專利名稱：用于治療帕金森病的包括l－dopa腎細(xì)胞轉(zhuǎn)移阻斷劑的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療帕金森病的組合物。本發(fā)明特別涉及L-DOPA腎細(xì)胞外移的阻斷劑作為所述組合物成分的用途。
帕金森病(PD)是一種病因不明的慢性神經(jīng)變性疾病，它在很大程度上影響源于黑質(zhì)(Substantia Nigra)并投射到紋狀體(striatum)的腦多巴胺能神經(jīng)元。在臨床上PD患者表現(xiàn)出逐步遞增的運(yùn)動(dòng)異常，這種異常更常見的是表現(xiàn)為震顫、強(qiáng)直和步態(tài)異常。此時(shí)對其給予腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺前體L-DOPA加卡比多巴或芐絲肼，患有PD的受治療者表現(xiàn)出相當(dāng)程度的運(yùn)動(dòng)改進(jìn)。后兩種化合物是外周芳香L-氨基酸脫羧酶(AADC)的有效抑制劑且其給藥意圖阻止外周組織中L-DOPA轉(zhuǎn)化成多巴胺，由此防止了與外周器官(心血管和胃腸道)中與多巴胺作用相關(guān)的不良作用發(fā)生。對外周AADC的抑制還伴隨有L-DOPA生物利用度的提高，這一結(jié)果導(dǎo)致未受影響的腦多巴胺能神經(jīng)元中更有效地補(bǔ)充了多巴胺儲(chǔ)存量。
然而，L-DOPA相對短的半衰期限制了對PD患者的維持治療，從而要求給予多劑量的L-DOPA。由于這類原因，目前已經(jīng)利用了L-DOPA的緩釋制劑以便產(chǎn)生更為持久的運(yùn)動(dòng)改善并減少每天給藥的次數(shù)。這種策略的成功性仍然有限，因?yàn)檠h(huán)的L-DOPA迅速排泄入尿，這種消除途徑占主要重要的地位。盡管尿中出現(xiàn)的大部分L-DOPA來源于濾過形式的L-DOPA，但是已知相當(dāng)數(shù)量濾過的L-DOPA通過鈉依賴性和鈉非依賴性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白經(jīng)腎單位被重新吸收；以近端小管水平吸收的L-DOPA易于被轉(zhuǎn)化成多巴胺。在給予L-DOPA+AADC抑制劑的PD患者中，L-DOPA在腎的近端小管內(nèi)轉(zhuǎn)化成多巴胺的過程被阻斷且認(rèn)為大部分胞內(nèi)L-DOPA通過頂端細(xì)胞邊緣離開細(xì)胞這是載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，對它的抑制可以導(dǎo)致L-DOPA在胞內(nèi)區(qū)室中顯著累積。
發(fā)現(xiàn)這種腎小管L-DOPA外移系統(tǒng)對環(huán)孢菌素A敏感(Pestana等，1995，《英國藥理學(xué)雜志》(Br.J.Pharmacol.)115，1349-1358)且進(jìn)一步的證據(jù)提示P-糖蛋白與L-DOPA的外移有關(guān)(Soares-da-Silva等，1998，《英國藥理學(xué)雜志》(Br.J.Pharmacol.)123，13-22；Soares-da-Silva & Serro，2000，《藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)療法雜志》(J.Pharmacol.Exp.Ther.)293，697-704)。因?yàn)橛肔-DOPA治療PD中的主要難題與其較短的半衰期和下降的生物利用度有關(guān)(Cederbaum，1989，《臨床神經(jīng)藥理學(xué)》(Clin.Neuropharmacol.)12，147-166；Koller & Tolosa，1998，《神經(jīng)病學(xué)》(Neurology)50(增刊6)，S1-S48)，所以認(rèn)為腎小管L-DOPA頂端外移的抑制劑(促進(jìn)其腎排泄)可能會(huì)減少其在尿中消除并提高生物利用度。這一結(jié)果可能有利于L-DOPA從腎小管上皮運(yùn)動(dòng)至腎條間部且然后返回循環(huán)。令人遺憾的是，可以證實(shí)有益于提高L-DOPA在PD患者體內(nèi)的生物利用度的大部分P-糖蛋白抑制劑是眾所周知的細(xì)胞毒性劑或如果沒有毒性則產(chǎn)生對P-糖蛋白抑制作用所需的濃度在體內(nèi)條件下不實(shí)用。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于治療PD的組合物，它包括能夠減少L-DOPA腎排泄的化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供至少一種所述的化合物在制備用于通過與L-DOPA依次或同時(shí)給藥來治療PD的藥劑中的用途。
因此，本發(fā)明提供了待批權(quán)利要求中所述的用于治療帕金森病的組合物。
