專利名稱：用于治療耐受性和依賴性的促代謝谷氨酸受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐受性和依賴性治療。本發(fā)明還涉及鑒定能夠用于耐受和依賴性治療的產(chǎn)品的篩選方法。
就物質(zhì)濫用而言，能夠引發(fā)上癮行為，其維持多因素方式，濫用藥物的無(wú)條件增強(qiáng)對(duì)其起重要作用。有許多物質(zhì)對(duì)個(gè)體存在依賴性，這些物質(zhì)包括鴉片類(lèi)物質(zhì)、苯并二氮雜類(lèi)、安非他民、尼古丁、可卡因和酒精。
物質(zhì)依賴的影響非常大。例如，煙堿依賴性是藥物成癮的最廣泛類(lèi)型。15歲以上的全世界人群中有1/3是煙民。成年人中吸煙率持續(xù)升高，據(jù)WHO估計(jì)，每年約有一千萬(wàn)人的死亡與吸煙有關(guān)。在依賴性個(gè)體中停止吸煙能夠引起一系列癥狀，包括嗜欲、抑郁、焦慮、注意力不集中和體重增加。雖然目前有許多治療方法，但許多吸煙者仍然不能成功戒煙。
因此，在物質(zhì)濫用領(lǐng)域非常需要藥理學(xué)試劑，該試劑能夠比現(xiàn)有試劑更有效地減少戒斷癥狀，并且更重要地是降低復(fù)發(fā)率。確實(shí)，戒煙的治療效果目前通常非常差戒煙只有平均30％的成功率，而酒精成癮、鴉片類(lèi)和可卡因類(lèi)依賴性的戒斷率為50-80％(時(shí)間為6個(gè)月)。
雖然如此，藥物干預(yù)的原理仍然非常強(qiáng)，因?yàn)檫M(jìn)行藥物療法的人群可能比心里療法的人群更多些，因此可以通過(guò)增強(qiáng)治療的順從性和治療質(zhì)量以增強(qiáng)這些傳統(tǒng)方法。
在哺乳動(dòng)物CNS中，谷氨酸是絕大部分興奮性突觸的遞質(zhì)，在多種CNS功能中起重要作用。以前認(rèn)為谷氨酸在哺乳動(dòng)物腦中的作用僅僅由谷氨酸陽(yáng)離子通道活化所介導(dǎo)，其中所述谷氨酸陽(yáng)離子通道也稱為離子移變谷氨酸受體參見(jiàn)Watkins和Evans，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，21，165(1985)。然而，在19世紀(jì)80年代中期，偶合膦酰基肌苷水解活化的谷氨酸受體的發(fā)現(xiàn)顯示谷氨酸受體的存在直接通過(guò)G-蛋白偶合到另一個(gè)信使。從而導(dǎo)致一類(lèi)新的谷氨酸受體的發(fā)現(xiàn)，稱為代謝型(metabotropic)谷氨酸受體(mGluRs)參見(jiàn)例如Sladeczek等.，Nature，317，717(1985)和Sugiyama等.，Nature，325，531(1987)。
mGluR-相關(guān)性cDNAs的尋找已經(jīng)導(dǎo)致8種編碼不同mGluRs基因的分離。這些受體被稱為mGluR1-mGluR8。基于其氨基酸序列鑒定，這8種mGluRs可以分成3組。第I組包括mGluR1和mGluR5，第II組包括mGluR2和mGluR3，第III組包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8。
而第I組mGluRs刺激磷酸肌醇的代謝和細(xì)胞內(nèi)Ca2+的代謝，第II組和第III組mGluRs負(fù)性地偶合到腺苷酰環(huán)化酶(Schoepp & Conn，TrendPharmacol.Sci.，14，13，1993和Pin & Duvoisin，Neuropharmacology，34，1(1995))。
我們提出mGluR5的藥理學(xué)阻滯導(dǎo)致多巴胺-2(D2)受體的負(fù)性調(diào)節(jié)，最終將降低多巴胺能活性。這種多巴胺能活性的降低導(dǎo)致吸煙復(fù)發(fā)行為的降低。我們還提出mGluR5對(duì)可卡因給藥的高活性反應(yīng)有作用，并且還是可卡因和安非他民誘導(dǎo)的回報(bào)過(guò)程的必須成分。
另外，我們提出mGluR5參與了“情緒學(xué)習(xí)”。成癮意味著個(gè)體首先“學(xué)習(xí)”如何在成癮前依賴。各個(gè)記憶過(guò)程在先，我們建議mGluR5對(duì)依賴性的“學(xué)習(xí)”過(guò)程負(fù)責(zé)，不管依賴的類(lèi)型如何都是如此。因此，在最終生理學(xué)成癮之前，依賴過(guò)程的啟動(dòng)需要mGluR5受體。
因此，本發(fā)明提供mGluR5拮抗劑特別是人mGluR5的應(yīng)用，用于制備耐受性治療或依賴性治療的藥物。
本發(fā)明還提供-在治療人或動(dòng)物方法中應(yīng)用的mGluR5拮抗劑；-治療耐受性或成癮性患者的方法，該方法包括對(duì)所述患者給藥治療有效量的mGluR5拮抗劑；-含有mGluR5拮抗劑和可藥用載體或賦形劑的藥物組合物；-含有mGluR5拮抗劑和治療物質(zhì)作為聯(lián)合制劑同時(shí)、分別或按順序應(yīng)用的產(chǎn)品，其應(yīng)用于治療需要所述治療物質(zhì)的疾病，其中治療物質(zhì)在不含有所述拮抗劑的情況下應(yīng)用時(shí)會(huì)導(dǎo)致治療物質(zhì)的耐受性或依賴性；-mGluR5在鑒定用于治療耐受或依賴性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；-鑒定用于治療耐受性或依賴性的產(chǎn)品方法，包括(a)在缺乏測(cè)試物質(zhì)將導(dǎo)致所述mGluR活性的情況下讓測(cè)試產(chǎn)品接觸mGluR5，和(b)確定測(cè)試產(chǎn)品是否具有結(jié)抗mGluR5的活性，因此確定測(cè)試產(chǎn)品是否能夠用于治療物質(zhì)耐受性或依賴性；-通過(guò)本發(fā)明方法鑒定的產(chǎn)品；-在人或動(dòng)物治療方法中應(yīng)用的本發(fā)明產(chǎn)品；-本發(fā)明產(chǎn)品在制備用于耐受治療或成癮治療的藥物中的應(yīng)用；-治療耐受性或依賴性患者的方法，包括對(duì)該患者給藥治療有效量的本發(fā)明產(chǎn)品；-含有本發(fā)明產(chǎn)品和可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物；和-含有本發(fā)明產(chǎn)品和治療物質(zhì)的產(chǎn)品，其中本發(fā)明產(chǎn)品和治療物質(zhì)作為聯(lián)合制劑同時(shí)、分別或按順序用于治療應(yīng)用所述治療物質(zhì)的疾病，其中當(dāng)不含有本發(fā)明產(chǎn)品時(shí)應(yīng)用所述治療物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致治療物質(zhì)的耐受性或依賴性。
(b)顯示可卡因?qū)ν蛔冃?實(shí)心柱)和野生型(空心柱)運(yùn)動(dòng)活性的作用。60分鐘期間水平活性的總量被計(jì)算為載體處理效果的百分比(％數(shù)值對(duì)載體)。把生理鹽水靜脈注射至小鼠，在第0時(shí)間點(diǎn)置于儀器中。在第15分鐘，把可卡因以10、20或40mg/kg的劑量靜脈注射至小鼠，再次放入到該儀器中。對(duì)第20至60分鐘的數(shù)值比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(按照Dunnett’s的一道ANOVA；*＝P＜0.05；n＝14-16)。省略SEM。
圖2顯示可卡因自給藥試驗(yàn)的結(jié)果；(a)用食品增強(qiáng)劑(糖乳)的學(xué)習(xí)任務(wù)試驗(yàn)顯示mGlu(+/+)(實(shí)心柱)和(-/-)(空心柱)進(jìn)行了等量操作行為；和對(duì)(b)野生型(-)和剔除型(O)小鼠進(jìn)行不同劑量可卡因自給藥模式的量-效曲線。
圖3顯示腹膜內(nèi)注射10mg/kg可卡因或生理鹽水緩沖液后，(a)野生型小鼠和(b)剔除型小鼠的伏隔核多巴胺微分析結(jié)果。
圖4顯示在mGluR5剔除型(-/-)小鼠中自給藥的d-安非他民。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于治療耐受性或依賴性的mGluR5拮抗劑。mGluR5優(yōu)選人的mGluR5。
