專利名稱：含有異源核和線粒體的多能細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是對細(xì)胞的操作，以產(chǎn)生用于核移植方法的非人類卵母細(xì)胞，其中這些核移植單位含有來自相同種的兩個不同細(xì)胞來源的異源核和線粒體。
背景技術(shù)：
已經(jīng)證實能將分化細(xì)胞的核移植到去核成熟(term)細(xì)胞中，產(chǎn)生去分化的多能細(xì)胞，這為生物學(xué)操作、研究和治療提供了廣泛的機(jī)會。應(yīng)用能替代或補(bǔ)充生物缺陷或不利醫(yī)學(xué)病癥的細(xì)胞或器官糾正這些缺陷或病癥的機(jī)會越來越多。至于移植，迄今仍依賴于從供體獲得的器官，其中供體已經(jīng)死亡，或者供體有兩份器官而放棄其中一份。盡管積極鼓勵人們在死后提供可以使用的器官，但是可以利用的器官仍然極其短缺，許多人排隊等待。在替換缺陷器官失敗可能致命的情況下，找到替代器官的時間十分有限。
不僅器官供應(yīng)短缺，而且供體必須與受體組織相容。甚至在供體與受體之間有緊密的組織相容性匹配時，受體通常也必須依賴免疫抑制藥物防止移植物排斥。這些藥物對移植受體通常有嚴(yán)重的副作用，但是必須忍受，因為沒有移植物將是致命的。由于手術(shù)能力已經(jīng)擴(kuò)展，細(xì)胞和器官移植物糾正大量適應(yīng)證的可能性越來越大。
胚胎干(“ES”)細(xì)胞提供了按照需要生產(chǎn)分化細(xì)胞、器官和完整個體的機(jī)會，使人們可以克隆特定基因型。至于家畜，例如有蹄類動物，來自著床前家畜胚胎的核支持去核卵母細(xì)胞發(fā)育成熟(Smith等人，Biol Reprod.401027-1035(1989)；Keefer等人，同上50935-939(1994))。由于ES細(xì)胞的意義和重要性，有大量論文報道了該技術(shù)的不同方面。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.43255-260(1991)報道了來自豬和綿羊胚泡的穩(wěn)定的多能細(xì)胞系的建立；Gerfen等人，Anim.Biotech.61-14(1995)報道了從豬胚泡中分離胚胎細(xì)胞系，這些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分化為幾種不同的細(xì)胞型；Cherny等人，Theriogenology 41175(1994)報道了長期培養(yǎng)保存的多能牛原始生殖細(xì)胞衍生的細(xì)胞系，它們形成胚狀體并自發(fā)分化為至少兩種不同的細(xì)胞型；Campbell等人，Nature 38064-68(1996)報道了在有利于分離小鼠中的ES細(xì)胞系的條件下培養(yǎng)綿羊胚胎，在第9天對胚胎的胚盤(“ED”)細(xì)胞進(jìn)行核移植，產(chǎn)生活的羊羔；VanStekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev.40444-454(1995)報道了從牛胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(“ICM”)細(xì)胞中分離并表征永久細(xì)胞系；Smith等人，WO 94/24274，1994年10月7日公布，Wheeler等人，WO94/26889，1994年11月24日公布，報道了可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的牛和豬多能ES細(xì)胞的產(chǎn)生；Collas等人，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)報道了通過向去核成熟卵母細(xì)胞中顯微注射裂解的供體細(xì)胞，對牛ICM進(jìn)行核移植(參見，Keefer等人，同上文)；Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906143-6147(1993)報道了通過將體外短期培養(yǎng)的牛ICM細(xì)胞的核移植到去核成熟卵母細(xì)胞中，生產(chǎn)小牛(參見，Stice等人，Biol.Reprod.54100-110(1996))。最后，Robl等人的PCT/US97/12919報道了由種間核移植產(chǎn)生的ES細(xì)胞。
ES細(xì)胞操作提供的特殊機(jī)會保證了對ES細(xì)胞的特性、它們可來自的來源、它們增殖和成熟的方式等的持續(xù)研究和改進(jìn)。因此，十分關(guān)注尋找在細(xì)胞和器官或器官片段發(fā)育中廣泛使用ES細(xì)胞的方法，用于移植、動物飼養(yǎng)、研究導(dǎo)致細(xì)胞分化和類器官、器官及其部分形成的發(fā)育過程。
發(fā)明概述提供如下的方法和組合物，它們涉及能夠培養(yǎng)增殖并分化為不同細(xì)胞型的修飾卵母細(xì)胞和ES細(xì)胞，工程化ES細(xì)胞，由其產(chǎn)生的分化細(xì)胞，器官或其部分和由之產(chǎn)生的生物。該方法包括使用異源卵細(xì)胞，其中異源是指用于細(xì)胞的最終物種(這些細(xì)胞去核并導(dǎo)入入異種核)產(chǎn)生含有來自一個種的細(xì)胞質(zhì)和線粒體和來自不同種的核的嵌合細(xì)胞。在嵌合細(xì)胞增殖獲得可產(chǎn)生ES細(xì)胞的核移植(NT)單位后，ES細(xì)胞可用于進(jìn)一步增殖和科學(xué)研究，或者可將NT單位移植到異源、同源或其它相容的異種宿主子宮中(基于原始卵母細(xì)胞)以備妊娠和分娩。然后可以收獲來自該F1動物的卵母細(xì)胞，去核，導(dǎo)入異源核，產(chǎn)生一種卵細(xì)胞，該細(xì)胞能產(chǎn)生含有單一物種的蛋白質(zhì)、有免疫能力的細(xì)胞，在植入異體宿主時排斥危險降低，因而能夠接受。對于本申請，這些細(xì)胞及其后代被稱為“異源嵌合的”(allochimeric)。特別關(guān)注將要施用分化異源嵌合細(xì)胞的宿主的核的用途。
