專利名稱：Dfmo的d－對(duì)映體及其使用方法
背景技術(shù)：
本專利申請(qǐng)要求共同未決的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/187.441(2000年3月7日申請(qǐng))和共同未決的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/215.866(2000年7月1日申請(qǐng))的優(yōu)先權(quán)。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及癌癥和生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及在癌癥的治療中使用二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的D-對(duì)映體的方法。
2.相關(guān)技術(shù)描述二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)是一種鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的不可逆抑制劑，該酶是哺乳動(dòng)物多元胺生物合成的關(guān)鍵酶(Pasic等，1997)。據(jù)報(bào)道，DFMO的兩種對(duì)映體在抑制ODC的能力上有所不同，L型比D對(duì)映體更有效(Danzin等，1987)。雖然多元胺的生理學(xué)作用還不完全清楚，但已證實(shí)它們的細(xì)胞內(nèi)濃度是受到高度控制的，并且正常的細(xì)胞生長(zhǎng)、復(fù)制、分化、分泌和修復(fù)功能均需要多元胺(Pegg和McCann.，1982；Oka等，1981；Pegg，1986；Bachrach，1973；Williams-Ashman和Canellakis，1979；Thet等，1984；Luc和Baylin，1984)。已發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤細(xì)胞中含有高濃度的多元胺(Pasic等，1997)，它供養(yǎng)細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)，而這是癌癥發(fā)展的多步驟過(guò)程所必需的。在結(jié)腸癌發(fā)生的動(dòng)物模型中，用DFMO抑制ODC可以減少結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌的數(shù)量和大小(Meyskens和Germer，1995)。在膀胱的過(guò)渡期細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)了ODC水平的升高并且報(bào)道了用DFMO來(lái)治療膀胱癌的患者(Messing等，1995)。
用DFMO治療的一個(gè)不利的副作用是聽(tīng)覺(jué)功能的破壞。在耳蝸發(fā)現(xiàn)了多元胺，但它們的在聽(tīng)覺(jué)中的作用卻不清楚(Schweitzer等，1986)。多元胺在耳蝸中的一個(gè)可能的作用是允許與疏水性的環(huán)境相互作用(例如在膜中所發(fā)生的那些)并且可以調(diào)節(jié)無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的流出(Canellakis等，1979)。耳蝸功能密切依賴于內(nèi)淋巴獨(dú)特的電解質(zhì)濃度和正極化。因此，多元胺濃度的變化可以改變構(gòu)成內(nèi)耳蝸電位基礎(chǔ)的電解質(zhì)的動(dòng)力學(xué)，從而影響耳蝸的功能(Schweitzer等，1986)。
已知有兩種類型的耳毒性，眩暈綜合征和聽(tīng)力損失(Meyskens和Gerner，1995)。隨著D，L-DFMO每日劑量的增加(0.5g/m2/天至3g/m2/天)，閾值改變的大小和發(fā)生率增加，而開(kāi)始發(fā)生閾值改變的時(shí)間縮短(Pasic等，1997)。具有正?；€聽(tīng)力圖的患者(閾值小于30dB)比那些具有異?；€聽(tīng)力圖的患者(閾值大于或等于30dB)以更高的頻率顯示更嚴(yán)重的聽(tīng)力損失(Crogham等，1991)。這兩種副作用在停止給藥后均是可逆的(Mevskens和Gerner，1995)，閾值的恢復(fù)顯示出與閾值改變的大小或D，L-DFMO的給藥劑量無(wú)關(guān)(Pasic等，1997)。
開(kāi)發(fā)具有較少耳毒性的化療劑由于缺乏在動(dòng)物模型中的劑量數(shù)據(jù)以及對(duì)DFMO耳毒性敏感的物種的不確定性而變得復(fù)雜。DFMO最常用的給藥途徑是服用摻有藥物的引用水。但是，對(duì)水的攝取量(即藥物劑量)沒(méi)有進(jìn)行過(guò)精確的定量。體重降低是這樣服用DFMO的一個(gè)嚴(yán)重后果(Meyskens等，1995)，還不清楚體重的降低究竟是由于個(gè)體限制其攝取的含有藥物的水的量(可能是由于味道等因素)引起的還是由于藥物本身的毒性作用所引起的。
DFMO研究的模型產(chǎn)生了相互矛盾的數(shù)據(jù)。在豚鼠中，D，L-DFMO可以抑制耳蝸組織中的ODC活性并引起耳蝸多元胺的明顯缺乏(Marks等，1991)。此外，腦干聽(tīng)力測(cè)定顯示用摻有1％D，L-DFMO的水治療可以產(chǎn)生伴有鉤(hook)和第一轉(zhuǎn)彎的損傷的聽(tīng)力損失，在所有的排均有毛細(xì)胞損失。內(nèi)側(cè)毛細(xì)胞的損失比例大于外側(cè)的毛細(xì)胞(OHC)(Salzer等，1990)。當(dāng)使用大鼠作為模型時(shí)，耳蝸多元胺并沒(méi)有減少到被認(rèn)為對(duì)于破壞其它系統(tǒng)中多元胺依賴性的過(guò)程是很重要的水平。通過(guò)腦干激發(fā)電位評(píng)估的聽(tīng)覺(jué)閾值在D，L-DEMO治療的大鼠中保持不變(Schweitzer等，1986)，雖然僅研究了有限的劑量范圍。
目前仍需要顯示較低毒性和/或其它副作用的治療組合物和使用這些組合物治療癌癥的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在患者中預(yù)防和/或治療癌癥的方法，該方法包括向患者施用有效量的明顯富集的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的D對(duì)映體(D-DFMO)或其類似物。D-DFMO或其類似物以約0.05至約20.0gm/m2/天的劑量給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，D-DFMO以大約0.1至約2.0gm/m2/天的劑量給藥。在治療和/或預(yù)防癌癥時(shí)，可將DFMO或其類似物給藥一次以上。
癌癥可以是膀胱癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腦癌、肺癌、胃癌、血癌、皮膚癌、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食管癌以及它們的各種組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)腸癌，并且可以包括家族性腺瘤性息肉病病。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥是膀胱癌，并且可以包括表淺性膀胱癌。通過(guò)施用D-DFMO或其類似物在患者中預(yù)防和/或治療癌癥可以包括實(shí)體瘤的切除術(shù)。D-DFMO或其類似物可以切除術(shù)前或切除術(shù)后給藥。
通過(guò)施用D-DFMO或其類似物在患者中預(yù)防和/或治療癌癥可以通過(guò)選自下列的機(jī)制來(lái)完成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分化、抑制轉(zhuǎn)移的可能性、減少腫瘤負(fù)荷、增加對(duì)化療或放療的敏感性、殺死癌細(xì)胞、抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤消退及其各種組合。
D-DFMO或其類似物的給藥通過(guò)選自下列的途徑來(lái)進(jìn)行口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、真皮、鼻、直腸、陰道、局部、頰部和淋巴內(nèi)給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將DFMO直接向腫瘤給藥。還可將D-DFMO或其類似物向腫瘤的區(qū)域性脈管系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)給藥或者向所述腫瘤的區(qū)域淋巴系統(tǒng)內(nèi)給藥。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將D-DFMO口服給藥。
明顯富集是指D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少60％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少70％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少80％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少90％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少95％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少97.5％(重量)或所給藥的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少99％(重量)。優(yōu)選的實(shí)施方案中，D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸劑量的至少99.5％(重量)。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，該組合物含有明顯富集的二氟甲基尿氨酸的D對(duì)映體(D-DFMO)或其類似物和可藥用載體。D-DFMO藥物組合物可以配制成用于向患者給藥單位劑量。藥物制劑的形式選自快速釋放、定時(shí)釋放、延遲釋放、持續(xù)釋放、口服混懸液、片劑、膠囊、散劑、錠劑、栓劑、脂質(zhì)體、納米顆粒、吸入劑、鼻用溶液、眼用溶液、耳用溶液、沖洗液、靜脈內(nèi)混合物、表皮或經(jīng)皮溶液、口含片、糖漿、霜?jiǎng)④浉?、洗劑、凝膠、乳劑、酏劑、灌洗液、灌腸劑、含漱劑、植入劑和氣霧劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有占組合物中的總DFMO或類似物至少60％(重量)的D-DFMO或其類似物或占組合物中的總DFMO至少70％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少80％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少90％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少95％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少97.5％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少99％(重量)的D-DFMO或占組合物中的總DFMO至少99.5％(重量)的D-DFMO。
附圖概述以下附圖構(gòu)成了本說(shuō)明書(shū)的一部分，包含這些附圖是為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參照其中的一個(gè)或多個(gè)附圖并結(jié)合對(duì)于具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。