mGluR5拮抗劑是這樣一種物質(zhì)其減少或降低通?；罨痬GluR5的配體(激動(dòng)劑)的作用。因此，例如，該拮抗劑可以是化學(xué)拮抗劑、藥代動(dòng)力學(xué)拮抗劑、經(jīng)受體阻滯的拮抗劑、非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑或生理學(xué)拮抗劑。
化學(xué)拮抗劑是溶液中結(jié)合配體的拮抗劑，因此配體的效應(yīng)消失。
藥理學(xué)拮抗劑能夠有效降低活性藥物在其作用部位的濃度，例如增加活性配體的代謝消除速率。
受體阻塞的拮抗劑包括兩種重要機(jī)理可逆性競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用和不可逆性非平衡競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用。當(dāng)拮抗劑分子的離解速率足夠高從而配體能夠有效地置換拮抗劑分子時(shí)，出現(xiàn)可逆性競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用。當(dāng)然，該配體不能驅(qū)逐已經(jīng)結(jié)合的拮抗劑分子，反之亦然。當(dāng)拮抗劑分子離解速率非常慢或者不從受體中離解時(shí)，結(jié)果應(yīng)用配體并不使拮抗占據(jù)狀態(tài)發(fā)生變化，此時(shí)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性拮抗。因此，拮抗作用是不能克服的。
非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用記載了這樣的情形拮抗劑阻斷信號(hào)傳導(dǎo)的某一點(diǎn)，導(dǎo)致配體反應(yīng)的形成。
生理學(xué)上的拮抗作用是這樣的術(shù)語(yǔ)，該術(shù)語(yǔ)被不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)赜糜诿枋鰞煞N物質(zhì)的相互作用，其中體內(nèi)的相反作用傾向抵消各自的作用。
拮抗劑也可以是降低或取消功能性mGluR5表達(dá)的物質(zhì)。因此，例如拮抗劑可以是一種降低或取消編碼mGluR5基因表達(dá)、降低或取消mGluR RNA翻譯、降低或取消mGluR5蛋白翻譯后修飾或者降低或取消mGluR5插入到細(xì)胞膜的物質(zhì)。
優(yōu)選的拮抗劑是這樣一些物質(zhì)這些物質(zhì)在濃度為1μgml-1、10μgml-1、100μgml-1、500μgml-1、1mgml-1、10mgml-1或100mgml-1濃度時(shí)導(dǎo)致配體活化至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。百分比拮抗作用代表比較存在拮抗劑和不存在拮抗劑的條件下mGluR5活性降低的百分比?？梢园焉鲜霭俜直绒卓棺饔贸潭群娃卓箘舛冉Y(jié)合用于定義本發(fā)明的拮抗劑，優(yōu)選較低濃度的更大拮抗劑。
用于本發(fā)明的拮抗劑可以是通常mGluRs拮抗劑的相對(duì)非選擇性拮抗劑。優(yōu)選的本發(fā)明拮抗劑僅僅是第I組mGluRs拮抗劑。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明的拮抗劑是mGluR5的選擇性拮抗劑。選擇性mGluR5拮抗劑是一種拮抗mGluR5的拮抗劑，但對(duì)其它mGluRs拮抗很弱或者根本不拮抗。最優(yōu)選的拮抗劑為那些在低濃度條件下選擇性拮抗mGluR5的拮抗劑，例如那些在100μgml-1濃度或更低濃度引起50％或更高拮抗作用的拮抗劑。
因此，選擇性mGluR5拮抗劑通常顯示對(duì)mGluR5受體的活性比對(duì)mGluR1受體的活性高至少100倍、優(yōu)選至少高200倍、最優(yōu)選至少高400倍。它們可以顯示作為人和/或大鼠mGluR5拮抗劑的高選擇性和高親和力。
本發(fā)明所用的合適拮抗劑公開(kāi)于EP-A-0807621、WO99/02497、WO00/20001和WO00/63166中。因此，關(guān)于公開(kāi)于WO 99/0249 的拮抗劑，合適的拮抗劑具有下列結(jié)構(gòu)式(I) 其中R1代表氫，低級(jí)烷基、羥基-低級(jí)烷基、低級(jí)烷基-氨基、哌啶子基、羧基、酯化羧基、酰胺化羧基、未取代的或被低級(jí)烷基-，低級(jí)烷氧基-，鹵素-和/或三氟甲基-取代的N-低級(jí)烷基-N苯基氨基甲酰基、低級(jí)烷氧基、鹵素-低級(jí)烷基或鹵素-低級(jí)烷氧基；R2代表氫、低級(jí)烷基、羧基、酯化羧基、酰胺化羧基、羥基-低級(jí)烷基、羥基、低級(jí)烷氧基或低級(jí)烷酰氧基、4-(4-氟-苯甲?；?-哌啶-1-基羧基、4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基-羧基、4-(4-疊氮基-2-羥基苯甲酰基)-哌嗪-1-基-羧基或4-(4-疊氮基-2-羥基-3-碘-苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基；R3代表氫、低級(jí)烷基、羧基、低級(jí)烷氧基-羰基、低級(jí)烷基-氨基甲?；?、羥基-低級(jí)烷基、雙-低級(jí)烷基-氨基甲基、嗎啉代羰基或4-(4-氟-苯甲?；?-哌啶-1-基-羧基；R4代表氫、低級(jí)烷基、羥基、羥基-低級(jí)烷基、氨基低級(jí)烷基、低級(jí)烷基氨基-低級(jí)烷基、雙-低級(jí)烷基氨基-低級(jí)烷基、未取代或被羥基-取代的低級(jí)亞烷基氨基-低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷酰氧基、氨基-低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基氨基-低級(jí)烷氧基、雙-低級(jí)烷基氨基-低級(jí)烷氧基、苯二甲酰亞氨基-低級(jí)烷氧基、未取代或羥基-或2-氧代-咪唑啉-1-基-取代的低級(jí)亞烷基氨基-低級(jí)烷氧基、羧基、酯化或酰胺化羧基、羧基-低級(jí)烷氧基或酯化羧基-低級(jí)烷氧基；X代表任選被鹵素-取代的低級(jí)亞烯基或通過(guò)相鄰飽和碳原子或疊氮(-N＝N-)基鍵合的亞炔基、和R5代表芳基或雜芳基，其可以是未取代或者被選自下列的一個(gè)或多個(gè)取代基所取代低級(jí)烷基、鹵素，鹵代低級(jí)烷基、鹵代低級(jí)烷氧基、低級(jí)鏈烯基、低級(jí)炔基、未取代或被低級(jí)烷基-、低級(jí)烷氧基-、鹵素-和/或三氟甲基-取代的苯基、未取代或被低級(jí)烷基-、低級(jí)烷氧基-、鹵素和/或三氟甲基-取代的苯基-低級(jí)炔基、羥基、羥基-低級(jí)烷基、低級(jí)烷酰氧基-低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)鏈烯基氧，低級(jí)亞烷二氧基、低級(jí)烷酰氧基、氨基-，低級(jí)烷基氨基-，低級(jí)烷?；被?或N-低級(jí)烷基-N-低級(jí)烷?；被?低級(jí)烷氧基、未取代或被低級(jí)烷基-，低級(jí)烷氧基-，鹵素-和/或三氟甲基-取代的苯氧基、未取代或被低級(jí)烷基-，低級(jí)烷氧基-，鹵素和/或被三氟甲基-取代的苯基-低級(jí)烷氧基、?；Ⅳ然?、酯化羧基、酰胺化羧基、氰基、羧基-低級(jí)烷基氨基、酯化羧基-低級(jí)烷基氨基、酰胺化羧基-低級(jí)烷基氨基、膦?；?低級(jí)烷基氨基、酯化膦酰-低級(jí)烷基氨基、硝基、氨基、低級(jí)烷基氨基、雙-低級(jí)烷基氨基酰基氨基、N-?；?N-低級(jí)烷基氨基、苯基氨基、苯基-低級(jí)烷基氨基、環(huán)烷基-低級(jí)烷基氨基或雜芳基-低級(jí)烷基氨基，各自可以不被取代或者被低級(jí)烷基-，低級(jí)烷氧基-，鹵素-和/或三氟甲基-取代；其N(xiāo)-氧化物及其可藥用鹽。
具有堿性基團(tuán)的式(I)化合物可以形成酸加成鹽，具有酸性基團(tuán)的式(I)化合物可以形成堿加成鹽。具有堿性基團(tuán)并且還具有至少一個(gè)酸性基團(tuán)的式(I)化合物也可以形成內(nèi)鹽。還可以包括總鹽和部分鹽，也就是說(shuō)，每摩爾式(I)酸可以含有1、2或3當(dāng)量?jī)?yōu)選2當(dāng)量堿的鹽，或者每摩爾式(I)堿可以含有1、2或3當(dāng)量酸的鹽。只有可藥用的非毒性鹽可以在治療上應(yīng)用，因此他們是優(yōu)選的。