本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了待批權(quán)利要求中所述的至少一種L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑在制備用于通過依次或同時(shí)與L-DOPA聯(lián)合給藥來治療帕金森病或運(yùn)動(dòng)障礙的藥劑中的用途。本發(fā)明還提供了待批權(quán)利要求中所述的包括至少一種這類阻斷劑化合物與L-DOPA的組合物在制備用于治療帕金森病的藥劑中的用途。
本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了至少一種L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑與L-DOPA的組合用于待批權(quán)利要求中所述的療法的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種帕金森病的治療方法，該方法包括根據(jù)哺乳動(dòng)物種類對這類治療的需要對其依次或同時(shí)與L-DOPA聯(lián)合給予治療有效量的L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷性化合物的步驟。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種控制帕金森病患者運(yùn)動(dòng)的方法，其中給予治療有效量的L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷性化合物以便提高依次或同時(shí)給予的L-DOPA在大腦中的生物利用度并控制運(yùn)動(dòng)。
本發(fā)明中所述的阻斷性化合物選自待批權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的那些化合物。
本發(fā)明還在另一個(gè)方面中提供了一種既能增加所給予的L-DOPA在哺乳動(dòng)物種類體內(nèi)的循環(huán)水平又能提高大腦對L-DOPA的生物利用度的方法，該方法包括對所述的種類依次或同時(shí)與L-DOPA聯(lián)合給予有效量的至少一種如上所述的阻斷性化合物。
除抑制腎小管L-DOPA頂端外移外，本文所述的阻斷性化合物還同時(shí)抑制了外周AADC。這些化合物增加了所給予的L-DOPA在血漿中的循環(huán)水平、抑制了外周中的AADC并提高了大腦對所給予的L-DOPA的生物利用度。
本發(fā)明的方法優(yōu)選進(jìn)一步包括與其它活性化合物依次或同時(shí)給予已知的AADC抑制劑(諸如芐絲肼或卡比多巴)或兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(諸如恩他卡朋或托卡朋)的步驟。此外，將藥物上可接受的惰性載體與所述的活性化合物混合。所述的藥物上可接受的載體可以是固體或液體。固體劑型包括粉劑、片劑、可分散的顆粒和膠囊。固體載體可以是一種或多種還可以起稀釋劑、調(diào)味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑或片劑崩解劑作用的物質(zhì)；它也可以是一種包囊材料。
優(yōu)選所述的藥物制劑是單位劑型，例如包裝制劑，這種包裝包含諸如包裝片劑、膠囊和包裝在小瓶或安瓿中的粉劑這樣的可分散量的制劑。
所述的劑量取決于患者的需求、疾病的嚴(yán)重程度和所用的特定化合物。為方便起見，可以在全天內(nèi)分次或分部分給予總每日劑量。對特定患者確定合適的劑量屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的范圍，但就所述的阻斷性化合物的情況而言，優(yōu)選的范圍約為40μg-約30,000μg/kg/治療。
現(xiàn)在僅通過實(shí)施例并參照附圖來更具體地描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中附

圖1是表示測試化合物對L-DOPA在37℃下與2.5μM的底物(L-DOPA)一起保溫6分鐘的LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)累積的作用的示意圖。
附圖2是表示測試化合物對L-DOPA在37℃下與25μM從基底細(xì)胞邊緣施加的底物(L-DOPA)一起保溫6分鐘的LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)的頂端流量(附圖2a)和細(xì)胞累積(附圖2b)的作用的一對示意圖。
附圖3是表示測試化合物對L-DOPA在37℃下與250μM的底物(L-DOPA)一起保溫6分鐘的LLC-PK1細(xì)胞內(nèi)脫羧化的作用的示意圖。
