專利名稱：粉末組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗組合物。更具體而言，本發(fā)明涉及適于由無(wú)針注射器透皮顆粒給藥的疫苗組合物。
背景技術(shù)：
使藥劑進(jìn)入并穿過皮膚表面的給藥方式(透皮給藥)，比通過口腔或非經(jīng)腸的給藥方式具有諸多優(yōu)點(diǎn)。具體而言，透皮給藥方式是傳統(tǒng)給藥方式的安全、方便且無(wú)感染的替代方式，它方便地避免了口服給藥所帶來(lái)的主要問題(例如，吸附率和新陳代謝率的不確定、對(duì)胃腸道的刺激和/或藥物的苦味或不愉快的味道)或非經(jīng)腸給藥所帶來(lái)的主要問題(例如，針頭的刺痛、對(duì)患者造成感染的危險(xiǎn)、當(dāng)醫(yī)務(wù)工作者不小心被針頭刺到時(shí)受到感染或傳染的危險(xiǎn)，以及廢棄針頭的處置)。
然而，盡管透皮給藥具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，但是它也有許多固有的相關(guān)問題。在不損傷皮膚的條件下被動(dòng)給藥，當(dāng)然必須使分子穿過許多結(jié)構(gòu)不同的組織，這類組織包括角質(zhì)層、活的表皮、真皮乳頭以及毛細(xì)血管壁，從而使藥物進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)。因此，透皮給藥方式必須克服各類組織所形成的障礙。
基于上述原因，人們已經(jīng)開發(fā)出了被動(dòng)透皮給藥的多種替代方法。這些替代方法包括采用增強(qiáng)了對(duì)皮膚的穿透力的藥劑即“滲透增強(qiáng)劑”，用來(lái)增加對(duì)皮膚的滲透力，以及非化學(xué)方法如離子電滲療法、電穿孔法或超聲波法。然而，這些替代方法通常都會(huì)帶來(lái)它們所特有的副作用，如皮膚發(fā)炎或過敏。所以，那些可用傳統(tǒng)的透皮給藥方法安全而有效地施用的藥劑的范圍仍然是有限的。
最近，有人報(bào)道了一種新的透皮給藥裝置，該裝置能夠采用無(wú)針注射器將粉末(即，含藥物的固體顆粒)按一定劑量注入并穿過皮膚，而不損傷皮膚。具體地說(shuō)，共同權(quán)利人Bellhouse等的美國(guó)專利No.5,630,796描述了一種無(wú)針注射器，該注射器用超聲波氣流負(fù)載藥物顆粒的方式給藥。無(wú)針注射器的用途有透皮輸送粉狀的藥物化合物和組合物；輸送遺傳物質(zhì)進(jìn)入活的細(xì)胞(如基因療法)；以及輸送生物藥劑進(jìn)入皮膚、肌肉、血液或淋巴系統(tǒng)。外科手術(shù)中也可采用無(wú)針注射器來(lái)輸送藥物和生物制劑到器官表面、硬化的腫瘤和/或手術(shù)空腔(如腫瘤切除后留下的腫瘤床或腫瘤空腔)。從理論上講，事實(shí)上，任何可被制成實(shí)心固體顆粒形式的藥劑均可采用這類裝置安全而方便地給藥。
在藥物領(lǐng)域中，可采用此種新式裝置給藥的疫苗組合物尤其受到人們的注意。適當(dāng)?shù)囊呙绨切┖斜畸}佐劑吸附的抗原的疫苗。這類組合物在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的(例如，見美國(guó)專利No.5,902,565)，而且由于佐劑增強(qiáng)了疫苗的免疫原性，所以這類組合物是有利的。
然而，佐劑疫苗的貯存和運(yùn)輸存在問題。含有鹽佐劑的商品疫苗組合物不可冷凍，以避免對(duì)疫苗造成損害。而且，目前常用的疫苗貯存技術(shù)之一凍干也不能用于含鹽佐劑的組合物。此前的研究表明，凍干會(huì)導(dǎo)致疫苗組合物的凝膠結(jié)構(gòu)坍塌，從而導(dǎo)致在水中再懸浮時(shí)佐劑鹽的凝聚和沉淀(Warren等，1986，免疫年鑒(Annu.Rev.Immunol.)4369-388頁(yè)；Alving等，紐約科學(xué)院年鑒(Ann.N.Y.Acad.Sci.)690265-275頁(yè))。據(jù)信這是由于組合物中所含的水分冷凍結(jié)晶為大的晶體，于是溶質(zhì)集中在某些特定區(qū)域，即所謂的冷凍凝集區(qū)。在冷凍凝集區(qū)中，佐劑鹽顆粒靠得非常近，以致克服了它們之間的排斥力，于是形成了凝聚物。該鹽一旦凝聚，就不能復(fù)原為初始的懸浮液。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凝聚顯著地降低了疫苗的免疫原性。有報(bào)道顯示，將凍干的被明礬吸附的乙肝表面抗原(HBsAg)在4℃下貯存2年，該抗原完全失去了免疫原性(Diminsky等，疫苗(Vaccine)，183-17頁(yè))。
因此需要貯存佐劑疫苗組合物的替代方法，目的是要解決因凍干而產(chǎn)生的凝聚問題，并能最大程度地保持免疫原性。無(wú)論對(duì)于上述新的透皮給藥裝置，還是對(duì)于傳統(tǒng)的免疫技術(shù)的應(yīng)用，延長(zhǎng)疫苗的貯存時(shí)間都具有重要意義。因此，提供可以取代凍干的有效方法具有重要的商業(yè)價(jià)值。此外，還希望將疫苗制備成適于無(wú)針注射的形式。無(wú)針注射技術(shù)要求疫苗組合物為粉狀，每一顆粒都具有適于透皮給藥的粒度和強(qiáng)度，而且在再懸浮時(shí)該疫苗組合物可形成凝膠。
此前的報(bào)道稱，傳統(tǒng)凍干方法的取代技術(shù)包括在疫苗組合物中加入助劑來(lái)增加明礬佐劑的穩(wěn)定性。美國(guó)專利No.4,578,270描述了加入大量葡聚糖和蛋白質(zhì)來(lái)部分保持鋁凝膠的結(jié)構(gòu)。然而，所加入的大量蛋白質(zhì)會(huì)從鋁膠體中置換出疫苗抗原，而且在多數(shù)情況下是致免疫的，從而可能會(huì)掩蓋疫苗抗原的免疫反應(yīng)。
EP-B-0130619也涉及給凍干即冷凍干燥的疫苗制劑加入穩(wěn)定劑。該專利描述了凍干的乙肝疫苗制劑，該制劑含有吸附了鋁凝膠和穩(wěn)定劑的、滅活性的純凈乙肝病毒表面抗原。所述穩(wěn)定劑由至少一種氨基酸或其鹽、至少一種糖和至少一種膠體物質(zhì)組成。該專利采用了很低濃度的鋁鹽佐劑，典型地低于0.1％重量。然而，該文獻(xiàn)僅涉及乙肝疫苗，而沒有公開通用的非特異性免疫的方法。
美國(guó)專利No.5,902,565公開了含有被鋁鹽吸附的免疫原的噴霧干燥的疫苗制劑。該專利描述了即釋制劑，將被鋁鹽吸附的免疫原的水懸浮液經(jīng)噴霧干燥來(lái)制備該制劑。在其唯一的實(shí)施例1中給出了這方面的信息，所得到的微球粒徑約為3μm。根據(jù)美國(guó)專利No.5,902,565，在噴霧干燥過程中，甚至在沒有任何其他可產(chǎn)生穩(wěn)定作用的物質(zhì)(除最少量的疫苗抗原外，該最少量典型地為1-10μg/ml)存在的條件下，鋁膠體完全保留了其膠體形成特性。據(jù)說(shuō)，給噴霧干燥的粉末加水可立即形成一種典型的膠體，該膠體的沉淀特性與起始物質(zhì)相似。

發(fā)明內(nèi)容
我們研究了是否真的如美國(guó)專利No.5,902,565所述，能形成可形成凝膠體的鋁鹽噴霧干燥粉末。我們發(fā)現(xiàn)，將氫氧化鋁或磷酸鋁的水懸浮液噴霧干燥得到了粉末，該粉末中的鋁鹽的亞微細(xì)顆粒凝集成較大的顆粒。通過將該粉末復(fù)水，這些較大的顆粒不能解離為小顆粒，不能形成凝膠體懸浮液。相反，氫氧化鋁或磷酸鋁的凝集顆粒從懸浮液中沉淀出來(lái)了。
通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用鋁鹽與其他特定的藥劑結(jié)合時(shí)，可以通過噴霧干燥形成適當(dāng)?shù)姆勰?。此外，需要將鋁鹽與其他藥劑按一定比例使用。我們還發(fā)現(xiàn)，具體干燥方法的采用對(duì)于佐劑鹽的凝聚程度具有顯著影響。通過這些研究我們發(fā)現(xiàn)，將明礬佐劑疫苗組合物噴霧凍干可得到適用于無(wú)針注射的粉末，該粉末在復(fù)水時(shí)可基本上保持膠體結(jié)構(gòu)。
該噴霧凍干法包括將懸浮的疫苗組合物噴霧到液氮中的步驟。該方法有兩方面的重要作用首先，液氮作為導(dǎo)熱劑使懸浮液迅速冷凍；其次，霧化減少了每一個(gè)冷凍液滴的體積，進(jìn)而增加了冷凍速率。這兩方面的作用促使懸浮液的微小液滴迅速冷凍，并且形成了固態(tài)的小冰晶。因而，與普通的凍干技術(shù)相比，冷凍凝集區(qū)的尺寸顯著地減小了。由于顆粒的冷凍非常迅速且其顆粒的粒徑較小，故所形成的粉末中的佐劑很少凝聚或沒有凝聚。
于是，本發(fā)明提供了簡(jiǎn)單而有效的疫苗組合物粉末的制備技術(shù)，該組合物含有鹽佐劑且適于長(zhǎng)期貯存。本發(fā)明的疫苗組合物在復(fù)水時(shí)基本上沒有出現(xiàn)凝聚，從而基本上保持了其免疫原性。該組合物還具有確定的粒徑、密度和機(jī)械特性，這些特性的綜合使得該粉末適于通過無(wú)針注射透皮給藥。
本發(fā)明另一重要的優(yōu)點(diǎn)是，它適用于多種疫苗組合物，并可很好地適用于其他藥物組合物，尤其是在同樣遇到凝聚的問題時(shí)。我們目前發(fā)現(xiàn)，在佐劑疫苗組合物這一領(lǐng)域中，該噴霧凍干技術(shù)完全不受配方的影響。
于是，本發(fā)明提供了適于用作疫苗的粉末，所述粉末能夠形成凝膠體并可自由流動(dòng)，所述粉末是將含有如下組分的水懸浮液經(jīng)噴霧干燥或噴霧凍干而形成的(a)吸附了抗原的0.1-0.95％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(b)0.5-6％重量的糖；(c)0.1-2％重量的氨基酸或其鹽；和
