度x，其ED50的毒性作用很小或沒(méi)有毒性。劑量可以在該范圍內(nèi)根據(jù)所用劑型和給藥方式而有所變化。對(duì)于本發(fā)明方法中應(yīng)用的任何化合物，開始時(shí)其治療有效劑量都可以從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中估計(jì)。在動(dòng)物模型中可以制定一個(gè)劑量，使循環(huán)血漿濃度范圍包括IC50，包括在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中測(cè)定的濃度x的IC50(即測(cè)試化合物的濃度可以使癥狀得到一半抑制)。這些信息可以用來(lái)更精確地確定人類應(yīng)用劑量。例如可以應(yīng)用高效液相層析測(cè)定血漿水平。
4.5.4.在臨床試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)FRP/Wnt治療藥物的效果根據(jù)FRP或Wnt通路組分基因或疾病遺傳學(xué)特征，確定預(yù)期可以顯示最好臨床效果的人群的能力使下述方面成為可能1)對(duì)已經(jīng)上市但市場(chǎng)反應(yīng)不好的藥物進(jìn)行重新定位；2)援救備選藥物，其臨床開發(fā)由于安全性或療效的限制而不能繼續(xù)，這種限制是部分患者特異性的；以及3)加速備選藥物的開發(fā)過(guò)程，并使備選藥物開發(fā)的成本降低，藥物標(biāo)記更加理想(例如，應(yīng)用FRP或Wnt通路組分基因作為標(biāo)記，可以用來(lái)使有效劑量最優(yōu)化)。
治療FRP或Wnt通路組分基因的個(gè)體，應(yīng)用通過(guò)檢測(cè)FRP或Wnt通路組分基因特征對(duì)治療進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述特征如FRP或Wnt通路組分基因蛋白水平或活性，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因mRNA水平，和/或FRP或Wnt通路組分基因轉(zhuǎn)錄水平。這些檢測(cè)指標(biāo)可以提示治療是否有效，或者是否應(yīng)該對(duì)治療進(jìn)行調(diào)制或優(yōu)化。因此，可以應(yīng)用FRP或Wnt通路組分基因作為臨床試驗(yàn)期間藥物療效的標(biāo)記。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種監(jiān)測(cè)某制劑(如激動(dòng)劑，拮抗劑，擬肽，蛋白，肽，核酸，小分子或其他應(yīng)用本文所述篩檢方法鑒定的備選藥物)治療受試者有效性的方法，該方法包括以下步驟(i)在應(yīng)用制劑前，獲得受試者治療前樣本；(ii)檢測(cè)治療前；(iii)獲得一個(gè)或多個(gè)受試者治療后樣本；(iv)檢測(cè)治療后樣本FRP或Wnt通路組分基因蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平；(v)將治療前樣本FRP或Wnt通路組分基因蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平與治療后一個(gè)或多個(gè)樣本的FRP或Wnt通路組分基因蛋白、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平進(jìn)行比較；以及(vi)根據(jù)結(jié)果修正受試者制劑的應(yīng)用。例如，如果需要將FRP或Wnt通路組分基因的表達(dá)或活性提高到高于檢測(cè)水平，可以增量使用制劑，即增加制劑的效果。此外，如果需要將FRP或Wnt通路組分基因的表達(dá)或活性降低到低于檢測(cè)水平，可以減量使用制劑，即降低制劑的效果。
還可以在應(yīng)用FRP或Wnt通路組分基因治療藥物前后獲取受試者細(xì)胞，檢測(cè)FRP或Wnt通路組分基因之外的其他基因的表達(dá)水平，確認(rèn)FRP或Wnt通路組分基因治療藥物不會(huì)產(chǎn)生有害的基因表達(dá)的增加或降低。可以應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)錄profiling來(lái)達(dá)成這一點(diǎn)。因此，可以應(yīng)用體內(nèi)暴露于FRP或Wnt通路組分基因治療藥物的細(xì)胞mRNA以及未暴露于FRP或Wnt通路組分基因治療藥物的細(xì)胞mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后與含有多種基因DNA的芯片進(jìn)行雜交，進(jìn)而比較經(jīng)過(guò)或未經(jīng)FRP或Wnt通路組分基因治療藥物處理的細(xì)胞的基因表達(dá)。如果，例如，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因治療藥物使個(gè)體的原癌基因表達(dá)開放，那么這種特定FRP或Wnt通路組分基因治療藥物可能是不受歡迎的。
4.5.5.配方和應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明所用的藥物組合物可以應(yīng)用一種或多種生理可接受載體或賦形劑以傳統(tǒng)方式制備。因此，化合物及其生理可接受鹽類、溶劑可以制備成用于，例如注射、吸入或吹入(通過(guò)口腔或鼻腔)或局部外用、口服、口腔、非腸道或直腸的制劑。
對(duì)于這樣的治療，本發(fā)明化合物可以制備成多種給藥方式，包括系統(tǒng)給藥，外用或局部給藥。所用技術(shù)和制劑通?？梢詤⒖糝emmington’sPharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.Easton，PA。注射通常不是系統(tǒng)給藥的優(yōu)選方式，而口服劑型則是。本發(fā)明的局部眼用組合物可以與一種或多種藥用賦形劑配伍，如緩沖劑，防腐劑(包括防腐佐劑)，張力調(diào)節(jié)劑，表面活性劑，助溶劑，穩(wěn)定劑，舒適感增強(qiáng)劑，緩和劑，pH調(diào)節(jié)劑和潤(rùn)滑劑。眼部外用組合物的pH通常制備成4.5-8，滲透壓為26-320mOSm/kg。對(duì)于系統(tǒng)給藥，優(yōu)選注射，包括肌內(nèi)注射，靜脈內(nèi)注射，腹腔注射和皮下注射。對(duì)于注射制劑，本發(fā)明化合物可以制成溶液形式，優(yōu)選溶于生理可兼容緩沖液，如Hank’s液或Ringer’s液。此外，化合物還可制備成固體形式，在用前溶解或再懸。還包括凍干形式。
對(duì)于口服給藥，藥物組合物可以采用例如通過(guò)傳統(tǒng)方式與藥用賦形劑制備的片劑或膠囊的形式，所述藥用賦形劑如結(jié)合劑(如pregelatinised玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)，填充劑(如乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)，潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂，云母或硅土)，分散劑(如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)，或濕潤(rùn)劑(如硫酸月桂酸鈉)。片劑可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行包衣。口服液體制劑可以采用例如溶液、糖漿或懸液的形式，或者也可以以干品形式呈現(xiàn)，然后在使用前用水或其他適宜載體進(jìn)行溝兌。這些液體制劑可以通過(guò)傳統(tǒng)方法與藥物添加劑共同制備，所述藥用添加劑如懸浮劑(如山梨醇糖漿，纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)，乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯樹膠)，非水性載體(如，ationdoil，油脂，酒精或分餾植物油)，以及防腐劑(如甲基或丙基-p-羥安息香酸或山梨酸)。制劑還可以包括適宜的緩沖鹽，調(diào)味劑，色素和增甜劑。
口服制劑還可以通過(guò)適宜制備，控制活性化合物的釋放。對(duì)于口腔用藥，組合物可以采用以傳統(tǒng)方式制備的片劑或錠劑的形式。對(duì)于吸入給藥，本發(fā)明應(yīng)用的化合物可以應(yīng)用適宜的推進(jìn)劑通過(guò)加壓裝置或噴霧器以氣霧劑的形式方便地給藥，所述推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他適宜氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可以通過(guò)提供閥門來(lái)確定，這樣可以給予一定數(shù)量的藥物。例如用于吸入器或吹入器的白明膠膠囊和cartridge，可以制備成含有化合物和適宜粉基的粉劑混合物，所述粉基如乳糖或淀粉。
化合物還可以制備用于通過(guò)注射的非腸道給藥，如彈丸注射或連續(xù)輸注。注射制劑可以以單位劑量的形式存在，如在安瓿中或在多劑量容器中，并添加防腐劑。組合物可以采用如下形式，如懸液，溶液或溶于油性或水性載體的乳劑，并可含有如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的制劑。此外，活性成分還可以是粉劑，在使用前用適宜的載體進(jìn)行溝兌，如無(wú)病原體消毒水。
化合物還可制備成直腸用組合物，如栓劑或保留灌腸劑，如含有傳統(tǒng)栓劑基質(zhì)，如可可油或其他甘油酯。
除了前述制劑，化合物還可制備成長(zhǎng)效制劑。這些長(zhǎng)效制劑可以局部應(yīng)用，通過(guò)植入(如皮下或肌內(nèi))或肌內(nèi)注射。因此，例如，化合物可以與適宜的多聚物或疏水物質(zhì)(如在適宜的油類中的乳劑)或離子交換樹脂一起制備，或者制備成sparingly可溶性衍生物，如sparingly可溶性鹽。其他適宜的給藥系統(tǒng)包括微球系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在一段較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，將藥物無(wú)損性局部導(dǎo)入。該技術(shù)應(yīng)用的微球?yàn)榍懊?xì)血管大小，可以通過(guò)冠脈導(dǎo)管注射到任何所需部分，如心臟或其他器官，而不導(dǎo)致炎癥或缺血。應(yīng)用的治療藥物可以從這些微球中緩慢釋放，并通過(guò)周圍的組織細(xì)胞(如上皮細(xì)胞)攝取。