附圖4是表示增加濃度的芐絲肼對在Vmax條件(5mM L-DOPA；15分鐘保溫)中測定的大腦、肝臟和腎臟芳香L-氨基酸脫羧酶(AADC)活性的作用的示意圖。
附圖5是表示白藜蘆醇對給予L-DOPA(12mg/kg)+芐絲肼(3mg/kg)和白藜蘆醇的大鼠血漿內(nèi)L-DOPA水平的作用的示意圖。
材料和方法體外研究細(xì)胞培養(yǎng)物L(fēng)LC-PK1細(xì)胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection)(Rockville，MD)，它是一種保持了培養(yǎng)物中近端腎小管上皮細(xì)胞的幾種特性的來源于豬的近端腎小管上皮細(xì)胞系。將LLC-PK1(ATCC CRL 1392；第198-206代)維持在37℃、5％CO2-95％空氣的濕潤氣體下在補(bǔ)充了100U/mL青霉素G、0.25μg/mL兩性霉素B、100μg/mL鏈霉素(Sigma)、3％胎牛血清(Sigma)和25mM N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES；Sigma)的培養(yǎng)基199(Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo，USA)中生長。為了進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用0.05％胰蛋白酶-EDTA使細(xì)胞解離、按1∶4分裂并在含有75-或162-cm2生長區(qū)的Costar燒瓶(Costar，Badhoevedorp，The Netherlands)中傳代培養(yǎng)。為了進(jìn)行攝取研究，以40,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種在膠原蛋白處理的24孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)(內(nèi)徑為16mm，Costar)或以13,000個(gè)細(xì)胞/孔(2.0×104個(gè)細(xì)胞cm2)的密度接種在膠原蛋白處理的0.2μm聚碳酸酯濾膜支持物(內(nèi)徑12mm Transwell，Costar)上。將細(xì)胞培養(yǎng)基每2天更換一次且細(xì)胞在3-5天的孵育后達(dá)到融合。在每次實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，使細(xì)胞培養(yǎng)基不含胎牛血清。一般在細(xì)胞達(dá)到融合后2-3天和在最初接種后6-8天且每cm2含有約80μg的細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。LLC-PK1細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)研究在實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，抽吸生長培養(yǎng)基并用Hanks’培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，此后，在37℃下將細(xì)胞單層在Hank’s培養(yǎng)基中預(yù)保溫15分鐘。Hanks’培養(yǎng)基含有下列組成(mM)NaCl 137、KCl 5、MgSO40.8、Na2HPO40.33、KH2PO40.44、CaCl20.25、MgCl21.0、Tris HCl 0.15和丁酸鈉1.0、pH＝7.4。該保溫培養(yǎng)物中還含有芐絲肼(1μM)和托卡朋(1μM)以便分別抑制酶AADC和兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行時(shí)程研究，其中將細(xì)胞與0.5μM底物一起保溫1、3、6和12分鐘。使用增加濃度L-DOPA(2.5到250μM)在保溫6分鐘的細(xì)胞中進(jìn)行飽和實(shí)驗(yàn)。僅從頂端施加測試物質(zhì)并使其在預(yù)保溫和保溫期限過程中存在。在預(yù)保溫和保溫過程中，將細(xì)胞持續(xù)振搖并維持在37℃下。通過添加2ml含有指定濃度的底物的Hanks’培養(yǎng)基來啟動(dòng)頂端攝取。通過用與巴氏吸管連接的真空泵快速除去攝取溶液、隨后用冷Hanks’培養(yǎng)基快速洗滌并添加250μL的0.2mM高氯酸來終止攝取。將酸化的樣品儲(chǔ)存在4℃下，此后將其注入高壓液相層析儀以檢測L-DOPA。