具體實施方案描述提供了如下的異源嵌合細(xì)胞，其含有來自第一個物種的第一個個體的線粒體和來自相同物種的第二個個體的核。一般來說，將產(chǎn)生能發(fā)育成胚胎或大量不同細(xì)胞型的多能細(xì)胞，其含有來自異源物種的線粒體(異源物種是指目的種)，和異種的核(異種是指將要植入細(xì)胞的物種，或與細(xì)胞植入和細(xì)胞分化為胚胎相容的不同物種)。發(fā)育或成熟的胚胎然后可用于收獲卵母細(xì)胞，使卵母細(xì)胞去核，并導(dǎo)入來自相同物種的核作為線粒體。產(chǎn)生的異源嵌合細(xì)胞可以在體外和體內(nèi)用于研究分化，用于產(chǎn)生不同分化途徑(例如外胚層、內(nèi)胚層或中胚層)的細(xì)胞，和這些類別的細(xì)胞，如神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)元、星形細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)等，造血細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞等，成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。
該方法包括下列主要步驟1.收獲卵細(xì)胞并去核。
2.將來自不同于該卵細(xì)胞的物種的核線粒體基因?qū)氩煌锓N的體細(xì)胞的核基因組中。
3.將來自不同于該卵細(xì)胞的物種的核導(dǎo)入去核卵細(xì)胞中，產(chǎn)生嵌合細(xì)胞。
4.擴(kuò)增嵌合細(xì)胞，產(chǎn)生活性(competent)嵌合ES細(xì)胞，或者溫育以發(fā)育核移植(NT)單位。
5.將活性嵌合NT單位植入到相容的雌性宿主中。
6.使嵌合NT單位生長為胚胎或至足月，產(chǎn)生新生動物。
7.使新生動物生長到一定年齡，產(chǎn)生嵌合卵母細(xì)胞。
8.從后代中收獲嵌合卵母細(xì)胞。
9.將嵌合卵母細(xì)胞去核，導(dǎo)入與卵母細(xì)胞線粒體異源的核，產(chǎn)生異源嵌合NT單位。
10.培養(yǎng)異源嵌合NT單位產(chǎn)生ES細(xì)胞。
11.任選地遺傳修飾異源嵌合ES細(xì)胞。
12.利用異源嵌合ES細(xì)胞生產(chǎn)其它細(xì)胞型。
現(xiàn)在將詳述該方法的每一個步驟。
1.收獲卵細(xì)胞并去核。
卵細(xì)胞可從任何常規(guī)目的宿主中收獲，希望含有來自目的物種的線粒體。因此，任何目的哺乳動物種都可用作卵細(xì)胞的來源，特別是家畜，更特別地是大型家畜，例如馬、牛、綿羊、豬、貓、犬、兔、鼠等，和靈長類動物，例如人、猴和猿。卵母細(xì)胞可以用任何常規(guī)方法獲得，取決于卵泡的來源是宰殺動物還是需要手術(shù)方法。特別關(guān)注的是靈長類動物細(xì)胞，更特別地是人類細(xì)胞，它們可用于產(chǎn)生分化的細(xì)胞。這些細(xì)胞可來自這些物種的任一成員，隨后使用的核將決定物種和細(xì)胞的組織相容性。本發(fā)明尤其使用人類細(xì)胞，盡管也有異源嵌合細(xì)胞能起作用的其它物種的例子，例如珍稀動物、體外受精不可行的動物等。
人類細(xì)胞已經(jīng)分離并去核。在Zhang等人，J.Assist.Reprod.Genet.12361-8(1995)中，分離并凍存人類胎卵，在融解后發(fā)現(xiàn)能成熟形成極體。Messinis等人，Br.J.Obstet.Gynaecol.9339-42(1986)；Pellicer等人，Hum.Reprod.4536-40(1989)；Wahlstrom等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.442402-7(1985)；Wood等人，Br.J.Obstet.Gynaecol.88756-60(1981)描述了卵泡的吸出。去核技術(shù)使用用于其它物種的技術(shù)，具體方式在實驗部分描述。
卵細(xì)胞可以按照已知的方法使用合適的成熟培養(yǎng)基在體外成熟。含有極體的卵母細(xì)胞(中期II卵母細(xì)胞)可以用作宿主細(xì)胞。參見，例如，Prather等人，Differentiation 481-8(1991)和Seshagine等人，Biol.Reprod.40544-606(1989)。
去核按照常規(guī)方法實現(xiàn)，方便地使用微量吸管吸出極體和周圍的細(xì)胞質(zhì)。然后選擇卵母細(xì)胞完成成功的去核。
2.將來自不同于該卵細(xì)胞的物種的核線粒體基因?qū)氩煌锓N的體細(xì)胞的核基因組中。
通過導(dǎo)入對于卵細(xì)胞所含線粒體類型中的線粒體功能至關(guān)重要的基因可以構(gòu)建體細(xì)胞核。本發(fā)明特別可用于向動物特別是牛的體細(xì)胞中導(dǎo)入人類核線粒體基因，以利于含有人類線粒體的動物細(xì)胞的細(xì)胞功能。
3.將來自不同于該卵細(xì)胞的物種的核導(dǎo)入去核卵細(xì)胞中，產(chǎn)生嵌合細(xì)胞。
許多哺乳動物宿主可以用作核的來源，一個主要問題是方便。除了嵌合NT單位生長成熟的必要性之外，選擇宿主來源的其它考慮有易于從宿主獲得卵母細(xì)胞，易于操作和培養(yǎng)生長，技術(shù)的成熟性，以前獲得后代的成功率，易于宿主生長，產(chǎn)生的嵌合卵母細(xì)胞的生存力，可利用的卵母細(xì)胞數(shù)量，線粒體與宿主核的相容性，以及其它實際考慮。盡管可以使用任何哺乳動物宿主，但特別關(guān)注的是家畜，更特別地是大型家畜或非人類的靈長類動物。代表性哺乳動物包括有蹄類動物、牛和綿羊、豬、貓、馬、兔、鼠、犬等。分離的卵母細(xì)胞在體外成熟，根據(jù)極體的存在篩選。