系統(tǒng)給藥還可以通過(guò)經(jīng)粘膜或經(jīng)皮途徑進(jìn)行。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，制劑中可以應(yīng)用能夠滲透屏障的適宜滲透劑。這些滲透劑在本領(lǐng)域通常已知，包括，例如經(jīng)粘膜給藥的膽鹽和梭鏈孢酸衍生物。此外，還可應(yīng)用去污劑使?jié)B透變得更加容易。經(jīng)粘膜給藥可以通過(guò)鼻腔噴霧或應(yīng)用栓劑。對(duì)于外用給藥，本發(fā)明的寡聚體可以制備成本領(lǐng)域通常已知的藥膏、油膏、凝膠或霜?jiǎng)?。還可以局部應(yīng)用洗液治療損傷或炎癥，加速愈合。
在臨床工作中，可以通過(guò)本領(lǐng)域熟悉的多種方法，將治療性FRP或Wnt通路組分基因的基因?qū)胂到y(tǒng)引入患者中。例如，基因?qū)胂到y(tǒng)的藥用制劑可以通過(guò)眼內(nèi)注射或系統(tǒng)給藥如靜脈注射引入，蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)可以主要通過(guò)基因?qū)胼d體的特異性轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞型或組織型表達(dá)是由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列控制報(bào)道基因的表達(dá)，或者兩者結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組基因的起始導(dǎo)入限制更多，需要定位導(dǎo)入到動(dòng)物體內(nèi)。例如，基因?qū)胼d體可以通過(guò)導(dǎo)管(見(jiàn)美國(guó)專利5,328,470)或定位注射(如Chen et al.(1994)PNAS 913054-3057)的方式導(dǎo)入。FRP或Wnt通路組分基因可以以基因治療構(gòu)建物的形式通過(guò)例如Dev et al.(1994) Cancer Treat Rev 20105-115所述的電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)或transcleral iontophoresis技術(shù)導(dǎo)入。
基因治療構(gòu)建物的藥物制劑或本發(fā)明化合物可以主要包括適宜稀釋的基因?qū)胂到y(tǒng)，或者包括緩釋基質(zhì)，該基質(zhì)中埋入基因?qū)胼d體或化合物。此外，當(dāng)完整的基因?qū)胂到y(tǒng)可以從重組細(xì)胞中完全制備時(shí)，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，藥物制劑可以包括一種或多種制備該基因?qū)胂到y(tǒng)的細(xì)胞。
如果需要，組合物還可以包裝或dispenser裝置的形式存在，包裝或裝置中可以包括含有活性成分的一個(gè)或多個(gè)劑型單位。例如，包裝可以含有金屬或塑料襯托，如真空成形泡殼包裝。包裝或dispenser裝置中還可以包括使用說(shuō)明書。
4.6.試劑盒本發(fā)明還提供了用于診斷或預(yù)后方法或者用于治療疾病或病況的試劑盒，所述疾病或病況與異常的FRP或Wnt通路組分基因蛋白相關(guān)。本發(fā)明還提供了確定給某受試者應(yīng)用哪種FRP或Wnt通路組分基因治療藥物的試劑盒。本發(fā)明包括的試劑盒可以檢測(cè)生物樣本中FRP或Wnt通路組分基因mRNA或蛋白的存在，還可以檢測(cè)FRP或Wnt通路組分基因中存在的突變，或者鑒定FRP或Wnt通路組分基因中的多態(tài)性區(qū)域。例如，試劑盒可以包括能夠檢測(cè)生物樣本中FRP或Wnt通路組分基因蛋白或mRNA的標(biāo)記化合物或制劑；檢測(cè)樣本中FRP或Wnt通路組分基因量的方法；以及將樣本中FRP或Wnt通路組分基因的量與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較的方法。化合物或制劑可以包裝在適宜的容器中。試劑盒還可包括應(yīng)用試劑盒檢測(cè)FRP或Wnt通路組分基因mRNA或蛋白的使用說(shuō)明書。
在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分基因拮抗劑治療藥物的藥物組合物和治療或預(yù)防高血壓的使用說(shuō)明書。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分基因拮抗劑治療藥物的藥物組合物和治療眼病如青光眼的使用說(shuō)明書。通常說(shuō)來(lái)，試劑盒包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分基因激動(dòng)劑或拮抗劑治療藥物的藥物組合物和作為青光眼治療藥物的使用說(shuō)明書。例如，試劑盒可以包括含有有效劑量FRP或Wnt通路組分基因激動(dòng)劑治療藥物的藥物組合物和用作止痛劑的使用說(shuō)明書。
還有其他試劑盒可以用來(lái)確定一個(gè)個(gè)體是否已經(jīng)發(fā)病或傾向于發(fā)病，所述疾病與異常的FRP或Wnt通路組分基因活性相關(guān)。這樣的試劑盒可以包括，例如一種或多種核酸探針，所述探針可以與FRP或Wnt通路組分基因或其等位基因變異體或其變異形式的至少一個(gè)部分進(jìn)行特異性雜交。
4.7.FRP或Wnt通路基因蛋白和核酸的其他應(yīng)用本發(fā)明FRP或Wnt通路組分基因核酸還可用于以下試驗(yàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有序列1或其部分的人類FRP或Wnt通路組分基因核酸或者能夠與之雜交的核酸，可以用來(lái)確定FRP或Wnt通路組分基因的染色體位置。將FRP或Wnt通路組分基因的染色體位置與業(yè)已顯示與某特定疾病或病況相關(guān)的染色體區(qū)域位置進(jìn)行比較，例如通過(guò)連鎖分析(物理位置臨近基因的共同遺傳)，可以提示FRP或Wnt通路組分基因可能具有一定作用的疾病或病況。業(yè)已與特定疾病連鎖的染色體區(qū)域列表可以在，例如McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可以通過(guò)約翰霍普金斯大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館在線獲得)和http//www3.ncbi.nih.gov/Omim(Online Mendelian Inheritance in Man)中獲得。而且，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因還可作為染色體標(biāo)記物用于基因連鎖研究，所述研究涉及的基因不是FRP或Wnt通路組分基因。
基因的染色體定位可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的幾種方法進(jìn)行。例如，應(yīng)用Southern印跡雜交或雜交體細(xì)胞PCR繪圖技術(shù)可以確定某特定基因位于哪條染色體或染色體片段上?？梢詫⒁粋€(gè)基因定位于染色體或染色體區(qū)域的其他繪圖策略包括原位雜交，標(biāo)記流式分類染色體預(yù)篩檢，以及通過(guò)與染色體特異性cDNA文庫(kù)構(gòu)建物雜交進(jìn)行預(yù)選。
而且，核酸與中期染色體熒光原位雜交(FISH)，是一種將核酸準(zhǔn)確定位到染色體上的一步式方法，所述核酸如FRP或Wnt通路組分基因核酸。該技術(shù)應(yīng)用的核酸可以短至500或600堿基；但是，大于2000bp的克隆與特異性染色體位置結(jié)合的可能性更高，所述特異性染色體位置具有簡(jiǎn)單檢測(cè)所需要的足夠的信號(hào)強(qiáng)度。這些技術(shù)在如Verma et al.，Human Chromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NewYork(1988)中有述。應(yīng)用這些技術(shù)，一個(gè)基因可以定位于含有大約50-500個(gè)基因的染色體區(qū)域。
如果顯示，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因位于的染色體區(qū)域與某種特異性疾病共分離，即相關(guān)，那么就需要測(cè)定受累個(gè)體與未受累個(gè)體間cDNA或基因組序列的差異。在突變存在于一些或所有受累個(gè)體而非正常個(gè)體，提示突變可能是疾病的致病原因。
本發(fā)明還以下述實(shí)施例的形式進(jìn)行闡釋，但這些實(shí)施例不應(yīng)被視為以任何形式對(duì)本發(fā)明的限制。所有引用的內(nèi)容(包括本申請(qǐng)全部引用的參考文獻(xiàn)，業(yè)已核準(zhǔn)的專利，公開的專利申請(qǐng))在此引入，做為參考。除非有特別指示，本發(fā)明的實(shí)踐方法均采用傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面介紹。見(jiàn)，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.by Sambrook，F(xiàn)ritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.美國(guó)專利號(hào)4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription andTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；論著，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wuet al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