(d)0.02-1％重量的膠體物質(zhì)。
這樣可制得適用于疫苗的自由流動(dòng)的粉末組合物。該組合物具有確定的顆粒尺寸、密度和機(jī)械特性，這些特性的綜合使得該粉末適于通過無(wú)針注射的透皮給藥。
本發(fā)明進(jìn)而提供了—適于用作疫苗的粉末的制備方法，所述粉末能夠形成凝膠體并可自由流動(dòng)，所述方法包括將含有如下組分的水懸浮液噴霧干燥或噴霧凍干的步驟(a)吸附了抗原的0.1-0.95％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(b)0.5-6％重量的糖；(c)0.1-2％重量的氨基酸或其鹽；和(d)0.02-1％重量的膠體物質(zhì)；—無(wú)針注射器的劑量容器，所述容器裝有有效量的本發(fā)明的粉末；—裝有本發(fā)明的粉末的無(wú)針注射器；—含有藥用載體或稀釋液以及本發(fā)明的粉末的疫苗組合物；—對(duì)受試者免疫的方法，該方法包括給所述受試者施用有效量的本發(fā)明的粉末；和—適于用作疫苗的能夠形成凝膠體的自由流動(dòng)的粉末，所述粉末含有(i)吸附了抗原的5-60％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(ii)25-90％重量的糖；(iii)4.5-40％重量的氨基酸或其鹽；和(iv)0.5-10％重量的膠體物質(zhì)。
此外，本發(fā)明提供了適于用作疫苗的粉末，所述粉末通過將水懸浮液噴霧凍干而得到，所述水懸浮液含有吸附了抗原的鋁鹽或鈣鹽佐劑。
本發(fā)明進(jìn)而提供了—適于用作疫苗的粉末的制備方法，所述方法包括將含有吸附了抗原的鋁鹽或鈣鹽佐劑的水懸浮液噴霧凍干的步驟；—無(wú)針注射器的劑量容器，所述容器裝有有效量的本發(fā)明的噴霧凍干的粉末；—裝有本發(fā)明的噴霧凍干的粉末的無(wú)針注射器；—含有藥用載體或稀釋液以及本發(fā)明的噴霧凍干的粉末的疫苗組合物；和—為受試者免疫的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的本發(fā)明的噴霧凍干的粉末。


圖1顯示吸附了HBsAg的明礬膠體在干燥前(i)后(ii)的粒度分布，干燥采用了噴霧凍干技術(shù)并經(jīng)過了復(fù)水。
圖2顯示另一吸附了HBsAg的明礬膠體在干燥前后的粒度分布，干燥采用了傳統(tǒng)的凍干方法。
圖3顯示采用注射了吸附有HBsAg的明礬疫苗的小鼠所進(jìn)行的免疫原性研究的結(jié)果，該明礬疫苗或者采用根據(jù)本發(fā)明的噴霧凍干(SFD)技術(shù)進(jìn)行干燥，或者采用凍干(FD)方法進(jìn)行干燥。將凍干的粉末篩分為不同粒徑的級(jí)分，然后檢測(cè)其免疫原性。檢測(cè)了明礬含量不同的兩種配方的噴霧凍干粉末。
圖4顯示三種不同的噴霧凍干粉末對(duì)小鼠的免疫原性，免疫方法為用針頭肌肉注射或者用粉末給藥裝置進(jìn)行表皮粉末免疫。
圖5顯示噴霧凍干的白喉-破傷風(fēng)類毒素疫苗對(duì)豚鼠的免疫原性。采用粉末給藥裝置將直徑為20-38μm和38-53μm的噴霧凍干粉末通過腹部皮膚給藥。
具體實(shí)施例方式
在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于所例舉的組合物或方法參數(shù)，當(dāng)然，因?yàn)樗鼈兪强梢宰兓?。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所采用的術(shù)語(yǔ)僅供描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
之用，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
本文的上下文所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，在此對(duì)其作了完整的引述以備參考。
必須注意，除非另有明確規(guī)定，本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書中所用的單數(shù)名詞均包括其復(fù)數(shù)。因此，例如提到“顆?！睍r(shí)，就包括兩個(gè)或更多的該顆粒，提到“賦形劑”時(shí)，就包括兩種或更多的此類賦形劑，等等。
A.定義除非另有約定，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)的含義均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。在本發(fā)明的實(shí)施中，盡管可采用與本文所述相似或相同的多種方法和材料，但本文描述了優(yōu)選的材料和方法。
在描述本發(fā)明時(shí)，將會(huì)用到下述詞語(yǔ)，其含義如下文所定義?！翱乖敝负幸粋€(gè)或多個(gè)抗原決定簇的分子，該抗原決定簇可激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性細(xì)胞抗原免疫反應(yīng)或體液抗體反應(yīng)。因此，抗原包括多肽、低聚糖/寡糖、多糖等，所述多肽包括抗原蛋白片段。此外，可由任何已知的病毒、細(xì)菌、寄生蟲、植物、原生動(dòng)物或真菌以及可以是所有有機(jī)體獲得抗原。該術(shù)語(yǔ)還包括腫瘤抗原。與此相似，抗原的定義也可包括例如用于DNA免疫應(yīng)用的表達(dá)抗原的寡核苷酸或多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)還包括合成抗原，例如多抗原決定簇、側(cè)抗原決定簇和其他重組體或合成衍生抗原(Bergmann等(1993)，歐洲免疫雜志(Eur.J.Immunol.)232777-2781；Bergmann等(1996)，免疫雜志(J.Immunol.)1573242-3249；Suhrbier，A(1997)，免疫和細(xì)胞生物學(xué)(Immunol.and CellBiol.)75402-408；Gardner等(1998)，第12屆世界愛滋病大會(huì)，瑞士日內(nèi)瓦，1998年6月28日-7月3日)。
本發(fā)明的吸附了抗原的一種或多種佐劑的結(jié)合，典型地與一種或多種附加物質(zhì)如載體、介質(zhì)和/或賦形劑相結(jié)合?！拜d體”、“介質(zhì)”和“賦形劑”通常指基本上是惰性的材料，這些材料無(wú)毒且不與組合物中的其他組分發(fā)生有害的反應(yīng)?？梢杂眠@些物質(zhì)來(lái)增加顆粒藥物組合物中固體的量。適當(dāng)?shù)妮d體的例子包括水、硅樹脂、明膠、蠟等材料。通常采用的“賦形劑”的例子包括藥品級(jí)的碳水化合物，這類碳水化合物包括單糖、二糖、環(huán)葡聚糖及多糖(例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、綿子糖、甘露醇、山梨醇、纖維醇、葡聚糖和麥芽糖-葡聚糖復(fù)合劑)；淀粉；纖維素；鹽(如磷酸鈉或磷酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂)；枸櫞酸；酒石酸；甘氨酸；高分子量的聚乙二醇(PEG)；普郎尼克類(Pluronics)；表面活性劑；以及上述物質(zhì)的結(jié)合。當(dāng)采用載體和/或賦形劑時(shí)，通常其用量為藥物組合物的約0.1-99wt％。
本文所用的“粉末”一詞指基本上由固體顆粒組成的組合物，該組合物可用無(wú)針注射器透皮給藥。組成該粉末的顆?？捎梢幌盗袇?shù)來(lái)表征，這些參數(shù)包括但不局限于平均顆粒尺寸、平均顆粒密度、顆粒形態(tài)(例如顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)形狀和顆粒的表面特征)和顆粒的滲透能(P.E.)。
本發(fā)明的粉末的平均顆粒尺寸變化范圍較寬，通?？蔀?.1-250μm，例如從10μm到100μm，更典型地為從20μm到70μm。采用常規(guī)技術(shù)如顯微技術(shù)(該技術(shù)直接測(cè)量單個(gè)顆粒的尺寸，而非測(cè)定大量顆粒的統(tǒng)計(jì)值)、氣體吸附、滲透力或飛行時(shí)間，可以測(cè)得質(zhì)量中位空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMAD)，以此來(lái)作為該粉末的平均顆粒尺寸。如果需要，可以采用自動(dòng)顆粒尺寸計(jì)數(shù)器(例如Aerosizer計(jì)數(shù)器、Coulter計(jì)數(shù)器、HIAC計(jì)數(shù)器或Gelman自動(dòng)顆粒計(jì)數(shù)器)來(lái)確定平均顆粒尺寸。
采用已知的定量技術(shù)如氦比重法等，可容易地確定顆粒的真實(shí)密度或“絕對(duì)密度”。替代地，可采用堆密度測(cè)定法來(lái)測(cè)定本發(fā)明的粉末的密度。本發(fā)明的粉末的堆密度通常為0.1-2.5g/cm3，優(yōu)選為0.8-1.5g/cm3。
堆密度信息對(duì)于表征尺寸和形狀不規(guī)則的物體的密度非常有用。堆密度為物體的質(zhì)量除以其體積，其中的體積包括孔和小凹腔的體積，但不包括顆粒間隙的體積?，F(xiàn)有技術(shù)中有許多已知的測(cè)定堆密度的方法，這類方法包括蠟浸潤(rùn)法、汞置換法、水吸附法和表觀比重法。測(cè)定堆密度有許多適合的儀器，例如Micromeritics Instrument Corp.公司的1360型GeoPyc。藥物組合物試樣的堆密度與絕對(duì)密度之間的差異，提供了關(guān)于試樣的總百分空隙率和比孔容方面的信息。