上述研究已經(jīng)證實(shí)在LLC-PK1細(xì)胞中累積的某些L-DOPA可以通過頂端外部轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白脫離開細(xì)胞(Soares-da-Silva等，1998，《英國藥理學(xué)雜志》(Br.J.Pharmacol.)123，13-22)。因此，在設(shè)計(jì)研究增加L-DOPA的胞內(nèi)累積的藥物的作用的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與從基底細(xì)胞邊緣施加的25μM L-DOPA一起保溫并在6分鐘內(nèi)測定攝取量(在細(xì)胞單層中的累積量)和流量(轉(zhuǎn)入對側(cè)室內(nèi)的量)。僅從頂端施加測試藥物并使其在預(yù)保溫和保溫過程中存在。在保溫結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞置于冰上并收集冰浴頂端細(xì)胞邊緣的培養(yǎng)基、將其用高氯酸酸化且保存在4℃下至檢測L-DOPA時(shí)為止。將細(xì)胞用冰冷的Hanks’培養(yǎng)基洗滌且分別在上部室和下部室內(nèi)添加0.2mM高氯酸(100μl)和500μl；將酸化的樣品保存在4℃下，此后轉(zhuǎn)入高壓液相層析儀以檢測L-DOPA。脫羧化研究在實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天，抽吸生長培養(yǎng)基并用Hanks’培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞(LLC-PK1)，此后，在37℃下將細(xì)胞單層在Hanks’培養(yǎng)基中預(yù)保溫15分鐘。Hanks’培養(yǎng)基含有下列組成(mM)NaCl 137、KCl 5、MgSO40.8、Na2HPO40.33、KH2PO40.44、CaCl20.25、MgCl21.0、Tris HCl 0.15和丁酸鈉1.0、pH＝7.4。該保溫培養(yǎng)基中還含有磷酸吡哆醛(120μM)、托卡朋(1μM)和帕吉林(100μM)。使用增加濃度的L-DOPA(2.5到250μM)對保溫6分鐘的細(xì)胞中進(jìn)行飽和實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)用于研究測試化合物對L-DOPA的脫羧化的作用的實(shí)驗(yàn)中，在有測試的化合物存在的情況下將細(xì)胞預(yù)保溫30分鐘。在預(yù)保溫后，在含有250μM L-DOPA的Hanks’培養(yǎng)基中將細(xì)胞保溫6分鐘。通過添加250μl的0.2mM高氯酸終止該反應(yīng)。將酸化的樣品保存在4℃下，此后轉(zhuǎn)入高壓液相層析儀以檢測多巴胺。細(xì)胞存活力在37℃下將塑料支持物中培養(yǎng)的細(xì)胞預(yù)保溫15分鐘且然后在沒有或有L-DOPA和測試化合物存在的情況下進(jìn)一步保溫6分鐘。隨后在37℃下將細(xì)胞與錐蟲藍(lán)(0.2％w/v)在磷酸緩沖液中保溫2分鐘。通過用Hanks’培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗2次來中止保溫并使用Leica顯微鏡檢查細(xì)胞。在這些條件下，有95％以上的細(xì)胞沒有染色。體內(nèi)研究這些實(shí)驗(yàn)用于評價(jià)測試化合物對生物利用度和L-DOPA在腦中過程的作用。在全部實(shí)驗(yàn)中使用體重為170-280g、在可控環(huán)境條件(12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)和24℃的室溫)下保持2只/籠的雄性Wistar大鼠。在確定的間隔通過斷頭處死大鼠并摘除其大腦、肝臟和腎臟且用于測定L-DOPA、多巴胺和DOPAC。大鼠組織中AADC的檢測在某些實(shí)驗(yàn)中，如上所述在Vmax條件(5mM L-DOPA；15分鐘保溫)下測定大腦、肝臟和腎臟中的AADC活性(Soares-da-Silva等，1994，《英國藥理學(xué)雜志》(Br.J.Pharmacol.)112，611-615)。通過添加500μl的2M高氯酸終止該反應(yīng)并將制備物保存在4℃下60分鐘。然后將樣品離心(200g，2分鐘，4℃)并將500μl的在Spin-X濾管(Costar)上過濾的上清液等分部分用于多巴胺檢測。L-DOPA、多巴胺和胺代謝物的檢測通過如上述所報(bào)導(dǎo)的(Soares-da-Silva和Garrett，1990，《神經(jīng)藥理學(xué)》(Neuropharmacol.)29，869-874；Soares-da-Silva等，1998，《美國生理學(xué)雜志》(Am.J.Physiol.)274，F(xiàn)243-F251)帶有電化學(xué)檢測的高壓液相層析對L-DOPA、多巴胺和胺代謝物(DOPAC和HVA)進(jìn)行定量。