4.8.藥物基因組學(xué)單獨(dú)運(yùn)用導(dǎo)致個(gè)體FRP或Wnt通路組分基因或蛋白缺陷或缺乏的特定改變的知識(shí)(FRP或Wnt通路組分基因的基因特征)，或者結(jié)合導(dǎo)致該疾病的其他遺傳學(xué)缺陷信息，可以針對(duì)個(gè)體的基因特征，為其定制特定疾病的治療方法，這就是“藥物基因組學(xué)”的目標(biāo)。例如，攜帶FRP或Wnt通路組分基因某特異性等位基因的個(gè)體，可能出現(xiàn)也可能不出現(xiàn)某種特定疾病的癥狀，或者有發(fā)生某種特定疾病癥狀的傾向。而且，如果這些個(gè)體是有癥狀的，他們對(duì)某種藥物的治療也可能有反應(yīng)，也可能沒(méi)有反應(yīng)，但也可能對(duì)另一種藥物的治療有反應(yīng)，所述藥物如特異性FRP或Wnt通路組分基因治療藥物。因此，從一個(gè)群體中產(chǎn)生FRP或Wnt通路組分基因的基因特征(FRP或Wnt通路組分基因的群體基因特征)(如與發(fā)生某種疾病相關(guān)的FRP或Wnt通路組分基因改變分類)，所述群體具有某疾病或病況的癥狀，所述疾病或病況由FRP或Wnt通路組分基因和/或蛋白的缺陷和/或缺乏所致，并將某個(gè)體的FRP或Wnt通路組分基因特征與群體基因特征相比較，使我們可以篩選或設(shè)計(jì)預(yù)期對(duì)某特定患者或患者群(即具有相同遺傳改變的患者)安全有效的藥物。
例如，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因的群體特征可以通過(guò)在罹患某一疾病的群體中測(cè)定FRP或Wnt通路組分基因的特征達(dá)成，如測(cè)定FRP或Wnt通路組分基因的同一性，所述疾病由FRP或Wnt通路組分基因的缺陷或缺乏所致。任選地，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因群體特征還可以包括該群體對(duì)FRP或Wnt通路組分基因治療藥物反應(yīng)的相關(guān)信息，該信息可以通過(guò)應(yīng)用多種方法獲得，包括，監(jiān)測(cè)1)FRP或Wnt通路組分基因相關(guān)疾病相關(guān)癥狀的嚴(yán)重性，2)FRP或Wnt通路組分基因的表達(dá)水平，3)FRP或Wnt通路組分基因的mRNA水平，和/或4)FRP或Wnt通路組分基因的蛋白水平。以及(iii)根據(jù)FRP或Wnt通路組分基因中存在的特定基因改變，或者FRP或Wnt通路組分基因通路基因，將群體分開或分類。FRP或Wnt通路組分基因的群體基因特征還可以任選提示，某些特定改變的患者可能對(duì)某種特定治療方法有反應(yīng)或沒(méi)有反應(yīng)。根據(jù)個(gè)體FRP或Wnt通路組分基因特征，應(yīng)用這種信息或群體特征應(yīng)該可以預(yù)言哪個(gè)個(gè)體將對(duì)特定藥物治療有反應(yīng)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)RP或Wnt通路組分基因特征是轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平特征，以及步驟(i)包括單獨(dú)確定FRP或Wnt通路組分基因蛋白的表達(dá)水平，或者聯(lián)合確定已知對(duì)該疾病有關(guān)的其他基因的表達(dá)水平。FRP或Wnt通路組分基因特征可以在很多患者的疾病不同階段給予檢測(cè)。
還可以應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行藥物基因組學(xué)研究。例如，如本文所述，可以制備轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠含有FRP或Wnt通路組分基因的特定等位基因變異體。這些小鼠可以通過(guò)下述方法創(chuàng)建，例如通過(guò)應(yīng)用人FRP或Wnt通路組分基因等位基因取代小鼠的野生型FRP或Wnt通路組分基因。然后測(cè)定這些小鼠對(duì)FRP或Wnt通路組分基因治療藥物的反應(yīng)情況。
4.9.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些動(dòng)物可以用于多種目的，如鑒定青光眼治療藥物。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括核酸序列中含有突變的非人動(dòng)物，所述核酸序列可以導(dǎo)致不適宜高水平的FRP(如可以調(diào)控FRP表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因發(fā)生突變)。此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可以包括Wnt信號(hào)組分的突變，包括卷曲蛋白(Fz)，Disheveled(Dsh)，糖原合酶激酶3(GSK3)，蛋白激酶C(APC)，β-連環(huán)蛋白和高遷移率組(HMG)蛋白(如LEF/TCF(淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子))。這些動(dòng)物可以用來(lái)，例如檢測(cè)通過(guò)干擾小梁網(wǎng)細(xì)胞基因表達(dá)對(duì)表型的影響，所述基因的表達(dá)受Wnt信號(hào)調(diào)控。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還可以是含有轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，所述轉(zhuǎn)基因如報(bào)道基因，受FRP啟動(dòng)子或其片段的控制。這些動(dòng)物對(duì)于，例如鑒定調(diào)制FRP產(chǎn)生的藥物非常有用，例如，這些藥物可以調(diào)制FRP的基因表達(dá)。例如，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，應(yīng)用FRP cDNA片段篩檢基因組文庫(kù)，分離FRP基因啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行特征鑒定。
在本發(fā)明范疇內(nèi)的其他非人動(dòng)物還包括(這樣的動(dòng)物)，(該動(dòng)物中)編碼Wnt信號(hào)組分的內(nèi)源性基因的表達(dá)發(fā)生突變或被“敲除”。這些動(dòng)物可以用來(lái)檢測(cè)某一Wnt信號(hào)組分的缺失是否可以導(dǎo)致某一特定表型。獲得轉(zhuǎn)基因和基因敲除非人動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域眾所周知，并將在這里給予探討。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于開展青光眼診斷和治療的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。例如，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括異源FRP表達(dá)基因，該基因?qū)е卵鄄拷M織中FRP基因表達(dá)水平增加。在優(yōu)選實(shí)施方案中，眼部組織是小梁網(wǎng)，F(xiàn)RP過(guò)度表達(dá)細(xì)胞是小梁網(wǎng)細(xì)胞。在其他更優(yōu)選實(shí)施方案中，小梁網(wǎng)細(xì)胞FRP表達(dá)水平增加的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物至少具有一個(gè)青光眼特征性癥狀，如眼內(nèi)壓(IOP)增高。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供了體內(nèi)篩檢青光眼治療化合物和開展青光眼診斷的試驗(yàn)系統(tǒng)。
4.9.1.基于動(dòng)物的系統(tǒng)本發(fā)明的另一方面涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的(該動(dòng)物)細(xì)胞，優(yōu)選(雖然任選)在動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中表達(dá)外源性FRP蛋白。FRP轉(zhuǎn)基因可以編碼野生型蛋白，也可以編碼其同系物，包括激動(dòng)劑和拮抗劑，以及反義構(gòu)建物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以應(yīng)用，例如能夠控制所需表達(dá)模式的cis-作用序列，將轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限制于某些特定類型的細(xì)胞、組織或發(fā)育階段。在本發(fā)明中，這種嵌合表達(dá)的FRP蛋白對(duì)于多種形式的連鎖分析都很重要，而且提供了另外一種方法，評(píng)價(jià)例如FRP表達(dá)缺乏的效果，在其他部分正常的胚胎中，F(xiàn)RP表達(dá)缺乏可能會(huì)完全改變組織某一部分的發(fā)育情況。為了達(dá)到這一目的，可以應(yīng)用組織特異性調(diào)控序列和條件調(diào)控序列控制轉(zhuǎn)基因以某一特定空間模式表達(dá)。而且，表達(dá)的暫時(shí)模式可以通過(guò)，例如條件重組系統(tǒng)或原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列達(dá)到。
能夠通過(guò)位點(diǎn)特異性基因調(diào)控在體內(nèi)使轉(zhuǎn)基因得到表達(dá)的基因技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，現(xiàn)在已有能夠使重組酶得到調(diào)控表達(dá)的基因系統(tǒng)，所述重組酶可以催化靶序列的基因重組。本文所用短語(yǔ)“靶序列”是指能夠通過(guò)重組酶基因重組的核苷酸序列。靶序列的側(cè)翼序列是重組酶的識(shí)別序列，在表達(dá)重組酶活性的細(xì)胞中通常是切除的或者是反轉(zhuǎn)的。可以設(shè)計(jì)重組酶催化的重組事件，這樣靶序列的重組可以導(dǎo)致FRP蛋白之一的表達(dá)激活或抑制。例如，可以設(shè)計(jì)將能夠干擾重組FRP基因表達(dá)的一個(gè)靶序列切除，如編碼拮抗同系物或反義轉(zhuǎn)錄物的序列，這樣可以激活該基因的表達(dá)。這種干擾蛋白表達(dá)的過(guò)程可以由多種機(jī)制產(chǎn)生，如將FRP基因從啟動(dòng)子元件或內(nèi)部終止子中空間分離。而且，轉(zhuǎn)基因還可以這樣制備，其中基因的編碼序列由重組酶識(shí)別序列側(cè)翼包繞，并在起始時(shí)以相對(duì)于啟動(dòng)子元件3’到5’的方向轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在這種情況下，靶序列的反轉(zhuǎn)使研究基因進(jìn)行了重新定向，即通過(guò)將編碼序列的5’端以相對(duì)于啟動(dòng)子元件的方向定位，這樣啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的激活。