采用通常的光學(xué)顯微鏡檢測(cè)法可以很容易地檢測(cè)出顆粒的形態(tài)，尤其是顆粒的空氣動(dòng)力學(xué)形態(tài)。優(yōu)選組成該粉末的的顆?；旧鲜乔蛐蔚模蛘咧辽倩旧鲜菣E圓形的空氣動(dòng)力學(xué)形態(tài)。還優(yōu)選該顆粒的軸比為3或小于3，以避免出現(xiàn)桿狀或針狀的顆粒。這些相同的顯微鏡檢測(cè)技術(shù)還可用來(lái)檢測(cè)顆粒的表面特征，例如表面凹坑的數(shù)量和比例或空隙度。
可以采用多種常規(guī)技術(shù)來(lái)確定顆粒的滲透能，例如鍍金屬膜滲透能測(cè)定法。采用鍍金屬膜材料(例如，125μm的聚酯薄膜的一側(cè)鍍有350的鋁層)作為基質(zhì)，用無(wú)針注射器(例如，Bellhouse等的美國(guó)專利No.5,630,796所述的無(wú)針注射器)以約100-3000米/秒的初速度將所述粉末發(fā)射入該薄膜材料。將該鍍金屬膜的金屬涂層朝上放置于一適當(dāng)?shù)谋砻妗?br> 使裝有粉末的無(wú)針注射器的隔片與該薄膜接觸，然后發(fā)射。采用適當(dāng)?shù)娜軇┏ュ兘饘倌ど蠚埩舻姆勰?。采用GS-700型BioRad顯像密度計(jì)掃描該鍍金屬膜，用一臺(tái)帶有SCSI界面并安裝了MultiAnalyst(BioRad)和Matlad(5.1版，The Math Works，Inc.)軟件的個(gè)人計(jì)算機(jī)來(lái)分析密度計(jì)的讀數(shù)，從而測(cè)出滲透能。該密度計(jì)采用透射度法或反射度法進(jìn)行掃描，利用一個(gè)程序來(lái)處理該密度計(jì)的掃描讀數(shù)。噴霧涂敷的粉末的滲透能應(yīng)相當(dāng)于或好于用同樣方法處理的同樣尺寸的甘露醇顆粒的滲透能(根據(jù)共同權(quán)利人的國(guó)際公開No.WO 97/48485的方法，通過凍干、壓縮、研磨和篩分得到該甘露醇顆粒，引用于此供參考)。
“受試者”一詞指亞門(subphylum cordata)的任何個(gè)體，包括但不局限于人和其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物，所述其他靈長(zhǎng)類動(dòng)物包括除人之外的如黑猩猩和其他猿和猴屬動(dòng)物；家畜如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動(dòng)物如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠；禽類包括家禽和野禽如雞、火雞和其他鶉雞類禽、鴨、鵝等?！笆茉囌摺币辉~不指定具體年齡，因而可包括成年和新生的個(gè)體。本文所述的方法可用于上述任何脊椎類動(dòng)物，因?yàn)樗羞@些脊椎類動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的工作方式是相似的。
“透皮給藥”一詞既包括經(jīng)由皮膚的也包括經(jīng)由粘膜的給藥途徑，即通過皮膚或粘膜組織給藥。參見例如《透皮給藥問題的進(jìn)展及研究的首創(chuàng)精神(Tansdermal Drug DeliveryDevelopmental Issues andReaserch Initiatives)》，Hadgraft和Guy(編者)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；《受控給藥基礎(chǔ)和應(yīng)用(Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications)》，Robinson和Lee(編者)，MarcelDekker，Inc.，(1987)；和《透皮給藥(Transdermal Del ivery ofDrugs)》，1-3卷，Kydonieus和Berner(編者)，CRC出版社，(1987)。
B.一般方法本發(fā)明涉及適于用作疫苗的粉末，該粉末能形成凝膠體的且可自由流動(dòng)。該粉末適于采用無(wú)針注射器的給藥裝置透皮給藥。就此而言，組成該粉末組合物的顆粒必須具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，以便能夠經(jīng)受突然加速到數(shù)倍于音速的速度，而且還能經(jīng)受來(lái)自皮膚和組織的沖擊，并可穿過皮膚和組織。將水懸浮液噴霧干燥或噴霧凍干可制得這種顆粒，在某些實(shí)施方式中，所述的水懸浮液含有或基本上由如下組分組成(a)吸附了抗原的0.1-0.95％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(b)0.5-6％重量的糖；(c)0.1-2％重量的氨基酸或其鹽；和(d)0.02-1％重量的膠體物質(zhì)。
該水懸浮液含有，如組分(a)，吸附了抗原的小于1％重量的佐劑。優(yōu)選地，該水懸浮液含有吸附了抗原的0.2或0.3到0.6或0.75％重量的，更優(yōu)選0.2到0.4％重量的佐劑。鋁鹽佐劑通常為氫氧化鋁或磷酸鋁。替代地，該佐劑可為硫酸鋁或磷酸鈣。
可以采用本文所定義的任何適當(dāng)?shù)目乖??？乖蔀椴《究乖Ｒ虼耍乖蔀橐韵赂骺撇《拘『颂呛怂岵《究?如小核糖核酸病毒等)；杯狀病毒科；披蓋病毒科(如風(fēng)疹病毒、登革熱病毒等)；黃病毒科；日冕形病毒科；呼腸弧病毒科；Birnaviridae；彈狀病毒科(如狂犬病毒等)；纖絲病毒科；副粘病毒科(如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸合胞體病毒等)；正粘病毒科(如.A、B和C型流行性感冒病毒等)；本揚(yáng)病毒科；沙粒病毒科；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(如HTLV-I；HTLV-II；HIV-1和HIV-2)；以及猿的免疫缺陷病毒(SIV)等。
替代地，病毒抗原可來(lái)自乳頭瘤病毒屬(如HPV)；皰疹病毒屬；肝炎病毒如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)、戊肝病毒(HEV)或己肝病毒(HGV)；以及蜱傳播的腦炎病毒。關(guān)于上述病毒的描述參見例如《病毒學(xué)(Virology)》，第三版，(W.K.Joklik編著，1988)；《基礎(chǔ)病毒學(xué)(Fundamental Virology)》，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe編著，1991)。
本發(fā)明所用的細(xì)菌抗原可來(lái)自能夠引起如下疾病的生物白喉、霍亂、肺結(jié)核、破傷風(fēng)、百日咳、腦膜炎及其他發(fā)病狀態(tài)，所述生物包括例如A型、B型和C型腦膜炎球菌、B型嗜血桿菌流行性感冒(HIB)、幽門螺桿菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、彎曲桿菌屬、沙門菌、鏈球菌屬和葡糖球菌屬?？梢蕴峁┒喾N細(xì)菌抗原的結(jié)合，例如白喉、百日咳和破傷風(fēng)抗原的結(jié)合。適當(dāng)?shù)陌偃湛瓤乖瓰榘偃湛榷舅睾?或絲狀血凝素和/或百日咳桿菌粘附素，也稱為P69。由導(dǎo)致瘧疾和萊姆關(guān)節(jié)炎的生物體可得到抗寄生物的抗原。
本發(fā)明所用的抗原可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法制備。具體來(lái)說(shuō)，可采用普通的提純技術(shù)從天然源直接分離抗原。替代地，可以采用完全被殺死的、減弱了毒性的或失活的細(xì)菌、病毒、寄生蟲或其他微生物。此外，可采用已知技術(shù)通過重組制備抗原。參見例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular CloningALaboratory Manual)》第I和II卷(D.N.Glover等，1985)。
根據(jù)已經(jīng)公開的氨基酸序列，通過化學(xué)聚合物合成方法如固相縮氨酸合成法，可合成本發(fā)明所用的抗原。此類方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的。參見例如J.M.Stewart和J.D.Young的《固相縮氨酸合成(SolidPhase Peptide Synthesis)》，第二編，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984)；G.Barany和R.B.Merrifield的《縮氨酸的分析、合成和生物學(xué)(The PetidesAnalysis，Synthesis，Biology)》，編者E.Gross和J.Meienhofer，第二卷，Academic Press，New York，(1980)，3-254頁(yè)，關(guān)于固相縮氨酸的合成技術(shù)；M.Bodansky的《縮氨酸合成原理(Principles of Peptide Synthesis)》，Springer-Verlag Berlin(1984)；以及E.Gross和J.Meienhofer編著的《縮氨酸的分析、合成和生物學(xué)(The PetidesAnalysis，Synthesis，Biology)》，見上，卷1，關(guān)于傳統(tǒng)的溶液合成。