圖1通過(guò)管飼法用D，L-DFMO治療54天大鼠的體重增加。選擇四種情況來(lái)表示數(shù)據(jù)。 對(duì)照(n＝3)，■200mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，400mg/kg D，L-DFMO(n＝3)；▲600mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，◆800mg/kg D，L-DFMO和●1.2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖2A、圖2B、圖2C、圖2D和圖2E管飼D，L-DFMO54天所引起的大鼠CAP閾值升高。動(dòng)物與圖1中相同。圖2A. 對(duì)照(n＝3)，■200mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，圖2B. 對(duì)照(n＝3)，400mg/kgD，L-DFMO(n＝3)；圖2C. 對(duì)照(n＝3)，▲600mg/kg D，L-DFMO(n＝3)；圖2D. 對(duì)照(n＝3)，◆800mg/kg D，L-DFMO；圖2E. 對(duì)照(n＝3)，●1.2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖3A、圖3B、圖3C、圖3D和圖3E管飼D，L-DFMO54天所引起的大鼠1μV RMS CM等幅曲線的升高。動(dòng)物與圖1中相同。圖3A. 對(duì)照(n＝3)，■200mg/kg D，L-DFMO(n＝3)，圖3B. 對(duì)照(n＝3)，400mg/kg D，L-DFMO(n＝3)；圖3C. 對(duì)照(n＝3)，▲600mg/kgD，L-DFMO(n＝3)；圖3D. 對(duì)照(n＝3)，◆800mg/kg D，L-DFMO；圖3E. 對(duì)照(n＝3)，●1.2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖4通過(guò)每天腹膜內(nèi)注射用D，L-DFMO治療45天豚鼠的體重增加。由于毒性，2g/kg的D，L-DFMO提前結(jié)束。數(shù)據(jù)僅代表進(jìn)行了聽(tīng)力測(cè)定的動(dòng)物。 對(duì)照(n＝3)，■500mg/kg D，L-DFMO(n＝5)，●1g/kgD，L-DFMO(n＝3)，▲2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖5A、圖5B和圖5C通過(guò)每天腹膜內(nèi)注射用D，L-DFMO治療所引起的豚鼠CAP閾值升高。動(dòng)物與圖4中相同。圖5A. 對(duì)照(n＝3)，■500mg/kg D，L-DFMO(n＝5)；圖5B. 對(duì)照(n＝3)，●1g/kgD，L-DFMO(n＝3)；圖5C. 對(duì)照(n＝3)，▲2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖6A、圖6B和圖6C通過(guò)每天腹膜內(nèi)注射用D，L-DFMO治療所引起的豚鼠1μV RMS CM等幅曲線的升高。動(dòng)物與圖4中相同。圖6A. 對(duì)照(n＝3)，■500mg/kg D，L-DFMO(n＝5)；圖6B. 對(duì)照(n＝3)，●1g/kg D，L-DFMO(n＝3)；圖6C. 對(duì)照(n＝3)，▲2g/kg D，L-DFMO(n＝2)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖7A、圖7B、圖7C、圖7D、圖7E和圖7F在一個(gè)用D，L-DFMO治療(1g/kg/天，治療45天)的動(dòng)物中的毛細(xì)胞損失和聽(tīng)力損失。定位是距離基底膜頂端的百分比。所有光學(xué)顯微照片的放大率均相同。圖7A.26％；圖7B.63％；圖7C.74％；圖7D.90％；圖7E.1g/kg/天D，L-DFMO(■)和平均對(duì)照(n＝5， )的CAP閾值；圖7F.1g/kg/天D，L-DFMO(●)和平均對(duì)照(n＝5，○)的1μV RMS CM等幅曲線。
圖8通過(guò)每天腹膜內(nèi)注射用1g/kg D，L-DFMO、D-DFMO或L-DFMO治療45天豚鼠的體重增加。所有動(dòng)物均存活至聽(tīng)力測(cè)試。 對(duì)照(n＝5)，■1g/kg D，L-DFMO(n＝5)，●1g/kg D-DFMO(n＝5)，▲1g/kg L-DFMO(n＝5)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖9通過(guò)每天腹膜內(nèi)注射用1g/kg D，L-DFMO、D-DFMO或L-DFMO治療所引起的豚鼠CAP閾值升高。動(dòng)物與圖8中相同。(A) 對(duì)照(n＝5)，■1g/kg D，L-DFMO(n＝5)；(B) 對(duì)照(n＝5)，●1g/kgD-DFMO(n＝5)；(C) 對(duì)照(n＝5)，▲1g/kg L-DFMO(n＝5)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖1OA、圖10B和圖10C通過(guò)每天腹膜內(nèi)注射用1g/kg D，L-DFMO、D-DFMO或L-DFMO治療所引起的豚鼠1μV RMS CM等幅曲線的升高。動(dòng)物與圖8中相同。圖10A. 對(duì)照(n＝5)，■1g/kg D，L-DFMO(n＝5)；圖10B. 對(duì)照(n＝5)，●1g/kg D-DFMO(n＝5)；圖10C. 對(duì)照(n＝5)，▲1g/kg L-DFMO(n＝5)。垂直的條是標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。
圖11在裸鼠中的MCF-7人乳腺腫瘤的平均腫瘤重量。將D-、L-或D，L-DFMO在動(dòng)物的飲用水中以如下濃度隨意(ad libidum)給藥0.0％對(duì)照(●)0.5％D-DFMO(○)0.5％L-DFMO()0.5％D，L-DFMO()；3.0％D，L-DFMO(■)。
圖12比較D-和L-DFMO異構(gòu)體的相對(duì)抑制活性的劑量響應(yīng)研究。將給定劑量的DFMO通過(guò)管飼法向一組雌性小鼠口服給藥一次。在用DFMO處理1小時(shí)后，涂抹TPA(5nmol)在0.2ml丙酮中的溶液剃除小鼠背部的毛。每個(gè)治療組有3只小鼠。涂抹TPA5小時(shí)后，測(cè)定可溶性表皮ODC活性。每一數(shù)值均為重復(fù)測(cè)定從3只小鼠制備的表皮提取物的ODC活性的平均值±S.E。
圖13接受口服給藥400mg/kg外消旋D，L-DFMO(○)、200mg/kgD-DFMO(■)或200mg/kg L-DFMO(▲)的大鼠平均血漿濃度。
示例性實(shí)施方案的描述人們需要有效并且毒性小的預(yù)防和/或治療癌癥的方法。目前的治療方法、特別是用于治療結(jié)腸癌和息肉的方法包括腫瘤切除術(shù)、化療和放療。本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)有效并且安全的藥物，該藥物可改善某些癌癥的預(yù)后。本發(fā)明提供了使用二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的D對(duì)映體(D-DFMO)預(yù)防和/或治療癌癥的治療組合物和方法。I.二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)D，L-DFMO，也稱為依洛尼塞，其化學(xué)名為2-(二氟甲基)-DL-鳥(niǎo)氨酸。它是鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的抑制劑，該酶是多元胺生物合成途徑的限速酶。由于可以抑制多元胺的合成，該化合物可以在多種器官系統(tǒng)中有效地預(yù)防癌癥的形成、抑制癌癥生長(zhǎng)并且減小腫瘤的大小。它還與其它抗腫瘤劑具有協(xié)同作用。該藥物在O.4gr/M2/天的低劑量下對(duì)人是相對(duì)無(wú)毒的并且可以對(duì)腫瘤的腐胺合成產(chǎn)生抑制作用。在大鼠腫瘤模型中的研究證實(shí)，輸注D，L-DFMO可以使腫瘤的腐胺水平降低90％而不會(huì)抑制外周的血小板計(jì)數(shù)。
還可用D-DFMO的類似物代替D-DFMO來(lái)預(yù)防和/或治療癌癥。所述類似物可以是如下形式的D異構(gòu)體 其中R是C1-4烷基或C2-4鏈烯基，這些基團(tuán)均可以是未取代的或被最多3個(gè)選自下列的取代基所取代NHR″’、氯、氟、OR″’或SR″’，其中R″’是氫或C1-4烷基；R’是被最多3個(gè)選自氯和/或氟的鹵原子取代的C1-3烷基；R″是氫或C1-4烷基。類似物包括但不僅限于α-甲基鳥(niǎo)氨酸、α-乙基鳥(niǎo)氨酸、α-氯甲基鳥(niǎo)氨酸、α-氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-二氯甲基鳥(niǎo)氨酸、α-氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-三氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-三氯甲基鳥(niǎo)氨酸、α-二氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-氯二氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-乙炔基鳥(niǎo)氨酸、α-氰基甲基鳥(niǎo)氨酸、α-乙烯鳥(niǎo)氨酸、α-乙烯基鳥(niǎo)氨酸、α-丙二烯基鳥(niǎo)氨酸、α-羥基甲基鳥(niǎo)氨酸、α-甲氧基甲基鳥(niǎo)氨酸、α-乙炔基-δ-甲基鳥(niǎo)氨酸、α-乙炔基-δ，δ-二甲基鳥(niǎo)氨酸、δ-甲基-乙炔鳥(niǎo)氨酸、α-甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-乙基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-氯甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-二氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α--二氯甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-氯氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-三氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-三氯甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-二氯氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-氯二氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-乙炔基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-氰基甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-乙烯脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-乙烯基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-丙二烯基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-羥基甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-甲氧基甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸、α-二氟甲基腐胺、α-氟甲基腐胺、α-氟甲基脫氫腐胺、δ-甲基-乙炔腐胺、α-乙炔基-δ-甲基腐胺、3-氨基-3-(甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(羥基-甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(氟甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(氯甲基)-2-哌啶酮、3-氨基-3-(二氟甲基)-2-哌啶酮、α-甲基賴氨酸、α-乙基賴氨酸、α--氯甲基賴氨酸、α-氟甲基賴氨酸、α-二氟甲基賴氨酸、α-二氯甲基賴氨酸、α-氯氟甲基賴氨酸、α-三氟甲基賴氨酸、α-三氯甲基賴氨酸、α-二氯氟甲基賴氨酸、α-氯二氟甲基賴氨酸、α-乙炔基賴氨酸、α-氰基甲基賴氨酸、α-乙烯賴氨酸、α-乙烯基賴氨酸、α-丙二烯基賴氨酸、α-羥基甲基賴氨酸、α-甲氧基甲基賴氨酸、α-乙炔基-δ-甲基賴氨酸、α-乙炔基-δ，δ-二甲基賴氨酸、δ-甲基乙炔賴氨酸、α-甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-乙基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-氯甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-氟甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-二氯甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-三氟甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-三氯甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-二氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-氯二氟甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-乙炔基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-氰基甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-乙烯鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-乙烯基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-丙二烯基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-羥基甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-甲氧基甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-乙炔基-δ-甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-乙炔基-δ，δ-二甲基鳥(niǎo)氨酸甲酯、δ-甲基-乙炔鳥(niǎo)氨酸甲酯、α-甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-乙基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-氯甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-氟甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、a-二氯甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-三氟甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-三氯甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-二氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-氯二氟甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-乙炔基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-氰基甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-乙烯鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-乙烯基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-丙二烯基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-羥基甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-甲氧基甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-乙炔基-δ-甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯、α-乙炔基-δ，δ-二甲基鳥(niǎo)氨酸乙酯和δ-甲基-乙炔鳥(niǎo)氨酸乙酯。