本發(fā)明中，鹵素代表氟、氯、溴或碘。低級(jí)烷基通常為C1-6烷基，例如C1-4烷基。低級(jí)烷氧基通常為C1-6例如C1-4烷氧基。低級(jí)炔基通常為C2-5炔基。低級(jí)烷?；ǔ镃2-5烷?；?。低級(jí)亞烷基通常為C2-5亞烷基。低級(jí)亞烯基通常為C2-5亞烯基。低級(jí)亞炔基通常為C2-4亞炔基。
當(dāng)X代表亞烯基時(shí)，優(yōu)選反式構(gòu)型。
優(yōu)選的式(I)化合物為這樣的一些化合物，在這些化合物中X代表任選被鹵素-取代的(C2-4)亞烯基或通過(guò)相鄰不飽和碳原子鍵合的亞炔基。
R1為氫、(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、羥基(C1-4)烷基、氰基、乙炔基、羧基、(C1-4)烷氧基羰基、雙(C1-4)烷基氨基、(C1-6)烷基氨基羰基、三氟甲基苯基氨基羰基、R2為氫，羥基(C1-4)烷基、羥基(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基，羧基、(C2-5)烷?；酢?C1-4)烷氧基羰基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷酰基、雙(C1-4)烷基氨基甲基、4-(4-氟-苯甲?；?-哌啶-1-基-羧基、4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基-羧基、4-(4-疊氮基-2-羥基苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基或4-(4-疊氮基-2-羥基-3-碘-苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基、R3為氫，(C1-4)烷基、羧基、(C1-4)烷氧基羰基、(C1-4)烷基氨基甲?；⒘u基(C1-4)烷基、雙(C1-4)烷基氨基甲基、嗎啉代羰基或4-(4-氟-苯甲?；?-哌啶-1-基-羧基、R4為氫，羥基、(C1-4)烷氧基、羧基、(C2-5)烷?；?，(C1-4)烷氧基-羰基、氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷基、羧基(C1-4)烷基羰基、(C1-4)烷氧基羰基(C1-4)烷氧基、羥基(C1-4)烷基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷氧基、間-羥基-對(duì)-疊氮基苯基羰基氨基(C1-4)烷氧基、和R5為下式基團(tuán) 或 其中Ra和Rb獨(dú)立地為氫、羥基、鹵素、硝基、氰基、羧基、(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、羥基(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基羰基、(C2-7)烷酰基、(C2-5)烷酰基氧、(C2-5)烷酰基氧(C1-4)烷基、三氟甲基、三氟甲氧基、三甲基硅烷乙炔基、(C2-5)炔基、氨基、疊氮基、氨基(C1-4)烷氧基、(C2-5)烷?；被?C1-4)烷氧基、(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷氧基、(C1-4)烷基氨基、雙(C1-4)烷基氨基、單鹵代芐基氨基、噻吩基甲基氨基、噻吩基羰基氨基、三氟甲基苯基氨基羰基、四唑基，(C2-5)烷酰基氨基、芐基羰基氨基、(C1-4)烷基氨基羰基氨基、(C1-4)烷氧基羰基氨基羰基氨基或(C1-4)烷基磺?；?。
R6為氫、氟、氯、溴、羥基、(C1-4)烷基、(C2-5)烷酰氧、(C1-4)烷氧基或氰基，和Rd為氫、鹵素或(C1-4)烷基。
更優(yōu)選的式(I)化合物這樣的化合物，在這些化合物中X如上定義，和R1是氫、(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、氰基、乙炔基或雙(C1-4)烷基氨基、R2是氫、羥基、羧基、(C1-4)烷氧基羰基、雙(C1-4)烷基氨基甲基、4-(4-氟-苯甲酰基)-哌啶-1-基-羧基、4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基羧基、4-(4-疊氮基-2-羥基苯甲酰基)-哌嗪-1-基-羧基或4-(4-疊氮基-2-羥基-3-碘-苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基、R3如上所述，R4是氫、羥基、羧基、(C2-5)烷酰基氧、(C1-4)烷氧基羰基、氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷基或羥基(C1-4)烷基，和R5為下式基團(tuán) 或 其中Ra和Rb獨(dú)立地為氫、鹵素，硝基，氰基，(C1-4)烷基、C(1-4)烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基或(C2-5)炔基，和Rc和Rd如上定義。
另外一些選擇性mGluR拮抗劑為2-芳基鏈烯基、2-雜芳基鏈烯基-，2-芳基炔基-，2-雜芳基-炔基，2-芳基偶氮-和2-雜芳基偶氮-吡啶類(lèi)，更優(yōu)選6-甲基-2-(苯基偶氮)-3-吡啶醇，(E)-2-甲基-6-苯乙烯基-吡啶和(苯基偶氮)-3-吡啶醇，(E)-2-甲基-6-苯乙烯基-吡啶和式(II)化合物 其中R1為氫、(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、氰基、乙炔基或雙(C1-4)烷基氨基，R2為氫，羥基、羧基、(C1-4)烷氧基羰基、雙(C1-4)烷基氨基甲基、4-(4-氟-苯甲酰基)-哌啶-1-基-羧基、4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基-羧基、4-(4-疊氮基-2-羥基苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基或4-(4-疊氮基-2-羥基-3-碘-苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基。
R3為氫、(C1-4)烷基、羧基、(C1-4)烷氧基羰基、(C1-4)烷基氨基甲?；?、羥基(C1-4)烷基、雙(C1-4)烷基氨基甲基、嗎啉代羰基或4-(4-氟-苯甲?；?-哌嗪-1-基-羧基，R4為氫、羥基、羧基、C(2-5)烷酰氧、(C1-4)烷氧基羰基、氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷氧基、雙(C1-4)烷基氨基(C1-4)烷基或羥基(C1-4)烷基，和R5為下式基團(tuán) 或 其中Ra和Rb獨(dú)立地為氫、鹵素、硝基、氰基、(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基或(C2-5)炔基，和Rc為氫、氟、氯、溴、羥基(C1-4)烷基、C(2-5)烷酰氧、(C1-4)烷氧基或氰基；和Rd為氫、鹵素或(C1-4)烷基；所述化合物為游離形式或者可藥用鹽形式。
合適的苯基甘氨酸化合物公開(kāi)于EP-A-0807621中，因此本發(fā)明應(yīng)用的苯基甘氨酸化合物具有下列式(III)結(jié)構(gòu) 其中R1為氫、羥基或C1-6烷氧基；R2為氫、羧基、四唑基，-SO2H，-SO3H，-OSO3H，-CONHOH，或-P(OH)OR′、-PO(OH)OR′、-OP(OH)OR′或-OPO(OH)OR′，其中R′為氫、C1-6烷基、C2-6鏈烯基或芳基C1-6芳基；R3為氫、羥基或C1-4烷氧基；和R4為氟、三氟甲基、硝基、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、C2-6鏈烯基、C2-6炔基、C1-6烷基硫、雜芳基、任選取代的芳基、任選取代的芳基C1-6烷基、任選取代的芳基C2-6鏈烯基、任選取代的芳基C2-6炔基、任選取代的芳基氧、任選取代的C1-6烷氧基、任選取代的芳基硫、任選取代的芳基C1-6烷基硫或-CONR″R、-NR″R、-OCONR″R或-SONR″R，其中R″和R各自為氫、C1-6烷基或芳基C1-6烷基、或R″和R一起組成一個(gè)C3-7亞烷基環(huán)；或其鹽或其酯。
在一個(gè)實(shí)施方案中，R1、R2和R3不都是氫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)R2和R3為氫并且R1為羥基時(shí)，R4不為氟。