核可以來自任何適宜的來源，能用于產(chǎn)生后代的生殖細(xì)胞或體細(xì)胞。因此，核可以來自胎細(xì)胞、新生動物細(xì)胞、成熟細(xì)胞、培養(yǎng)基中產(chǎn)生的細(xì)胞等。一般不使用腫瘤細(xì)胞核，但是根據(jù)腫瘤的性質(zhì)也可以使用。來源可以是分化的細(xì)胞，可以是休眠的，G0細(xì)胞，或者處于活性狀態(tài)，如G1或G2細(xì)胞。細(xì)胞型包括單細(xì)胞胚胎(受精卵)或前核、卵細(xì)胞、卵裂球、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、肺泡細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、造血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、實質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、卵泡細(xì)胞等，它們的選擇可取決于與最終用途有關(guān)的許多因素。
有多種技術(shù)可用于向去核卵細(xì)胞中導(dǎo)入核。融合和注射已經(jīng)表明是有效的，其中作為核來源的細(xì)胞置于去核卵母細(xì)胞的卵周隙中，利用電脈沖或使用細(xì)玻璃針在融合室中融合，供體核或來自受精卵母細(xì)胞的前核能被分離，并輸送到受體卵的細(xì)胞質(zhì)中。這些前核可以來自基因組已被修飾因而包含與受體卵母細(xì)胞相同的物種的核線粒體基因的動物。(參見，例如，Prather等人，美國專利號4,997,384。)融合也能利用電脈沖或使用不同融合劑(如仙臺病毒)完成。(參見，例如，Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.919(1969)；Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994))。
4.擴(kuò)增嵌合細(xì)胞，產(chǎn)生活性嵌合ES細(xì)胞，或者溫育以發(fā)育核移植(NT)單位。
融合后，將產(chǎn)生的融合核移植(“NT”)單位置于合適的培養(yǎng)基(如CRIaa培養(yǎng)基)中直到激活。一般在不久后即進(jìn)行激活，通常在24小時內(nèi)，更常見地是在4-9小時后。激活可以利用周知的對于哺乳動物細(xì)胞的方法完成，如在亞生理溫度(如室溫)下培養(yǎng)NT單位，精子穿透卵母細(xì)胞，電和化學(xué)休克等。參見，例如，Susko-Parrish等人，美國專利號5,496,720。其它方法包括利用電休克、乙醇處理或螯合劑處理，同時或連續(xù)提高卵母細(xì)胞中二價陽離子的水平，例如鈣、鎂、鋇或鍶，適當(dāng)?shù)囊噪x子載體的形式；或減少卵母細(xì)胞中細(xì)胞蛋白的磷酸化，使用激酶抑制劑，例如6-二甲基氨基嘌呤(DAMP)、星形孢菌素、roscovitine、丁內(nèi)酯、2-氨基嘌呤和鞘氨醇，或者向卵母細(xì)胞中導(dǎo)入一種或多種磷酸酶，如磷酸酶2A或2B。一種重要的激活技術(shù)是在成熟培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)后18-30小時內(nèi)激活NT單位。然后從培養(yǎng)基中取出NT單位，置于激活培養(yǎng)基(2mL TL Hepes，含2mg牛血清白蛋白、5mM離子霉素和2mM 6-DMAP)中，在載玻片加溫器上4分鐘。4分鐘結(jié)束時，用TL Hepes漂洗NT單位，在38.5℃和5％CO2下置于含有2mM 6-DMAP的培養(yǎng)基中2-5小時。結(jié)束時，用TL Hepes漂洗NT單位4次，放置培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到希望的發(fā)育階段時，將產(chǎn)生ES細(xì)胞，或者將NT單位轉(zhuǎn)移到雌性受體中。
然后可在適當(dāng)?shù)捏w外或體內(nèi)培養(yǎng)基中培養(yǎng)激活的嵌合細(xì)胞的NT單位，直到產(chǎn)生ES細(xì)胞和發(fā)育胚胎(如胚泡)的細(xì)胞集落。適于ES細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)和成熟的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域眾所周知。嵌合細(xì)胞可以作為來自核的物種的細(xì)胞處理，核基因確定表面膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)和核蛋白。已知培養(yǎng)基的例子包括Ham’s F-10+10％胎牛血清(“FCS”)、組織培養(yǎng)基-199(“TCM-199”)+10％胎牛血清、Tyrodesp白蛋白-乳酸-丙酮酸(“TALP”)、Dulbecco磷酸緩沖液(“PBS”)、Eagle和Whitten培養(yǎng)基。常用的一種培養(yǎng)基是TCM-199或DMEM和5-20％胎牛血清或支持生長的類似來源的因子，如新生血清、動情期母牛血清、羔羊血清或steer血清。一種代表性培養(yǎng)基是含有Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml慶大霉素的TCM-199。這些培養(yǎng)基可用于細(xì)胞系提供條件培養(yǎng)基，使用卵泡顆粒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、BRL細(xì)胞、子宮細(xì)胞和STO細(xì)胞。此外，也可使用Rosenkrans，jr.，美國專利號5,096,822所述的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基被稱為CR1，含有約1-10mM、通常1-5mM的半鈣(hemicalcium)L-乳酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉和少量無脂肪酸牛血清白蛋白，當(dāng)加入必需和非必需氨基酸時，培養(yǎng)基被稱為CR1aa。一種典型的CR1培養(yǎng)基含有114.7mM NaCl、3.1mM KCl、26.2mM Na2CO3、5mM半鈣L-乳酸和3mg/ml無脂肪酸牛血清白蛋白。