在一個(gè)或多個(gè)位置上用氘代替了氫的以上所列化合物也認(rèn)為是DFMO的類似物。
所觀察到的D，L-DFMO的副作用包括在4gr/M2/天的高劑量下對(duì)聽(tīng)力的影響，該副作用可在停藥時(shí)消除。當(dāng)以0.4gr/M2/天的低劑量給藥長(zhǎng)達(dá)一年時(shí)，未觀察到對(duì)聽(tīng)力的影響(Meyskens等，1994)。此外，觀察到了少量的頭暈/眩暈，可在停藥時(shí)消除。血小板減少癥主要見(jiàn)于使用高“治療”劑量D，L-DFMO(＞1.0g/m2/天)的研究中和以前經(jīng)歷過(guò)化療的癌癥患者或有骨髓抑制的患者中。雖然與D，L-DFMO治療有關(guān)的毒性通常并不象其它類型的化療那樣嚴(yán)重，但在有限的臨床試驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)它可以促進(jìn)與劑量有關(guān)的血小板減少癥。此外，在大鼠中的研究證實(shí)，與對(duì)照相比，連續(xù)輸注D，L-DFMO12天可以明顯減少血小板計(jì)數(shù)。其它研究產(chǎn)生了類似的觀察結(jié)果，即，血小板減少癥是連續(xù)靜脈內(nèi)D，L-DFMO療法的主要毒副作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，D，L-DFMO可以顯著抑制巨核細(xì)胞的骨髓前體的ODC活性。DFMO可以抑制增生性的修復(fù)過(guò)程，例如上皮的傷口愈合。
雖然D，L-DFMO可以有效地阻斷腫瘤腐胺的生物合成，但所產(chǎn)生的抗腫瘤作用是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制而不是細(xì)胞毒性。例如，D，L-DFMO可以減慢MCA肉瘤的生長(zhǎng)速率但不會(huì)產(chǎn)生腫瘤的消退。該發(fā)現(xiàn)與其它研究者的報(bào)道是一致的，他們證實(shí)D，L-DFMO是一種細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。但是，研究表明了DFMO具有重要作用，因此可以在將來(lái)開(kāi)發(fā)包含DFMO的聯(lián)合化療方案。
D，L-DFMO及其在治療良性前列腺增生中的應(yīng)用記載于兩項(xiàng)美國(guó)專利--4,413,141和4,330,559中。美國(guó)專利4,413,141記載了可以在體外和體內(nèi)用作有效的ODC抑制劑的D，L-DFMO。施用D，L-DFMO可以在通常很活躍地產(chǎn)生多元胺的細(xì)胞內(nèi)引起腐胺和精脒濃度的降低。此外，當(dāng)以常規(guī)的腫瘤模型進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，證實(shí)D，L-DFMO可以減慢腫瘤細(xì)胞的增殖。美國(guó)專利4,330,559記載了D，L-DFMO和DFMO衍生物用于治療良性前列腺增生的用途。象許多以迅速的細(xì)胞增殖為特征的疾病狀態(tài)一樣，良性前列腺增生也伴隨著多胺濃度的異常升高。在該參考文獻(xiàn)中所描述的治療方法可以是向患者口服或胃腸外給藥。
由于D，L-DFMO是有效的ODC抑制劑，一些研究者正在嘗試使用D，L-DFMO作為與其它治療劑的聯(lián)合療法的一部分。例如，美國(guó)專利4,499,072描述了通過(guò)將干擾素與ODC抑制劑聯(lián)用來(lái)改善ODC抑制劑(包括D，L-DFMO)的減少多元胺的作用。此外，它還描述了將ODC抑制劑和干擾素與已知的細(xì)胞毒藥物例如甲氨碟呤聯(lián)用。美國(guó)專利5,002,879描述了類似的聯(lián)合療法，其中，將ODC抑制劑、優(yōu)選D，L-DFMO與淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞和白介素-2聯(lián)合使用。
美國(guó)專利4,859,452描述了另一種使D，L-DFMO更易于被人類患者所接受的方案。該專利描述了D，L-DFMO的制劑，其中含有必需氨基酸以及精氨酸或鳥(niǎo)氨酸以幫助降低D，L-DFMO所引起的毒性。II.DFMO的D對(duì)映體本發(fā)明描述了另一種降低與DFMO有關(guān)的毒性的方法。正如文中所描述的，DFMO的D對(duì)映體及其類似物雖然仍是ODC的抑制劑，但在動(dòng)物模型中的毒性、包括耳毒性較低。使用D對(duì)映體來(lái)治療癌癥以及D-DFMO的藥物組合物將可以克服許多與使用D，L-DFMO有關(guān)的問(wèn)題。
Wagner等(1987)描述了通過(guò)高效液相色譜用手性洗脫劑以及通過(guò)氣相色譜在Chirasil-Val上拆分各種α-取代的鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸類似物的方法。描述了通過(guò)使用L-脯氨酸和銅作為手性流動(dòng)相的反相高效液相色譜法來(lái)對(duì)映體拆分各種α-取代的鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸類似物。雖然鳥(niǎo)氨酸不能通過(guò)所用的手性洗脫劑來(lái)分離，但對(duì)于各種α-烷基-、α-鹵代甲基-、α-乙烯基-和α-乙炔基-取代的鳥(niǎo)氨酸、包括DFMO，卻獲得了極佳的拆分效果。對(duì)于脫氫鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸類似物也觀察到了類似的分離效果。在手性固定相Chirasil-Val上的氣相色譜可以在將鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸類似物衍生成其相應(yīng)的內(nèi)酰胺的單氟酰基衍生物后對(duì)其進(jìn)行拆分。對(duì)于脫氫鳥(niǎo)氨酸類似物的二-N-全氟?；榛ィ贑hirasil-Val上的GC不能拆分或拆分效果很差。手性洗脫劑HPLC方法很容易升級(jí)用于半制備拆分各種鳥(niǎo)氨酸類似物，即α-氟甲基鳥(niǎo)氨酸、α-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)、α-氯氟甲基鳥(niǎo)氨酸和α-氟甲基脫氫鳥(niǎo)氨酸，已知這些物質(zhì)在體外和體內(nèi)是有效的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抑制劑。
美國(guó)專利5,217,886描述了通過(guò)將2-取代的-哌啶酮與酶L-α-E-氨基己內(nèi)酰胺-水解酶在二價(jià)陽(yáng)離子的存在下反應(yīng)然后純化所生成的L-DFMO來(lái)生產(chǎn)(-)-4-二氟甲基-鳥(niǎo)氨酸(L-DFMO)的方法。該酶從真菌Cryptococcus laurentii Toray2001得到。
美國(guó)專利4,496,588教導(dǎo)了-種合成2-取代的鳥(niǎo)氨酸的光學(xué)異構(gòu)體的方法。該方法包括將外消旋的2-哌啶酮用(-)聯(lián)萘磷酸拆分。然后將哌啶酮的各光學(xué)異構(gòu)體分別水解產(chǎn)生2-取代的-鳥(niǎo)氨酸的所需光學(xué)異構(gòu)體。III.人類癌癥本發(fā)明還涉及向個(gè)體施用治療化合物來(lái)減少或抑制癌癥細(xì)胞。靶癌細(xì)胞包括膀胱、肺、腦、前列腺、腎臟、肝臟、卵巢、乳腺、皮膚、胃、食道、頭和頸部、睪丸、結(jié)腸、子宮頸、淋巴系統(tǒng)和血液的癌癥。特別令人感興趣的是許多器官的上皮癌，包括結(jié)腸和息肉的上皮癌，它們傾向于表達(dá)活化的Ki-ras。同樣特別令人感興趣的是膀胱癌，包括表淺性膀胱癌。
本發(fā)明還涉及向表現(xiàn)出癌癥前期癥狀的個(gè)體施用治療化合物來(lái)預(yù)防癌癥的發(fā)作。該類型的細(xì)胞包括息肉和其它癌癥前期的損傷、惡化前的、腫瘤發(fā)生前的或其它顯示可能發(fā)展為癌癥狀態(tài)的畸變表型1.Kirsten-Ras依賴型的癌癥Ras是指在染色體11上發(fā)現(xiàn)的原癌基因產(chǎn)物。它存在于正常的細(xì)胞中，在這些細(xì)胞中，它通過(guò)起到開(kāi)關(guān)的作用來(lái)傳播信號(hào)(Lowv和Willumsen，1993)。當(dāng)細(xì)胞表面的受體受到刺激時(shí)(例如受到激素的刺激時(shí))，Ras打開(kāi)并轉(zhuǎn)導(dǎo)讓細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)。如果細(xì)胞表面受體沒(méi)有受到刺激，Ras不會(huì)被激活，于是導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的途徑將不會(huì)被引發(fā)。在約30％的人類癌癥中，Ras發(fā)生了變異，于是它永久性的打開(kāi)并指示細(xì)胞生長(zhǎng)，而不管細(xì)胞表面上的受體是否被激活。細(xì)胞ras基因(c-ras)的點(diǎn)突變也可以引起可以轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的p21蛋白。
Ras是一族與逆轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)的DNA序列，它最初從Harvey(H-ras、Ha-ras、rasH)和Kirsten(K-ras、Ki-ras、rasK)鼠肉瘤病毒分離得到。Ras基因廣泛保留于動(dòng)物內(nèi)，對(duì)應(yīng)于H-ras和K-ras基因的序列也已經(jīng)在人、鳥(niǎo)類、鼠科動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的基因組內(nèi)被檢測(cè)到。密切相關(guān)的N-ras基因已經(jīng)在人成神經(jīng)細(xì)胞瘤和肉瘤細(xì)胞系中被檢測(cè)到。該家族的所有基因均具有類似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)并且均編碼p21蛋白。
2.家族性腺瘤性息肉病，癥狀，基因家族性腺瘤性息肉病(FAP)，一種遺傳性的息肉綜合征，是由多發(fā)性結(jié)腸腺癌(APC)腫瘤抑制基因的種系突變引起的(Su等，1992)。該伴有可變表達(dá)的常染色體顯性狀態(tài)與成百上千的結(jié)腸腺癌的出現(xiàn)有關(guān)，它們均在40歲時(shí)發(fā)展為腺癌，比偶發(fā)性結(jié)腸癌的平均診斷年齡早20年(Bussey，1990)。在對(duì)患有FAP的癥狀前個(gè)體的早期研究中，當(dāng)與正常家族成員對(duì)照相比較時(shí)，在表面正常的結(jié)腸直腸活組織檢查中發(fā)現(xiàn)了多元胺精脒和精胺以及它們的二胺前體腐胺水平的升高(Giardiello等，1997)。在FAP患者的表面正常的結(jié)腸粘膜活組織檢查中，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)，哺乳動(dòng)物多元胺合成的第一個(gè)和限速酶的活性也升高了(Giardiello等，1997；Luk和Baylin，1984)。這些發(fā)現(xiàn)非常有價(jià)值，因?yàn)槎嘣肥亲罴训募?xì)胞增殖所必需的(Pegg，1986)。此外，用酶激活的不可逆抑制劑DFMO抑制ODC的活性可以在用致癌物處理的嚙齒動(dòng)物中抑制結(jié)腸癌的發(fā)生(Kingsnorth等，1983；Tempero等，1989)。