在上式中，烷基可以是直鏈或支鏈，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基和異丁基，優(yōu)選甲基或乙基。C2-6鏈烯基包括例如乙烯基、丙-2-烯基、丁-3-烯基、戊-4-烯基和異丙烯基。優(yōu)選的鏈烯基為式RCH＝CH-，其中R為C1-4烷基。炔基包括例如丙-2-炔基、丁-3-炔基和叔戊炔基。優(yōu)選的炔基為下式基團(tuán)R-C≡C-其中R為C1-4烷基。C3-7環(huán)烷基優(yōu)選例如環(huán)丙基、環(huán)戊基或環(huán)己基，這些基團(tuán)可以任選被一個(gè)或兩個(gè)甲基取代基所取代。
芳基優(yōu)選苯基或萘基，和任選取代的苯基或萘基，例如任選被一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)選自下列的基團(tuán)所取代C1-4烷基(特別是甲基)、C1-4烷氧基(特別是甲氧基和乙氧基)、羧基、羥基、氰基、鹵素(特別是溴、氯和氟)、三氟甲基、硝基、氨基、C1-4?；被虲1-4烷基硫。萘基可以是1-萘基或2-萘基。其中取代的苯基或萘基優(yōu)選被1-3個(gè)取代基所取代。芳基C1-6烷基是通過(guò)亞烷基鏈連接的這樣一些基團(tuán)例如芳基(CH2)n，其中n為1-6，最優(yōu)選的例子為芐基。優(yōu)選的例子如下芳基氧-任選取代的苯氧；芳基C1-6烷氧基-任選取代的苯基甲氧基或苯基乙氧基；芳基硫-任選取代的苯基硫；芳基C1-6烷基硫-任選取代的苯基甲基硫或苯基乙基硫。
雜芳基可以是在環(huán)中具有1個(gè)或多個(gè)雜原子的芳基。該術(shù)語(yǔ)包括稠環(huán)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)選自氧、氮和硫作為雜原子的雜芳基。優(yōu)選含有5-10個(gè)碳原子，例如下式結(jié)構(gòu) 其中Q為-O、-S-或-NR-，并且R為氫或C1-4烷基，或者，雜芳基含有苯并稠環(huán)，例如 和另外的雜環(huán)，包括 和 特別優(yōu)選的雜芳基為吡咯基、噻吩基或呋喃基，優(yōu)選的例子為2-噻吩基和2-呋喃基，還有吡啶基，特別是2-和3-吡啶基。
基團(tuán)R2優(yōu)選氫、羧基或四唑基，特別優(yōu)選羧基，基團(tuán)R4優(yōu)選C1-6烷基、C2-6鏈烯基、任選取代的苯基、任選取代的苯基C1-6烷基、任選取代的苯氧基、任選取代的苯基硫或任選取代的苯基C1-6烷基硫。
基團(tuán)R1和R3各自優(yōu)選氫或羥基。
本發(fā)明應(yīng)用的優(yōu)選的mGluR5拮抗劑例子包括2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶(MPEP)、2-甲基-6-[(1E)-2-苯基乙烯基]吡啶、6-甲基-2-(苯基偶氮)-3-吡啶醇、(RS)-α-甲基-4-羧基苯基甘氨酸(MCPG)及其類(lèi)似物和衍生物。
mGluR5拮抗劑可以用于治療人或動(dòng)物體的方法。該治療可以是預(yù)防性治療。具體地說(shuō)，這樣的拮抗劑可以用于耐受和/或依賴性治療。拮抗劑還可以用于制備用于耐受和/或依賴性治療的藥物?；加心褪芎?或依賴性的患者的癥狀可以通過(guò)給藥mGluR5拮抗劑加以改善。可以把治療有效量的mGluR5拮抗劑給藥至需要的人患者。
可以按照本發(fā)明治療耐受和依賴，耐受和依賴性是獨(dú)立的現(xiàn)象。
耐受的特征在于具體物質(zhì)產(chǎn)生預(yù)定的藥理學(xué)效果需要增加劑量。對(duì)于鴉片制劑，耐受發(fā)展迅速。
依賴性包括兩種獨(dú)立的因素，即生理學(xué)依賴性和心理學(xué)依賴性。生理學(xué)依賴性的特征在于戒斷癥狀綜合癥，例如突然戒除物質(zhì)(中止)可能導(dǎo)致增加的興奮或身體顫抖。戒斷癥狀的自然特性與所研究的具體物質(zhì)有關(guān)，本發(fā)明還可以用于治療脫癮癥狀/中止。
心里學(xué)依賴性比生理學(xué)依賴性更復(fù)雜，并且可能在強(qiáng)迫性物質(zhì)的攝取(成癮)過(guò)程中更重要。一般來(lái)說(shuō)，完全從戒斷綜合癥中恢復(fù)的鴉片成癮者可能以后會(huì)恢復(fù)吸毒。在對(duì)鴉片制劑有心里依賴(基于operant癥狀測(cè)試毒品作為增強(qiáng)劑的可能性測(cè)定)的動(dòng)物模型中，毒品的增強(qiáng)效應(yīng)比生理戒斷癥狀持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)久)。本發(fā)明還可以用于治療心里學(xué)依賴性和降低或禁止藥物的增強(qiáng)效應(yīng)。
本發(fā)明可以用于治療許多不同形式的耐受性或依賴性。耐受性或依賴性可以被降低或消失。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明能夠用于治療物質(zhì)耐受性或物質(zhì)依賴性。
在物質(zhì)依賴性和耐受性的上下文中，本發(fā)明既能夠用于泛泛地指″濫用″例如吸煙者的尼古丁成癮或者其它娛樂(lè)性藥物的消耗，也能夠指“治療用途”。例如，苯并二氮雜類(lèi)物質(zhì)和鴉片類(lèi)物質(zhì)的治療應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致這些藥物的依賴性和/或耐受性。非常明顯藥理學(xué)治療效果的這些結(jié)果可以被改善或消除。
因此，mGluR5拮抗劑可以用于預(yù)防治療藥物的成癮。在這些應(yīng)用中， 可以在所述治療藥物本身給藥之前、所述藥物給藥之后或者停用所述藥物之后，其可以與所述藥物共同給藥。
本發(fā)明還涉及治療廣譜其它成癮相關(guān)癥狀的治療。例如，mGluR5拮抗劑可以用于治療神經(jīng)性食欲過(guò)剩、神經(jīng)性食欲缺乏、賭博依賴性、性依賴性、運(yùn)動(dòng)活性依賴性或強(qiáng)迫癥。因此，mGluR5拮抗劑可以用于治療著迷性和/或強(qiáng)迫性行為以及多種疾病的著迷性和/或強(qiáng)迫性方面例如賭博和/或強(qiáng)迫性性行為。
本發(fā)明提供治療許多物質(zhì)的耐受性和依賴性。本發(fā)明還特別用于治療尼古丁成癮，例如治療戒煙的戒斷癥狀。因此，本發(fā)明可以用于治療戒煙相關(guān)癥狀包括嗜煙、抑郁、焦慮、難以集中注意力和體重增加，可以降低與戒煙有關(guān)的戒斷癥狀。
本發(fā)明還用于治療可卡因、安非他民和酒精成癮?？梢越档秃拖煽ㄒ?、安非他民和酒精的依賴性。對(duì)于安非他民相關(guān)性藥物例如右苯丙胺、甲基苯丙胺、利他靈和芬氟拉明的依賴性和耐受性，也可以應(yīng)用mGluR5拮抗劑治療。
本發(fā)明還可以在“濫用”的所有兩種意義上用于治療鴉片耐受性和依賴性例如海洛因依賴性，還可以在“藥物”意義上治療鴉片類(lèi)耐受性和依賴性，例如用于預(yù)防嗎啡耐受和/或依賴性。另外，也可以應(yīng)用mGluR5拮抗劑治療苯并二氮雜類(lèi)(包括安定和替馬西泮)的耐受性和依賴性。
mGluR5拮抗劑可以按照多種劑型給藥。因此，可以口服給藥，例如其劑型為片劑、錠劑、糖錠、水或油懸浮液、可分散性粉末或粒劑。拮抗劑還可以經(jīng)胃腸外給藥，例如皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、經(jīng)皮給藥或輸注給藥。所述抑制劑也可以作為栓劑給藥。醫(yī)務(wù)工作者能夠針對(duì)各個(gè)具體患者確定需要的給藥途徑。
mGluR5拮抗劑的配制將取決于許多因素例如具體拮抗劑的性質(zhì)、藥物應(yīng)用還是獸藥應(yīng)用等等。還可以把mGluR5拮抗劑配制成同時(shí)、獨(dú)立或者按順序應(yīng)用形式。
通常來(lái)說(shuō)，可以把mGluR5拮抗劑與可藥用載體或稀釋劑一起配制。例如，可藥用載體或稀釋劑可以是等滲溶液。例如，固體口服制劑可以含有與活性化合物一起的下列物質(zhì)稀釋劑例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纖維素、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二醇；粘合劑例如淀粉、阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮；解聚劑例如淀粉、海藻酸、藻酸鹽或淀粉羥乙酸鈉；起泡混合物、染料；甜味劑；濕潤(rùn)劑例如卵磷脂、聚山梨醇酯、月桂硫酸酯；和通常用于藥物制劑中的非毒性和藥理學(xué)惰性物質(zhì)。這樣的藥物制劑可以按照已知方式制備，例如通過(guò)混合、制粒、制片、糖包衣或膜包衣方法制備。