高壓液相層析系統(tǒng)由與測壓組件(Gilson 802C型)連接的泵(Gilson 302型；GilsonMedical Electronics，Villiers Le Bel，F(xiàn)rance)和25cm長的不銹鋼5μmODS柱(Biophase；Bioanalytical System，West Lafayette，IN)組成；通過與Gilson稀釋儀(401型)連接的自動(dòng)樣品注射器(Gilson 231型)注射樣品。流動(dòng)相是脫氣的檸檬酸(0.1mM)、辛基硫酸鈉(0.5mM)、乙酸鈉(0.1M)、EDTA(0.17mM)、二丁胺(1mM)和甲醇(8％v/v)的溶液，用高氯酸(2M)將該流動(dòng)相調(diào)節(jié)至pH3.5并以1.0ml/分鐘的速率泵送。使用玻璃化碳(glassycarbon)電極、Ag/AgCl參比電極和電流檢測器(Gilson 141型)以電化學(xué)方式進(jìn)行檢測；檢測器單元在0.75V下起作用。使用Gilson 712 HPLC軟件監(jiān)測產(chǎn)生的電流。L-DOPA、多巴胺、DOPAC、3-MT和HVA的檢測下限在350-500fmol的范圍。數(shù)據(jù)分析根據(jù)使用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件包(Motulsky，P.Spannard，R.Neubig.GraphPad Prism(1.0版)，San Diego，USAGraphPad PrismSoftware Inc.，1994)的非線性回歸分析來計(jì)算如飽和實(shí)驗(yàn)中測定的L-DOPA攝取的Km和Vmax。
使用下列表達(dá)式計(jì)算頂端級分流出量L-DOPA頂端流量/(L-DOPA頂端流量+L-DOPA細(xì)胞)其中L-DOPA頂端流量表示到達(dá)頂端室的L-DOPA的量(以nmol/mg蛋白質(zhì)計(jì))，L-DOPA細(xì)胞(以nmol/mg蛋白質(zhì)計(jì))表示在細(xì)胞單層中累積的L-DOPA的量。
用S.E.M.表示算術(shù)平均值。通過變量單向(one-way)方差分析(ANOVA)、隨后使用進(jìn)行多重比較(multlple comparisons)的Newman-Keuls檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將P值小于0.05推斷為表示有顯著性差異。結(jié)果在時(shí)程實(shí)驗(yàn)中不飽和濃度(0.5μM)的L-DOPA的累積隨時(shí)間以線性方式增加了幾分鐘。在6分鐘保溫時(shí)，當(dāng)攝取量與時(shí)間呈線性關(guān)系且認(rèn)為胞內(nèi)水為7.0±0.7μL/mg蛋白質(zhì)(Soares-da-Silva等，1998，《美國生理學(xué)雜志》(Am.J.Physiol.)274，F(xiàn)243-F251)時(shí)，胞內(nèi)L-DOPA濃度在0.5μM的培養(yǎng)基濃度下為4.0±0.4μM。它代表了為相應(yīng)培養(yǎng)基濃度8.0±0.8倍的L-DOPA的細(xì)胞濃度。在用于測定L-DOPA頂端轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白動(dòng)力學(xué)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與增加濃度(1到250μM)的底物一起保溫6分鐘。對L-DOPA飽和曲線的非線性分析顯示Km值為47±8(以μM計(jì))且Vmax值(以pmol/mg蛋白質(zhì)/6分鐘)為3069±224。
為了評價(jià)對L-DOPA攝取量的代謝需求，在4℃下保溫細(xì)胞。在預(yù)保溫和保溫過程中使溫度從37℃下降至4℃的作用在于L-DOPA(2.5μM)的累積顯著減少(77±2％減少量)。
減少胞外鈉(從140mM到70、35和0mM)這一過程不會(huì)影響L-DOPA的累積。此外，在沒有胞外鈉(用等摩爾濃度的膽堿取代)的情況下，L-DOPA的Km值和Vmax值與在有鈉存在下觀察到的結(jié)果類似。N-(甲基氨基)-異丁酸(MeAIB)不會(huì)影響L-DOPA的攝取，而2-氨基二環(huán)(2，2，1)-庚烷-2-羧酸(BHC)對L-DOPA的攝取產(chǎn)生了濃度依賴性抑制作用(IC50＝407μM)。1mM BHC對L-DOPA累積的抑制作用屬于競爭型，正如通過用于L-DOPA攝取的Km值增加(130±19μM)、而Vmax值沒有增加(3783±244pmoL/mg蛋白質(zhì)/6分鐘)所證實(shí)的。這些結(jié)果共同提示L-DOPA的頂端內(nèi)移可以通過BHC-敏感性和鈉依賴性L-型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而得到促進(jìn)(Audus和Borchardt，1986，《神經(jīng)化學(xué)雜志》(J.Neurochem.)47，484-488)。