與FAP具有共同的突變APC/apc基因型的Min(多發(fā)性腸癌)小鼠可以作為有用的人類FAP患者的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型(Lipkin，1997)。Min小鼠可以在120天的生命里在整個(gè)胃腸道發(fā)展出大于100的胃腸腺瘤/腺癌，導(dǎo)致胃腸出血、梗阻和死亡。
3.表淺性膀胱癌膀胱腫瘤可以根據(jù)其在顯微鏡下的形狀分為多種類型。影響膀胱的三種主要癌癥類型是過(guò)渡型細(xì)胞癌(TCC)、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。同樣類型的癌癥也可以在腎臟內(nèi)層(稱為腎盂)、輸尿管和尿道出現(xiàn)。事實(shí)上，膀胱癌的患者在腎臟內(nèi)層、輸尿管和尿道有同樣類型的癌癥并不罕見(jiàn)，這也就是在評(píng)估這些患者時(shí)建議對(duì)整個(gè)泌尿系進(jìn)行評(píng)估的原因。
過(guò)渡型細(xì)胞癌(TCC)是目前最常見(jiàn)的膀胱癌形式。其占這些癌癥的約90％。TCC是形成膀胱內(nèi)層的過(guò)渡型細(xì)胞的癌變形式。鱗狀細(xì)胞癌占膀胱癌的約8％。在顯微鏡下，該細(xì)胞看起來(lái)更象是皮膚癌的細(xì)胞。幾乎所有的鱗狀細(xì)胞癌都是侵入性的。腺癌占膀胱癌的約1％至2％。該細(xì)胞與腸癌的腺形成細(xì)胞有許多共同之處。幾乎所有的膀胱腺癌都是侵入性的。
過(guò)渡型細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌對(duì)手術(shù)、放療和化療均有不同的反應(yīng)，因此，治療方法可能會(huì)不同。并不是所有的TCC都是相同的；根據(jù)它們是表淺性的還是侵入性的，或根據(jù)它們的形狀是乳頭狀的還是平的，可將它們分成多種亞型。
表淺型TCC沒(méi)有擴(kuò)散到膀胱的主要肌肉層(固有肌層)。癌癥可能完全局限于最靠近膀胱內(nèi)層的過(guò)渡型細(xì)胞層，或者也可能擴(kuò)散到在過(guò)渡型細(xì)胞下方的薄的結(jié)締組織層(固有肌層)。
侵入型TCC擴(kuò)散的更深并且涉及膀胱的肌肉層，而且還有可能侵入該肌肉層外的脂肪層。
乳頭狀TCC可以生長(zhǎng)進(jìn)入膀胱的凹穴中心。它們可能有窄的莖并且看起來(lái)象一個(gè)微型的蘑菇。某些乳頭狀TCC僅向著膀胱的中心生長(zhǎng)。這些稱為表淺型非侵入性乳頭狀TCC。其它的向著中心生長(zhǎng)并且還向外生長(zhǎng)進(jìn)入膀胱壁的肌肉層。這些稱為侵入型乳頭狀TCC。
扁平TCC完全不向膀胱的凹穴部分生長(zhǎng)。其中的一些僅涉及最靠近膀胱內(nèi)層或凹穴部分的細(xì)胞層。這些稱為非侵入型扁平TCC。非侵入型扁平TCC的醫(yī)學(xué)名稱為扁平原位癌(CIS)。某些扁平TCC會(huì)侵入到較深的層(離開(kāi)凹穴部分)、特別是肌肉層。這些稱為扁平侵入型TCC。IV.治療癌癥的方法在一個(gè)具體的方面，本發(fā)明提供了治療各種惡性腫瘤的方法。治療方法涉及用有效量的含有D-DFMO或其類似物的治療組合物對(duì)個(gè)體進(jìn)行治療。有效量通常是指足以可檢測(cè)到地并且重復(fù)地改善、減輕、最小化或限制疾病或其癥狀的程度的量?？梢圆捎酶鼑?yán)格的定義，包括消除、根除或治愈疾病。
用含有富集的D-DFMO或其類似物的治療組合物治療的優(yōu)選的癌癥的一個(gè)例子是膀胱癌，特別是早期或表淺型膀胱癌。早期膀胱癌幾乎都可以進(jìn)行治療而不用切除膀胱。治療選項(xiàng)包括單獨(dú)的經(jīng)尿道切除術(shù)(TUR)或是在TUR之后進(jìn)行電灼療法(灼燒)、膀胱內(nèi)免疫療法或膀胱內(nèi)化療。
對(duì)0期膀胱癌很少做部分膀胱切除術(shù)。對(duì)于該階段的治療，進(jìn)行根治性膀胱切除術(shù)更為少見(jiàn)。只有當(dāng)存在許多表淺型癌癥或者當(dāng)表淺型癌癥持續(xù)生長(zhǎng)或者雖然采用了其它療法但后來(lái)又在膀胱的許多區(qū)域鑒定出表淺型癌癥時(shí)，才考慮該手術(shù)。
0a期膀胱癌的預(yù)后是極佳的。這些非侵入型乳頭狀癌癥幾乎都可以通過(guò)適當(dāng)?shù)闹委熀烷L(zhǎng)期的隨訪護(hù)理得到治愈。
雖然這些患者很容易在其泌尿系的其它部位發(fā)展出一種或多種表淺型癌癥，但這些癌癥很少是深入侵入型和威脅生命的。0a期癌癥的5年存活率在95％以上。
對(duì)0期膀胱癌(也稱為原位癌或扁平非侵入型癌癥)的預(yù)后不很理想，因?yàn)樗鼈兒苋菀鬃罱K發(fā)展成為有肌肉侵入的癌癥。5年存活率約為85％。
膀胱內(nèi)化療是指將藥物直接置于膀胱內(nèi)而不是通過(guò)口服或注射到靜脈內(nèi)。當(dāng)直接給藥到膀胱內(nèi)時(shí)，這些藥物可以到達(dá)靠近膀胱內(nèi)層的癌細(xì)胞而不會(huì)到達(dá)腎臟、輸尿管和尿道內(nèi)的癌細(xì)胞、可能已經(jīng)深入地侵入到膀胱壁內(nèi)的癌細(xì)胞或已經(jīng)擴(kuò)散到其它器官的癌細(xì)胞。基于這一原因，該療法僅用于表淺型(0期)或最低侵入型(I期)的膀胱癌。該療法使用可以殺死活躍生長(zhǎng)的癌細(xì)胞的藥物。許多相同的藥物用于全身性給藥(通過(guò)口服或注射到靜脈內(nèi))來(lái)治療更晚期的膀胱癌。噻替哌、絲裂霉素和阿霉素鹽酸鹽最常用于膀胱內(nèi)化療的藥物。膀胱內(nèi)化療的一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是藥物不會(huì)擴(kuò)散到整個(gè)體內(nèi)。這限制了在全身性化療中可能出現(xiàn)的對(duì)其它器官的不利副作用。
D-DFMO或其類似物可以大約0.05至約20.0gm/M2/天的劑量給藥，因?yàn)轭A(yù)期D對(duì)映體的毒性較低。優(yōu)選的D-DFMO或其類似物的給藥劑量為約0.1至約15.0gm/M2/天或約0.1至12gm/M2/天或約0.1至10gm/M2/天或約0.1至8gm/M2/天或約0.1至6gm/M2/天或約0.1至4gm/M2/天或約0.1至2gm/M2/天或約0.1至1gm/M2/天或約0.1至0.5gm/M2/天。
為了殺死細(xì)胞、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制轉(zhuǎn)移、減小腫瘤體積或逆轉(zhuǎn)或減少腫瘤細(xì)胞的惡性表型，使用本發(fā)明的方法和組合物，通?？梢詫ⅰ鞍小奔?xì)胞和治療組合物接觸?？蓪⑵渑c含有其它可有效治療癌癥的藥物的組合物聯(lián)合。這些組合物應(yīng)以可有效殺死或抑制細(xì)胞增殖的聯(lián)合量提供。該方法可以包括將細(xì)胞同時(shí)與D-DFMO或其類似物以及藥物或因子接觸。這可以通過(guò)將細(xì)胞與單一組合物或同時(shí)含有兩種藥物的藥物制劑接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，或通過(guò)將細(xì)胞同時(shí)與兩種不同的組合物或制劑接觸來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中的一種組合物含有D-DFMO或其類似物，而另一種含有第二種藥物。
或者，D-DFMO療法可在用其它藥物治療之前或之后間隔數(shù)分鐘或數(shù)周進(jìn)行。在將其它藥物和D-DFMO或D-DFMO的類似物分別向細(xì)胞施用的實(shí)施方案中，通常應(yīng)確保各給藥時(shí)間的間隔不會(huì)超過(guò)有效時(shí)間，從而使藥物和D-DFMO仍能夠?qū)?xì)胞產(chǎn)生有利的聯(lián)合作用。在該情況下，應(yīng)將細(xì)胞與兩種代謝物在相互間隔約12-24小時(shí)內(nèi)接觸，更優(yōu)選在相互間隔約6-12小時(shí)內(nèi)接觸，首選延遲的時(shí)間僅為約12小時(shí)。在某些情況下，可能需要延長(zhǎng)治療的時(shí)間間隔，在各治療之間相隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7天)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
向患者施用本發(fā)明的治療性D-DFMO或其類似物的組合物可以按照化療的一般給藥方案來(lái)進(jìn)行，并考慮D-DFMO或D-DFMO的毒性(如果有的話)。如需要，可以將治療周期重復(fù)進(jìn)行。也可以將各種常規(guī)的療法以及手術(shù)介入和所述的療法聯(lián)合應(yīng)用。
當(dāng)在臨床上采用D-DFMO療法時(shí)，需要制備適于預(yù)定應(yīng)用的藥物組合物。通常需要制備基本上不含熱原以及其它任何可能對(duì)人或動(dòng)物有害的雜質(zhì)的藥物組合物。通常還需要采用適宜的鹽和緩沖劑來(lái)使組合物穩(wěn)定并使組合物能夠被靶細(xì)胞攝取。
本發(fā)明的含水組合物含有有效量的溶解或分散在可藥用載體或含水介質(zhì)中的化合物。該組合物還可以稱為接種物。短語(yǔ)“可藥用的”是指在向動(dòng)物或人給藥時(shí)不會(huì)產(chǎn)生相反的、過(guò)敏性的或其它不希望的反應(yīng)的分子或組合物。本文所用的“可藥用載體”包括各種溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑對(duì)于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除了與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，其在治療組合物中的應(yīng)用均是可行的。還可以在組合物中摻入另外的活性成分。
本發(fā)明的組合物可以包括傳統(tǒng)的藥物制劑。分散液還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及油中制備。在常規(guī)的存放和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
根據(jù)所要治療的具體癌癥，本發(fā)明的治療性組合物的給藥可以通過(guò)任何常規(guī)的途徑進(jìn)行，只要能夠通過(guò)該途徑到達(dá)靶組織即可。這些途徑包括口服、鼻、頰部、直腸、陰道或局部的途徑。局部給藥對(duì)于皮膚癌的治療特別有利?；蛘?，可以通過(guò)原位的、真皮內(nèi)的、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行給藥。這些組合物通常以含有生理可接受的載體、緩沖劑或其它賦形劑的可藥用組合物的形式給藥。
在某些實(shí)施方案中，還可以采用先體外后體內(nèi)的療法。先體外后體內(nèi)的療法涉及從患者中取出靶細(xì)胞。將細(xì)胞在患者體外進(jìn)行處理然后送回到患者體內(nèi)。先體外后體內(nèi)療法的另一個(gè)例子涉及自身骨髓移植(ABMT)的一種改變形式。在許多時(shí)候，ABMT不能成功，因?yàn)樵诔槌龅墓撬柚写嬖谝恍┌┘?xì)胞，向治療的患者回輸骨髓會(huì)導(dǎo)致向患者重新注入癌細(xì)胞。但是，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將抽出的骨髓在患者體外用靶向并可殺死癌細(xì)胞的病毒顆粒進(jìn)行處理。一旦骨髓細(xì)胞被“凈化”，就可將其重新引入患者體內(nèi)。
治療可以包括各種“單位劑量”。單位劑量被定義為含有根據(jù)其給藥方法、即適宜的途徑和治療方案計(jì)算出的可以產(chǎn)生所需響應(yīng)的預(yù)定量的治療組合物。給藥量以及具體的給藥途徑和制劑是臨床技術(shù)人員所熟知的。所要治療的個(gè)體、特別是個(gè)體的狀態(tài)和所需的保護(hù)作用也是很重要的。單位劑量并不一定需要以單一注射液的形式給藥，還可以包括在一段時(shí)間內(nèi)的連續(xù)輸注。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及將D-DFMO或其類似物的治療組合物用于特定的靶癌細(xì)胞。靶癌細(xì)胞包括肺、腦、前列腺、腎臟、肝臟、卵巢、乳腺、皮膚、胃、食道、頭和頸部、睪丸、結(jié)腸、子宮頸、淋巴系統(tǒng)和血液的癌癥。特別令人感興趣的是非小細(xì)胞肺癌，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞未分化的癌。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)直接向腫瘤注射D-DFMO或類似的組合物來(lái)治療癌癥。或者，可以用任何適宜的傳送載體向腫瘤輸注組合物。還可以采用對(duì)腫瘤的局部或區(qū)域性給藥。最后，還可以進(jìn)行全身性給藥。如果適當(dāng)?shù)脑挘€可以采用連續(xù)給藥，例如，當(dāng)腫瘤被切除并且對(duì)腫瘤床進(jìn)行治療以消除殘余的、在顯微鏡下可以看到的病變時(shí)。優(yōu)選通過(guò)注射器或?qū)Ч芙o藥。所述連續(xù)輸注可以在治療開(kāi)始后進(jìn)行約1-2小時(shí)至約2-6小時(shí)、至約6-12小時(shí)、至約12-24小時(shí)、至約1-2天、至約1-2周或更常的時(shí)間。通常，通過(guò)連續(xù)輸注的治療組合物的劑量應(yīng)等于通過(guò)單次或多次注射的給藥劑量，根據(jù)輸注的持續(xù)時(shí)間而調(diào)整。
對(duì)于＞4cm的腫瘤，給藥的體積應(yīng)為約4-10ml(優(yōu)選10ml)，而對(duì)于＜4cm的腫瘤，應(yīng)使用約1-3ml的體積(優(yōu)選3ml)。作為單一劑量給藥的多次注射含有約0.1至約0.5ml體積。病毒顆粒優(yōu)選通過(guò)向腫瘤的多次注射給藥進(jìn)行接觸，給藥間隔約為1cm。