本發(fā)明所有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都在它們的多種細(xì)胞中包括一個(gè)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞功能、細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡和/或分化改變“宿主細(xì)胞”的表型。因?yàn)閼?yīng)用本文描述的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物可以產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因生物體，所以將給出通過(guò)參考外源性遺傳物質(zhì)制備轉(zhuǎn)基因生物體的一般性論述。為了應(yīng)用下述方法和材料將特異性轉(zhuǎn)基因序列整合到生物體中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)該一般性論述進(jìn)行調(diào)整。
在一個(gè)示例實(shí)施方案中，可以應(yīng)用噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)(Lakso et al.(1992)PNAS 896232-6236；Orban et al.(1992)PNAS 896861-6865)或者釀酒酵母的FLP重組酶系統(tǒng)(O’Gorman et al.(1991)Science 2511351-1355；PCT公開WO 92/15694)產(chǎn)生體內(nèi)位點(diǎn)特異性基因重組系統(tǒng)。Cre重組酶可以催化位于loxP序列之間的干預(yù)靶序列的位點(diǎn)特異性重組。loxP序列是34個(gè)堿基對(duì)的核苷酸重復(fù)序列，可以與Cre重組酶結(jié)合，而且是Cre重組酶介導(dǎo)的基因重組的必需序列。在Cre重組酶存在的情況下，loxP序列的方向性決定了干預(yù)靶序列是切除的還是反轉(zhuǎn)的(Abremski et al.(1984)J.Biol.Chem.2591509-1514)；當(dāng)loxP序列序列是順行重復(fù)序列時(shí)，催化靶序列的切除，當(dāng)loxP序列是反轉(zhuǎn)重復(fù)序列是，催化靶序列的倒位。
因此，靶序列的基因重組有賴于Cre重組酶的表達(dá)。重組酶的表達(dá)可以通過(guò)啟動(dòng)子元件進(jìn)行調(diào)控，所述啟動(dòng)子元件也受調(diào)控，如通過(guò)外部添加制劑，啟動(dòng)子元件可以是組織特異性的，發(fā)育階段特異性的，可誘導(dǎo)的或可抑制的。這種調(diào)控可以使靶序列的基因重組只發(fā)生在啟動(dòng)子元件介導(dǎo)的重組酶表達(dá)的細(xì)胞中。因此，重組FRP蛋白的表達(dá)激活可以通過(guò)控制重組酶表達(dá)得到調(diào)控。
應(yīng)用cre/loxP重組酶系統(tǒng)調(diào)控重組FRP蛋白的表達(dá)需要構(gòu)建一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該動(dòng)物包括編碼Cre重組酶和研究蛋白的轉(zhuǎn)基因。通過(guò)構(gòu)建“雙”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以得到含有Cre重組酶和重組FRP基因的動(dòng)物。得到這種動(dòng)物的一種方便方法是將兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交，這兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，每一種都含有一個(gè)轉(zhuǎn)基因，如FRP基因和重組酶基因。
開始構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得的一個(gè)優(yōu)勢(shì)源于這樣的可能性，即研究蛋白的表達(dá)對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能有害，所述研究蛋白可以是激動(dòng)劑，也可以是拮抗劑，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物含有重組酶介導(dǎo)的可表達(dá)形式的FRP蛋白。在這種情況下，可以繁殖并維持研究轉(zhuǎn)基因在所有組織中都保持靜默狀態(tài)的初始群。該初始群中的個(gè)體可以與表達(dá)重組酶的動(dòng)物進(jìn)行雜交，所述重組酶在動(dòng)物的例如一個(gè)或多個(gè)組織和/或以所需時(shí)間模式表達(dá)。因此，創(chuàng)建一個(gè)初始群，例如，初始群中FRP拮抗轉(zhuǎn)基因是靜默的，可以進(jìn)行該初始群后代的研究，在這些后代中，特定組織或特定發(fā)育階段的FRP介導(dǎo)的誘導(dǎo)發(fā)生障礙，導(dǎo)致，例如致死性表型的出現(xiàn)。
相似的條件轉(zhuǎn)基因還可應(yīng)用原核啟動(dòng)子序列進(jìn)行提供，為了使FRP轉(zhuǎn)基因的表達(dá)更加容易，該原核啟動(dòng)子序列需要與原核蛋白同時(shí)表達(dá)。示例的啟動(dòng)子和相應(yīng)的轉(zhuǎn)激活原核蛋白可以參考美國(guó)專利號(hào)4,833,080。
而且，條件轉(zhuǎn)基因的表達(dá)還可以通過(guò)類似基因治療的方法進(jìn)行誘導(dǎo)，其中，編碼轉(zhuǎn)激活蛋白，如重組酶或原核蛋白的基因被導(dǎo)入到組織中，并以，例如細(xì)胞類型特異性的方式表達(dá)。通過(guò)該方法，F(xiàn)RP轉(zhuǎn)基因可以一直保持靜默狀態(tài)到成年，除非由轉(zhuǎn)激活子誘導(dǎo)“打開”。
在一個(gè)示例實(shí)施方案中，本發(fā)明“轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物”可以通過(guò)將轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物生殖細(xì)胞系來(lái)制備?？梢詰?yīng)用不同發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段，可以應(yīng)用不同的方法。選擇用于實(shí)踐本發(fā)明的任何動(dòng)物特定細(xì)胞系，這些細(xì)胞系健康，胚胎生長(zhǎng)良好，胚胎生殖核能見(jiàn)度良好，復(fù)制適應(yīng)性良好。此外，單模標(biāo)本也是一個(gè)顯著因素。例如，在制備轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)，通常應(yīng)用如C57BL/6的品種或FVB品系(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。優(yōu)選品種為攜帶H-2b，H-2d或H-2q單模標(biāo)本的品種，如C57BL/6或DBA/1。用來(lái)實(shí)踐本發(fā)明的品系可以是轉(zhuǎn)基因品系本身，和/或敲除品系(即源于一個(gè)或多個(gè)基因部分或完全受到抑制的動(dòng)物)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物被導(dǎo)入到單細(xì)胞階段的胚胎。合子是最佳的顯微注射靶目標(biāo)。在小鼠中，雄性生殖核的直徑可以達(dá)到大約20微米，這樣可以進(jìn)行再生性注射DNA溶液1-2pl。應(yīng)用合子作為基因轉(zhuǎn)移的靶目標(biāo)的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)在于，在絕大多數(shù)情況下，注射的DNA可以在第一次分裂前整合到宿主基因中(Brinster et al.(1985)PNAS 824438-4442)。結(jié)果是，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的所有細(xì)胞都攜帶整合的轉(zhuǎn)基因。這通常在轉(zhuǎn)基因有效傳播到初始群后代方面也有所反映，因?yàn)?0％的生殖細(xì)胞將含有轉(zhuǎn)基因。
正常情況下，在適宜的培養(yǎng)基中孵育受精胚，直至出現(xiàn)生殖核。如下所述，大約在這個(gè)時(shí)候，將含有轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列導(dǎo)入雌性或雄性生殖核中。在一些品種如小鼠中，優(yōu)選雄性生殖核。最優(yōu)選的是，在雄性合子被卵子核或合子的雌性生殖核處理之前，將外源性遺傳物質(zhì)添加到雄性合子的DNA互補(bǔ)鏈中。據(jù)信卵子核或雌性生殖核可以釋放能夠影響雄性DNA互補(bǔ)鏈的分子，可能是通過(guò)將雄性DNA的精蛋白置換為組蛋白，從而使雌性和雄性DNA互補(bǔ)鏈能夠更加容易地結(jié)合，形成二倍體合子。
因此，優(yōu)選在雄性DNA互補(bǔ)鏈?zhǔn)艿酱菩陨澈擞绊懼?，將外源性遺傳物質(zhì)添加到雄性DNA互補(bǔ)鏈或其他任何DNA互補(bǔ)鏈中。例如，外源性遺傳物質(zhì)可以在雄性生殖核剛剛形成后，就添加到早期雄性生殖核中，這個(gè)時(shí)候，雄性和雌性生殖核相互分離，兩個(gè)生殖核都緊鄰細(xì)胞膜。此外，還可在精子經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)行decondensation后，將外源性遺傳物質(zhì)添加到精子核中。然后將含有外源性遺傳物質(zhì)的精子添加到卵子中，或者將decondensed精子添加到卵子中，然后立即添加轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。