方便地將激活的NT單位嵌合ES細(xì)胞置于含1.9mM DMAP的CR1aa培養(yǎng)基中約4小時，隨后用HECM洗滌，然后在約38.5℃和5％CO2下在含有BSA的CR1aa中培養(yǎng)約4-5個小時。通常洗滌培養(yǎng)的NT單位，并置于合適的條件培養(yǎng)基中生長。一種有效的培養(yǎng)基是含有10％FCS和6mg/ml BSA的CR1aa培養(yǎng)基。合適的飼養(yǎng)層包含成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，特別是子宮上皮細(xì)胞，形成如有蹄類動物、雞、鼠、STO、SI-m220和BRL細(xì)胞的來源。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞特別有用。在足夠的時間后(因核的物種而不同)，獲得嵌合ES細(xì)胞，現(xiàn)在可用于植入適當(dāng)?shù)乃拗髦小?br> 5.將活性嵌合NT單位植入到相容的雌性宿主中。
6.使嵌合NT單位生長為胚胎或足月，產(chǎn)生新生動物。
許多物種(包括鼠和有蹄類動物)的這些階段在文獻(xiàn)中已經(jīng)很好地表述。為了受精，將NT單位轉(zhuǎn)移到子宮中。受精后，監(jiān)視宿主，以確保NT單位成功植入。根據(jù)宿主的性質(zhì)，可以約束宿主，以防止自發(fā)性流產(chǎn)。胎或新生動物的分娩可以是自然或人工流產(chǎn)、自然分娩或剖腹產(chǎn)。
7.使新生動物生長到一定年齡，產(chǎn)生嵌合卵母細(xì)胞。
8.從后代中收獲嵌合卵母細(xì)胞。
上述階段取決于宿主的性質(zhì)。正常照顧宿主，使新生動物生長為健康宿主。卵母細(xì)胞的收獲可以如上所述進(jìn)行。
9.將嵌合卵母細(xì)胞去核，導(dǎo)入與卵母細(xì)胞線粒體異源的核，產(chǎn)生異源嵌合NT單位。
去核和導(dǎo)入核的方法已經(jīng)描述。提供核的物種的選擇將取決于細(xì)胞的用途。細(xì)胞可用于克隆特定物種，特別是卵母細(xì)胞難以生長的物種，如人類或稀有物種，或者作為分化細(xì)胞的來源，其中細(xì)胞含有來自相同物種的核和線粒體。與人類不同，本發(fā)明使用的其它物種包括稀有和瀕危動物的克隆。
10.培養(yǎng)異源嵌合NT單位產(chǎn)生ES細(xì)胞。
NT單位在飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，直到NT單位達(dá)到適于分離ES細(xì)胞的大小，通常需要至少4個細(xì)胞，優(yōu)選地至少50個細(xì)胞，一般不超過400個細(xì)胞。培養(yǎng)一般使用38.5℃和5％CO2的條件，大約每1-5天更換培養(yǎng)基。
最后階段包括從培養(yǎng)物中機(jī)械取出NT單位，從NT單位內(nèi)部分離細(xì)胞，盡管來自NT單位其它部分的細(xì)胞也可以使用，洗滌NT單位的細(xì)胞，將細(xì)胞接種于來自與核相同或不同的物種的飼養(yǎng)層上，例如照射的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞保存于適當(dāng)培養(yǎng)基(例如補(bǔ)充10％FCS、0.1mMβ-巰基乙醇和L-谷氨酰胺的α-MEM)的飼養(yǎng)層上。大約每1-3天更換生長培養(yǎng)基。
對于人類異源嵌合ES細(xì)胞，個體細(xì)胞沒有很好定義，集落的邊界折射且外觀光滑。集落沒有上皮樣外觀。
可以使用NT單位細(xì)胞產(chǎn)生胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞。ICM細(xì)胞能利用飼養(yǎng)層(如含有活性炭吸附的血清的STO(小鼠成纖維細(xì)胞))培養(yǎng)生長。
11.任選地遺傳修飾異源嵌合ES細(xì)胞。
ES細(xì)胞可以按照常規(guī)技術(shù)用DNA修飾。利用合適的培養(yǎng)基、脂質(zhì)體、轉(zhuǎn)運(yùn)序列、通透、電融合等，可以將裸DNA、recA包被的DNA、病毒、質(zhì)粒、YAC、染色體外DNA、染色體片段、cDNA或其它來源的希望的基因、調(diào)節(jié)序列等導(dǎo)入ES細(xì)胞中。參見，例如，Schneike等人，Science 2782130-3(1997)。
修飾能提供特定產(chǎn)物的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)，例如胰島素，血管生成因子，細(xì)胞因子，例如白介素、干擾素和集落刺激因子，血液因子，例如血清白蛋白、凝血酶、纖維蛋白原、血小板生成素、促紅細(xì)胞生成素、組織纖溶酶原激活物等，激素，例如生長激素，生長因子，例如表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)生長因子等，酶，酶抑制劑，例如α-抗胰蛋白酶，端粒相關(guān)蛋白，例如Sir、端粒酶等，神經(jīng)元蛋白質(zhì)，例如神經(jīng)營養(yǎng)因子-3，4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等，胰蛋白，堿性蛋白，味蕾蛋白，眼蛋白，血紅蛋白，轉(zhuǎn)錄因子，脂蛋白，免疫球蛋白，表面膜受體，例如胰島素受體，癌基因抑制劑，L-多巴胺和血管生成抑制劑。此外，為了糾正缺陷或不希望的表型，可以利用核的同源重組產(chǎn)生異源嵌合ES細(xì)胞。例如，可以遺傳修飾來自鐮狀細(xì)胞性貧血患者的核，獲得產(chǎn)生天然血紅蛋白的細(xì)胞；血友病患者可糾正血液因子(如因子VIIIc或VIIIvw，克里斯馬斯因子)的突變基因；由于遺傳因素易患病的患者可修飾核，產(chǎn)生對這些疾病(例如AIDS、幼年型發(fā)病型糖尿病、肌營養(yǎng)不良、阿爾茨海默病、帕金森氏病等)敏感性較低的等位基因。