水懸浮液中可含有一種或多種糖作為組分(b)。糖的含量典型地為1.5-5％重量，優(yōu)選2-4％重量。糖可以是單糖如葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、D-甘露糖或山梨糖；二糖如乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖或蔗二糖；或者是糖醇如甘露醇、山梨醇、木糖醇、丙三醇、赤蘚醇或阿糖醇。
水懸浮液中可含有一種或多種氨基酸或氨基酸鹽作為組分(c)?？梢圆捎萌魏紊韺W(xué)可接受的氨基酸鹽。該鹽可以是堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀或鎂鹽。氨基酸可以是酸性、中性或堿性的氨基酸。適當(dāng)?shù)陌被釣楦拾彼?、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸。谷氨酸單鈉是適當(dāng)?shù)陌被猁}。該水懸浮液通常含有0.5-1.5％重量，更優(yōu)選0.75-1.25％重量的氨基酸和/或氨基酸鹽。
膠體物質(zhì)(d)是不能穿過半透膜的分散物質(zhì)，該膠體物質(zhì)由存在于懸浮液或溶液中而不會(huì)沉淀出來(lái)的顆粒組成。EP-B-0130619公開了適當(dāng)?shù)哪z體物質(zhì)。組分(d)可選自多糖如葡聚糖或麥芽糖-葡聚糖復(fù)合體；水凝膠如白明膠或瓊脂糖；或蛋白質(zhì)如人類血清蛋白。該膠體物質(zhì)的分子量可為500-80,000或更高，例如從1000或2000到30,000，或從5,000到25,000。組分(d)在水懸浮液中的含量通常為0.05-0.5％重量，優(yōu)選0.07-0.3％重量。
將吸附了抗原的佐劑和糖、氨基酸或其鹽以及膠體物質(zhì)懸浮于水中。將該水懸浮液噴霧干燥或噴霧凍干。選擇噴霧干燥或噴霧凍干的條件，使得可以產(chǎn)生所預(yù)期的顆粒?？諝獾妮斎霚囟?、空氣的輸出溫度、水懸浮液的進(jìn)料速率、空氣流速等可據(jù)需要而有所不同。必要時(shí)可以改變噴嘴的尺寸。下文將對(duì)噴霧凍干的具體條件作詳細(xì)描述。
于是可以提供適于作為疫苗的粉末，該粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)。通過調(diào)節(jié)用于噴霧干燥或噴霧凍干的懸浮液組成，可以調(diào)節(jié)該粉末各組分的比例。然而，該粉末典型地包括如下組分，或在某些實(shí)施方式中基本上由如下組分組成
(i)吸附了抗原的5-60％，例如7-50％，又如10-30％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(ii)25-90％，例如30-80％，又如40-70％重量的糖；(iii)4.5-40％，例如7-30％，又如10-20％重量的氨基酸或其鹽；和(iv)0.5-10％，例如0.8-6％，又如1-3％重量的膠體物質(zhì)。
本發(fā)明通常涉及適于用作疫苗的粉末，將含有吸附了抗原的鋁鹽或鈣鹽佐劑的水懸浮液進(jìn)行噴霧凍干就形成了所述粉末。該粉末適于采用無(wú)針注射器給藥裝置透皮給藥。就此而言，組成該粉末組合物的顆粒必須具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，以便能夠經(jīng)受突然加速到數(shù)倍于音速的速度，并能經(jīng)受來(lái)自皮膚和組織的沖擊，而且可穿過皮膚和組織。
優(yōu)選地，在噴霧凍干之前，該水懸浮液含有小于10％重量，例如小于5％重量且優(yōu)選小于3％重量的吸附了抗原的鹽佐劑。該水懸浮液典型地含有至少0.05％重量，例如至少0.1％重量或至少0.6％重量的吸附了抗原的佐劑。更優(yōu)選地，該水懸浮液含有從0.2或0.3到0.6％、0.75％或1％重量，優(yōu)選從0.2到0.4％重量的吸附了抗原的佐劑。當(dāng)佐劑鹽的濃度高于約10％重量時(shí)，水懸浮液的粘度變得很高。這限制了將該懸浮液噴成霧狀的能力。
應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選的佐劑濃度上限適用于噴霧凍干前的水懸浮液。吸附了抗原的佐劑的量可為本發(fā)明的粉末的50％重量或更高。
佐劑通常為鋁鹽，例如氫氧化鋁或磷酸鋁。替代地，佐劑可為硫酸鋁或磷酸鈣。
同樣，可以采用本文所定義的任何適當(dāng)?shù)目乖??？乖蔀椴《究乖?。因此，抗原可為以下各科病毒小核糖核酸病毒?如小核糖核酸病毒等)；杯狀病毒科；披蓋病毒科(如風(fēng)疹病毒、登革熱病毒等)；黃病毒科；日冕形病毒科；呼腸弧病毒科；Birnaviridae；彈狀病毒科(如狂犬病毒等)；纖絲病毒科；副粘病毒科(如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸合胞體病毒等)；正粘病毒科(如.A、B和C型流行性感冒病毒等)；本揚(yáng)病毒科；沙粒病毒科；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(如HTLV-I；HTLV-II；HIV-1和HIV-2)；以及猿的免疫缺陷病毒(SIV)等。
替代地，病毒抗原可來(lái)自乳頭瘤病毒屬(如HPV)；皰疹病毒屬；肝炎病毒如甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、丁肝病毒(HDV)、戊肝病毒(HEV)或己肝病毒(HGV)；以及蜱傳播的腦炎病毒。關(guān)于上述病毒的描述參見例如《病毒學(xué)(Virology)》，第三版，(W.K.Joklik編著，1988)；《基礎(chǔ)病毒學(xué)(Fundamental Virology)》，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe編著，1991)。
本發(fā)明所用的細(xì)菌抗原可來(lái)自能夠引起如下疾病的生物白喉、霍亂、肺結(jié)核、破傷風(fēng)、百日咳、腦膜炎及其他發(fā)病狀態(tài)，所述生物包括例如A型、B型和C型腦膜炎球菌、B型嗜血桿菌流行性感冒(HIB)、幽門螺桿菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、彎曲桿菌屬、沙門菌、鏈球菌和葡糖球菌。可以提供多種細(xì)菌抗原的結(jié)合，例如白喉、百日咳和破傷風(fēng)抗原的結(jié)合。適當(dāng)?shù)陌偃湛瓤乖瓰榘偃湛榷舅睾?或絲狀血凝素和/或百日咳桿菌粘附素，也稱為P69。由導(dǎo)致瘧疾和萊姆關(guān)節(jié)炎的生物體可得到抗寄生物的抗原。
本發(fā)明所用的抗原可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法制備。具體來(lái)說(shuō)，可采用普通的提純技術(shù)從天然源直接分離抗原。替代地，可以采用完全被殺死的、減弱了毒性的或失活的細(xì)菌、病毒、寄生蟲或其他微生物。此外，可采用已知技術(shù)通過重組制備抗原。參見例如Sambrook、Fritsch和Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular CloningALaboratory Manual)》第I和II卷(D.N.Glover等，1985)。
根據(jù)已經(jīng)公開的氨基酸序列，通過化學(xué)聚合物合成方法如固相縮氨酸合成法，可合成本發(fā)明所用的抗原。此類方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的。參見例如J.M.Stewart和J.D.Young的《固相縮氨酸合成(SolidPhase Peptide Synthesis)》，第二編，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984)；G.Barany和R.B.Merrifield的《縮氨酸的分析、合成和生物學(xué)(The PetidesAnalysis，Synthesis，Biology)》，編者E.Gross和J.Meienhofer，第二卷，Academic Press，New York，(1980)，3-254頁(yè)，關(guān)于固相縮氨酸的合成技術(shù)；M.Bodansky的《縮氨酸合成原理(Principles of Peptide Synthesis)》，Springer-Verlag Berlin(1984)；以及E.Gross和J.Meienhofer編著的《縮氨酸的分析、合成和生物學(xué)(The PetidesAnalysis，Synthesis，Biology)》，見上，卷1，關(guān)于傳統(tǒng)的溶液合成。
水懸浮液可基本上含有水和吸附了抗原的佐劑，或者該懸浮液進(jìn)而含有添加劑?？梢圆捎萌魏位旧蠠o(wú)毒且藥理學(xué)惰性的添加劑。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用含有多種不同添加劑的水懸浮液時(shí)，該噴霧凍干方法的效果非常好，而且還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法及由此方法所得到的粉末與其配方完全無(wú)關(guān)。