發(fā)現(xiàn)L-DOPA腎細(xì)胞外移的阻斷劑以濃度依賴性方式增加L-DOPA的累積(2.5μM)，其中EC50為6-339μM(附圖1)。發(fā)現(xiàn)用測試化合物預(yù)處理細(xì)胞顯著增加了(P＜0.05)增加濃度的L-DOPA的最大累積量(Vmax)而沒有顯著改變Km值。
為了證實(shí)由測試化合物誘導(dǎo)的L-DOPA累積增加是由于胞內(nèi)(近期累積的)L-DOPA外移減少所導(dǎo)致的，將在聚碳酸酯濾膜上培養(yǎng)的細(xì)胞與從基底細(xì)胞邊緣施加的L-DOPA(25μM)一起保溫并測定L-DOPA的基底至頂端的流量(basal-to-apicalflux)。正如附圖2中所示，測試化合物顯著減少了L-DOPA的基底至頂端的流量而增加了L-DOPA在細(xì)胞中的累積，這一結(jié)果明確證實(shí)了它們作為L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑的作用。
將下面的一系列實(shí)驗(yàn)用于評價(jià)測試化合物對AADC的抑制功效。為了這一目的，將LLC-PK1細(xì)胞與增加濃度的測試化合物或芐絲肼一起預(yù)保溫30分鐘；此后將細(xì)胞與接近飽和濃度的L-DOPA(250μM)一起保溫。正如附圖3中所示，發(fā)現(xiàn)測試化合物以濃度依賴性方式抑制了AADC活性，正如通過L-DOPA轉(zhuǎn)化成多巴胺所測定的。IC50變化范圍為從0.07μM(芐絲肼)到393μM(功效較低)。
在體內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，通過口服途徑給予大鼠測試化合物，此后給予L-DOPA或L-DOPA+芐絲肼。由于高劑量的芐絲肼可以導(dǎo)致大腦中的AADC抑制(Da Prada等，1987，《歐洲神經(jīng)病學(xué)》(Eur.Neurol.)27，9-20)，所以進(jìn)行前期臨床實(shí)驗(yàn)以便測定不影響大腦中AADC活性的芐絲肼的劑量。
正如附圖4中所示，缺乏對大腦AADC作用的對肝臟和腎臟AADC產(chǎn)生最大抑制作用的芐絲肼(benserazide)的劑量為3mg/kg芐絲肼，它與來自其它實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)完全一致(Da Prada等，1987，《歐洲神經(jīng)病學(xué)》(Eur.Neurol.)27，9-20)。為了符合在人體體內(nèi)通常使用的L-DOPA/芐絲肼的比例(4∶1之比)，將所用的L-DOPA的劑量設(shè)定為12mg/kg。
在給予L-DOPA(12mg/kg)+芐絲肼(3mg/kg)前30分鐘，經(jīng)口服對非麻醉大鼠給予白藜蘆醇時(shí)，結(jié)果是在大腦中L-DOPA、多巴胺和胺代謝物的組織水平顯著增加(表1)。伴隨這些作用有L-DOPA的血漿水平增加(附圖5)和L-DOPA和多巴胺在腎臟中的組織水平增加?？赡艿那闆r是白藜蘆醇的AADC抑制作用不會(huì)在很大程度上導(dǎo)致L-DOPA的生物利用度提高。首先，給予測試白藜蘆醇的大鼠腎臟中的多巴胺水平高于相應(yīng)的對照組(給予L-DOPA+芐絲肼的大鼠)。其次，30mg/kg白藜蘆醇對肝臟和腎臟AADC活性的抑制作用(肝臟降低48％；腎臟降低38％)顯著低于對芐絲肼所觀察到的結(jié)果(附圖4)。
上述數(shù)據(jù)共同證明L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑使得L-DOPA在血漿中存在高劑量水平并提高了它在大腦中的生物利用度。表1.在給予載體(0.5％羧甲基纖維素，4ml/kg)、L-DOPA(L，12mg/kg)、L-DOPA(L，12mg/kg)+芐絲肼(B，3mg/kg)和白藜蘆醇(R)+L-DOPA(L，12mg/kg)+芐絲肼(B，3mg/kg)后L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺(DA)、3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)在大腦和腎臟中的水平。在給予L-DOPA+芐絲肼前30分鐘給予白藜蘆醇，在給予L-DOPA+芐絲肼后60分鐘處死大鼠。
與在用L-DOPA(L，12mg/kg)+芐絲肼(B，3mg/kg)治療的大鼠的相應(yīng)的數(shù)值具有顯著性差異(*P＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種用于治療帕金森病的組合物，該組合物包括L-DOPA和至少一種選自苯基苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)的用于阻斷L-DOPA腎細(xì)胞外移的化合物，其提高了大腦對L-DOPA的生物利用度。