可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任意方法將轉(zhuǎn)基因核苷酸序列導(dǎo)入到胚胎中，例如，顯微注射，電擊轉(zhuǎn)化或微脂粒感染技術(shù)。轉(zhuǎn)基因核苷酸序列導(dǎo)入胚胎后，可以在體外孵育胚胎，孵育時(shí)間不限，也可以將胚胎直接再植入代理宿主，或者在體外孵育一段時(shí)間后，再植入宿主。體外孵育至成熟也屬于本發(fā)明范疇。一種常見(jiàn)方法是在體外孵育胚胎大約1-7天后，將它們?cè)僦踩氪硭拗?，具體孵育時(shí)間要根據(jù)種系來(lái)確定。
為本發(fā)明起見(jiàn)，合子實(shí)際上是二倍體細(xì)胞的形成，該細(xì)胞能夠發(fā)育成為一個(gè)完整的生物體。通常，合子包括一個(gè)含有核的卵，核可以是天然形成的，也可以是人工形成的，所述卵是通過(guò)兩個(gè)來(lái)自接合體的單倍體核融合形成的。因此，結(jié)合體核必須是天然兼容的核，即這個(gè)核可以導(dǎo)致健康合子的形成，合子能夠進(jìn)行分化，并發(fā)育成為具有功能的生物體。通常，優(yōu)選整倍體合子。如果獲得了整倍體合子，那么染色體數(shù)量的變化相對(duì)于接合體來(lái)源生物體的整倍體數(shù)量就不應(yīng)該超過(guò)1。
除了相似的生物學(xué)考慮外，物理學(xué)特征也控制著外源性遺傳物質(zhì)的量(如體積)，所述外源性遺傳物質(zhì)可以添加到合子核中，或者添加到構(gòu)成合子核一部分的遺傳物質(zhì)中。如果沒(méi)有去除遺傳物質(zhì)，那么外源性遺傳物質(zhì)可以添加的量就會(huì)受到在不破壞物理特性的情況下的吸收量的限制。通常，插入的外源性遺傳物質(zhì)的體積不超過(guò)大約10皮升。添加的物理學(xué)效應(yīng)必需不能破壞合子的存活能力。DNA序列數(shù)量和變異的生物學(xué)限制根據(jù)特定合子和外源性遺傳物質(zhì)的功能而有所差異，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，因?yàn)楫a(chǎn)生合子的遺傳物質(zhì)，包括外源性遺傳物質(zhì)，必須在生物學(xué)上能夠啟動(dòng)并維持合子的分化和發(fā)育，使之成為一個(gè)具有功能的生物體。
添加到合子中的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物的拷貝數(shù)量有賴于添加的外源性遺傳物質(zhì)的總量，而且該拷貝數(shù)量將是能夠使基因轉(zhuǎn)化發(fā)生的數(shù)量。理論上只需要一個(gè)拷貝，但是通常情況下，需要應(yīng)用多拷貝，例如，為了保證一個(gè)拷貝具有功能，需要應(yīng)用1,000-2,000拷貝的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物。對(duì)于本發(fā)明，為了增強(qiáng)外源性DNA序列的表型表達(dá)，使每個(gè)插入的外源性DNA序列有超過(guò)一個(gè)的功能拷貝通常是具有優(yōu)勢(shì)的。
可以應(yīng)用任何能夠?qū)⑼庠葱赃z傳物質(zhì)添加到核遺傳物質(zhì)中的技術(shù)，只要這種技術(shù)不破壞細(xì)胞、核膜或其他現(xiàn)存的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或基因結(jié)構(gòu)。優(yōu)選通過(guò)顯微注射技術(shù)將外源性遺傳物質(zhì)插入到核遺傳物質(zhì)中。顯微注射的細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)已知，并在本領(lǐng)域得到應(yīng)用。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法可以完成再植。通常情況下，代理宿主是麻醉的，胚胎被植入到輸卵管中。植入特定宿主的胚胎數(shù)量根據(jù)品種的不同而有差異，但通常與該品種自然生產(chǎn)的后代數(shù)量相匹配。
可以應(yīng)用任何適宜方法篩檢代理宿主轉(zhuǎn)基因后代轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達(dá)情況。篩檢通常可以通過(guò)PCR，Southern印跡或Northern印跡分析完成，分析中應(yīng)用與轉(zhuǎn)基因至少一個(gè)部分互補(bǔ)的探針?？梢圆捎肳estern印跡分析作為篩檢轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物存在的替代或其他方法，分析應(yīng)用抗轉(zhuǎn)基因編碼蛋白的抗體。典型地，從尾部組織中制備DNA，然后應(yīng)用Southern印跡或PCR法分析轉(zhuǎn)基因。此外，盡管任何組織或細(xì)胞類型都可用于該分析，但可以應(yīng)用據(jù)信表達(dá)轉(zhuǎn)基因水平最高的組織或細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因存在和表達(dá)的測(cè)試，所述測(cè)試可以應(yīng)用Southern分析或PCR法。
評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因存在的其他替代方法包括但不限于適宜的生物化學(xué)方法，如酶和/或免疫學(xué)方法，特定標(biāo)記物或酶活性的組織學(xué)染色，流式細(xì)胞儀分析等。血液分析還可用來(lái)檢測(cè)血液中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的存在，并評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因?qū)Χ喾N類型血細(xì)胞和其他血液組分水平的影響。
可以通過(guò)將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與適宜的配體進(jìn)行交配獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代，也可以通過(guò)將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的卵子和/或精子體外受精獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代。在與配體進(jìn)行交配的時(shí)候，該配體可以是也可以不是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和/或基因敲除動(dòng)物；當(dāng)該配體是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，它可以包括同一或不同的轉(zhuǎn)基因，也可以同時(shí)包括同一和不同的轉(zhuǎn)基因。此外，配體可以是親本系。當(dāng)采用體外受精時(shí)，受精胚胎可以植入到代理宿主體內(nèi)，也可以體外孵育，或者在體外孵育后植入代理宿主體內(nèi)。無(wú)論應(yīng)用哪一種方法，都應(yīng)該應(yīng)用上述方法或其他適宜方法評(píng)價(jià)后代轉(zhuǎn)基因的存在情況。
根據(jù)本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物包括外源性遺傳物質(zhì)。如上所述，在某些實(shí)施方案中，外源性遺傳物質(zhì)是導(dǎo)致FRP蛋白(激活劑或拮抗劑)產(chǎn)生的DNA序列，反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或FRP突變體。而且，在這些實(shí)施方案中，該序列還與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件相連接，如啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子優(yōu)選能夠使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在某一特定類型的細(xì)胞中得到表達(dá)。
還可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)氲椒侨藙?dòng)物中。發(fā)育的非人胚胎可以體外培養(yǎng)到胚泡期。在此期間，分裂球可以作為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的靶細(xì)胞(Jaenich，R.(1976)PNAS 731260-1264)。分裂球的有效感染可以通過(guò)酶處理去除透明帶獲得(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986))。所用導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的典型病毒載體系統(tǒng)是攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Jahner et al.(1985)PNAS 82；6927-6931；Van der Putten etal.(1985)PNAS 826148-6152)?？梢酝ㄟ^(guò)在單層產(chǎn)病毒細(xì)胞上培養(yǎng)分裂球獲得有效而容易的轉(zhuǎn)染(Van der Putten et al.，supra；Stewart et al.(1987)EMBO J.6383-388)。此外，還在更晚一些的階段進(jìn)行感染?？梢詫⒉《净虍a(chǎn)病毒細(xì)胞注射到分裂腔內(nèi)(Jahner et al.(1982)Nature 298；623-628)。絕大多數(shù)初始群將成為轉(zhuǎn)基因嵌合體，因?yàn)檎现话l(fā)生在一部分細(xì)胞中，形成轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。而且，初始群還可以含有在基因組不同位點(diǎn)上插入的多種逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因，在后代中通常會(huì)分離。此外，還可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒宮內(nèi)感染妊娠中期胚胎，將轉(zhuǎn)基因?qū)氲缴臣?xì)胞系(Jahner et al.(1982)，supra)。