典型地，該水懸浮液含有適當(dāng)?shù)馁x形劑以及保護(hù)劑、溶劑、鹽、表面活性劑、緩沖劑等。適當(dāng)?shù)馁x形劑可包括可自由流動(dòng)的固體顆粒，這些顆粒與水接觸后不會(huì)發(fā)生增粘或聚合，給受試個(gè)體施用后無(wú)毒副作用，也不與藥劑發(fā)生明顯的改變藥物活性的反應(yīng)。通常采用的賦形劑的例子包括但不局限于，單糖如葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、D-甘露糖或山梨糖，二糖如乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖或蔗二糖，糖醇如甘露醇、山梨醇、木糖醇、丙三醇、赤蘚醇或阿糖醇，聚合物如葡聚糖、淀粉、纖維素、高分子量的聚乙二醇(PEG)，氨基酸或其鹽如甘氨酸、丙氨酸、丙氨酸鹽、精氨酸、賴氨酸或組氨酸，或上述氨基酸的堿金屬或堿土金屬如鈉、鉀或鎂鹽，或磷酸鈉或磷酸鈣、碳酸鈣、硫酸鈣、枸櫞酸鈉、枸櫞酸、酒石酸及上述物質(zhì)的組合。適當(dāng)?shù)娜軇┌ǖ痪窒抻诙燃淄?、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇和水。典型地，用水作為溶劑。通?？刹捎媚枬舛燃s為1mM到2M的藥用鹽。藥用鹽包括例如無(wú)機(jī)酸鹽如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸等的鹽；以及有機(jī)酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等?！独酌黝D藥物科學(xué)》(REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCINECES)(Mack Pub.Co.，N.J.1991)對(duì)藥物可接受的賦形劑、介質(zhì)及助劑作了詳細(xì)的描述，在此引用供參考。
優(yōu)選的用于水懸浮液的賦形劑包括糖、氨基酸或其鹽以及聚合物。典型地，該水懸浮液含有一種或多種糖，例如甘露糖醇和海藻糖的組合。糖的含量典型地為0.5-30％重量。氨基酸鹽例如精氨酸鹽、谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽，其含量為0.1-30％重量，和/或聚合物例如葡聚糖，其含量典型地為0-30％重量。典型的賦形劑的組合物包括一種或多種糖和聚合物，并且基本上不包括氨基酸鹽。水懸浮液中賦形劑的含量典型地為0-50％，更優(yōu)選10-30％。
本發(fā)明的顆粒的形成方法是，首先將吸附了抗原的佐劑及任何所需的添加劑溶解于水中，然后將該水懸浮液噴霧凍干。噴霧凍干步驟可采用本領(lǐng)域中的任何技術(shù)(例如，Mumenthaler等在《國(guó)際制藥學(xué)雜志(Int.J.Pharmaceutics)》(1991)72，97-110頁(yè)，以及Maa等在《制藥研究(Phar.Res.)》(1999)第16卷249頁(yè)所描述的方法)。典型的噴霧凍干技術(shù)包括將水懸浮液噴成霧狀進(jìn)入攪拌下的液氮中的步驟。然后將含有凍結(jié)的顆粒的液氮在低溫例如-60℃到-20℃下保存，隨后優(yōu)選在20到500mT(2.666到66.65Pa)的壓力和-50℃到0℃的低溫下真空干燥。典型地采用兩步干燥法，即初級(jí)干燥和次級(jí)干燥。初級(jí)干燥時(shí)間典型地為4到24小時(shí)，次級(jí)干燥時(shí)間典型地為6-24小時(shí)。可以逐步升溫，但在達(dá)到室溫之前一直保持低壓。
該技術(shù)包括將水懸浮液快速冷凍為小滴的步驟。隨后的干燥步驟通過升華除去了冰，而不需要高的空氣溫度?？刹捎萌魏我阎募夹g(shù)收集粉末。根據(jù)希望制得的顆粒應(yīng)具有的性質(zhì)，可以選擇噴霧凍干所采用的確切的條件。因而，可以根據(jù)需要來(lái)改變溫度、壓力及其他條件。
本發(fā)明的粉末通?？勺杂闪鲃?dòng)。該粉末包括很少或沒有聚集的佐劑鹽，因而在水中再懸浮時(shí)形成凝膠體。典型地，再懸浮時(shí)基本上沒有沉淀。將粉末加入蒸餾水(重量比1∶500)并搖晃3分鐘后，典型地得到一種沒有任何沉淀的類似于凝膠體的懸浮液。3小時(shí)后沒有觀察到沉淀的發(fā)生。靜置過夜，例如靜置12小時(shí)，不會(huì)形成沉淀。
典型地，通過復(fù)水后的凝膠體制劑衍射光束的能力，可以評(píng)估該復(fù)水的凝膠體制劑中沉淀的存在以及凝聚的程度。還可用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微和/或沉淀方法來(lái)定量地評(píng)估凝聚的程度。測(cè)定顆粒凝聚的另一適當(dāng)方法可以是，采用任何標(biāo)準(zhǔn)的粒徑測(cè)定技術(shù)，例如測(cè)定激光或光線的暗淡程度，測(cè)得復(fù)水前后的粒徑。
本發(fā)明的顆粒尺寸適于為受試者高速透皮給藥，典型地穿過角質(zhì)層或粘膜。顆粒的質(zhì)量中位空氣動(dòng)力學(xué)直徑(MMAD)約為0.1-250μm。MMAD可以是5-100μm或10-100μm，優(yōu)選10-70μm或20-70μm。通常，直徑高于MMAD至少5μm或低于MMAD至少5μm的顆粒少于10％重量。優(yōu)選地，直徑高于MMAD 5μm或更多的顆粒不高于5％重量。同樣優(yōu)選地，直徑低于MMAD 5μm或更多的顆粒不高于5％重量。
顆粒的堆密度為0.1-25g/cm3，優(yōu)選0.8-1.5g/cm3。盡管在顯微鏡下觀察，單個(gè)顆粒的形狀會(huì)有所不同，但優(yōu)選球形的顆粒。長(zhǎng)軸與短軸之比的平均值典型地為3∶1到1∶1，例如從2∶1到1∶1。
粉末的單個(gè)顆粒基本上是球形的空氣動(dòng)力學(xué)形狀，其具有基本上是均勻的無(wú)孔的表面。該顆粒還具有適于采用無(wú)針注射器裝置透皮給藥的顆粒滲透能。
正如本文所述的，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)就對(duì)本發(fā)明有用的無(wú)針注射器裝置作了詳細(xì)說(shuō)明。這類注射器被稱為無(wú)針注射器裝置，這類裝置的代表有皮膚PowderJect無(wú)針注射器裝置和口腔PowderJect無(wú)針注射器裝置(PowderJect Technologies Limited，英國(guó)牛津)。采用這類裝置可對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明的粉末。有效量指為受試者施用足夠的所需抗原所必需的量。根據(jù)抗原性質(zhì)的不同，給藥的用量也不同，可以根據(jù)基于被施用抗原的已知活性的臨床實(shí)驗(yàn)容易地確定該用量?！夺t(yī)師案頭參考》(“Physicians Desk Reference”)和《古德曼和吉爾曼治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》(“Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics”)對(duì)于確定該所需用量是有用的。
共同權(quán)利人Bellhouse等的美國(guó)專利No.5,630,796首先描述了用來(lái)施用顆粒的無(wú)針注射器，在此引用供參考。盡管現(xiàn)在有多種特殊結(jié)構(gòu)的無(wú)針注射器，但典型地這類注射器是按照線性順序由頂部到底部運(yùn)動(dòng)的筆形裝置，該裝置包括氣缸、顆粒盒或顆粒包以及附帶消音介質(zhì)的超音速噴嘴。將適當(dāng)?shù)姆勰?在此指本發(fā)明的噴霧干燥或噴霧凍干的粉末)放入適當(dāng)?shù)娜萜鳎缬蓛蓪涌善屏训木酆衔锬ば纬傻暮凶樱摼酆衔锬け蝗劢訛閴|圈狀的隔離物，從而形成獨(dú)立的密閉單元。選擇膜材使其可達(dá)到以一定方式打開和爆發(fā)的壓力，該壓力決定了產(chǎn)生超音速流的條件。工作時(shí)，該裝置啟動(dòng)，從氣缸釋放壓縮氣體進(jìn)入該裝置中的膨脹室。該釋放出來(lái)的氣體與顆粒盒接觸，當(dāng)積累了足夠的壓力時(shí)，顆粒盒的膜爆裂，將顆粒吹到超音速噴嘴中進(jìn)行隨后的給藥。噴嘴的設(shè)計(jì)應(yīng)具有特定的氣體速度和流動(dòng)方式，以便將一定量的顆粒運(yùn)送到指定區(qū)域的目的表面。消音器用來(lái)減弱膜破裂產(chǎn)生的噪音。
共同權(quán)利人的國(guó)際公開WO 96/20022描述了另一種顆粒給藥的無(wú)針注射器裝置。該給藥裝置也采用壓縮氣體作為能量來(lái)加速并運(yùn)送粉末組合物；然而，與美國(guó)專利No.5,630,796不同的是，它采用了震動(dòng)波而不是氣流來(lái)加速顆粒。更具體來(lái)說(shuō)，從柔性圓頂室后邊發(fā)出的震動(dòng)波使壓力瞬時(shí)升高，該壓力沖擊圓頂室的背部，使該柔性圓頂室向目的表面的方向突然翻轉(zhuǎn)，將粉末組合物(位于圓頂室的外部)以足夠的速度彈射出去，于是產(chǎn)生了足夠的動(dòng)力來(lái)穿透目的組織，例如口腔粘膜組織。當(dāng)圓頂室的翻轉(zhuǎn)達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)釋放該粉末組合物。該圓頂室還有完全遏制高壓氣流的作用，從而避免高壓氣流與組織接觸。由于在此給藥過程中氣體沒有釋出，所以該裝置本身是沒有噪音的。這種設(shè)計(jì)還可用于其他封閉的或敏感的應(yīng)用，例如，將顆粒輸送到輕度發(fā)病的手術(shù)部位。
在本發(fā)明的又一個(gè)方面，使用前可將本發(fā)明的粉末裝在單位劑量或多劑量的容器中，該容器包括密封容器，該密封容器中裝有適當(dāng)劑量的粉末?？蓪⒃摲勰┑臒o(wú)菌配方裝入容器，因此，該密封容器的設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)保持該配方在施用前的無(wú)菌性。如果需要，此類容器可以適于直接應(yīng)用于上述的無(wú)針注射器裝置。