口服的液體懸浮劑可以是糖漿劑、乳劑或混旋劑。糖漿劑可以含有下列物質(zhì)作為載體例如蔗糖或含有甘油和/或甘露糖醇和/或山梨糖醇的蔗糖。
混旋劑和乳劑可以含有例如下列物質(zhì)作為載體天然膠、瓊脂、藻酸鈉、果膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素或聚乙烯醇。肌肉內(nèi)注射用溶液或懸浮液除了含有活性化合物外還含有下列物質(zhì)可藥用載體例如消毒水、橄欖油、油酸乙酯、二元醇類(lèi)，例如丙二醇，如果需要，還可以含有合適量的鹽酸利多卡因。
靜脈內(nèi)給藥或輸注用溶液可以含有例如無(wú)菌水作為載體，或者優(yōu)選地它們?yōu)闊o(wú)菌的等滲生理鹽水溶液形式。
讓患者服用藥用有效量的mGluR5拮抗劑。mGluR5拮抗劑的劑量可以根據(jù)各種參數(shù)確定，特別是根據(jù)所用的物質(zhì)；所治療患者的年齡、體重和健康狀況；給藥途徑和需要的給藥方案。同樣地，醫(yī)務(wù)工作者能夠確定任一具體患者所需要的給藥途徑和給藥劑量。通常地，根據(jù)具體抑制劑的活性、所需治療的患者的年齡、體重和健康狀況、疾病惡化的類(lèi)型和嚴(yán)重程度以及給藥途徑和頻率，每日劑量約為0.1-50mg/kg體重。優(yōu)選地，每日劑量為5mg-2g。
本發(fā)明還提供鑒定那些可能用于治療人或動(dòng)物特別是治療耐受性或依賴性的產(chǎn)品的方法。這樣的方法基本上包括確定測(cè)試產(chǎn)物是否為mGluR5拮抗劑，并且確定這樣鑒定的拮抗劑是否能夠用于治療物質(zhì)耐受性或成癮性。
mGluR5拮抗劑定義如上，可以進(jìn)行所有合適的分析以確定測(cè)試產(chǎn)品是否mGluR5拮抗劑。優(yōu)選地，應(yīng)用的任何分析可以適合高過(guò)濾篩選技術(shù)，例如所述分析可以完美地在塑料微滴培養(yǎng)皿的單個(gè)孔中進(jìn)行。
可以應(yīng)用所有合適的分析格式來(lái)鑒定mGluR5拮抗劑。優(yōu)選地，改進(jìn)分析格式這樣它們可以在塑料微滴培養(yǎng)皿的單個(gè)孔中進(jìn)行。因此，改進(jìn)分析以用于高過(guò)濾篩選技術(shù)。
確定作為mGluR5拮抗劑的測(cè)試化合物的活性的一個(gè)分析例子包括應(yīng)用編碼mGluR5受體蛋白的cDNAs轉(zhuǎn)變CHO細(xì)胞，在該細(xì)胞中表達(dá)mGluR5(Daggett等.，1995，Neuropharmacology 34.871)。然后加入quisqualate和/或谷氨酸鹽活化mGluR5，可以進(jìn)行例如下列測(cè)試測(cè)定(i)磷酸肌醇水解(Litschig等.，1999，Mol.Pharmacol.55，453)；(ii)[3H]胞苷磷酸-二乙?；视头e累(Cavanni等.，1999.Neuropharmacology 38，A10)；或細(xì)胞中鈣流入的熒光測(cè)定(Kawabata等.，1996，Nature 383，89；Nakahara等.，1997，J.Neur ochemistry69，1467)。在測(cè)試產(chǎn)品的存在和不存在下進(jìn)行測(cè)定以確定測(cè)試化合物是否能夠拮抗測(cè)試產(chǎn)品的活性。
可以進(jìn)行合適的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。例如，可以應(yīng)用mGluR1測(cè)試公知的mGluR5拮抗劑以確定公知拮抗劑的特異性，或者確定與mGluRs不相關(guān)的其它受體的特異性以降低通常細(xì)胞膜受體拮抗劑的可能性。
用于鑒定mGluR5拮抗劑的合適測(cè)試產(chǎn)品包括組合文庫(kù)、已定義的化學(xué)身份、肽和肽類(lèi)似物、低核苷酸和天然產(chǎn)品文庫(kù)。例如，可以在起初的篩網(wǎng)中應(yīng)用測(cè)試產(chǎn)品，每反應(yīng)10個(gè)產(chǎn)品，顯示各個(gè)拮抗機(jī)理測(cè)試的成批產(chǎn)品。而且，可以應(yīng)用抗體產(chǎn)品(例如，單克隆和多克隆抗體，單鏈抗體，嵌合抗體和CDR-嫁接的抗體)。
上述顯示測(cè)試活性的測(cè)試產(chǎn)品可以在體內(nèi)系統(tǒng)中測(cè)試，例如在物質(zhì)(如尼古丁、可卡因或安非他民)依賴性動(dòng)物模型中測(cè)試。合適的模型記載于下列實(shí)施例中。
因此，本發(fā)明提供通過(guò)一種方法鑒定的產(chǎn)品，所述方法用于鑒定一種產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以用于治療人或動(dòng)物體特別是治療耐受性或依賴性的方法。這樣的產(chǎn)品可以用于上述治療方法。
下列實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例1介紹下列現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛報(bào)道吸煙相關(guān)性因素對(duì)于維持吸煙、嗜煙、戒煙狀態(tài)難以維持和吸煙復(fù)發(fā)有重要作用。人類(lèi)實(shí)驗(yàn)室調(diào)查已經(jīng)顯示吸煙相關(guān)因素從由吸煙獲得的尼古丁增援得到它們的調(diào)理值。實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的尼古丁自給藥是尼古丁增強(qiáng)特性的良好建立模型，其中特異性攝取尼古丁和尼古丁尋求行為可以誘導(dǎo)和維持若干星期。已經(jīng)證明多巴胺途徑的多巴能拮抗或損害作用能夠降低尼古丁的自給藥程度。
當(dāng)模仿由吸煙復(fù)發(fā)決定性因素引起的行為效果時(shí)，該模型顯示具有有效性對(duì)尼古丁的重新接觸或強(qiáng)調(diào)條件能夠重新恢復(fù)長(zhǎng)期戒除尼古丁的大鼠的尼古丁尋求行為Chiamulera等人.，Psychopharmacology，127，102(1996)；Buczek等.，Psychopharmacology.144.183(1999)。經(jīng)短期戒除后，讓大鼠接觸復(fù)發(fā)決定物中，可能誘導(dǎo)大鼠復(fù)發(fā)，這些內(nèi)容記載于Chiamulera等人.，Arch.Pharmacol.，358，R578(1998)中。結(jié)果與離子谷氨酸鹽受體和其它mGluRs相比，在重組mGluR5受體上測(cè)定可知化合物2-甲基-6-(苯基乙炔基)-吡啶(MPEP)是mGluRD受體的選擇性和強(qiáng)效拮抗劑。該化合物的藥理學(xué)特征在于細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)物、體外藥理學(xué)測(cè)定和全身給定的體內(nèi)電生理學(xué)。
在現(xiàn)有(尼古丁預(yù)先加載)或潛在(美加明)吸煙終止藥理學(xué)治療已經(jīng)生效的模型中，為了測(cè)定抗尼古丁尋求行為復(fù)發(fā)的效果，把MPEP給藥至大鼠。應(yīng)用體重為240-260g(85％隨意體重)的雄性Wistar大鼠(Charles River)。把這些動(dòng)物各個(gè)放置于恒溫室中，并使該恒溫室維持12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗周期。
在活動(dòng)Skinner盒中，訓(xùn)練大鼠至按壓杠桿以輸注尼古丁(0.03mg/kg/輸注)。把尼古丁溶解于肝素化生理鹽水(0.09％NaCl+0.5 UI/ml)中，用NaOH把調(diào)節(jié)pH至7.4。尼古丁劑量表達(dá)為mg游離堿/kg體重/輸注。獲得活動(dòng)行為后，把大鼠維持尼古丁自給藥的每日方案至少2-3周。在這些實(shí)驗(yàn)條件中，給藥行為的穩(wěn)定進(jìn)行(按照尼古丁輸注數(shù)量或尼古丁成對(duì)的迫切要求含量)是獲得和維持尼古丁依賴性的標(biāo)準(zhǔn)。
在測(cè)試當(dāng)天，在最后自給藥尼古丁24小時(shí)之后，讓大鼠進(jìn)行多重“復(fù)發(fā)方案”，其由兩部分組成首先，30分鐘時(shí)期露置于上下文(腔室)中，和非偶然性對(duì)條件刺激(tone+cue燈)以前成對(duì)尼古丁自給藥起反應(yīng)。皮下(s.c.)注射尼古丁0.15mg/kg至大鼠，因?yàn)閜riming和尼古丁配對(duì)的杠桿按壓(但對(duì)于反應(yīng)沒(méi)有結(jié)果)在第二個(gè)120分鐘期間測(cè)定(“尼古丁成分”)。皮下尼古丁注射誘導(dǎo)的恢復(fù)反應(yīng)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生理鹽水注射。