轉(zhuǎn)基因?qū)氲牡谌惏屑?xì)胞是胚胎干細(xì)胞(ES)。ES細(xì)胞可以從體外培養(yǎng)的植入前胚胎中獲得，并與胚胎融合(Evans et al.(1981)Nature292154-156；Bradley et al.(1984)Nature 309255-258；Gossler et al.(1986)PNAS 839065-9069；and Robertson et al.(1986)Nature 322445-448)?？梢酝ㄟ^(guò)DNA轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)有效地將轉(zhuǎn)基因?qū)隕S細(xì)胞。然后，可以將這些轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞與來(lái)自非人動(dòng)物的胚泡結(jié)合。這樣，ES細(xì)胞可以定殖在胚胎中，形成能夠產(chǎn)生嵌合動(dòng)物的生殖細(xì)胞系。綜述見(jiàn)Jaenisch，R.(1988)Science 2401468-1474。
在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用基因打靶技術(shù)將變化引入培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中，所述基因打靶技術(shù)是一種應(yīng)用同源重組修飾動(dòng)物基因組的方法。通過(guò)靶定ES細(xì)胞內(nèi)感興趣FRP基因，這些變化可以導(dǎo)入動(dòng)物的生殖細(xì)胞系，產(chǎn)生嵌合體?；虼虬羞^(guò)程可以通過(guò)將DNA靶構(gòu)建物引入組織培養(yǎng)細(xì)胞完成，所述DNA靶構(gòu)建物包括與靶FRP位點(diǎn)同源的片段，還包括對(duì)FRP基因組序列進(jìn)行修飾的所需序列(如插入，缺失，點(diǎn)突變)。然后篩檢準(zhǔn)確打靶的處理細(xì)胞，鑒定并分離那些業(yè)已適當(dāng)打靶的細(xì)胞。
胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)實(shí)際上是本發(fā)明考慮的一種方案，是通過(guò)應(yīng)用打靶轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物破壞FRP基因功能的一種方法，所述打靶轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物被設(shè)計(jì)成能夠與一個(gè)或多個(gè)FRP基因組序列進(jìn)行同源重組。可以安排打靶構(gòu)建物，在與FRP基因某一元件重組的基礎(chǔ)上，將陽(yáng)性篩選標(biāo)記物插入(或置換)基因的編碼序列。插入的序列不僅干擾破壞了FRP基因的功能，而且提供了一種陽(yáng)性篩選性狀。FRP的示例打靶構(gòu)建物將在下面給予更加詳細(xì)的描述。
通常，用來(lái)產(chǎn)生基因敲除動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)與產(chǎn)生的基因敲除動(dòng)物是同一種系。因此，例如，小鼠胚胎干細(xì)胞通常被用來(lái)產(chǎn)生基因敲除小鼠。
可以應(yīng)用技術(shù)人員眾所周知的方法產(chǎn)生并維持胚胎干細(xì)胞，如Doetschman et al.(1985)J.Embryol.Exp.Morphol.8727-45所述的方法?？梢詰?yīng)用任何ES細(xì)胞系，但是典型情況下，選擇的細(xì)胞系應(yīng)該具有這樣的能力，細(xì)胞可以整合進(jìn)入發(fā)育胚胎中，并成為生殖細(xì)胞系的一部分，進(jìn)而產(chǎn)生敲除構(gòu)建物的傳動(dòng)生殖細(xì)胞系。因此，任何據(jù)信具有這種能力的ES細(xì)胞系都適用于本發(fā)明。一種用來(lái)產(chǎn)生ES細(xì)胞的典型小鼠品系是129J。另一種ES細(xì)胞系是鼠細(xì)胞系D3(American Type CultureCollection，分類號(hào)CKL 1934)。另一種優(yōu)選ES細(xì)胞系是WW6細(xì)胞系(Ioffe et al.(1995)PNAS 927357-7361)?？梢詰?yīng)用技術(shù)人員眾所周知的方法培養(yǎng)細(xì)胞，準(zhǔn)備敲除構(gòu)建物的插入，所述方法如Robertson inTeratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach，E.J.Robertson，ed.IRL Press，Washington，D.C.；Bradley et al.(1986)Current Topics in Devel.Biol.20357-371；and Hogan et al.(Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)所披露。
可以應(yīng)用多種本領(lǐng)域眾所周知的方法，將敲除構(gòu)建物插入到ES細(xì)胞中，這些方法包括，例如電擊轉(zhuǎn)化，顯微注射以及磷酸鈣處理。插入的優(yōu)選方法是電擊轉(zhuǎn)化。
每個(gè)準(zhǔn)備插入到細(xì)胞中的敲除構(gòu)建物必須首先是線形的。因此，如果敲除構(gòu)建物業(yè)已插入到載體中(下述)，可以應(yīng)用適宜的限制性內(nèi)切酶消化DNA來(lái)獲得線性化，選擇的限制性內(nèi)切酶應(yīng)該只在載體序列內(nèi)進(jìn)行酶切，而不在敲除構(gòu)建物序列內(nèi)進(jìn)行酶切。
對(duì)于插入，根據(jù)所選插入方法，在適宜條件下將敲除構(gòu)建物添加到ES細(xì)胞中，所述適宜條件技術(shù)人員已知。當(dāng)導(dǎo)入ES細(xì)胞的構(gòu)建物超過(guò)一個(gè)時(shí)，可以將這些敲除構(gòu)建物同時(shí)導(dǎo)入，也可以每次導(dǎo)入一個(gè)。
如果ES細(xì)胞將進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，應(yīng)用點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化儀將ES細(xì)胞和敲除構(gòu)建物DAN暴露于電脈沖，并按照生產(chǎn)廠商的使用說(shuō)明進(jìn)行。典型地，電擊轉(zhuǎn)化后，在適宜的孵育條件下使ES細(xì)胞恢復(fù)。然后篩檢細(xì)胞，檢視敲除構(gòu)建物的存在情況。
可以應(yīng)用多種方法進(jìn)行篩檢。例如，當(dāng)標(biāo)記基因是抗生素耐藥基因時(shí)，可以在致死濃度抗生素存在的情況下培養(yǎng)ES細(xì)胞。推測(cè)那些能夠存活的ES細(xì)胞可能整合了敲除構(gòu)建物。如果標(biāo)記基因不是抗生素耐藥基因，可以應(yīng)用Southern印跡法，用設(shè)計(jì)的只能夠與標(biāo)記序列雜交的DNA序列作為探針，分析ES細(xì)胞基因組DNA。此外，還可應(yīng)用PCR法。最后，如果標(biāo)記基因是編碼酶的基因，所述酶活性可以檢測(cè)(如b-半乳糖苷酶)，可以在適宜條件下將酶作用底物添加到細(xì)胞中，然后分析酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可能對(duì)其他有用的標(biāo)記物非常熟悉，并熟知在給定細(xì)胞中檢測(cè)這些標(biāo)記物存在的方法。所有這些標(biāo)記物都在本發(fā)明教義的考慮范疇之內(nèi)。
敲除構(gòu)建物可能整合到ES細(xì)胞基因組的多個(gè)位點(diǎn)，由于隨機(jī)插入事件的發(fā)生，敲除構(gòu)建物可能在每個(gè)ES細(xì)胞基因組中整合的位點(diǎn)有所不同。插入的所需位置位于將被敲除DNA序列的互補(bǔ)位點(diǎn)，如FRP編碼序列，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列等。典型地，實(shí)際上只有少于大約1-5％攝取了敲除構(gòu)建物的ES細(xì)胞在所需位點(diǎn)整合了敲除構(gòu)建物。為了鑒定那些適當(dāng)整合了敲除構(gòu)建物的ES細(xì)胞，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法從ES細(xì)胞中提取總DNA。然后，應(yīng)用設(shè)計(jì)的探針對(duì)DNA進(jìn)行Southern印跡分析，所述探針能夠以特定形式與應(yīng)用特定限制性酶消化的基因組DNA雜交。此外，或者另外，還可以應(yīng)用探針通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA，所述探針經(jīng)特意設(shè)計(jì)，可以擴(kuò)增特定大小和序列的DNA片段(即，只有在適宜位置含有敲除構(gòu)建物的那些細(xì)胞才會(huì)產(chǎn)生適宜大小的DNA片段)。
鑒定了在適宜位置含有敲除構(gòu)建物的適宜細(xì)胞后，就可以將細(xì)胞插入到胚胎中了。插入可以通過(guò)技術(shù)人員熟知的多種方式進(jìn)行，但是，優(yōu)選的方法是顯微注射。對(duì)于顯微注射，在微量加樣槍中收集大約10-30個(gè)細(xì)胞，然后注射到胚胎中，所述胚胎處于適宜的發(fā)育階段，允許含有敲除構(gòu)建物的異體ES細(xì)胞整合到發(fā)育胚胎中。例如，如下述實(shí)施例所述，轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞可以被顯微注射到胚球中。
用于插入ES細(xì)胞的胚胎適宜發(fā)育階段非常依賴動(dòng)物品種，但是對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)，該階段大約為3.5天。胚胎是通過(guò)灌注雌性妊娠動(dòng)物子宮獲得的。進(jìn)行該過(guò)程的適宜方法是技術(shù)人員已知的，如Bradley et al.(supra)所披露。
盡管任何適宜發(fā)育階段的胚胎都適用，優(yōu)選雄性胚胎。在小鼠中，優(yōu)選的胚胎還具有編碼毛皮顏色的基因，所述基因編碼的毛皮顏色與ES細(xì)胞基因編碼的毛皮顏色不同。按照這種方式，可以通過(guò)尋找嵌合毛皮顏色(提示ES細(xì)胞整合進(jìn)入發(fā)育胚胎)容易地篩查出敲除構(gòu)建物的存在。因此，例如，如果ES細(xì)胞系攜帶的基因編碼白色皮毛，選擇的胚胎攜帶的基因就應(yīng)該編碼黑色或棕色皮毛。