有時可能不導(dǎo)入遺傳能力，而是希望關(guān)閉遺傳能力或使基因成為誘導(dǎo)型的?？梢郧贸恼f明性基因包括癌基因、組織相容性蛋白、血型蛋白和顯性表達(dá)導(dǎo)致病理的其它基因?？梢岳猛粗亟M或者篩選已經(jīng)發(fā)生希望的敲除的細(xì)胞。
12.利用異源嵌合ES細(xì)胞生產(chǎn)其它細(xì)胞型。
Pedersen，Reprod.Fertil.Dev.6543-52(1994)綜述了關(guān)于ES細(xì)胞分化的大量文章。作者報道了表達(dá)細(xì)胞型特異的CD標(biāo)記物的分化細(xì)胞的產(chǎn)生，和分化階段或細(xì)胞產(chǎn)物，細(xì)胞通常不以ES細(xì)胞分化的水平產(chǎn)生這些產(chǎn)物。ES細(xì)胞向特定細(xì)胞型的發(fā)育可見Bain等人，Dev.Biol.168342-357(1995)(神經(jīng)細(xì)胞)；Palacios等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927530-7537(1995)(造血細(xì)胞)；Rathjen等人，Reprod.Fertil.Dev.1031-47(1998)。
目的細(xì)胞包括造血細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、骨骼肌和心肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)構(gòu)細(xì)胞、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞、卵泡細(xì)胞、眼細(xì)胞、與感覺相關(guān)的細(xì)胞，如味蕾、內(nèi)耳細(xì)胞、骨細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞，例如β-胰島細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。
分化的ES細(xì)胞能有廣泛用途。含有異源線粒體和核的細(xì)胞提供含有來自單一物種的DNA的正常細(xì)胞。這樣避免了線粒體與核之間不相容性的問題，細(xì)胞質(zhì)中存在的蛋白質(zhì)都來自相同物種，核與線粒體的相互作用，例如蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)是自然的，細(xì)胞表面存在的免疫顯性序列全都來源于相同的物種。而且，依賴于線粒體與其它胞內(nèi)區(qū)室相互作用的細(xì)胞過程也是自然的。
ES細(xì)胞和分化的細(xì)胞提供了分析細(xì)胞過程、對外源因素(例如基因、藥物、因子等)的反應(yīng)的許多機(jī)會，用于篩選這些外源因素在藥物開發(fā)中的作用，確定與對這些外部因素的反應(yīng)相關(guān)的特定等位基因或突變，研究不同因素引起的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的變化。
另外，因為ES細(xì)胞可以培養(yǎng)保存并能增殖，所以能重復(fù)產(chǎn)生分化的細(xì)胞，這些細(xì)胞將基于相同的基因型。本發(fā)明也提供用來自個體的核進(jìn)行研究和診斷的能力。因此，可以確定特定個體對外部因素(如致癌物、變應(yīng)原、毒素和誘變劑)的敏感性，其中一個物種的一個完整細(xì)胞具有該物種的天然新陳代謝。也能研究對于特定方案(如藥物方案)的細(xì)胞反應(yīng)，以確定對特定患者正常細(xì)胞的影響。關(guān)于方案的慢性應(yīng)用，有足夠的時間使用貯存的目的物種的去核卵作為容器，導(dǎo)入來自該物種特定個體的分化細(xì)胞的核。然后可用ES細(xì)胞產(chǎn)生處于不同分化階段的不同分化細(xì)胞，它們能作為檢測的細(xì)胞接受該方案和改變。
本發(fā)明可用來研究線粒體與特定核的過程。例如，當(dāng)個體可能含有在產(chǎn)生線粒體使用的蛋白質(zhì)方面缺陷的核時，該方法可用于克隆這些細(xì)胞，觀察分化對線粒體過程的影響和對生長模式、表型等的影響。
在ES細(xì)胞或NT單位用于胚胎成熟和新生動物產(chǎn)生的情況中，使用天然線粒體避免了產(chǎn)生的個體與同一物種的其它個體交配時的不相容性。因此，由于存在外源線粒體蛋白，胎被母體排斥的可能性較小，對宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的可能性較小。
可用于本發(fā)明的組合物是分離并培養(yǎng)的含有來自一個物種的線粒體和來自不同物種的核的卵母細(xì)胞。大多數(shù)時候，核和線粒體來自于根本不同的物種，一般來自不同的屬，甚至不同的科。方便地選擇核，提供去核卵子的有用來源，如家畜(有蹄類動物)，例如牛、綿羊和豬，和實驗動物，如鼠。本發(fā)明也包括含有來自一個個體的線粒體和來自同一物種的不同個體的核的卵，由它產(chǎn)生的ES細(xì)胞，含有這些ES細(xì)胞的培養(yǎng)物，由其產(chǎn)生的分化細(xì)胞，和含有這些分化細(xì)胞的培養(yǎng)物。
這些組合物在用于細(xì)胞增殖的生長培養(yǎng)物中含有異源嵌合卵母細(xì)胞和ES細(xì)胞。這些組合物在用于細(xì)胞分化的培養(yǎng)基中也包含異源嵌合細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化細(xì)胞的混合物，或者伴隨著ES細(xì)胞和分化細(xì)胞的生長或保存。