應(yīng)用兩種戒煙的標(biāo)準(zhǔn)處理已經(jīng)進(jìn)行了該模型的藥理學(xué)特性(Rose& Corrigall，Psvchopharmacology，130，28，1997)。應(yīng)用美加明(1mg/kg，在開(kāi)始復(fù)發(fā)期前立即皮下給藥1mg/kg)或尼古丁預(yù)加載(0.03mg/kg，iv，在期間給藥30分鐘)但不應(yīng)用相應(yīng)的載體進(jìn)行預(yù)處理，這樣在尼古丁組分期間能夠顯著降低尼古丁配對(duì)的杠桿按壓(分別相對(duì)于載體處理后為為-68％和-49％，P＝＜0.05 Student′s ttest)。然而，在“cue組分”期間沒(méi)有觀察到顯著效果。
把MPEP溶解于生理鹽水(0.09％NaCl)中，以110mg/kg的劑量靜脈注射至大鼠或者注射載體，單個(gè)快速濃注，注射體積為1ml/kg體重。在復(fù)發(fā)測(cè)試開(kāi)始前5分鐘，在兩個(gè)復(fù)發(fā)測(cè)試期之間完成至少兩個(gè)穩(wěn)定的自給藥。
在“cue組分”期間，在1和10mg/kg劑量下，MPEP誘導(dǎo)對(duì)尼古丁配對(duì)的杠桿恢復(fù)抑制(相對(duì)于載體處理后的反應(yīng)分別為-60％和-86％P＝＜0.05ANOVA)。在尼古丁組分期間的所有時(shí)間點(diǎn)，這兩個(gè)劑量對(duì)于降低恢復(fù)程度均顯著有效，在第90分鐘，測(cè)定的最大效果為相對(duì)于相應(yīng)載體處理后分別為-42％和-98％；P＝＜0.05 ANOVA。
因此，我們已經(jīng)證明對(duì)于接觸復(fù)發(fā)決定因素的大鼠，用作選擇性mGluR5拮抗劑的化合物能夠降低大鼠尼古丁尋求行為的恢復(fù)。據(jù)認(rèn)為mGluR5受體的藥理學(xué)阻滯能夠消極地調(diào)節(jié)D2受體，因此降低多巴胺能活性，而多巴胺能活性是藥物尋求行為包括吸煙復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)。實(shí)施例2引言為了研究可卡因依賴的機(jī)理，我們研究了剔除mGluR5小鼠的可卡因生理學(xué)和行為學(xué)效應(yīng)。為了考慮可能的小鼠變種，剔除的小鼠已經(jīng)獨(dú)立地來(lái)源于兩種同系繁殖株C57BIack/6和129Sv。用這兩種動(dòng)物進(jìn)行了研究。材料和方法基因標(biāo)霸mGluR5剔除的小鼠產(chǎn)生如下從ES細(xì)胞同源DNA文庫(kù)中分離含有最終小鼠mGluR5基因外顯子的8.5kb基因組片段。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，把新霉素抗性盒和TK選擇單位插入到最終外顯子的兩個(gè)SacII位點(diǎn)，得到mGluR5基因編碼序列的360堿基對(duì)缺失。通過(guò)DNA印跡檢測(cè)突變的方法如下用內(nèi)部探針雜交后，用EcoRI切除基因組DNA得到5.1kbWT帶和2.2kb突變帶。然后如前所述23產(chǎn)生雜合與純合動(dòng)物，用mGluR5抗體(Upstate Biotech)證實(shí)了mGluR5的缺失(Upstate Biotech)。另外，用同系繁殖的C57BI/6J和129SvPasIco小鼠獨(dú)立地雜交雜合體5代。然后，通過(guò)在各個(gè)背景中雜交第5代雜合體得到突變純合體和WT小鼠，應(yīng)用從這些雜交中獲得的成年WT(÷/÷)和KO(-/-)小鼠進(jìn)行本研究。
可卡因自給藥在12/12小時(shí)黑暗/光照周期(早上700開(kāi)始光照)在控制溫度的動(dòng)物園中放置雄性mGluR5(+/+)和(-/-)小鼠，使動(dòng)物能夠在行為訓(xùn)練和測(cè)試期間之外的任何時(shí)候隨時(shí)獲得食物和水。所有室溫訓(xùn)練和藥物自給藥程序均在裝有2個(gè)杠桿(一個(gè)是活動(dòng)的，另一個(gè)是非活動(dòng)的，在試驗(yàn)者之間平衡)的可操作腔室中完成，所述杠桿在其中一個(gè)墻壁上，在另一個(gè)墻壁的中心有液體槽。應(yīng)用MedPC的Windows軟件(Med Associates，Georgia，VT..USA)通過(guò)IBM兼容性PC控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)和數(shù)據(jù)收集。靜脈注射用注射泵(Model A，RazelScientific)進(jìn)行，其中該注射泵通過(guò)Tygon管(0.02英寸內(nèi)徑(i.d.)×0.06英寸外徑(o.d.)，0.02英寸壁)把一端連接至不銹鋼轉(zhuǎn)環(huán)和平衡裝配(Instech，King of Prussia，PA.，美國(guó))以使動(dòng)物自由運(yùn)動(dòng)，另一端連接至小鼠中肩胛骨區(qū)域中的導(dǎo)管基部。
首先訓(xùn)練小鼠按壓一杠桿獲得液體增強(qiáng)材料(含蔗糖的乳奶，60g/L)，固定比例為1次暫停1秒程序的增強(qiáng)材料。按照此過(guò)程在1-小時(shí)期間小鼠獲得30增強(qiáng)劑后，增加該方案需要高達(dá)固定比為2次暫停20秒的方案，其與可卡因自給藥期間隨后應(yīng)用的增強(qiáng)方案相同。該訓(xùn)練通常降低動(dòng)物需要的時(shí)間以獲得靜脈內(nèi)自給藥，并且允許學(xué)習(xí)速率的不同，和/或進(jìn)行與評(píng)價(jià)藥物增強(qiáng)效果獨(dú)立的操作任務(wù)能力的不同。
在獲得杠桿按壓任務(wù)后，用氧-氟烷混合物(0.8-1.5％氟烷)麻醉小鼠，如前所述，用慢性靜脈內(nèi)頸靜脈導(dǎo)管移植(Caine等人.1999，Psychopharmacology 147，22-24；Deroche等人1997，Pharmacol.Biochem.Behav.57，429-40)。導(dǎo)管由硅橡膠管組成，硅橡膠管連接于被灣成直角的不銹鋼導(dǎo)管插管(Plastics One，Roanoke.VA)，并被牙骨質(zhì)(dental cement)包封，牙骨質(zhì)用1.0平方厘米的軟布網(wǎng)固定。該導(dǎo)管經(jīng)皮下從動(dòng)物的中肩胛骨區(qū)域通到右外頸靜脈管，其中，其被插入，并用縫合線保證安全。在接觸可卡因前，讓動(dòng)物從外科恢復(fù)至少48小時(shí)。為了確保不閉合，每天應(yīng)用大約0.01-0.03ml含有肝素的生理鹽水(30usp單位/毫升)沖洗導(dǎo)管。當(dāng)不用時(shí)，用單絲插入Tygon導(dǎo)管的較短長(zhǎng)度以蓋住導(dǎo)管。用Brevital鈉(1％melhohexital鈉.Elililly，Indianapolis.IN)在自給藥實(shí)驗(yàn)端以測(cè)試導(dǎo)管的未閉合性。具有未閉合導(dǎo)管的動(dòng)物在靜脈注射(iv)Brevital)2秒內(nèi)明顯顯示肌肉tone的消失。
應(yīng)用可卡因訓(xùn)練所有小鼠(0.8mg/ks/注射，50μl，2秒鐘)，以固定比例(FR)2將其中2個(gè)杠桿壓到活性杠桿活化的輸注泵和遞送單次注射藥物溶液，時(shí)間間隔為20秒(TO20s)(期間，記錄杠桿按壓，但沒(méi)有程序化結(jié)果)直至到達(dá)穩(wěn)定的基線(3個(gè)連續(xù)期間，＜20％平均變化和＞75％活性鼻刺反應(yīng))。當(dāng)小鼠達(dá)到穩(wěn)定基線自給藥后，測(cè)定可卡因劑量反應(yīng)曲線，其中在拉丁平方設(shè)計(jì)中單個(gè)每日期間讓小鼠服用各個(gè)劑量的可卡因(0.0，0.4，0.8，1.6，和3.2mg/kg/注射)。記錄各個(gè)劑量每期間掙的可卡因注射數(shù)，在各個(gè)劑量最后2個(gè)獨(dú)立期間測(cè)定各個(gè)劑量的注射數(shù)。