ES細(xì)胞導(dǎo)入胚胎后，可以將胚胎植入假孕撫育母體子宮進(jìn)行孕育。盡管可以應(yīng)用任何雌性動(dòng)物作為撫育母體，典型的撫育母體應(yīng)按照下述條件進(jìn)行選擇，即具有繁殖和生殖的良好能力，具有照顧下一代的能力。這些撫育母體可以通過(guò)與進(jìn)行了輸精管切除術(shù)的同種雄性動(dòng)物交配來(lái)制備。假孕撫育母體的階段對(duì)于成功植入是至關(guān)重要的，該時(shí)間是品種依賴性的。對(duì)于小鼠，該階段大約為假孕2-3天。
在采用了皮毛顏色篩選策略的情況下(如上所述，并見(jiàn)下述實(shí)施例)，可以首先通過(guò)嵌合皮毛顏色篩檢撫育母體生養(yǎng)的后代。此外，或者作為替代，還可應(yīng)用如上所述的Southern印跡和/或PCR方法，篩檢后代尾部組織DNA中敲除構(gòu)建物的存在。為了產(chǎn)生純合的敲除動(dòng)物，可以將顯示嵌合性狀的后代進(jìn)行彼此雜交，前提是這些動(dòng)物據(jù)信在其生殖細(xì)胞中攜帶敲除構(gòu)建物。通過(guò)Southern印跡分析同等數(shù)量的基因組DNA來(lái)鑒定純合子，所述基因組DNA來(lái)自該雜交產(chǎn)生的小鼠，以及已知是雜合子的小鼠和野生型小鼠。
還有其他方法可以用來(lái)鑒定和闡明敲除后代的特征。例如，可以應(yīng)用Northern印跡來(lái)分析mRNA中敲除基因、標(biāo)記基因或者兩種基因的編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在或缺如。此外，可以應(yīng)用Western印跡來(lái)評(píng)價(jià)后代中多種組織敲除的FRP基因的表達(dá)水平，可以應(yīng)用針對(duì)特定FRP蛋白的抗體或者針對(duì)標(biāo)記基因產(chǎn)物的抗體進(jìn)行Western印跡分析，前提是該基因得到表達(dá)。最后，可以應(yīng)用適宜的抗體對(duì)后代的多種細(xì)胞進(jìn)行原位分析(如固定細(xì)胞，應(yīng)用抗體標(biāo)記)和/或FACS分析(熒光激活細(xì)胞分類)，尋找敲除構(gòu)建物基因產(chǎn)物的存在或缺如。
其他制備敲除或破壞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法也眾所周知。見(jiàn)，例如Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。還可通過(guò)，例如同源重組插入靶序列，產(chǎn)生重組酶依賴性敲除，這樣可以通過(guò)重組酶序列控制FRP基因的組織特異性和/或時(shí)間調(diào)控性失活(下述)。
可以通過(guò)多種方式，制備含有一個(gè)以上敲除構(gòu)建物和/或一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建物的動(dòng)物。制備的優(yōu)選方式是產(chǎn)生一系列哺乳動(dòng)物，每種含有一個(gè)所需轉(zhuǎn)基因表型。這些動(dòng)物通過(guò)一系列雜交、回交和篩選進(jìn)行繁殖，最終產(chǎn)生含有所有所需敲除構(gòu)建物和/或表達(dá)構(gòu)建物的單一動(dòng)物，其中，動(dòng)物除了存在敲除構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)基因外，是野生型的同源株(異常一致)。
本發(fā)明還以下述實(shí)施例的形式進(jìn)行闡釋，但這些實(shí)施例不應(yīng)被視為以任何形式對(duì)本發(fā)明的限制。所有引用參考文獻(xiàn)內(nèi)容(包括本申請(qǐng)全部引用的參考文獻(xiàn)，業(yè)已核準(zhǔn)的專利，公開的專利申請(qǐng))在此引入，作為參考。除非有特別指示，本發(fā)明的實(shí)踐方法均采用傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)技術(shù)，這些技術(shù)屬于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面介紹。見(jiàn)，例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.by Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；DNACloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.美國(guó)專利號(hào)4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；論著，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
本發(fā)明還以下述實(shí)施例的形式進(jìn)行闡釋，但這些實(shí)施例不應(yīng)被視為以任何形式對(duì)本發(fā)明的限制。本申請(qǐng)所有引用的參考文獻(xiàn)內(nèi)容(包括參考文獻(xiàn)，業(yè)已核準(zhǔn)的專利，公開的專利申請(qǐng)，以及共同未決的專利申請(qǐng))在此引入，作為參考。
5.1.卷曲相關(guān)蛋白1(FRP-1)與青光眼的關(guān)系材料與方法通過(guò)RNA差異顯示鑒定的卷曲相關(guān)蛋白cDNA序列(見(jiàn)原文)5.2.重組FRP或Wnt通路基因在COS細(xì)胞中的表達(dá)本實(shí)施例描述了一種在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生全長(zhǎng)人類FRP或Wnt通路組分基因的方法。
可以通過(guò)下述方法，構(gòu)建含有編碼全長(zhǎng)人類FRP或Wnt通路組分基因蛋白或者可溶性FRP或Wnt通路組分基因蛋白的核酸表達(dá)構(gòu)建物。應(yīng)用基于序列1公開的序列信息的PCR引物，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)mRNA獲得上述編碼全長(zhǎng)人類FRP或Wnt通路組分基因蛋白或者可溶性FRP或Wnt通路組分基因蛋白的核酸，所述mRNA提取自表達(dá)FRP或Wnt通路組分基因的人細(xì)胞，如人小梁網(wǎng)細(xì)胞。PCR引物還可以含有適宜的限制性酶切位點(diǎn)，用于引入表達(dá)質(zhì)粒。然后將擴(kuò)增的核酸插入到真核表達(dá)質(zhì)粒如pcDNAI/Amp(InVitrogen)中，所述質(zhì)粒含有1)SV40復(fù)制起點(diǎn)；2)氨芐青霉素耐藥基因；3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；4)CMV啟動(dòng)子以及隨后的多接頭區(qū)域，SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸位點(diǎn)。然后將編碼全長(zhǎng)人類FRP或Wnt通路組分基因以及在其3’端框架融合的HA或myc標(biāo)簽的DNA片段克隆到(表達(dá)質(zhì)粒的)多接頭區(qū)域。如前所述(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell37，767)，HA標(biāo)簽對(duì)應(yīng)于衍生于流感病毒血凝素蛋白的抗原決定簇。HA標(biāo)簽與FRP或Wnt通路組分基因的融合使應(yīng)用能夠識(shí)別HA抗原決定簇的抗體來(lái)檢測(cè)重組蛋白更加容易。
為了表達(dá)重組FRP或Wnt通路組分基因，可以通過(guò)DEAE-DEXTRAN法應(yīng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring LaboratoryPress，(1989))。應(yīng)用抗HA抗體，可以通過(guò)放射標(biāo)記和免疫沉淀法(E.Harlow，D.Lane，Antibodies；A Laboratory Manual，Cold Spring LaboratoryPress，(1988))檢測(cè)FRP或Wnt通路組分基因-HA蛋白的表達(dá)。為了檢測(cè)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染兩天后應(yīng)用35S半胱氨酸標(biāo)記。然后收獲細(xì)胞或者培養(yǎng)基(如，對(duì)于可溶性FRP或Wnt通路組分基因)，使FRP或Wnt通路組分基因蛋白與HA特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。或者，也可以通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。為了確定全長(zhǎng)FRP或Wnt通路組分基因是膜蛋白，還是分泌型蛋白，可以應(yīng)用去污劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5))裂解轉(zhuǎn)染了編碼全長(zhǎng)FRP或Wnt通路組分基因蛋白載體的細(xì)胞。(Wilson，I.et al.Id.37767(1984))。然后在SDS-PAGE凝膠上分析沉淀蛋白。因此，細(xì)胞中存在FRP或Wnt通路組分基因可以提示全長(zhǎng)FRP或Wnt通路組分基因是膜結(jié)合的，而在上清中存在FRP或Wnt通路組分基因則提示蛋白還以可溶性形式存在，這種可溶性蛋白可能以分泌型蛋白的形式產(chǎn)生，或者通過(guò)滲漏的形式從細(xì)胞中釋放出來(lái)。
等價(jià)方案本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，或者能夠確認(rèn)，應(yīng)用常規(guī)試驗(yàn)就可以產(chǎn)生很多本文描述的本發(fā)明特定實(shí)施方案的等價(jià)方案。這些等價(jià)方案也包括在下述權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.診斷青光眼的方法，包括檢測(cè)患者樣本中Wnt通路組分或卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的異常水平或生物活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中患者樣本包括小梁網(wǎng)細(xì)胞組織細(xì)胞或患者淚液。