對于造血細(xì)胞，在Costar六孔培養(yǎng)板中，一種培養(yǎng)基含有絲裂霉素C處理的(5-10μg/ml，37℃，3-4小時)或照射的(2-4×103拉德γ射線；1拉德＝0.01Gy)RP.0.10骨髓基質(zhì)細(xì)胞單層，含有重組白介素-3(rIL-3)(100-300單位/ml)、rIL-6和F(終濃度為10％v/v)，鋪滿的FLS4.1胎肝基質(zhì)細(xì)胞的2天培養(yǎng)物的上清液。FLS4.1上清液含有FLT3配體、steel因子和一種支持造血干細(xì)胞生長的新因子，在2-2.5ml培養(yǎng)基[Iscove’s Dulbecco’s改良培養(yǎng)基/50μM 2-巰基乙醇/2mM L-谷氨酰胺/50μg/ml慶大霉素/7.5％v/v FCS]中，37℃，7.5％CO2/92.5％空氣。每5-7天收集細(xì)胞，在含有絲裂霉素C處理的RP.0.10基質(zhì)細(xì)胞和新制備的含細(xì)胞因子培養(yǎng)基的新Costar六孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)。(Palacios等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927530(1995))。應(yīng)當(dāng)理解，也可以使用提供類似的條件培養(yǎng)基的其它細(xì)胞系，以及提供類似活性的其它成分。
對于神經(jīng)元細(xì)胞，對ES細(xì)胞進(jìn)行8天誘導(dǎo)程序，包括4天培養(yǎng)，成為不含視黃酸(RA)的聚集物，隨后在RA存在下培養(yǎng)4天。培養(yǎng)基是DMEM(含L-谷氨酰胺、不含丙酮酸的高葡萄糖；GIBCO11965-043)、10％胎牛血清、10％新生牛血清和核苷原液。
其它培養(yǎng)基也可用于引導(dǎo)向其它細(xì)胞型分化，使用天然存在并且影響體內(nèi)分化的因子，如造血因子，例如G-CSF、M-CSF、GM-CSF、白介素、干擾素和其它細(xì)胞因子和生長因子。
全都含有相同線粒體的去核卵母細(xì)胞可以凍存于適當(dāng)培養(yǎng)基中較長一段時間，在使用前小心融化。
這些分化細(xì)胞無論遺傳修飾與否，均可在治療中應(yīng)用，健康細(xì)胞能導(dǎo)入適當(dāng)區(qū)室中行使希望的功能。例如，肌細(xì)胞可用于向心肌組織或其它肌肉組織移植，而天然或遺傳修飾的細(xì)胞可能具有例如在肌營養(yǎng)不良中能修正突變蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)。參見，例如，美國專利號5,602,301?？上蚧颊咧休斎朐煅?xì)胞，如淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或其前體，這些前體可用于特定細(xì)胞型或者可以是多能的，并將分化為大量不同類型的細(xì)胞。β-胰島細(xì)胞可以移植到胰腺上，或者置于保護(hù)容器中，它們可以通過血液供應(yīng)受神經(jīng)支配，用于糖尿病的治療。神經(jīng)元細(xì)胞可以導(dǎo)入腦腔中，通過提供L-多巴胺、NGE或能影響腦功能的其它因子或其它組合物的來源，用于治療帕金森癥、阿爾茨海默病、大腦性癱瘓等。ES細(xì)胞或其分化后代適用的其它適應(yīng)證包括脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肝病、血管疾病、燒傷軟骨置換、心臟病、腎臟病、泌尿道疾病、前列腺疾病和老化引起的疾病。
這些細(xì)胞可以用于加強(qiáng)地組成型或誘導(dǎo)型供應(yīng)特定因子。Pruschy等人，Chem.Biol.1163-72(1997)進(jìn)行了改進(jìn)，通過口服可激活轉(zhuǎn)錄因子的藥丸誘導(dǎo)產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，對于心臟病發(fā)作，能誘導(dǎo)產(chǎn)生組織纖溶酶原激活物，對于糖尿病，產(chǎn)生胰島素，對于感染，激活淋巴細(xì)胞，方法是導(dǎo)入非人類受體，如蛻皮激素受體等。
下列實施例是為了說明而不是限制。
實驗材料與方法受體人卵母細(xì)胞來自人胎的卵母細(xì)胞在選擇性流產(chǎn)后從16-20周妊娠的胎兒中獲得胎兒卵巢。將卵巢組織切碎成～1mm大小，在補(bǔ)充了15％(v/v)胎牛血清、0.03IU/ml FSH和35ng/ml胰島素的Waymouth培養(yǎng)基中培養(yǎng)。組織在37℃和5％CO2空氣中在Falcon平皿中培養(yǎng)5-25天，在Costar Transwell-COL膜上培養(yǎng)3-40天，之后在LH和人卵泡液存在下誘導(dǎo)最終成熟。由成纖維細(xì)胞組成的單層碎片在培養(yǎng)2-3天內(nèi)形成新鮮組織。培養(yǎng)1周后，卵泡從卵巢組織中分出，但仍附著于單層。從組織中分出的最大數(shù)量的卵泡在開始培養(yǎng)約1周后出現(xiàn)。在Costar平皿中培養(yǎng)40天后，卵的主要部分直徑達(dá)到80μ以上，約三分之一被透明帶包圍。在誘導(dǎo)最終成熟后，在Costar平皿中生長40天的卵中觀察到第一極體的擠壓?？墒占墒斓穆?，直接進(jìn)行去核。
來自成熟女性的卵母細(xì)胞。人卵利用Trotnow等人，Arch.Gynecol.236211-7(1985)的技術(shù)獲得。利用穿過套針的吸引針頭，用DiasonicsDS 1扇形掃描儀的轉(zhuǎn)換器進(jìn)行操控吸附，對吸引針頭進(jìn)行連續(xù)超聲成像。患者施以硬膜外麻醉。
也可以使用其它技術(shù)，包括按照Mercan等人，Hum.Reprod.121886-9(1997)所述方案施用卵泡刺激激素。
卵母細(xì)胞然后可如下在體外成熟。用含有3mg/ml牛血清白蛋白(級分V)的TL-HEPES緩沖培養(yǎng)基洗滌未成熟的卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞丘復(fù)合物在39℃下置于含10％胎牛血清、LH和/或FSH和雌二醇的TCM-199中。在成熟培養(yǎng)基中約20小時后，取出卵母細(xì)胞，置于含1mg/ml透明質(zhì)酸酶的TL-HEPES中，通過細(xì)孔吸管重復(fù)吸液除去丘細(xì)胞。根據(jù)極體篩選剝離的卵母細(xì)胞，選擇含有極體的卵母細(xì)胞(中期II卵母細(xì)胞)進(jìn)一步應(yīng)用。