因?yàn)閙GluR5(-/-)小鼠不能達(dá)到穩(wěn)定的可卡因自給藥，相反，它們的杠桿按壓行為在3-5個(gè)接觸可卡因期間消失，在各個(gè)可卡因劑量接觸期間，將它們重新訓(xùn)練至杠桿按壓以取食物至選擇標(biāo)準(zhǔn)(30食物增強(qiáng)材料/期)。建立該方法這樣mGluR5(-/-)小鼠在第一對(duì)接觸各個(gè)可卡因劑量期間沒(méi)有非零反應(yīng)速率。通常來(lái)說(shuō)，在隨后的可卡因劑量恢復(fù)測(cè)試之前，該食物抑制需要僅僅1或2期。應(yīng)用拉丁平方劑量順序在作為mGluR5(+/+)小鼠的同樣劑量的可卡因以測(cè)試mGluR5(-/-)小鼠，在各個(gè)劑量下測(cè)試直至反應(yīng)穩(wěn)定低于5注射/期。
微分析應(yīng)用跨大腦微分析技術(shù)測(cè)定野生型以及ko小鼠的Nucleus Accumbens中的DA含量。用氯醛水合物麻醉動(dòng)物(450mg/kg/10ml ip.)，僅僅通過(guò)鼻子接合器將其置于用于小動(dòng)物的趨實(shí)體性容器中。露置頭蓋骨，切除外側(cè)肌肉，將其轉(zhuǎn)移以顯示體壁骨。在各側(cè)鉆一個(gè)1mm的孔，按照以前的方法制備orizontal微分析探針(Zocchi等.1998，Neuroscience 82，2)，通過(guò)微操縱器插入到一個(gè)孔中，自始至終推進(jìn)穿透腦以在對(duì)側(cè)孔中退出。在NucleusAccumbens水平上計(jì)算協(xié)調(diào)物至探針位置(離開(kāi)bregma位置為A+2.2mm，V-4.6)。探針的末端連接到5-mm-長(zhǎng)不銹鋼插管上，在頭蓋骨頂部用環(huán)氧膠保護(hù)?？p合皮膚留下一個(gè)槽從而使插管通過(guò)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前單獨(dú)關(guān)閉該動(dòng)物至少24小時(shí)。
在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，把插管連接至聚乙烯管(PE10)，通過(guò)該聚乙烯管人工腦脊髓流體(KCl 4mM，NaCl 147mM，CaCl2，1.3mM)經(jīng)探針以1μl/分鐘的穩(wěn)定流速泵出。
把管道連接至液體旋轉(zhuǎn)抽承以使動(dòng)物自由運(yùn)動(dòng)。在ip.注射處理前允許4小時(shí)灌注液。處理之后，每20分鐘收集樣品，共收集3小時(shí)，然后立即在-80℃溫度下冷凍。應(yīng)用criostat和放大透鏡在實(shí)驗(yàn)?zāi)┒藱z測(cè)各個(gè)動(dòng)物的探針定位。結(jié)果正如成癮實(shí)驗(yàn)所顯示(未列出)，mGluR5(-/-)小鼠與野生型小鼠運(yùn)動(dòng)活性的基線含量沒(méi)有顯著不同。在初步實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用多巴胺再攝取抑制劑可卡因(10mg/kg/ip)處理小鼠時(shí)，獲得的結(jié)果顯示突變型小鼠沒(méi)有預(yù)期的運(yùn)動(dòng)增加(圖.1a)。應(yīng)用不同劑量的可卡因進(jìn)行確定的實(shí)驗(yàn)以便描述因可卡因刺激效應(yīng)而降低的突變敏感性。以10、20、40mg/kg的劑量按照劑量隨機(jī)化順序(即所有受試者接受所有處理)將可卡因腹膜注射或者用載體處理這兩組小鼠。對(duì)于野生型小鼠，可卡因誘導(dǎo)水平活性的劑量相關(guān)性增加，但突變型小鼠未出現(xiàn)此現(xiàn)象(

圖1b)，從而證實(shí)了前面的發(fā)現(xiàn)。另外，以4mg/kg劑量靜脈注射可卡因在剔除動(dòng)物中并沒(méi)有誘導(dǎo)任何明顯效應(yīng)。因此，我們的發(fā)現(xiàn)表明mGluR5對(duì)于可卡因誘導(dǎo)的機(jī)能亢進(jìn)是必須的。
眾所周知心理刺激誘導(dǎo)的機(jī)能亢進(jìn)并不反映屬于藥物成癮的可卡因增強(qiáng)效應(yīng)(Koob等人..1998，Neuron，21，467-476)。為了更好地評(píng)價(jià)后一效應(yīng)，我們已經(jīng)應(yīng)用了對(duì)mGluR5突變型和野生型小鼠的靜脈內(nèi)(IV)可卡因自給藥方法(Epping-Jordan等.，1998，BrainResearch，784，105)。首先用食物訓(xùn)練動(dòng)物以便使它們獲得操作行為，包括在規(guī)定條件下按壓杠桿。如圖2a所示，在可卡因自給藥前，突變型和野生型動(dòng)物均成功地以相同速率完成食物攝取任務(wù)。這是一個(gè)重要的對(duì)照模型，因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道在mGluR5(-/-)小鼠中有某些學(xué)習(xí)損害(Lu等.，1997，J.Neurosci.17，5196-5205.)。如果以穩(wěn)定的方式按照0.8mg/kg的劑量使野生型小鼠自給藥(即6天之后)，則mGluR5(-/-)小鼠顯示反應(yīng)的消失，并且在三段時(shí)期后停止按壓活性杠桿。而且，mGluR 5.3剔除的小鼠在所有測(cè)試劑量(從0.4-3.2mg/kg/注射)并不自給藥可卡因，然而野生型小鼠顯示標(biāo)準(zhǔn)的量效曲線中，最佳量效曲線的最大值為0.8mg/kg(圖2b)。食物訓(xùn)練結(jié)果顯示在mGluR5(-/-)小鼠中，不能獲得可卡因自給藥并不是由于不能學(xué)習(xí)操作性杠桿按壓任務(wù)。可卡因自給藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺乏mGluR5基因的小鼠不存在可卡因的增強(qiáng)特性。然后，除了機(jī)能亢進(jìn)反應(yīng)以外，mGluR5也可以是由可卡因誘導(dǎo)的酬答方法的必要成分。
若干研究已經(jīng)報(bào)道在嚙齒類(lèi)動(dòng)物腹部紋狀體中，應(yīng)用精神刺激物的處理誘導(dǎo)DA的降低(Koob等人.1998，同上)。并且，在運(yùn)動(dòng)活性和響應(yīng)精神刺激劑的mesoaccumbens DA釋放之間有密切的相關(guān)性(Zocchi等人.1998同上)。因?yàn)閙GluR5(-/-)小鼠既不顯示運(yùn)動(dòng)反應(yīng)，又沒(méi)有可卡因成癮行為，我們檢測(cè)了野生型和突變型小鼠經(jīng)可卡因處理(MD)后核accumbens DA釋放的含量。如圖3所示，微分析實(shí)驗(yàn)顯示在對(duì)照組小鼠和剔除小鼠之間，它們經(jīng)腹膜內(nèi)注射10mg/kg可卡因后，對(duì)照組小鼠和剔除小鼠核accumbens中的DA釋放含量相似，這表明mGluR5的缺乏既不影響mesoaccumbensDA的突觸前釋放，也不影響DA運(yùn)輸體(DAT)的功能，因?yàn)閮蓷l曲線顯示相同的峰，并顯示DA濃度的相同降低(圖3)。而且，在兩個(gè)基因型上顯示的組織射線照相術(shù)顯示突變型小鼠中DA受體表達(dá)沒(méi)有變化(未列出)。
最近研究已經(jīng)顯示mGluRs在核accubens中的活化不僅增加DA的釋放，而且降低了DA依賴的運(yùn)動(dòng)活化(Attarian和Amalric，1997，Eur.J.Neurosci.，9，809；Kim和Vezina，1997，J.Phar.Exp.Ther.，283，962；Vezma和Kim，Neurosci.Behav.Rev.，23，577)。該效應(yīng)已經(jīng)顯示被非選擇性I類(lèi)mGluR拮抗劑α-甲基-4-羧基苯基甘氨酸(MCPG)所阻滯。這些結(jié)果顯示mGlu受體和多巴胺能之間有相互作用。由于正如報(bào)道所述，mGluR5的缺乏并不影響DA在突變型小鼠中核accumbens的釋放，那么，mGluR5可能施展多巴胺能活性突觸的突觸后控制。這樣，該受體已經(jīng)顯示作為第I類(lèi)mGluR以突觸后位置定位(Romano等.1995.Comp.Neuro.，355，3)。另一方面，與DA釋放的相互作用如上所述，其可以被II或III類(lèi)mGluRs介導(dǎo)，已知這兩類(lèi)mGluRs能夠控制突觸后側(cè)的突觸活性。