3.權(quán)利要求1的方法，其中卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的異常高水平可以診斷青光眼狀態(tài)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物是FRP-1核酸或FRP-1多肽。
5.權(quán)利要求1的方法，其中Wnt通路組分選自Wnt基因，卷曲蛋白基因，糖原合酶激酶基因，蛋白激酶C基因，β-連環(huán)蛋白基因，TCF基因，TCF調(diào)控基因以及刺猬蛋白基因。
6.權(quán)利要求1的方法，其中Wnt通路組分生物活性是β-連環(huán)蛋白的生物活性。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過(guò)測(cè)定磷酸化β-連環(huán)蛋白的水平來(lái)檢測(cè)β-連環(huán)蛋白的生物活性。
8.權(quán)利要求6的方法，其中磷酸化β-連環(huán)蛋白的異常高水平可以診斷青光眼狀態(tài)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中Wnt通路組分生物活性是激酶。
10.權(quán)利要求8的方法，其中激酶是糖原合酶激酶-3或蛋白激酶C。
11.權(quán)利要求10的方法，其中糖原合酶激酶-3活性或蛋白激酶C活性水平的異?？梢栽\斷青光眼狀態(tài)。
12.診斷青光眼的方法，包括從患者樣本中檢測(cè)至少一種人Wnt通路組分編碼基因或卷曲相關(guān)蛋白編碼基因的多態(tài)性等位基因。
13.權(quán)利要求12的方法，其中患者樣本是血樣或頰部刮片樣本。
14.權(quán)利要求12的方法，其中人多態(tài)性等位基因是FRP-1基因。
15.權(quán)利要求14的方法，其中人多態(tài)性等位基因是FRP-1基因啟動(dòng)子。
16.權(quán)利要求15的方法，其中FRP-1基因啟動(dòng)子多態(tài)性等位基因與FRP-1基因產(chǎn)物表達(dá)增加有關(guān)。
17.鑒定抗青光眼化合物的方法，包括將表達(dá)Wnt通路組分或卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的細(xì)胞與測(cè)試化合物混合；并檢測(cè)在測(cè)試化合物存在的情況下，所述Wnt通路組分或所述卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的水平或生物活性；其中，在測(cè)試化合物存在的情況下，Wnt通路組分或卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物水平或生物活性相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下的Wnt通路組分或卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物水平或生物活性的升高或降低，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中，在測(cè)試化合物存在的情況下，檢測(cè)到的卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物水平或生物活性相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下檢測(cè)到的水平或生物活性降低，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中卷曲相關(guān)蛋白基因是FRP-1。
20.權(quán)利要求17的方法，其中，在測(cè)試化合物存在的情況下，檢測(cè)到的Wnt通路組分水平或生物活性相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下的檢測(cè)到的水平或生物活性升高，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中Wnt通路組分選自Wnt基因產(chǎn)物，卷曲蛋白基因產(chǎn)物，糖原合酶激酶基因產(chǎn)物，蛋白激酶C基因產(chǎn)物，β-連環(huán)蛋白基因產(chǎn)物，TCF基因產(chǎn)物，TCF調(diào)控基因產(chǎn)物，以及刺猬蛋白基因產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求20的方法，其中Wnt通路組分生物活性是β-連環(huán)蛋白的生物活性。
23.權(quán)利要求22的方法，其中通過(guò)測(cè)定磷酸化β-連環(huán)蛋白的水平來(lái)檢測(cè)β-連環(huán)蛋白的生物活性。
24.權(quán)利要求23的方法，其中在測(cè)試化合物存在的情況下，磷酸化β-連環(huán)蛋白的水平相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下的磷酸化β-連環(huán)蛋白的水平降低，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
25.權(quán)利要求17的方法，其中Wnt通路組分生物活性是激酶活性。
26.權(quán)利要求25的方法，其中激酶活性是糖原合酶激酶-3的活性，并且，在測(cè)試化合物存在的情況下，激酶活性水平相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下的激酶水平發(fā)生變化，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
27.權(quán)利要求25的方法，其中激酶活性是蛋白激酶C的活性，并且，在測(cè)試化合物存在的情況下，激酶活性水平相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下的激酶水平發(fā)生變化，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
28.鑒定抗青光眼化合物的方法，包括將細(xì)胞樣本與測(cè)試化合物混合；并測(cè)定Wnt響應(yīng)基因的水平或生物活性；其中，在測(cè)試化合物存在的情況下，Wnt響應(yīng)基因的水平相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在下的Wnt響應(yīng)基因的水平或生物活性增加，就能鑒定所述測(cè)試化合物是一種抗青光眼化合物。
29.權(quán)利要求28的方法，其中Wnt響應(yīng)基因選自刺猬蛋白基因，鋸齒蛋白基因，Lef/tcf調(diào)控基因，合成報(bào)導(dǎo)基因。
30.治療人類青光眼的方法，包括給該個(gè)體應(yīng)用治療有效劑量的化合物，所述化合物能夠調(diào)節(jié)Wnt通路組分或卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的水平或生物活性。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述化合物選自蛋白，肽，擬肽，小分子或核酸。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述核酸選自基因，反義，核酶和三體核酸。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述核酸是卷曲相關(guān)蛋白基因核酸。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述化合物是卷曲相關(guān)蛋白基因產(chǎn)物的拮抗劑。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物是基因治療藥物。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述化合物是蛋白治療藥物。
37.權(quán)利要求30的方法，其中所述化合物是能夠增加Wnt通路組分基因水平或生物活性的制劑。
38.權(quán)利要求30的方法，其中所述化合物含有突變卷曲相關(guān)蛋白基因或基因產(chǎn)物的拮抗劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述化合物是反義，核酶或三螺旋分子。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述化合物是小分子，肽或擬肽。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述化合物是抗體。
42.篩檢卷曲相關(guān)蛋白激動(dòng)劑或拮抗劑的方法，包括以下步驟a)令卷曲相關(guān)蛋白多肽或其生物活性片段在一定條件下與卷曲相關(guān)蛋白結(jié)合配體以及測(cè)試化合物結(jié)合，在所述條件下，對(duì)于測(cè)試化合物，卷曲相關(guān)蛋白與卷曲相關(guān)蛋白結(jié)合配體能夠發(fā)生相互作用；并且b)檢測(cè)在測(cè)試化合物存在的情況下，卷曲相關(guān)蛋白/卷曲相關(guān)蛋白結(jié)合配體復(fù)合物的形成程度，其中，在測(cè)試化合物存在的情況下，相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在的情況下，復(fù)合物形成的量增加，提示測(cè)試化合物是卷曲相關(guān)蛋白激動(dòng)劑，而在測(cè)試化合物存在的情況下，相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試化合物存在的情況下，復(fù)合物形成的量減少，提示測(cè)試化合物是卷曲相關(guān)蛋白拮抗劑。
43.權(quán)利要求42的方法，該方法還可包括從測(cè)試化合物中制備藥物組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明披露了診斷和治療青光眼的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1426482SQ01808791
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月29日
發(fā)明者A·F·克拉克, J·芬格爾特, L·麥克納特, E·M·斯通, W-H·王 申請(qǐng)人:阿爾康公司, 衣阿華大學(xué)研究基金會(huì)