在某些實(shí)施方案中，所治療的腫瘤是不能切除的，至少在開(kāi)始時(shí)是這樣。用治療性D-DFMO或類似的組合物治療可以因?yàn)樵谶吘壧幍氖湛s或通過(guò)消除某些侵入性的部分而增加腫瘤的可切除性。在治療后，切除可能是可行的。在切除術(shù)后的進(jìn)一步治療可以消除腫瘤部位在顯微鏡下可見(jiàn)的殘余病變。
癌癥療法還包括與化學(xué)和放射療法的各種組合療法。聯(lián)合化療包括，例如順鉑(CDDP)、碳鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹(shù)堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、bisulfan、亞硝脲、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博萊霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、紫杉酚、反鉑、5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿和甲氨蝶呤或其各種類似物或衍生物。
其它可以引起DNA損傷并且被廣泛使用的因素包括γ射線、X射線和/或直接向腫瘤細(xì)胞輸送放射性同位素。還可以采用DNA損傷因子的其它形式，例如微波和UV輻射。很可能所有這些因子可以對(duì)DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)以及染色體的裝配和維持產(chǎn)生寬范圍的損傷。X射線的劑量范圍從長(zhǎng)時(shí)間治療(3至4周)的50至200倫琴的每日劑量至2000至6000倫琴的單劑量。放射性同位素的劑量范圍可以有很寬的變化，并取決于同位素的半衰期、所發(fā)出輻射的強(qiáng)度和種類以及腫瘤細(xì)胞的攝取。
可以采用各種聯(lián)合形式，例如，當(dāng)D-DFMO或類似的組合物是“A”而放療或化療劑是“B”時(shí)A/B/AB/A/BB/B/AA/A/BA/B/BB/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A當(dāng)用于細(xì)胞時(shí)，本文中所用的術(shù)語(yǔ)“接觸”是指將治療性組合物和化療或放療劑輸送給靶細(xì)胞或直接和靶細(xì)胞放置在一起的過(guò)程。為了達(dá)到細(xì)胞殺傷或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，將兩種藥物以可以有效殺死細(xì)胞或預(yù)防其分化的聯(lián)合量向細(xì)胞給藥。V.藥物組合物本發(fā)明的含水組合物含有有效量的溶解或分散在可藥用載體或含水介質(zhì)中的D-DFMO或其類似物。短語(yǔ)“可藥用的”是指在向動(dòng)物或人給藥時(shí)不會(huì)產(chǎn)生相反的、過(guò)敏性的或其它不希望的反應(yīng)的分子或組合物。
本文所用的“可藥用載體”包括各種溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這些介質(zhì)和試劑對(duì)于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除了與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑外，其在治療組合物中的應(yīng)用均是可行的。還可以在組合物中摻入另外的活性成分。對(duì)于人類的給藥，制劑應(yīng)滿足FDA生物制劑標(biāo)準(zhǔn)部所要求的無(wú)菌、致熱性、一般安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。
生物材料應(yīng)進(jìn)行充分地透析以除去不希望的小分子量分子和/或進(jìn)行冷凍干燥以便更易于配制到所需的載體內(nèi)。然后可將活性化合物配制成用于胃腸外給藥的形式，例如，配制成用于通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、損傷內(nèi)或腹膜內(nèi)的途徑注射的形式。參照本文所公開(kāi)的內(nèi)容，制備含有headpin agent作為活性組分或成分的含水組合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，所述組合物可以制成液體溶液或混懸液形式的可注射制劑；還可以制成適用于在注射前通過(guò)加入液體來(lái)制備溶液或混懸液的固體形式；該制劑還可以被乳化。
適于注射的藥物形式包括無(wú)菌含水溶液或分散液；含有芝麻油、花生油或含水丙二醇的制劑；以及用于現(xiàn)場(chǎng)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。在所有情況下，這些形式必需是無(wú)菌的并且必需是易于注射的液體。其在生產(chǎn)和存放的條件下必需是穩(wěn)定的并且需要防止微生物、例如細(xì)菌和真菌的污染作用。
游離堿或可藥用鹽形式的活性化合物的溶液可以在適當(dāng)含有表面活性劑例如羥丙基纖維素的水中制備。分散液還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及油中制備。在常規(guī)的存放和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以預(yù)防微生物的生長(zhǎng)。
本發(fā)明的D-DFMO或類似物可以以中性的或鹽的形式配制成組合物。可藥用鹽包括與無(wú)機(jī)酸例如鹽酸或磷酸或有機(jī)酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)。還可以從無(wú)機(jī)堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵以及有機(jī)堿例如異丙基胺、三甲基胺、組氨酸、普魯卡因等制得與游離羧基形成的鹽。
載體還可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、其適宜的混合物和植物油的溶劑或分散介質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)例如使用包衣例如卵磷脂、在分散液的情況下通過(guò)保持所需的粒度以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適宜的流動(dòng)性。預(yù)防微生物的作用可以通過(guò)各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等來(lái)進(jìn)行。在許多情況下，優(yōu)選含有等滲劑例如糖或氯化鈉。延長(zhǎng)可注射組合物的吸收可以通過(guò)在組合物中使用延緩吸收的物質(zhì)例如一硬脂酸鋁和明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)。
無(wú)菌可注射溶液可以通過(guò)將所需量的活性化合物和根據(jù)需要的以上所列舉的各種其它成分一起摻入到適宜的溶劑中然后無(wú)菌過(guò)濾來(lái)制備。通常，分散液通過(guò)將各種無(wú)菌的活性成分摻入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和以上所列的其它所需成分的無(wú)菌載體中來(lái)制備。在用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由此可以得到活性成分加預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液中所存在的任何其它所需成分的粉末。制備用于直接注射的更濃或高度濃縮的溶液也是可行的，其中，預(yù)測(cè)使用DMSO作為溶劑可以導(dǎo)致向小區(qū)域內(nèi)極為迅速地滲透、輸送高濃度的活性物質(zhì)。
當(dāng)制成制劑時(shí)，可將溶液以與給藥的制劑相容的方式和治療有效量給藥。該制劑很容易以各種劑量形式、例如以上描述的可注射溶液給藥，但也可以采用藥物釋放膠囊等形式。
對(duì)于以水溶液的形式進(jìn)行胃腸外給藥，如需要，應(yīng)對(duì)溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)木彌_并且首先將液體稀釋劑用足夠量的鹽水或葡萄糖調(diào)至等滲。這些水溶液特別適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。就此而言，根據(jù)本文所公開(kāi)的內(nèi)容，可以采用的無(wú)菌含水介質(zhì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可將1個(gè)劑量溶于1ml等滲氯化鈉溶液然后加入1000ml皮下輸注液中或在推薦的輸注部位注射(參見(jiàn)例如，“Remington’sPharmaceutical Sciences”，第15版，1035-1038和1570-1580頁(yè))。根據(jù)所治療患者的情況，可能需要對(duì)劑量進(jìn)行一些改變。在任何情況下，應(yīng)由負(fù)責(zé)給藥者確定對(duì)于每一個(gè)體的適宜劑量。
除了將化合物配制成用于胃腸外給藥、例如靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射的制劑外，其它的可藥用形式包括，例如片劑或其它用于口服給藥的固體；脂質(zhì)體制劑；定時(shí)釋放的膠囊以及任何其它常用的形式，包括霜?jiǎng)?br> 還可以在本發(fā)明中使用鼻用溶液或噴霧劑、氣霧劑或吸入劑。鼻用溶液通常是含水溶液，用于以滴劑或噴霧劑的形式向鼻通道給藥。鼻用溶液被制備成在許多方面與鼻分泌物類似，從而可以保持正常的纖毛活動(dòng)。因此，含水鼻用溶液通常是等滲的并且進(jìn)行適當(dāng)?shù)木彌_以保持pH在5.5至6.5。此外，如需要，還可在制劑中含有抗菌防腐劑(與眼科制劑中所用的相同)和適宜的藥物穩(wěn)定劑。已知有各種市售的鼻制劑，其含有例如抗生素和抗組胺藥并且用于預(yù)防哮喘。
適用于其它給藥方式的其它制劑包括陰道栓劑和子宮托。也可以使用直腸栓劑。栓劑是具有各種重量和形狀的固體劑量形式，通常被制成用于插入直腸、陰道或尿道的藥物形式。在插入后，栓劑在腔液中軟化、熔化或溶解。通常，對(duì)于栓劑，常規(guī)的粘合劑和載體可以包括，例如聚亞烷基二醇或甘油三酯；所述栓劑可以從含有0.5％至10％、優(yōu)選1％-2％活性成分的混合物形成。
口服制劑含有常用的賦形劑，例如藥品級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可以是溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或散劑的形式。在某些實(shí)施方案中，口服藥物組合物含有惰性稀釋劑或可同化的食用載體，或者可將其包封在硬或軟殼的明膠膠囊中，或者可將其壓制成片劑，或者可將其直接摻入到食物中。對(duì)于口服治療性給藥，可將活性化合物與賦形劑混合并以咀嚼片、口含片、錠劑、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿、糯米紙囊劑等形式使用。這些組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1％的活性化合物。當(dāng)然，組合物和制劑的百分比可以改變，通?？梢栽趧┝繂挝坏募s2至約75％(重量)之間，或優(yōu)選在25-60％之間。在所述治療用組合物中的活性化合物的量為可以獲得適宜劑量的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可以含有如下成分粘合劑，例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂；甜味劑，例如蔗糖、乳糖或糖精或矯味劑例如薄荷、冬青油或櫻桃香精。當(dāng)單位劑量形式是膠囊時(shí)，除上述類型的物質(zhì)外，它還可以含有液體載體。可以存在各種其它物質(zhì)作為包衣或用來(lái)改善固體單位劑量形式的外觀。例如，片劑、丸劑或膠囊可以用紫膠、糖或二者進(jìn)行包衣。糖漿或酏劑可以含有活性化合物、甜味劑蔗糖或、防腐劑對(duì)羥基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和矯味劑例如櫻桃或橙香精。
在某些實(shí)施方案中，還可將脂質(zhì)體和/或納米顆粒用于D-DFMO或其類似物的制劑和給藥。脂質(zhì)體的形成和用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，在下文中也進(jìn)行了描述。
納米膠囊通常以穩(wěn)定和可重現(xiàn)的方式包裹化合物。為了避免由于細(xì)胞內(nèi)聚合物超負(fù)荷所引起的副作用，這些超細(xì)顆粒(粒度約為0.1μm)應(yīng)使用可在體內(nèi)降解的聚合物。滿足這些要求的生物可降解的聚氰基丙烯酸烷基酯納米顆粒可用于本發(fā)明，這些顆粒很容易制備。
脂質(zhì)體由磷脂制備，將所述磷脂分散在含水介質(zhì)中，其自發(fā)地形成多層的同心雙分子層囊(也稱為多層囊(MLV))。MLV的直徑通常為25nm至4μm。對(duì)MLV進(jìn)行超聲處理可以導(dǎo)致小的單層囊(SUV)的形成，其直徑為200至500，在核心中含有水溶液。