2.一種權(quán)利要求1的組合物，其中所述的苯基苯并吡喃衍生物包括一種類黃酮化合物。
3.一種權(quán)利要求2的組合物，其中所述的類黃酮化合物具有下列通式 其中基團(tuán)X相同或不同且選自H和OH；基團(tuán)Y相同或不同且選自H和OR，其中R代表H、CH3和CH2-Ph，包括相應(yīng)的3-C6H5(Y4)衍生物。
4.一種權(quán)利要求1的組合物，其中所述的反式-茋衍生物具有下列通式 其中基團(tuán)X相同或不同且是H或OH。
5.一種權(quán)利要求1的組合物，其中所述的阻斷劑化合物選自5，7-二羥基-2-(4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(金合歡素)；5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(芹菜配基)；5，6，7-三羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(黃岑苷元)；5，7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(白楊素)；([2R，3R])-2-[3，4-二羥基苯基]-3，4-二氫-1[2H]苯并吡喃-3，5，7-三醇((-)-表兒茶素)；2-(3，4-二羥基苯基)-3，7-二羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(黃顏木素)；5，7-二羥基-3-(4-羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(染料木黃酮)；3，5，7-三羥基-2-(4-羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(莰非醇)；2-(2，4-二羥基苯基)-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(桑色素)；3，5，7-三羥基-2-(3，4，5-三羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(楊梅黃酮)；3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)；2-(3，4-二羥基苯基)-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(櫟精)；2-(3，4-二羥基苯基)-3，5，6，7-四羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(六羥黃酮)；4’-芐氧基-3’，5’-二甲氧基-3，5，7-三羥基黃酮；3，7-二羥基-3’，4’，5’-三甲氧基黃酮；3’，4’，7，8-四羥基黃酮；3，5，7-三羥基-3’，4’，5’-三甲氧基黃酮；3，3’，4，5’-四羥基-反式-茋(云杉丹寧酚)；反式-4-苯乙烯基苯酚；和3，4’，5-三羥基-反式-茋(白藜蘆醇)。
6.權(quán)利要求1、4或5中任意一項(xiàng)的組合物，其中所述的阻斷劑化合物是白藜蘆醇。
7.上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，其進(jìn)一步包括氨基酸脫羧酶抑制劑和/或兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
8.一種權(quán)利要求7的組合物，其中所述的氨基酸脫羧酶抑制劑包括芐絲肼或卡比多巴，且所述的兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括恩他卡朋或托卡朋。
9.上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物，該組合物進(jìn)一步包括藥物上可接受的惰性賦形劑。
10.上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的組合物在制備用于治療任何形式的帕金森病或預(yù)防其惡化的藥劑中的用途。
11.至少一種選自苯基苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)的L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑，其與L-DOPA聯(lián)合通過依次或同時(shí)給藥用于治療。
12.權(quán)利要求11的至少一種阻斷劑化合物，其中所述的至少一種阻斷劑化合物選自權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的化合物。
13.至少一種選自苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)的L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑在制備用于通過依次或同時(shí)與L-DOPA一起給藥來治療任何形式的帕金森病或預(yù)防其惡化的藥劑中的用途。