研究已經(jīng)主要集中于理解多巴胺能和血清素能系統(tǒng)對(duì)藥物成癮性的作用(Koob等.1998.同上)。然而，最近對(duì)DA受體和DA傳遞物質(zhì)(DAT)剔除小鼠的研究得出出人意外的結(jié)果(參見(jiàn)Drago等.1998，Dev.Neurosci，20，2-3綜述)。D2受體突變型小鼠具有異常的運(yùn)動(dòng)自發(fā)活性，但仍然顯示鴉片類(lèi)IP-注射的運(yùn)動(dòng)反應(yīng)(Maldonado等.1997，Nature，388)。另外，值得注意的是D1受體或DAT剔除小鼠在注射可卡因后未觀察到運(yùn)動(dòng)活性的增加，它們同樣具有異常的自發(fā)行為(Miner等.1995，Neuroreport，6；Giros等.，1996，Nature，379)。相反，mGluR5突變型小鼠不同時(shí)是超高活性的，它們?cè)贑57B16和129Sv背景中缺乏對(duì)可卡因的運(yùn)動(dòng)員反應(yīng)(圖1)。因此，可以毫不含糊地指出可卡因不增加mGluR5剔除小鼠的運(yùn)動(dòng)員活性。
當(dāng)處于高活性時(shí)，突變型小鼠仍然自給藥可卡因的事實(shí)表明多巴胺能傳遞可能不是由可卡因增強(qiáng)誘導(dǎo)的回報(bào)方法主要因素(Rocha等.1998，Nature Neurosci.1，2)。相反，此處結(jié)果即mGluR5被剔除的小鼠在任何測(cè)試劑量下均不自給藥可卡因，這表明mGluR5對(duì)于回報(bào)機(jī)理有重要作用。因?yàn)橥蛔兪窃谛∈笈咛グl(fā)生過(guò)程中進(jìn)行的，一些變化也可能在神經(jīng)元發(fā)展中發(fā)生，這樣依次會(huì)在成年回報(bào)方法的發(fā)生中起重要作用。盡管如此，微分析顯示在mGluR5(-/-)小鼠核accumbens中DA釋放不受影響的事實(shí)表明突變型動(dòng)物中多巴胺能反應(yīng)至少保持在該含量。值得注意的是這種結(jié)果與公認(rèn)的結(jié)論相反，因?yàn)楣J(rèn)的結(jié)論認(rèn)為升高含量的DA是可卡因增強(qiáng)效應(yīng)的受托條件(Koob等.1998，同上)?？赡艿那闆r是mGluR5作用與多巴胺能系統(tǒng)是相同的，其神經(jīng)元突觸后回報(bào)機(jī)理以及由可卡因誘導(dǎo)的高活性。因此，研究記載了小鼠前額皮層中存在多巴胺受體和metabotropic谷氨酸鹽受體之間的協(xié)調(diào)活性(Otani等.，1999，J.Neurosci.19，9788-9802)。其它剔除研究結(jié)果一起，我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)谷氨酸鹽作為藥物濫用的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一和mGluR5作為回報(bào)過(guò)程的關(guān)鍵因素的重要性。
總之，我們已經(jīng)表明當(dāng)不具有表觀表型時(shí)，mGluR5剔除小鼠顯示可卡因注射缺少運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。另外，mGluR5(-/-)小鼠在任何測(cè)試劑量下均不自給藥，而mGluR5(+/+)小鼠顯示標(biāo)準(zhǔn)劑量反應(yīng)曲線。最后，突變型和野生型小鼠經(jīng)可卡因處理后，這兩種小鼠的核accumbens中釋放類(lèi)似，該事實(shí)表明mGluR5對(duì)多巴胺系統(tǒng)具有信號(hào)傳遞介導(dǎo)效果。我們的結(jié)果表明除了多巴胺外，谷氨酸鹽通過(guò)mGluR5對(duì)于精神刺激的依賴性起關(guān)鍵作用。實(shí)施例3d-安非他民的自給藥d-安非他民自給藥實(shí)驗(yàn)的所有放置、訓(xùn)練、外科和測(cè)試條件與上述實(shí)施例2所述的可卡因自給藥實(shí)驗(yàn)相同。雄性mGluR5(-/-)小鼠能夠以固定比例(FR)2方案按照20秒的時(shí)間間隔(TO20s)最初測(cè)試d-安非他民自給藥(0.2mg/kg注射)。
圖4中結(jié)果表明所有測(cè)試的小鼠均不能在該起初劑量下獲得自給藥。小鼠還在0.1、0.05和0.0(生理鹽水)mg/kg/注射d-安非他民的劑量下測(cè)試，顯示在所有劑量下(包括5個(gè)時(shí)期的生理鹽水)完全消失的反應(yīng)。如可卡因自給藥實(shí)驗(yàn)所示，由于mGluR5(-/-)小鼠不能獲得穩(wěn)定的d-安非他民自給藥，它們被重新訓(xùn)練按壓杠桿獲取液體增強(qiáng)劑至各個(gè)d-安非他民劑量之間的標(biāo)準(zhǔn)。建立該方法，這樣mGluR5(-/-)小鼠在第一對(duì)時(shí)期接觸各個(gè)劑量的d-安非他民。MGluR5小鼠不能獲得安非他民自給藥表明mGluR5對(duì)于d-安非他民的增強(qiáng)特性有關(guān)鍵作用。
權(quán)利要求
1.促代謝谷氨酸受體5(mGluR5)拮抗劑在制備用于耐受和成癮治療的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，用于治療吸煙成癮。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，用于治療物質(zhì)耐受和依賴性、神經(jīng)性食欲過(guò)剩、神經(jīng)性厭食、賭博依賴性、性依賴性或強(qiáng)迫癥。
4.權(quán)利要求1的應(yīng)用，用于治療物質(zhì)脫癮或停用。
5.權(quán)利要求3或4的應(yīng)用，其中所示物質(zhì)為尼古丁、可卡因、安非他民或其相關(guān)藥物、苯并二氮雜類(lèi)、鴉片制劑或酒精。
6.權(quán)利要求3或4的應(yīng)用，其中物質(zhì)是治療用物質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中治療物質(zhì)是安非他民或其相關(guān)藥物、苯并二氮雜類(lèi)或鴉片。
8.治療患耐受性或依賴性疾病的宿主的方法，所述方法包括對(duì)宿主給藥治療有效量的mGluR5拮抗劑。
9.含有mGluR5拮抗劑和治療用物質(zhì)的產(chǎn)品，所含有的這些物質(zhì)作為組合制劑同時(shí)、獨(dú)立或按順序用于治療應(yīng)用所述治療物質(zhì)的疾病，其中在缺乏所述拮抗劑的條件下，應(yīng)用該治療物質(zhì)能夠?qū)е轮委熚镔|(zhì)的耐受或依賴性。
10.mGluR5在鑒定用于治療耐受性或依賴性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
11.鑒定用于治療耐受性或依賴性的產(chǎn)品的方法，包括(a)在缺乏測(cè)試物質(zhì)的條件下讓測(cè)試產(chǎn)品接觸mGluR5將導(dǎo)致所述GluR5的活性，(b)確定測(cè)試產(chǎn)品釋放拮抗mGluR5活性；和(c)確定測(cè)試產(chǎn)品是否能夠用于治療耐受性或依賴性。
12.通過(guò)權(quán)利要求11的方法鑒定的產(chǎn)品。
13.用于耐受或依賴治療的權(quán)利要求12的產(chǎn)品。
14.權(quán)利要求12的產(chǎn)品在制備用于耐受治療或依賴性治療的藥物中的應(yīng)用。
15.治療患有耐受性或依賴性的宿主的方法，所述方法包括對(duì)宿主給藥治療有效量的權(quán)利要求12所述產(chǎn)品。
16.藥物組合物，含有權(quán)利要求11的產(chǎn)品和可藥用載體或稀釋劑。
17.含有權(quán)利要求12產(chǎn)品和治療用物質(zhì)的產(chǎn)品，其中所含有這些物質(zhì)作為組合制劑用于同時(shí)、獨(dú)立或按順序用于治療所述治療物質(zhì)的疾病，其中不存在所述產(chǎn)品時(shí)應(yīng)用治療物質(zhì)可能導(dǎo)致治療物質(zhì)的耐受或依賴性。
全文摘要
促代謝型谷氨酸受體5(mGluR5)拮抗劑能夠用于耐受或依賴治療。因此，這樣的拮抗劑能夠用于治療物質(zhì)耐受或依賴、神經(jīng)性食欲過(guò)剩、神經(jīng)性厭食、賭博依賴、性依賴或強(qiáng)迫性疾病。
文檔編號(hào)A61P25/30GK1427720SQ0180889
公開(kāi)日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月9日
發(fā)明者M·科爾斯, F·康奎特 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司