牛供體細(xì)胞小母牛超排卵，人工授精。在動情期第5天或第6天從生殖道獲取胚胎。用PBS從生殖道沖洗胚胎，并回收。在體外成熟、受精并培養(yǎng)的胚胎在受精后第5天用作供體胚胎。授精過程如Keefer等人，Mol.Reprod.Dev.36469-74(1993)所述。
去核去核在成熟開始約18小時后(hpm)利用斜角微量吸管進(jìn)行。去核在TL-HEPES培養(yǎng)基加雙苯酚硫胺(Hoechst 33342，3μg/ml)中證實。
核移植將個體供體細(xì)胞置于受體去核卵母細(xì)胞的卵周隙中。人卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和牛供體核(NT單位)利用電融合技術(shù)融合在一起在卵母細(xì)胞成熟開始24小時后90V融合脈沖25微秒。將得到的NT單位置于CR1aa培養(yǎng)基中直到成熟開始后28小時，此時它們按照下列方法激活。NT單位暴露于離子霉素-6-DMAP(2mM)4分鐘，隨后在補(bǔ)充了1mg/ml血清白蛋白的TL-HEPES中只在DMAP(2mM)中4小時，然后用補(bǔ)加30mg/ml血清白蛋白的TL-HEPES洗滌5分鐘。然后將NT單位轉(zhuǎn)移到4孔培養(yǎng)板上的一小滴CR1aa培養(yǎng)基加10％FCS和6mg/ml血清白蛋白中，其中含有鋪滿的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層。NT單位在38.5℃和5％CO2下培養(yǎng)3天多。每3天更換一次培養(yǎng)基，直到激活開始后第12天。此時應(yīng)當(dāng)形成約50個細(xì)胞，從透明帶中機(jī)械取出這些細(xì)胞，用于產(chǎn)生胚胎細(xì)胞系。
小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的初級培養(yǎng)物從14-16天的鼠胎中獲得。在無菌去除頭、肝、心臟和消化道后，將胚胎切碎，并在預(yù)溫的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中37℃溫育30分鐘。成纖維細(xì)胞接種于組織培養(yǎng)瓶中，在補(bǔ)加10％FCS、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。傳代3-4天后，照射35×10Nunc培養(yǎng)皿(Baxter Scientific，McGaw Park，IL)中的胚胎成纖維細(xì)胞。照射的成纖維細(xì)胞在含5％CO2的潮濕空氣中37℃生長并保存。含有均一細(xì)胞單層的培養(yǎng)板用來培養(yǎng)胚胎細(xì)胞系。
胚胎細(xì)胞系的產(chǎn)生洗滌如上所述獲得的NT單位細(xì)胞，直接接種于照射的飼養(yǎng)成纖維細(xì)胞上(見上)。這些細(xì)胞包括NT單位的內(nèi)部細(xì)胞。細(xì)胞保存于補(bǔ)加10％FCS和0.1mMβ-巰基乙醇的α-MEM生長培養(yǎng)基中。每2-3天更換一次培養(yǎng)基。到培養(yǎng)第2天或第3天觀察到最初的集落。該集落增殖，顯示與以前公開的小鼠和牛胚胎干(ES)細(xì)胞有類似的形態(tài)學(xué)。集落內(nèi)的個體細(xì)胞沒有很好定義，集落的邊界可折射且外表光滑。這些細(xì)胞具有上皮外觀。
嵌合牛NT單位的產(chǎn)生選擇嵌合NT單位，按照下列方法植入母牛中將1-5個NT單位植入子宮中。產(chǎn)生的小牛生長到卵母細(xì)胞發(fā)育的適當(dāng)階段，此時吸出并分離卵。此外，也可通過超排卵和超聲指導(dǎo)的卵母細(xì)胞獲取從成年雌性中或從宰殺的母牛卵巢中獲得卵母細(xì)胞。
異源嵌合人細(xì)胞的產(chǎn)生如上所述獲得的嵌合卵如上對于生長和去核所述處理，然后準(zhǔn)備用于接受人的核。用標(biāo)準(zhǔn)載玻片從征得同意的成人口腔內(nèi)輕輕刮下人上皮細(xì)胞。將細(xì)胞從載玻片上沖洗到含有含Ca或Mg的PBS的培養(yǎng)皿中。通過小口徑吸管吸取細(xì)胞，將細(xì)胞塊破碎為單細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到覆蓋于油下的一小滴含10％FCS的TL-HEPES培養(yǎng)基中，利用上述方法向含有人線粒體的去核嵌合牛卵母細(xì)胞中進(jìn)行核移植。
異源嵌合細(xì)胞可以使用來自基本上所有適合的人類細(xì)胞來源的核，如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞或膀胱上皮細(xì)胞。異源嵌合細(xì)胞培養(yǎng)生長，按照不同的分化模式，如Stice等人所述，(1998)，同上文，包括肌細(xì)胞的制備。
根據(jù)本發(fā)明，提供了含有來自不同個體的人類核和人類線粒體的異源嵌合人細(xì)胞。這些細(xì)胞具有廣泛用途，因為它們提供了模擬自然人類細(xì)胞，用于研究胚胎發(fā)育和向分化細(xì)胞型分化中的細(xì)胞過程。這些細(xì)胞也能用于生產(chǎn)分化的細(xì)胞，用于細(xì)胞治療或生產(chǎn)人類因子。這些細(xì)胞是只產(chǎn)生人類蛋白質(zhì)，以致不太可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的細(xì)胞，允許對核的遺傳操作，提供可以導(dǎo)入作為核來源的個體，但是為了治療或其它用途核被修飾的人類細(xì)胞，并且提供基因型相同的細(xì)胞的來源，它們可用于特定基因型的克隆。
本申請書中引用的參考文獻(xiàn)在此引用作為參考。包括所述的所有程序和方法，構(gòu)成本申請書的方法部分，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員，適用于本申請書的主題。