以下資料也可用于脂質(zhì)體制劑的生產(chǎn)。當(dāng)在水中分散時(shí)，根據(jù)脂類與水的摩爾比，磷脂可以形成除脂質(zhì)體之外的各種結(jié)構(gòu)。在低比例時(shí)，脂質(zhì)體是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物理性質(zhì)取決于pH、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽(yáng)離子的存在。脂質(zhì)體可以顯示對(duì)離子和極性物質(zhì)的低通透性，但在升高的溫度下會(huì)發(fā)生相變，從而明顯改變了其通透性。該相變涉及從緊密填充的、有序的結(jié)構(gòu)(稱為凝膠態(tài))變成松散填充的、不很有序的結(jié)構(gòu)(稱為流態(tài))。這在特征性的相變溫度下發(fā)生，并導(dǎo)致對(duì)于離子、糖和藥物通透性的增加。
脂質(zhì)體通過(guò)四種不同的機(jī)制與細(xì)胞相互作用通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的胞吞作用；通過(guò)非特異性的弱的疏水或靜電力或通過(guò)與細(xì)胞表面成分的特異性相互作用吸附到細(xì)胞表面；通過(guò)脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層插入到漿膜中并同時(shí)將脂質(zhì)體的成分釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)而與漿細(xì)胞膜融合；以及通過(guò)將脂質(zhì)體的脂類轉(zhuǎn)移到細(xì)胞或亞細(xì)胞膜上(或反過(guò)來(lái))而與脂質(zhì)體的成分沒(méi)有任何締合。改變脂質(zhì)體制劑可以改變其作用機(jī)制，盡管可能同時(shí)有一種以上的機(jī)制在起作用。VI.實(shí)施例以下實(shí)施例是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例中所公開(kāi)的技術(shù)代表了本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的可以很好地實(shí)踐本發(fā)明的技術(shù)，因此可以認(rèn)為是構(gòu)成了該實(shí)踐的優(yōu)選方式。但是，根據(jù)本公開(kāi)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以對(duì)所公開(kāi)的具體實(shí)施方案進(jìn)行許多改變?nèi)阅艿玫较嗨苹蛳嗤慕Y(jié)果而不超出本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。
實(shí)施例1DFMO的體內(nèi)研究方法動(dòng)物和試劑24只Long Evans色素沉著性大鼠(250-275g)從Harlan SpragueDawley(Indianapolis，IN)獲得，36只色素沉著性豚鼠從KuiperRabbit Ranch(Gary，IN)獲得，其開(kāi)始時(shí)的重量為200-250g并關(guān)在Oklahoma大學(xué)健康科學(xué)中心的動(dòng)物設(shè)施內(nèi)。將試驗(yàn)動(dòng)物在12∶12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)下飼養(yǎng)，可以自由接近食物和水，室溫控制在21℃。大鼠中的D，L-DFMO劑量響應(yīng)將24只動(dòng)物隨機(jī)分成8組，每組3只。治療組如下0、200、400和600mg/kg/天D，L-DFMO，每天通過(guò)管飼法給藥(5天/周)4和8周。再將另外4只動(dòng)物隨機(jī)分成2組400和600mg/kg/天，通過(guò)管飼法每天兩次給藥(5天/周)8周。在周末時(shí)，將D，L-DFMO(通過(guò)重量評(píng)估確定體積)放在飲用水中(30ml/天/動(dòng)物)。每天稱量體重(5天/周)并在給藥結(jié)束時(shí)進(jìn)行聽(tīng)覺(jué)功能評(píng)估。豚鼠中的D，L-DFMO劑量響應(yīng)將31只幼年色素沉著豚鼠隨機(jī)分到每日接受(7天/周)腹膜內(nèi)注射0.5g/kg D，L-DFMO(n＝5)、1g/kg/天D，L-DFMO(n＝5)、2g/kg/天D，L-DFMO(n＝2)、3g/kg/天D，L-DFMO(n＝4)和鹽水載體(n＝5)的治療組中。動(dòng)物數(shù)量的變化是由于顯著的死亡率引起的，因此決定中斷向更高的劑量組增加動(dòng)物。在給藥45天時(shí)，對(duì)0.5g/kg和1g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估聽(tīng)力閾值，而對(duì)于2g/kg/天的受試者，在給藥第22天時(shí)評(píng)估。因此，D，L-DFMO劑量為1g/kg/天和2g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物每公斤體重接受了總量基本相同的D，L-DFMO劑量。每天稱量體重以確定注射的體積。在給藥結(jié)束時(shí)進(jìn)行聽(tīng)覺(jué)功能評(píng)估。DFMO對(duì)映體與外消旋體在豚鼠中的比較將20只試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分到接受1g/kg/天D-DFMO、1g/kg/天L-DFMO、1g/kg/天D，L-DFMO或鹽水的治療組(n＝5)中。每天進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，共注射45天，通過(guò)每天稱量體重確定注射量。在給藥結(jié)束時(shí)，對(duì)試驗(yàn)期間存活下來(lái)的所有動(dòng)物進(jìn)行聽(tīng)覺(jué)功能評(píng)估。CAP和CM記錄和分析在治療周期結(jié)束時(shí)(最后一次給藥24小時(shí)后)，將大鼠用賽拉嗪(13mg/kg，肌肉內(nèi))和氯胺酮(87mg/kg，肌肉內(nèi))麻醉，將豚鼠用賽拉嗪(5mg/kg，肌肉內(nèi))、氯胺酮(30mg/kg，肌肉內(nèi))和尿烷(160mg/kg，腹膜內(nèi))麻醉。用腹側(cè)法手術(shù)暴露圓形窗口，并在手術(shù)顯微鏡下在圓形窗口上小心地放置一個(gè)銀線電極以記錄化合物動(dòng)作電位(CAP)和耳蝸微動(dòng)(CM)。在頸部肌肉內(nèi)放置一個(gè)氯化銀電極作為對(duì)照。將CAP和CM信號(hào)用Grass A.C.前置放大器(P15型)放大。增益為1000。CAP的帶通頻率為0.1-1.0kHz，CM的帶通頻率為0.1-50kHz。用數(shù)字示波器(Nicolet Instrument Co.，2090-IIIA)觀察CAP信號(hào)。將CM信號(hào)送到SR530 Lock-in放大器(Stanford Research Systems，Inc.)然后再送到PC計(jì)算機(jī)上自動(dòng)測(cè)定1μVRMS振幅。測(cè)定引起剛剛能檢測(cè)到的CAP的試驗(yàn)頻率的聲級(jí)并用該值以頻率來(lái)評(píng)估閾值。通過(guò)計(jì)算機(jī)程序測(cè)定在各試驗(yàn)頻率下引起1μV RMS CM的聲級(jí)并評(píng)估1μV RMS CM等幅曲線。通過(guò)在相同頻率下各治療動(dòng)物的各CAP閾值和平均對(duì)照值(由僅接觸載體的試驗(yàn)動(dòng)物測(cè)得)之間的差異計(jì)算出CAP閾值改變。以類似的方式得到CM等幅曲線圖。
用SR530Lock-in放大器(Stanford Research Systems.Inc.，Sunnyvale，CA)產(chǎn)生引起CAP和CM的純音。將信號(hào)通過(guò)可編程的衰減器衰減，然后通過(guò)高電壓放大器放大并傳送到放置在與暴露的外聽(tīng)覺(jué)口相適應(yīng)的張開(kāi)器內(nèi)的高頻音源(由ACO1/2″麥克風(fēng)7013制成)。音頻為2、4、6、8、12、16、20、24、30、35和40kHz。用連續(xù)音引發(fā)CM。用音爆來(lái)引發(fā)CAP。音爆的持續(xù)時(shí)間為10毫秒，上升/下降時(shí)間為1.0毫秒，重復(fù)率為9.7次/秒。將所有試驗(yàn)頻率下的聲級(jí)用位于鼓膜附近的探針麥克風(fēng)校準(zhǔn)。
用重復(fù)測(cè)量的ANOVA(NCSS軟件)來(lái)評(píng)估不同藥物接觸量和試驗(yàn)頻率之間的總的顯著性及其相互作用。將頻率作為個(gè)體內(nèi)變量來(lái)評(píng)估，治療組為個(gè)體間變量。通過(guò)Fisher最少二乘方差異進(jìn)行Post hoc分析。組織學(xué)在有限數(shù)量的個(gè)體中評(píng)估柯替氏器官的表面制備物。在記錄了CAP和CM之后，在深度麻醉下將動(dòng)物斬首。立即取出耳蝸。打開(kāi)圓形和橢圓形的窗口并鉆開(kāi)耳蝸的尖端以便于灌注。將耳蝸用SDH(琥珀酸脫氫酶)保溫溶液(0.05M琥珀酸鈉、0.05M磷酸鹽緩沖液和0.05％四硝基藍(lán)四唑)灌注然后在該溶液中浸泡1小時(shí)(37℃)。然后將耳蝸用10％福爾馬林固定至少2天。固定后，將耳蝸在10％EDTA溶液(乙二胺四乙酸)中脫鈣3天或根據(jù)需要脫鈣更長(zhǎng)的時(shí)間。在光學(xué)顯微鏡下完成耳蝸的顯微解剖。
實(shí)施例2在用D，L-DFMO處理的大鼠中的劑量響應(yīng)毒性和耳毒性當(dāng)通過(guò)插管法使大鼠接觸劑量為200mg/kg/天至1.2g/kg/天的D，L-DFMO長(zhǎng)達(dá)8周時(shí)，未產(chǎn)生任何明顯的重量改變或聽(tīng)覺(jué)功能障礙。圖1顯示了在5天間隔期內(nèi)所有治療組的平均重量增加(以克表示)。與對(duì)照的治療增加相比，200mg/kg/天至600mg/kg/天的劑量沒(méi)有引起任何的重量減輕。兩個(gè)最高劑量似乎可以減輕體重的增加，盡管這些組中所用的試驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量較少。當(dāng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，這些數(shù)據(jù)不符合顯著性的標(biāo)準(zhǔn)(F[22，44]＝1.56，p＝0.103)。
在圖2和圖3中分別表示出了多劑量D，L-DFMO治療對(duì)CAP閾值和CM幅度的影響。D，L-DFMO對(duì)兩種測(cè)量結(jié)果均沒(méi)有影響。CAP閾值水平和1μV RMS等幅CM曲線與載體處理的對(duì)照個(gè)體相差不到5dB；這一大小的變化在與測(cè)量有關(guān)的誤差范圍內(nèi)，沒(méi)有生物學(xué)意義(F[2，4]＝1.24，p＝0.381)。
實(shí)施例3在用D，L-DFMO處理的豚鼠中的劑量響應(yīng)毒性和耳毒性與大鼠中觀察到的數(shù)據(jù)相反，當(dāng)將豚鼠用劑量為500mg/kg/天至3g/kg/天的D，L-DFMO處理時(shí)，觀察到了明顯的全身毒性和耳毒性。所有3g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物均在處理的前6天內(nèi)死亡，有五分之二1g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物不能在整個(gè)6周的給藥時(shí)間內(nèi)存活。隨著3g/kg/天組的死亡，增加了兩個(gè)2g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物。在第22天，2g/kg/天的動(dòng)物事實(shí)上已經(jīng)沒(méi)有體重的增加，于是在此時(shí)對(duì)動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)功能進(jìn)行評(píng)估。圖4顯示進(jìn)行了聽(tīng)力評(píng)估的動(dòng)物體重增加的速率。對(duì)于2g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物，體重增加被有效地阻滯，而1g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物似乎在給藥期的最后10天與對(duì)照產(chǎn)生了差異。500mg/kg/天D，L-DFMO的動(dòng)物顯示沒(méi)有明顯的全身性毒性的癥狀；它們的生長(zhǎng)速率實(shí)際上超過(guò)了對(duì)照。分析表明，500mg/kg/天以及1g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物均與對(duì)照沒(méi)有顯著性差異(F＜1.0)。
在D，L-DFMO處理的豚鼠中觀察到了劑量依賴性的聽(tīng)力閾值的升高。由于全身性毒性，聽(tīng)力評(píng)估實(shí)際上是在5只500mg/kg/天D，L-DFMO、3只1g/kg/天D，L-DFMO、2只2g/kg/天D，L-DFMO和3只對(duì)照試驗(yàn)動(dòng)物(去掉了兩只動(dòng)物，一只是由于麻醉劑過(guò)量，另一只是由于懷孕)上進(jìn)行的。圖5顯示了各D，L-DFMO給藥組CAP靈敏度的減弱。接受500mg/kg/天藥物的試驗(yàn)動(dòng)物顯示CAP閾值升高的平均值為9dB，在整個(gè)頻率范圍內(nèi)，靈敏度的減弱相對(duì)較為平坦。有限數(shù)量的2g/kg/天和1g/kg/天的動(dòng)物顯示的閾值變化在高頻率試驗(yàn)范圍內(nèi)最為明顯。2g/kg/天組顯示在所有頻率下的平均損失為14dB，而1g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物顯示10dB的平均偏移。當(dāng)僅對(duì)20至40kHz之間的頻率進(jìn)行評(píng)估時(shí)，聽(tīng)力靈敏度的平均損失對(duì)于2g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物為30dB，而對(duì)于1g/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物僅為17dB，對(duì)于500mg/kg/天的試驗(yàn)動(dòng)物為7.1dB。將重復(fù)測(cè)量值的ANOVA對(duì)不同的n進(jìn)行校正，顯示出接受2g/kg/天D，L-DFMO、1g/kg/天D，L-DFMO、500mg/kg/天D，L-DFMO和鹽水的四個(gè)給藥組之間CAP的顯著性差異(治療之間，F(xiàn)[3，9]＝4.06，p＝0.044；頻率之間，F(xiàn)[10，190]＝25.98，p＜0.001；治療-頻率相互作用之間，F(xiàn)[30，190]＝10.89，p＜0.001)。Post hoc分析顯示所有3組藥物治療均與對(duì)照有顯著性差異(p＜0.05)。