14.至少一種選自苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)的L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷劑在制備用于通過改變黑質(zhì)紋狀體途徑的網(wǎng)狀多巴胺能活性并通過依次或同時(shí)與L-DOPA一起給藥來治療運(yùn)動(dòng)障礙的藥劑中的用途。
15.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14的用途，其中所述的至少一種阻斷劑化合物選自權(quán)利要求2-6中任意一項(xiàng)所述的那些化合物。
16.權(quán)利要求13-15中任意一項(xiàng)的用途，其中所述的阻斷劑化合物的使用量為提供每劑約40-約30,000μg/kg/的用量。
17.權(quán)利要求13-16中任意一項(xiàng)的用途，其中所述的治療包括同時(shí)或依次給予氨基酸脫羧酶抑制劑或兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述的脫羧酶抑制劑包括芐絲肼或卡比多巴且所述的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括恩他卡朋或托卡朋。
19.至少一種選自權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的那些化合物的阻斷劑化合物在制備用于通過依次或同時(shí)給予的L-DOPA阻斷外周脫羧化來治療帕金森病的藥劑中的用途。
20.一種帕金森病的治療方法，該方法包括根據(jù)受治療者對這類治療的需要對其依次或同時(shí)與L-DOPA聯(lián)合給予治療有效量的至少一種L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷性化合物，所述的阻斷性化合物選自苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)。
21.一種通過改變黑質(zhì)紋狀體途徑的網(wǎng)狀多巴胺能活性來控制運(yùn)動(dòng)障礙的方法，該方法包括對需要這類控制的依次或同時(shí)與L-DOPA聯(lián)合給予治療有效量的至少一種L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷性化合物的步驟，所述化合物選自苯基苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)。
22.一種增加所給予的L-DOPA在受治療者體內(nèi)的循環(huán)水平的方法，該方法包括對所述的受治療者給予有效量的至少一種L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷性化合物，所述的化合物選自苯基苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)。
23.一種提高所給予的L-DOPA在受治療者大腦內(nèi)的生物利用度的方法，該方法包括對所述的受治療者給予有效量的至少一種L-DOPA腎細(xì)胞外移阻斷性化合物的步驟，所述的化合物選自苯基苯并吡喃衍生物、反式-茋衍生物或3-(4-羥基苯基)-1-(2，4，6-三羥基苯基)-1-丙酮(根皮素)。
24.權(quán)利要求20-23中任意一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括給予芳香L-氨基酸脫羧酶抑制劑或兒茶酚-o-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療帕金森病的藥物組合物，它包括L－DOPA和至少一種能夠阻斷L－DOPA腎細(xì)胞外移途徑的化合物；所述的阻斷性化合物選自(a)類黃酮苯基苯并吡喃衍生物；(b)反式－芪衍生物；或(c)根皮素[3－(4－羥基苯基)－1－(2，4，6－三羥基苯基)－1－丙酮]。該組合物還可以包括諸如卡比多巴或芐絲肼這樣的氨基酸脫羧酶(AADC)抑制劑和/或諸如恩他卡朋或托卡朋這樣的兒茶酚－O－甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)抑制劑。優(yōu)選以固體形式給予該組合物且可以將L－DOPA與阻斷L－DOPA腎細(xì)胞外移的化合物同時(shí)或與之依次給藥。
文檔編號(hào)A61P25/16GK1429109SQ01809375
公開日2003年7月9日 申請日期2001年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月14日
發(fā)明者帕特里齊奧·索雷斯－達(dá)－西爾瓦 申請人:波特拉和康潘希亞股份有限公司