本發(fā)明現(xiàn)已完全描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不背離附加權(quán)利要求書的精神或范圍的情況下，能對其進(jìn)行許多改變和修改。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)異源嵌合細(xì)胞的方法，其含有來自第一個人的線粒體和來自第二個不同的人的核，該方法包括將來自第一個人的卵母細(xì)胞去核；將來自非人類的物種的核導(dǎo)入該去核卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生第一種嵌合卵母細(xì)胞；培養(yǎng)擴(kuò)增第一種嵌合細(xì)胞，產(chǎn)生NT單位；將該ES細(xì)胞植入相容的雌性宿主中，使該NT單位生長為至少一個含有第二種嵌合卵母細(xì)胞的胚胎；收集并分離至少一個第二種嵌合卵母細(xì)胞；將至少一個第二種嵌合卵母細(xì)胞去核，并將人的核導(dǎo)入該第二種嵌合卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生異源嵌合NT單位；和培養(yǎng)該異源嵌合NT單位，產(chǎn)生異源嵌合ES細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該異源嵌合ES細(xì)胞在導(dǎo)致產(chǎn)生分化細(xì)胞的條件下培養(yǎng)生長。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該分化細(xì)胞是神經(jīng)元細(xì)胞、肌細(xì)胞或造血細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該物種是有蹄類動物，該雌性宿主是有蹄類動物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中人的核來源于分化的人類細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過電融合導(dǎo)入來自非人類的物種的核。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，另外包括遺傳修飾該異源嵌合ES細(xì)胞的步驟。
8.一種生產(chǎn)異源嵌合細(xì)胞的方法，其含有來自第一個人的線粒體和來自第二個不同的人的核，該方法包括將來自第一個人的卵母細(xì)胞去核；將來自有蹄類動物的核導(dǎo)入該去核卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生第一種嵌合卵母細(xì)胞；培養(yǎng)擴(kuò)增第一種嵌合細(xì)胞，產(chǎn)生至少4個ES細(xì)胞；將該ES細(xì)胞植入與核來源相同的有蹄類動物中，使該ES細(xì)胞生長為至少一個含有第二種嵌合卵母細(xì)胞的胚胎；收集并分離至少一個第二種嵌合卵母細(xì)胞；將至少一個第二種嵌合卵母細(xì)胞去核，并將來自分化人類細(xì)胞的核導(dǎo)入該第二種嵌合卵母細(xì)胞中，產(chǎn)生異源嵌合卵母細(xì)胞；和培養(yǎng)擴(kuò)增該異源嵌合卵母細(xì)胞，產(chǎn)生異源嵌合ES細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中該異源嵌合ES細(xì)胞在產(chǎn)生神經(jīng)元、肌肉或造血途徑中的分化細(xì)胞的條件下培養(yǎng)生長。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，另外包括遺傳修飾該異源嵌合ES細(xì)胞的步驟。
11.一種治療人類宿主中對異源嵌合細(xì)胞治療敏感的適應(yīng)證的方法，該方法包括產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求2的分化的異源嵌合細(xì)胞；和將該異源嵌合細(xì)胞導(dǎo)入人類宿主的一個部位，治療該適應(yīng)證。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該異源嵌合ES細(xì)胞在分化之前經(jīng)遺傳修飾。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中人的核來源于該人類宿主。
14.一種含有大量異源嵌合人類ES細(xì)胞的組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中培養(yǎng)該異源嵌合人類ES細(xì)胞。
16.一種組合物，其含有大量來自非人類宿主的分化的異源嵌合細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中培養(yǎng)該分化的異源嵌合細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中該分化的異源嵌合細(xì)胞處于神經(jīng)元、肌肉或造血途徑中。
19.一種組合物，其含有培養(yǎng)的異源嵌合ES細(xì)胞和異源嵌合分化細(xì)胞的混合物。
20.一種組合物，由于在至少一個異源嵌合ES細(xì)胞中體外導(dǎo)入外源DNA，其含有大量遺傳修飾的異源嵌合ES細(xì)胞。
全文摘要
提供如下的異源嵌合ES細(xì)胞，其含有來自一個物種的一個個體的核和來自相同物種的不同個體的線粒體。ES細(xì)胞可用于分化為分化的細(xì)胞型，用于治療，或研究在形成胚胎和分化中的不同發(fā)育過程。
文檔編號A61K38/00GK1427887SQ01808875
公開日2003年7月2日 申請日期2001年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月14日
發(fā)明者M·D·威斯特 申請人:先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司