因此，本發(fā)明的粉末包裝為用于無(wú)針注射器給藥的單劑量。本文所用的“單劑量”指含有治療有效量的本發(fā)明的粉末的劑量容器。典型地將該劑量容器安裝在無(wú)針注射器中，使得可以通過該注射器透皮給藥。這類容器可為膠囊、箔袋、小袋、盒子等。
進(jìn)而可對(duì)該裝有粉末的容器進(jìn)行標(biāo)記，以便識(shí)別其組成并提供有關(guān)劑量的信息。此外，可在該容器上按照官方機(jī)構(gòu)例如食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)規(guī)定的方式標(biāo)明注意事項(xiàng)，其中的注意事項(xiàng)指出，所裝供人施用的粉末的生產(chǎn)、使用和銷售依照聯(lián)邦法律得到了該機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。
被施用的顆粒透入目標(biāo)表面的實(shí)際深度取決于顆粒尺寸(例如，假定顆粒的幾何形狀大體為球形時(shí)顆粒的公稱直徑)、顆粒密度、顆粒撞擊表面的初速度以及目標(biāo)皮膚組織的密度和運(yùn)動(dòng)速度。在這方面，用于無(wú)針注射的優(yōu)選的顆粒密度一般介于約0.1g/cm3和25g/cm3之間，例如在約0.8g/cm3到1.7g/cm3之間，優(yōu)選在約0.9g/cm3到1.5g/cm3之間。注射速度通常在約100和3,000米/秒之間。在適當(dāng)?shù)臍怏w壓力下，通過噴嘴可將平均直徑為10-70μm的顆粒加速到接近驅(qū)動(dòng)氣流的超音速。
如果需要，可將含有適當(dāng)劑量的本發(fā)明的粉末預(yù)裝入無(wú)針注射器裝置。可將裝有粉末的注射器裝入密封的容器，進(jìn)而按照上述方法標(biāo)記該容器。
為了表征無(wú)針注射器裝置的性能，已經(jīng)開發(fā)出了多種新的測(cè)試方法，或者對(duì)現(xiàn)有的測(cè)試方法進(jìn)行了改進(jìn)。這些測(cè)試包括粉末組合物的表征、氣流和顆粒加速的測(cè)定、對(duì)人造或生物目標(biāo)的沖擊以及對(duì)整個(gè)裝置性能的測(cè)試?？梢圆捎孟率鰷y(cè)試方法中的一個(gè)、幾個(gè)或全部，來(lái)評(píng)估本發(fā)明用于無(wú)針注射器裝置的粉末的物理性能和功能適應(yīng)性。
對(duì)人造膜目標(biāo)的影響的測(cè)試同時(shí)測(cè)定粉末注射器裝置多個(gè)方面的功能性測(cè)試被稱為“鍍金屬膜”或“滲透能”(PE)測(cè)試。該測(cè)試基于顆?？蓪?duì)金屬薄層所造成的破壞，該金屬薄層被塑料膜基材所負(fù)載，其具有精確的厚度。破壞的情況與顆粒的動(dòng)態(tài)能量和某些其他特性有關(guān)。測(cè)試的反應(yīng)越強(qiáng)烈(即，膜的損壞/破裂越嚴(yán)重)，該裝置賦予顆粒的能量就越高。測(cè)試電阻的變化或在反射或透射方式下測(cè)試顯像密度，均是評(píng)估該裝置或配方性能的可靠手段，該手段可控制并且可重復(fù)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，膜試驗(yàn)床對(duì)給藥時(shí)裝置的所有主要參數(shù)的變化是敏感的，這些參數(shù)包括壓力、劑量、顆粒粒度分布和材料等，而且，該膜試驗(yàn)床對(duì)于氣體不敏感。本試驗(yàn)采用的膜為在125μm厚的聚酯基材上鍍有約350埃厚的鋁，用該膜來(lái)測(cè)試在直到60bar下工作的注射器裝置。
對(duì)工程泡沫目標(biāo)的沖擊作用的測(cè)試測(cè)試由無(wú)針注射器裝置給藥時(shí)的顆粒性能的另一方法是，測(cè)定顆粒對(duì)剛性聚甲基亞酰胺泡沫(Rohacell 5 IIG，密度52kg/m3，Rohm TechInc.公司，Malden，麻薩諸塞州)的沖擊作用。該實(shí)驗(yàn)的裝置與鍍金屬膜測(cè)試所用的裝置相似。采用精密卡尺測(cè)定滲透的深度。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，采用經(jīng)過處理的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)物作為對(duì)照，其他所有參數(shù)如裝置壓力、顆粒尺寸范圍等保持不變。數(shù)據(jù)顯示，該方法也對(duì)顆粒大小和壓力的差異是敏感的。在臨床前的試驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)，經(jīng)過處理的作為藥物賦形劑的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)物可分布到全身，所以在泡沫滲透測(cè)試中，相關(guān)性能的測(cè)試具有實(shí)際的體內(nèi)基礎(chǔ)。那些與甘露醇相比表現(xiàn)出相同的或更好的滲透力的粉末，可望在臨床前或臨床研究中具有適當(dāng)?shù)男阅堋＿@一簡(jiǎn)單而迅速的試驗(yàn)是評(píng)估粉末的相對(duì)方法，不可將其單獨(dú)考慮。
顆粒磨損測(cè)試顆粒性能的另一指標(biāo)是，各種備選組合物經(jīng)受與高速顆粒注射技術(shù)有關(guān)的各種力的能力，所述的各種力即，與靜置顆粒突然接觸的高速氣流的力量，當(dāng)粉末穿過無(wú)針注射器時(shí)顆粒與顆粒的碰撞的力，以及當(dāng)粉末通過該裝置時(shí)顆粒與裝置的碰撞的力。據(jù)此，設(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)單的顆粒磨損實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)測(cè)定了初始組合物以及通過無(wú)針注射器裝置給藥之后的組合物的粒度分布的變化。
測(cè)試方法為，將顆粒組合物裝載入上述的無(wú)針注射器，然后將該組合物充入裝有載流的燒瓶中，該顆粒組合物不溶解于該流體(例如，礦物油、硅油等)。收集載流，采用適當(dāng)?shù)念w粒分級(jí)裝置計(jì)算初始組合物和排放到載流中的組合物的顆粒尺寸，該分級(jí)裝置例如780型AccuSizer光學(xué)顆粒分級(jí)器。經(jīng)過裝置的沖擊后，質(zhì)量中位直徑(由AccuSizer裝置所測(cè)定的)的減少小于約50％，更優(yōu)選小于約20％的組合物被認(rèn)為適用于本文所述的無(wú)針注射器裝置。
對(duì)人的皮膚外給藥和經(jīng)表皮的水分損失為了使粉末的性能測(cè)試更接近于最終的實(shí)際應(yīng)用，可將備選的粉末組合物注射到用植皮刀取自人腹部的完整厚度的皮片內(nèi)。注射后可將同樣的皮片置于裝有32℃的水、生理鹽水或緩沖液的經(jīng)過修飾的弗朗茨(Franz)擴(kuò)散皿上?？梢圆捎锰砑觿┤绫砻婊钚詣﹣?lái)防止皮片粘附于擴(kuò)散皿的某些部位?？蛇M(jìn)行兩種測(cè)試來(lái)評(píng)估該配方在皮膚內(nèi)的性能。
為了測(cè)定物理作用，即顆粒注射對(duì)于皮膚屏障功能的影響，可以測(cè)定經(jīng)表皮的水分損失(TEWL)。將Tewameter TM 210(Courage & Khazaka公司，德國(guó)科隆)置于擴(kuò)散皿頂蓋上，其作用類似于約12mm的煙囪，平衡時(shí)(約1小時(shí))進(jìn)行測(cè)試。體外注射的顆粒較大且注射壓力較高時(shí)，TEWL值也按比例升高，而且顯示該結(jié)果與體內(nèi)測(cè)試的結(jié)果相關(guān)。體外顆粒注射后，隨顆粒大小和氦氣壓力的不同，TEWL值從約7增加到了約27(g/m2h)。注射不帶顆粒的氦氣沒有作用。體內(nèi)測(cè)試時(shí)，對(duì)于多數(shù)尺寸的粉末顆粒來(lái)說(shuō)，TEWL在約1小時(shí)內(nèi)返回到了處理前的值，這表明皮膚的屏障功能很快恢復(fù)到了正常水平。對(duì)于53-75μm的最大的顆粒，顯示皮片在1小時(shí)內(nèi)有50％的恢復(fù)，在24小時(shí)內(nèi)完全恢復(fù)。
對(duì)人的皮膚體外給藥以及藥物的擴(kuò)散速率為了測(cè)試配方在體外的性能，按預(yù)定的時(shí)間間隔，全部或部分置換弗朗茨皿接受器的溶液，從而收集備選粉末的抗原成分，以便采用HPLC或其他適當(dāng)?shù)姆治黾夹g(shù)進(jìn)行化學(xué)分析?？梢圆捎脻舛葦?shù)據(jù)來(lái)得出給藥曲線，并計(jì)算穩(wěn)定狀態(tài)的滲透速率。在體內(nèi)研究之前，可以采用該技術(shù)來(lái)篩選那些顯示出抗原與皮膚結(jié)合、抗原分散、顆粒穿透角質(zhì)層的效率等早期征兆的配方。