有趣的是，與對(duì)CAP靈敏度的破壞相反，治療對(duì)CM的靈敏度沒(méi)有影響(參見(jiàn)圖6)。CM主要由外毛細(xì)胞、特別是耳蝸底部的細(xì)胞(靠近記錄電極)對(duì)聽(tīng)覺(jué)刺激的反應(yīng)而產(chǎn)生。CM不受任何劑量D，L-DFMO的影響表明在CAP中所看到的作用不是在OHC功能障礙的基礎(chǔ)上繼發(fā)的。所有治療均沒(méi)有產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的CM曲線的改變(F＜1.0)。
對(duì)存在由D，L-DFMO(1g/kg/天，45天)引起嚴(yán)重的CAP閾值升高但CM靈敏度沒(méi)有改變的豚鼠的毛細(xì)胞損傷進(jìn)行了組織學(xué)檢查。試驗(yàn)動(dòng)物相對(duì)于對(duì)照的CAP閾值改變隨著刺激的頻率而增加，最大升高值為在40kHz時(shí)的55dB(圖7E)。由于CM的干擾，沒(méi)有測(cè)得對(duì)低頻率的CAP閾值。通過(guò)與尖端的百分比距離來(lái)確定沿著基底膜表面的位置，并且可以與生理學(xué)數(shù)據(jù)相關(guān)，因?yàn)閷⒙曇粢砸粽{(diào)排列的方式編碼，用最高的頻率表示耳蝸的最底部。在基底膜最頂端40％內(nèi)的內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)和外毛細(xì)胞(OHC)均顯示正常的SDH(琥珀酸脫氫酶)染色。例如，圖7A是位于基底膜26％處的毛細(xì)胞圖像?；啄さ钠溆?0％(圖7B)顯示出毛細(xì)胞損傷。在74％處(圖7C)，出現(xiàn)了OHC和IHC的減少。有趣的是，在非常靠近底部的某些位置，所有的IHC均消失了，但仍有許多OHC存活。(圖7D，90％)。CM的靈敏度正常(圖7F)表明在靠近圓形窗的基底轉(zhuǎn)彎處存活的OHC具有正常的功能。
實(shí)施例4L-DFMO和D-DFMO在豚鼠中的毒性和耳毒性在圖8、圖9和圖10中顯示了比較DFMO的對(duì)映體和外消旋體的數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)D-DFMO在豚鼠中不產(chǎn)生任何明顯的聽(tīng)力損傷，而DFMO的L-對(duì)映體產(chǎn)生超過(guò)了D，L-DFMO處理的閾值變化。體重的數(shù)據(jù)表明該對(duì)映體不產(chǎn)生明顯的全身性毒性。
圖8顯示了動(dòng)物的生長(zhǎng)。盡管所處理的動(dòng)物似乎比對(duì)照的生長(zhǎng)速度較幔，但對(duì)于整個(gè)試驗(yàn)期間的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示沒(méi)有顯著性差異(F[3，16]＝0.95，p＝0.44)。對(duì)映體和外消旋體的體重增加之間彼此沒(méi)有差異。
圖9顯示了對(duì)映體、外消旋體和對(duì)照的CAP閾值改變。L-DFMO(實(shí)心的三角形)和D，L-DFMO(實(shí)心的正方形)均產(chǎn)生了25±2dB的平均閾值改變。當(dāng)對(duì)D-對(duì)映體(圖9，實(shí)心圓)測(cè)定聽(tīng)覺(jué)功能時(shí)，在所有頻率下均測(cè)得了2dB的CAP平均閾值改變，在40kHz處略有升高。重復(fù)測(cè)量值的ANOVA顯示出在接受1g/kg/天D，L-DFMO、1g/kg/天D-DFMO、1g/kg/天L-DFMO和鹽水的四個(gè)給藥組之間CAP的顯著性差異(治療之間，F(xiàn)[3，19]＝7.41，p＝0.002；頻率之間，F(xiàn)[10，190]＝7.99，p＜0.001；治療-頻率相互作用，F(xiàn)[30，90]＝2.90，p＜0.001)。當(dāng)進(jìn)行Fisher’s LSD時(shí)，發(fā)現(xiàn)L-DFMO(p＜0.005)和D，L-DFMO(p＜0.005)在所有試驗(yàn)頻率下與對(duì)照均有顯著性差異，但D-對(duì)映體沒(méi)有。
與對(duì)CAP閾值的顯著影響相反，L-DFMO不產(chǎn)生CM靈敏度的改變(圖10，實(shí)心三角形)。在35和40kHz處的略微升高是由于一只動(dòng)物在這兩個(gè)頻率下顯示高達(dá)40dB的聽(tīng)力損失。D-DFMO也不會(huì)改變CM。與對(duì)照相比，所有治療均不會(huì)顯著影響CM(F[3，16]＝0.9，p＝0.45)。討論當(dāng)用酶抑制劑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療時(shí)，預(yù)期結(jié)果會(huì)是有某些飽和點(diǎn)的劑量依賴型的曲線。為了消除D，L-DFMO化療的耳毒性副作用，需要測(cè)定對(duì)該藥物的耳毒性劑量反應(yīng)。以前的研究是在飲用水中給藥，這使得難以測(cè)定實(shí)際的藥物攝取量。因此，需要直接給藥以產(chǎn)生準(zhǔn)確的耳毒性劑量反應(yīng)。在該方法同時(shí)使用大鼠和豚鼠。
大鼠模型不產(chǎn)生明顯的體重減輕(毒性)和聽(tīng)力范圍內(nèi)的明顯閾值變化(耳毒性)。該結(jié)果暗示在大鼠中的D，L-DFMO治療不會(huì)產(chǎn)生以前在人類患者中所報(bào)道的耳毒性副作用。Schweitzer等(1986)發(fā)現(xiàn)，用1％DFMO在飲用水中對(duì)大鼠治療(約300mg/kg，假設(shè)每日攝取30ml水)不僅可以引起正常的腦干激發(fā)電位，多元胺的水平也不會(huì)減少至可能會(huì)影響其它系統(tǒng)的水平。本發(fā)明人通過(guò)使動(dòng)物接觸(插管法)高達(dá)4倍的更大劑量擴(kuò)大了該數(shù)據(jù)的范圍，仍未發(fā)現(xiàn)對(duì)聽(tīng)力閾值的影響。如果多元胺的水平確實(shí)在聽(tīng)覺(jué)功能中起作用，大鼠的代謝會(huì)使D，L-DFMO不能抑制多元胺的合成達(dá)到?jīng)Q定性的水平，因此不能將大鼠用作測(cè)定D，L-DFMO耳毒性的可靠模型。
相反，用D，L-DFMO處理在豚鼠中產(chǎn)生了明顯的聽(tīng)覺(jué)功能障礙(耳毒性)。同樣，以前的研究中的實(shí)際藥物攝取量的測(cè)定是很困難的，因此在本研究中所有的給藥均是通過(guò)腹膜內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行的。在研究的前6天，D，L-DFMO在3g/kg/天的劑量下顯示明顯的毒性，100％的動(dòng)物死亡。其余的治療組在試驗(yàn)期間內(nèi)未產(chǎn)生明顯的毒性(死亡或體重減輕)。對(duì)治療過(guò)程中死亡的一個(gè)動(dòng)物以及一直存活到實(shí)驗(yàn)結(jié)束的動(dòng)物進(jìn)行尸檢。結(jié)果支持這樣的結(jié)論，即，重復(fù)注射與試驗(yàn)動(dòng)物的死亡或?qū)w重增加的抑制沒(méi)有影響。
CAP閾值表明D，L-DFMO可以在豚鼠中產(chǎn)生明顯而且是可重現(xiàn)的改變。正如所預(yù)期的，在整個(gè)試驗(yàn)頻率下的平均閾值改變是劑量依賴型的。2g/kg/天的D，L-DFMO可以在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生較大的聽(tīng)力損傷暗示最終決定耳毒性的是藥物的給藥量而不是治療的持續(xù)時(shí)間。
CM主要由耳蝸基底轉(zhuǎn)彎處的外毛細(xì)胞產(chǎn)生，它是檢測(cè)許多耳毒性藥物、包括氨基糖甙和順鉑所引起的損傷的一個(gè)靈敏的測(cè)量方法，但D，L-DFMO不會(huì)產(chǎn)生CM等幅曲線的改變。組織學(xué)表明，在基底轉(zhuǎn)彎處的大部分外毛細(xì)胞是完整的是對(duì)CM沒(méi)有影響的原因。但是，基底內(nèi)毛細(xì)胞顯示出大范圍的損傷，大部分均消失了。耳蝸的中部顯示出外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞均有損傷和減少。在尖端，外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞均沒(méi)有損傷或減少。因此，D，L-DFMO可能對(duì)位于耳蝸基底轉(zhuǎn)彎處的毛細(xì)胞有一些選擇性。
劑量反應(yīng)曲線的產(chǎn)生使得可以對(duì)D，L-DFMO及其對(duì)映體進(jìn)行比較。由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了可重現(xiàn)的D，L-DFMO引起的豚鼠閾值變化，因此可以在豚鼠中繼續(xù)對(duì)對(duì)映體進(jìn)行鑒定。由于在高劑量下的致死率，選擇1g/kg/天用于將對(duì)映體和外消旋體進(jìn)行比較。
對(duì)映體不顯示明顯的毒性(通過(guò)體重增加來(lái)測(cè)定)。發(fā)現(xiàn)DFMO的D形式對(duì)化合物的動(dòng)作電位或耳蝸微動(dòng)均沒(méi)有影響。對(duì)聽(tīng)覺(jué)功能的評(píng)估發(fā)現(xiàn)DFMO的L形式可以對(duì)正常的耳蝸電位產(chǎn)生明顯的破壞。以上描述的研究暗示了可以開(kāi)發(fā)涉及DFMO的單一對(duì)映體的化療方案。
實(shí)施例5D-、L-和DL-二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的比較。
對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)活性的影響材料和方法將重組鼠ODC在大腸桿菌中表達(dá)然后純化用于研究。用微量測(cè)定來(lái)測(cè)定ODC活性和DFMO的抑制作用。具體地講，將20μl重組的鼠ODC(濃度為0.6mg/ml)和系列稀釋液(0至80μM的D-、L-或D-L-DFMO)一起在1.5ml Eppendorf管中于室溫下預(yù)保溫30分鐘。通過(guò)加入27.5μlBrij35ODC試驗(yàn)混合物(最終濃度40mM Tris HCl pH7.5，8mM DTT，0.64mM吡哆醛磷酸鹽(PLP)，0.80mM EDTA，0.04％ Brij35和0.2μCi(14C)L-鳥(niǎo)氨酸)在Eppendorf管中引發(fā)反應(yīng)。將40μl CO2捕獲劑(乙醇胺/3-甲氧基乙醇.2∶1)置于20ml玻璃螺口液體閃爍瓶的底部，將含有樣品的開(kāi)口Eppendorf管置于瓶?jī)?nèi)遠(yuǎn)離捕獲劑的位置。立即用隔膜蓋將閃爍瓶蓋上，然后將小瓶于37℃的振搖水浴中保溫1小時(shí)。然后將小瓶從水浴中取出，通過(guò)隔膜向開(kāi)口的Eppendorf管內(nèi)加入100μl2M檸檬酸以停止ODC反應(yīng)。將閃爍瓶繼續(xù)于37℃下保溫2小時(shí)以終止反應(yīng)。將Eppendorf管從小瓶?jī)?nèi)取出并加入6ml閃爍液。將小瓶在Beckman LS-6500閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)分鐘。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的最小二乘方擬合得到KI抑制值。結(jié)果在使用濃度為0.6μM至80μMD-、L-和D，L-DFMO的三次獨(dú)立的研究中，測(cè)定了抑制50％ODC活性(Ki)的有效濃度水平。有效濃度水平如下D-DFMO24.1μML-DFMO6.4μMD，L-DFMO 8.1μM兩種對(duì)映體以及外消旋混合物均有抑制作用。D-DFMO的KI值比L形式低4倍，比混合物低3倍。
實(shí)施例6D-、L-和D，L-DFMO在細(xì)胞系中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在6種人細(xì)胞系中研究了D-、L-和D，L-DFMO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力MCF-7(乳腺癌，ATCC#HTB22)、LNCaP(前列腺癌，ATCC#CRL1740)、PC-3(前列腺癌，ATCC#CRL1435)、HT-29(結(jié)腸癌，ATCC#HTB38)、HSK612(正常的角質(zhì)細(xì)胞，購(gòu)自InCell.Inc.)和506SM(正常的結(jié)腸粘膜下層間質(zhì)細(xì)胞，購(gòu)自InCell.Inc.)。將所有三種形式的DFMO在兩種濃度(1和10μM)下進(jìn)行試驗(yàn)。用阿霉素和氯化鈣作為陽(yáng)性對(duì)照。用按照細(xì)胞DNA斷裂ELISA試劑盒(Boehringer MannheimBiochemicais，目錄號(hào)1585-045)的多孔板DNA斷裂測(cè)定法和Hoechst染色測(cè)定細(xì)胞凋亡。