可以采用的上述和其他的定性和定量測(cè)試方法，來(lái)評(píng)估本發(fā)明的用于高速顆粒注射裝置的粉末的物理性質(zhì)和功能適應(yīng)性。優(yōu)選但非必須地，粉末的顆粒具有以下特性基本上是球形(例如，長(zhǎng)軸與短軸之比盡可能接近于1)；表面光滑；適當(dāng)?shù)挠行аb載量；進(jìn)行顆粒磨損測(cè)試后顆粒尺寸的減少小于20％；堆密度盡可能接近組合物的真實(shí)密度(例如，大于約0.8g/ml)；粒度分布窄，質(zhì)量中位空氣動(dòng)力學(xué)直徑約為20-70μm。典型地該組合物可自由流動(dòng)(例如，在50％的相對(duì)濕度下保存8小時(shí)以及在40％相對(duì)濕度下保存24小時(shí)后仍可自由流動(dòng))。采用上述方法可確定上述全部的參數(shù)，進(jìn)一步的詳細(xì)描述參見以下參考文獻(xiàn)，引用于此供參考。Etzler等(1995)，Part.Part.Syst.Charact.12217；Ghadiri等(1992)，IFPRI Final Report，F(xiàn)RR 16-03 University of Surrey，UK；Bellhouse等(1997)，《采用震動(dòng)波和超聲氣流對(duì)干燥粉末狀藥物無(wú)針給藥》(“Needleless delivery of drugs in dry powder form，using shockwaves and supersonic gas flow”)，Plenary Lecture 6，21stInternational Symposium on Shock Waves，Australia；和Kwon等(1998)，《制藥科學(xué)增刊1》(Pharm.Sci.Suppl.1)(1)，103。
替代地，可以采用本發(fā)明的粉末通過其他途徑為受試者免疫。為此目的，可將該粉末與適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋液如注射用水或生理鹽水相混合。所得到的疫苗組合物典型地通過注射例如皮下或肌肉注射給藥。
無(wú)論選擇何種給藥途徑，均需給待免疫的受試者施用有效量的抗原。通常產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原的量為50ng到1mg，更優(yōu)選1μg到約50μg。根據(jù)被測(cè)試受試者的年齡和總體狀況、所選擇的具體的一種或多種抗原、給藥部位及其他因素的不同，所需的確切的量將有所不同。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)?shù)挠行Я俊?br> 劑量治療可以采用單劑量療程或多劑量療程。多劑量療程為，免疫的初級(jí)階段可以采用1-10個(gè)單獨(dú)劑量，在隨后的時(shí)間間隔中給予其他劑量，選擇保持和/或加強(qiáng)免疫反應(yīng)，例如在1-4月采用第二劑量以及，如果需要，在數(shù)月后采用隨后的劑量。給藥計(jì)劃或至少其中的一部分還將根據(jù)受試者的需要來(lái)確定，同時(shí)也取決于醫(yī)師的判斷。當(dāng)然，在被病原體初期感染之前通常會(huì)發(fā)生免疫，感染初期需要采用保護(hù)措施。
C.實(shí)驗(yàn)以下是本發(fā)明特定實(shí)施方式的實(shí)施例。提供實(shí)施例的目的僅在于說(shuō)明，并不打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
我們?cè)诒ＷC所引用數(shù)據(jù)(例如，數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性方面已經(jīng)做了努力，但是，當(dāng)然應(yīng)當(dāng)對(duì)某些實(shí)驗(yàn)的誤差和偏差予以諒解。
參考實(shí)施例1根據(jù)美國(guó)專利No.5,902,565所述的方法得到了噴霧干燥即釋免疫制劑。將含有5％重量甘露醇和5％重量磷酸鋁(磷酸鹽佐劑)的配料采用臺(tái)式噴霧干燥器(Buchi 190)噴霧干燥。噴霧干燥的條件為入口溫度＝130℃；出口溫度＝70℃，液體喂料速度＝3ml/min；噴霧氣流速率＝500l/hr；以及滿刻度的干燥空氣。所得到的自由流動(dòng)的粉末的顆粒尺寸約為10μm。在蒸餾水中將該粉末復(fù)水(重量比1∶500)。將含有懸浮顆粒的溶液靜置15分鐘，沒有形成凝膠體。用光學(xué)顯微鏡觀察，復(fù)水后的顆粒保持了其形狀和尺寸，這表明明礬保持了聚集狀態(tài)而沒有分散。
實(shí)施例1將下表所列的組分與15ml蒸餾水混合即得到下述配方

1)鋁膠3％重量的氫氧化鋁2)磷酸鹽佐劑2％重量的磷酸鋁采用Buchi 190 Mini-Spin干燥器在下述條件下將上述配方噴霧干燥空氣入口溫度＝130℃；空氣出口溫度＝70℃；Q液體喂料速率5檔；和Q噴霧氣流速率500l/hr。將干燥空氣設(shè)置到最大刻度。得到自由流動(dòng)的粉末。收率如下

所得到的粉末組合物與用于噴霧干燥的懸浮液的固含量的關(guān)系如下

將該噴霧干燥的粉末再懸浮于蒸餾水。具體來(lái)說(shuō)，將每種粉末加入蒸餾水(重量比為1∶500)中并搖晃3分鐘。測(cè)定所得懸浮液的凝聚情況。只有根據(jù)本發(fā)明的配方2形成了類似于凝膠體的懸浮液而沒有發(fā)生沉淀。結(jié)果如下—配方1 將32.59mg噴霧干燥的粉末加入1ml蒸餾水中。所得懸浮液靜置過夜后形成了白色沉淀?！浞? 將37.1mg噴霧干燥的粉末加入1ml蒸餾水中。形成了灰白色的類似于凝膠體的懸浮液。所得懸浮液靜置過夜后沒有觀察到沉淀?！浞? 將44.34mg噴霧干燥的粉末加入1ml蒸餾水中。所得懸浮液靜置過夜后形成了白色沉淀?！浞? 將29.4mg噴霧干燥的粉末加入1ml蒸餾水中。所得懸浮液靜置過夜后形成了白色沉淀。
實(shí)施例2按下述方法制備兩種疫苗配方配方A按如下方法制備濃縮的明礬-HBsAg懸浮液首先用去離子蒸餾水洗滌吸附了HBsAg疫苗的明礬，以除去緩沖鹽，該HBsAg疫苗來(lái)自RheinAmerican S.A.，其含有500μg的明礬(約1500μg的氫氧化鋁)，該明礬吸附了20μg的HBsAg(約為1個(gè)人的劑量)。將明礬凝膠體置于250ml的Nalgene細(xì)口方形聚碳酸酯瓶中，在2-8℃下靜置過夜。除去上清液(150ml)，在沉淀中加入同體積的水并攪拌。重復(fù)該步驟一遍。
在Nalgene方形瓶中稱出100g經(jīng)過洗滌的明礬-HBsAg配方，并在2-8℃下靜置過夜。當(dāng)除去90ml的上清液之后，將剩余的懸浮液轉(zhuǎn)移到50ml的聚丙烯離心管中，采用臺(tái)式離心機(jī)(Allegra 6R，Beckman)在200rpm下離心4分鐘。進(jìn)而除去上清液，得到3.369g濃縮的明礬-HBsAg懸浮液。然后在該懸浮液中加入315.24mg甘露醇、81.73mg甘氨酸、101.91mg葡聚糖和安慰劑明礬凝膠體(2％的Al2O3)，從而得到明礬濃度為3％的明礬-HBsAg液體配方。
配方B按照配方A中所述的方法洗滌明礬-HBsAg懸浮液。在50ml離心管中稱出20.79g的該懸浮液，并將其在2-8℃下靜置過夜。當(dāng)除去了17ml的上清液之后，將剩余的濃縮的懸浮液(3.572g)與113.06mg甘露醇、47.31mg甘氨酸和23.22mg葡聚糖混合，得到明礬濃度為0.6％的液體配方。
將此二配方用下表1所列的技術(shù)進(jìn)行干燥表1干燥技術(shù)

凍干按照表2的凍干步驟，采用Dura-Stop凍干機(jī)(FTS System公司，Stone Ridge，紐約)將吸附了HBsAg的明礬配方凍干。
表2凍干步驟

在整個(gè)初級(jí)和次級(jí)干燥過程中保持100mT(13.3Pa)的真空度。
噴霧凍干采用超聲噴霧器(Sono Tek Corporation，Milton，紐約)在噴嘴頻率為60kHz時(shí)，將每種懸浮液噴霧到帶攪拌的盛有液氮的不銹鋼盤中。用于霧化的聲能設(shè)定為5.0瓦。MasterFlex C/L蠕動(dòng)泵的液體喂料速率為1.5ml/min。將裝有冷凍顆粒的液氮盤裝入預(yù)冷到-50℃的Dura-凍干機(jī)中，然后按照表3的條件凍干。
表3凍干步驟

在整個(gè)初級(jí)和次級(jí)干燥過程中保持200mT(16.6Pa)的真空度。
壓縮/研磨/篩分將凍干的物質(zhì)采用壓縮、研磨和篩分(“C/G/S”)技術(shù)制成顆粒。具體而言，將凍干的物質(zhì)在直徑為13mm的不銹鋼模(Carver Press公司，Wabash，印第安那州)中用12,000psi的壓力壓縮5-10分鐘。用缽和杵手工研磨壓縮餅。用套篩(直徑為3英寸)手工篩分研磨后的粉末，將其分為三種直徑的級(jí)分53-75μm、38-53μm和20-38μm。
實(shí)驗(yàn)1干燥過程對(duì)凝聚程度的影響將粉末1至3按1∶500 w/w的比例復(fù)水，并按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。采用光學(xué)顯微鏡(Model DMR，Leica，德國(guó))，用10倍的目鏡和5倍的物鏡對(duì)顆粒進(jìn)行目測(cè)分析。該顯微鏡裝有Polaroid照相機(jī)用來(lái)輸出圖象。光學(xué)顯微檢查對(duì)明礬的凝聚程度作了定性分析。在此實(shí)驗(yàn)中，復(fù)水后粉末1形成了很大凝聚團(tuán)，而粉末2只有輕微的凝聚。粉末3幾乎根本就沒有凝聚。
還定量測(cè)定了復(fù)水粉末的顆粒尺寸。攪拌/超聲波處理復(fù)水的粉末樣品，得到均一的懸浮液。然后將該懸浮液加入到顆粒尺寸分析儀(AccuSizer 780，Particle Sizing Systems公司，Santa Barbara，加利福尼亞)的玻璃容器中測(cè)定其粒度分布。對(duì)噴霧凍干前和后的粉末2和3的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。圖2顯示了噴霧凍干前和后粉末1的顆粒尺寸的類似的對(duì)比結(jié)果。這些結(jié)果顯示，干燥前后粉末2和3的粒度分布相似，這表明在凍干過程中極少或沒有明礬凝聚的發(fā)生。相比之下，干燥后粉末1的顆粒尺寸顯著增加了，這表明明礬發(fā)生了顯著的凝聚。