所有三種形式的DFMO均可以引起細(xì)胞凋亡，但在癌細(xì)胞系中沒(méi)有細(xì)胞毒性。在所測(cè)定的濃度下，不同形式的DFMO之間沒(méi)有總的顯著差異。所有DFMO溶液的細(xì)胞凋亡均比阿霉素陽(yáng)性對(duì)照(其是細(xì)胞毒性的并且可以引起細(xì)胞凋亡)明顯。
實(shí)施例7DFMO對(duì)映體在MCF-7人乳腺癌異種移植模型中的體內(nèi)評(píng)估在裸鼠中植入雌激素依賴型的人乳腺腫瘤細(xì)胞系MCF-7(ATCC#HTB22)。以0.5％w/v溶液的形式在動(dòng)物的飲用水中隨意給藥D-、L-或D，L-DFMO，每組8只動(dòng)物。另一組的8只動(dòng)物給藥3.0％溶液形式的D，L-DFMO。實(shí)驗(yàn)在第90天(當(dāng)對(duì)照腫瘤達(dá)到400mg時(shí))停止實(shí)驗(yàn)。每周對(duì)小鼠稱重兩次并且每周兩次通過(guò)卡尺測(cè)量腫瘤，從DFMO給藥時(shí)開(kāi)始(第1天)。將腫瘤測(cè)量值通過(guò)公式L2×W/2轉(zhuǎn)換成mg腫瘤重量。
對(duì)于接受D，L-DFMO的組，7/8的動(dòng)物平均部分腫瘤縮小了60.4％，在第8只動(dòng)物中，腫瘤生長(zhǎng)的抑制為99.2％。對(duì)于接受L-DFMO的組，7/8的動(dòng)物平均部分腫瘤縮小了50.0％，在第8只動(dòng)物中，腫瘤生長(zhǎng)的抑制為5.5％。對(duì)于接受D-DFMO的組，4/8的動(dòng)物平均部分腫瘤縮小了62.6％，2/8的動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)抑制為84.7％，其余兩只動(dòng)物中毒死亡。將各組的平均結(jié)果與對(duì)照(包括3.0％D，L-DFMO組)進(jìn)行比較，如圖11中所示。在這些組中觀察到的抗腫瘤活性的差異不能認(rèn)為是顯著性的。
實(shí)施例8DFMO對(duì)映體對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶體外活性的影響用兩種體外系統(tǒng)研究了D-、L-或D，L-DFMO抑制鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的作用。第一種采用在來(lái)自小鼠ODC cDNA的不含細(xì)胞的系統(tǒng)中合成的ODC。發(fā)現(xiàn)L-DFMO在低抑制劑底物比時(shí)是比D-DFMO更有效的ODC抑制劑。在該系統(tǒng)中測(cè)得D異構(gòu)體的效力比L形式低10倍，而外消旋D，L-DFMO的效力介于中間。L-形式似乎以非競(jìng)爭(zhēng)性的方式起作用(正如對(duì)不可逆抑制劑所預(yù)期的那樣)，而D-形式似乎以競(jìng)爭(zhēng)性的方式起作用。
第二種系統(tǒng)著眼于對(duì)HCT-116結(jié)腸癌衍化的細(xì)胞中內(nèi)源性O(shè)DC的抑制。同樣，在減少細(xì)胞內(nèi)的多元胺(ODC活性的終產(chǎn)物)水平上，L-形式比D-形式更有效。所有形式的DFMO均可抑制腐胺(ODC的另一種終產(chǎn)物)水平在檢測(cè)限以下。在用D-DFMO處理的細(xì)胞中，多元胺水平的恢復(fù)比用L-DFMO處理的細(xì)胞更為迅速。
實(shí)施例9D-、L-和D，L-DFMO對(duì)ODC體內(nèi)抑制作用的比較全身性給藥D-、L-和D，L-DFMO抑制佛波酯誘導(dǎo)的小鼠皮膚內(nèi)ODC的能力。以100mg給藥(單劑量或分開(kāi)的劑量)的所有形式的DFMO均完全抑制了ODC活性，每天給藥5mg劑量的所有形式5天的時(shí)間幾乎完全抑制了ODC活性，各異構(gòu)體之間沒(méi)有顯著性差異。如圖12所示，單劑量的D-DFMO和L-DFMO顯示劑量依賴型的ODC抑制作用，在兩種異構(gòu)體之間同樣沒(méi)有差異。
實(shí)施例10在生物流體中分析D，L-DFMO向大鼠給藥單劑量的D-、L-或D，L-DFMO并隨時(shí)測(cè)定血漿水平(圖13)。給藥400mg/kg D，L-DFMO的大鼠在給藥后1至2小時(shí)之間達(dá)到109μg/ml的最大血漿水平。接受200mg/kg D-DFMO或L-DFMO的大鼠在相同的時(shí)程內(nèi)分別達(dá)到102μg/ml和45μg/ml的血漿水平。對(duì)L-DFMO觀察到的低的血液水平可能是由于該形式的生物利用度較低、排泄更迅速或更迅速地與組織或蛋白結(jié)合所引起的。
根據(jù)本文所公開(kāi)的內(nèi)容，所公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法均不用過(guò)多的實(shí)驗(yàn)就可以制備和實(shí)施。雖然以優(yōu)選實(shí)施方案的方式對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可以對(duì)組合物和/或方法在本文所述方法的步驟或步驟的順序上進(jìn)行改變而不超出本發(fā)明的概念、實(shí)質(zhì)和范圍。更具體地講，可以用某些在化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的物質(zhì)代替本文中所描述的物質(zhì)而達(dá)到相同或類似的結(jié)果。所有這些對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的類似的替換和改變均被認(rèn)為是在所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的實(shí)質(zhì)、范圍和概念之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.在患者中預(yù)防和/或治療癌癥的方法，該方法包括向所述患者施用有效量的明顯富集的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的D對(duì)映體(D-DFMO)或其類似物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D-DFMO或其類似物以大約0.05至約20.0gm/M2/天的劑量給藥。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中的D-DFMO或其類似物以大約0.1至約2.0gm/M2/天的劑量給藥。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所治療的癌癥選自膀胱癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腦癌、肺癌、胃癌、血癌、皮膚癌、睪丸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、食管癌及其各種組合。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中的癌癥是結(jié)腸癌。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中的結(jié)腸癌是家族性腺瘤性息肉病。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中的癌癥是膀胱癌。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中的膀胱癌是表淺型膀胱癌。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的預(yù)防和/或治療癌癥是通過(guò)選自下列的機(jī)制來(lái)完成的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞分化、抑制轉(zhuǎn)移的可能性、減少腫瘤負(fù)荷、增加對(duì)化療或放療的敏感性、殺死癌細(xì)胞、抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤消退及其各種組合。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中D-DFMO或其類似物至少給藥兩次。
11.權(quán)利要求1所述的方法，還包括切除實(shí)體瘤。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物在所述的切除術(shù)前給藥。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其中，將DFMO或其類似物在所述的切除術(shù)后給藥。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中的給藥途徑選自口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、真皮、鼻、直腸、陰道、局部、頰部和淋巴內(nèi)給藥。
15.權(quán)利要求1所述的方法，其中，將DFMO或其類似物直接向腫瘤內(nèi)給藥。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物全身性給藥。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物向腫瘤的區(qū)域性脈管系統(tǒng)內(nèi)給藥。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物向腫瘤的區(qū)域淋巴系統(tǒng)內(nèi)給藥。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中，將D-DFMO或其類似物口服給藥。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少60％。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少70％。
22.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少80％。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少90％。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少95％。
25.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少97.5％。
26.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少99％。
27.權(quán)利要求1所述的方法，其中的D對(duì)映體占所施用的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少99.5％。
28.藥物組合物，含有明顯富集的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的D對(duì)映體(D-DFMO)或其類似物以及可藥用載體。
29.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其配制成用于向患者給藥的單位劑量。
30.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其配制成選自下列的劑型快速釋放、定時(shí)釋放、延遲釋放、持續(xù)釋放、口服混懸液、片劑、膠囊、散劑、錠劑、栓劑、脂質(zhì)體、納米顆粒、吸入劑、鼻用溶液、眼用溶液、耳用溶液、沖洗液、靜脈內(nèi)混合物、表皮或經(jīng)皮溶液、口含片、糖漿、霜?jiǎng)?、軟膏、洗劑、凝膠、乳劑、酏劑、灌洗液、灌腸劑、含漱劑、植入劑和氣霧劑。
31.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少60％。
32.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少70％。
33.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少80％。
34.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少90％。
35.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少95％。
36.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少97.5％。
37.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少99％。
38.權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中的D對(duì)映體占全部二氟甲基鳥(niǎo)氨酸或其類似物重量的至少99.5％。
全文摘要
本發(fā)明涉及在患者中預(yù)防和/或治療癌癥的方法，該方法包括向患者施用有效量的明顯富集的二氟甲基鳥(niǎo)氨酸的D對(duì)映體(D－DFMO)或D－DFMO的類似物。將D－DFMO或其類似物以大約0.05至約20.0gm/m
文檔編號(hào)A61K9/20GK1447686SQ01809107
公開(kāi)日2003年10月8日 申請(qǐng)日期2001年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月7日
發(fā)明者C·萊文森, Z·沙克德 申請(qǐng)人:伊萊克斯腫瘤學(xué)公司