實(shí)驗(yàn)2凝聚對(duì)含有乙肝疫苗的明礬的穩(wěn)定性的影響我們研究了明礬的凝聚對(duì)被明礬吸附的乙肝疫苗的免疫原性的影響。如前所述，當(dāng)用凍干方法干燥乙肝疫苗(含有明礬)時(shí)凝聚很嚴(yán)重，而噴霧凍干的乙肝疫苗則沒有發(fā)生凝聚。在該小鼠實(shí)驗(yàn)中，我們比較了凍干的和噴霧凍干的乙肝疫苗的免疫原性。為了確定何種級(jí)分的疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性，我們比較了未分級(jí)的和不同級(jí)分(直徑分別為＜20、38-45和53-75μm)的凍干的乙肝疫苗的免疫原性。實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)如表4所示。
表4小鼠免疫原性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

*配方A和B的詳情見上文。
用蒸餾水將粉末復(fù)水，然后用其來(lái)對(duì)Balb/C小鼠(雌性，每組8只，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)5-7周齡)進(jìn)行免疫。采用23 1/5的針頭通過腹膜注射來(lái)施用復(fù)水的疫苗。每次注射200 l含有被明礬吸附的2μg乙肝表面抗原的溶液。用未處理的液體乙肝疫苗為對(duì)照組小鼠免疫。經(jīng)過免疫初期(0天)和免疫加強(qiáng)期(28天)，對(duì)在第42天收集的血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，從而測(cè)定對(duì)乙肝疫苗的免疫反應(yīng)。對(duì)照參比血清來(lái)確定抗體的滴定度。
如圖3所示，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地表明，由凍干引起的明礬凝聚導(dǎo)致了乙肝疫苗免疫原性的降低甚至喪失。與未處理的液體疫苗相比，凍干的乙肝疫苗(組1)的免疫原性降低了。凍干顆粒的免疫原性與顆粒的尺寸成反比(組2、3和4)。顆粒尺寸較大的級(jí)分的免疫原性比尺寸較小的顆粒的免疫原性低。這清楚地表明，由凝聚形成的大尺寸的顆粒的免疫力受到了損失。與未處理的疫苗相比，噴霧凍干的乙肝疫苗保持了其免疫原性(組5和6)。明礬在全部干燥物中的含量(50％或12％)對(duì)干燥粉末的免疫力沒有影響。兩種噴霧凍干的粉末均沒有凝聚的問題。噴霧凍干配方保持了明礬鹽佐劑在很高濃度(3％重量)下的免疫力，這一點(diǎn)非常重要。
綜合上述數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，采用凍干技術(shù)的明礬的凝聚與明礬疫苗的免疫力的損失有關(guān)。據(jù)信那些凝聚形成的大尺寸的顆粒在體內(nèi)不溶解，它們不能被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞處理，因而不具有免疫力。更重要的是，本發(fā)明的方法可制備穩(wěn)定的干燥粉末，該粉末中的疫苗含有明礬而不會(huì)引起凝聚。據(jù)信，噴霧凍干方法中所采用的在液氮中迅速冷凍的步驟，對(duì)于阻止凝聚具有關(guān)鍵作用，而阻止凝聚就保持了免疫力。
實(shí)驗(yàn)3賦形劑和干燥方法對(duì)噴霧凍干的乙肝疫苗的穩(wěn)定性的影響在本實(shí)驗(yàn)中，研究了賦形劑和不同的噴霧凍干方法對(duì)明礬疫苗的穩(wěn)定性的影響。采用被氫氧化鋁吸附的乙肝表面抗原(HbsAg)作為模型抗原(model antigen)。此外，通過兩種不同的免疫途徑，研究了噴霧凍干的粉末對(duì)小鼠的免疫原性。前述兩種免疫途徑為，用針頭進(jìn)行肌肉注射和用無(wú)針粉末注射器進(jìn)行表皮粉末免疫。噴霧凍干配方的賦形劑如表5所示。在此情形下，噴霧凍干配方采用了兩種糖和一種聚合物的組合。沒有采用氨基酸/氨基酸鹽。噴霧凍干的條件同表3，但是沒有采用壓縮/研磨/篩分步驟。噴霧凍干粉末的粒度分布亦如表5所示。
表5噴霧凍干配方的比較

在小鼠實(shí)驗(yàn)中研究了噴霧凍干配方的免疫原性。采用了Balb/C小鼠(雌性，每組8只，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)5-7周齡)。該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)如表6。肌肉注射(IM)時(shí)，在蒸餾水中將粉末復(fù)水，用23 1/5的針頭將200 l該溶液注射入四頭肌，該溶液含有被明礬吸附的2μg乙肝表面抗原。對(duì)于透皮(EPI)粉末免疫，采用可重新灌粉的粉末給藥裝置向剃掉毛的小鼠腹部皮膚施藥。通過肌肉注射采用未處理的乙肝疫苗給對(duì)照組小鼠免疫。經(jīng)過免疫初期(0天)和免疫加強(qiáng)期(28天)，對(duì)在第42天收集的血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，從而測(cè)定對(duì)乙肝疫苗的免疫反應(yīng)。對(duì)照參比血清來(lái)確定抗體的滴定度。
表6小鼠免疫研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究的結(jié)果如圖4所示，該結(jié)果清楚地顯示，不論是復(fù)水后通過肌肉途徑施藥，還是用粉末經(jīng)皮膚施藥，三種噴霧凍干的乙肝疫苗均對(duì)小鼠具有免疫原性。這些配方采用了不同的賦形劑，但這些配方的免疫原性沒有明顯差異。所有這些配方在復(fù)水時(shí)均沒有凝聚的問題(未顯示數(shù)據(jù))。這進(jìn)一步證明，噴霧凍干方法中的快速冷凍步驟是使明礬穩(wěn)定的關(guān)鍵步驟。賦形劑的作用較不重要。該研究還表明，被明礬吸附的噴霧凍干的疫苗對(duì)于通過不同途徑的免疫，例如復(fù)水后肌肉注射或以粉末形式透皮給藥的免疫均是有用的。
實(shí)驗(yàn)4噴霧凍干的白喉-破傷風(fēng)類毒素疫苗的免疫原性為了確定可用噴霧凍干方法制備穩(wěn)定的含有明礬的其他疫苗，我們采用來(lái)自CSL Limited公司(澳大利亞)的白喉-類毒素疫苗制備了噴霧凍干的粉末。該商品疫苗含有5％ w/v的磷酸鋁，該磷酸鋁分別吸附了濃度為563Lf/mL的白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素。根據(jù)表3所述的條件制備噴霧凍干的白喉-破傷風(fēng)-類毒素疫苗，隨后進(jìn)行壓縮/研磨/篩分，從而得到平均粒徑為20-38μm和38-53μm的顆粒配方的信息歸結(jié)于表7。復(fù)水后用光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，這些顆粒不存在凝聚的問題(未顯示數(shù)據(jù))。
表7

用豚鼠(Charles River)測(cè)定了該噴霧凍干的白喉-破傷風(fēng)-類毒素疫苗的免疫原性。采用粉末給藥裝置在第0天和第28天在豚鼠(4只/組)的腹部皮膚施藥進(jìn)行免疫。每只豚鼠接受0.5mg的粉末，該粉末含有被250μg磷酸鋁吸附的1.5Lf白喉類毒素和1.5Lf破傷風(fēng)類毒素。用23 1/2的針頭將未處理的疫苗通過肌肉注射來(lái)對(duì)對(duì)照組的豚鼠進(jìn)行免疫。采用在第42天收集的血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素的血清抗體反應(yīng)。
免疫原性研究的結(jié)果如圖5所示。用被明礬吸附的噴霧凍干的白喉類毒素進(jìn)行透皮粉末免疫，引起了每種疫苗成分的抗體反應(yīng)，而且其抗體滴定度與由未處理的疫苗透皮注射所導(dǎo)致的滴定度相似。噴霧凍干的粉末的尺寸似乎對(duì)免疫原性沒有明顯影響，因?yàn)檫@些粉末沒有在體內(nèi)的凝聚問題。噴霧凍干配方顆粒的較小尺寸的級(jí)分比較大尺寸的級(jí)分對(duì)白喉類毒素導(dǎo)致的滴定度稍低一些。該研究再次表明，噴霧凍干方法保持了干燥固體劑量形式的含有明礬的疫苗的免疫力。
因此，我們描述了新的噴霧凍干粉末組合物及其制備方法。盡管本發(fā)明對(duì)優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，只要不違背所附權(quán)利要求規(guī)定的本發(fā)明的精神和范圍，可以對(duì)其進(jìn)行顯著的變化。
權(quán)利要求
1.適于用作疫苗的粉末，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)，所述粉末是將含有如下組分的水懸浮液經(jīng)噴霧干燥或噴霧凍干而形成的(a)吸附了抗原的0.1-0.95％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(b)0.5-6％重量的糖；(c)0.1-2％重量的氨基酸或其鹽；和(d)0.02-1％重量的膠體物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的粉末，其中的佐劑是氫氧化鋁或磷酸鋁。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的粉末，其中的佐劑是硫酸鋁或磷酸鈣。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的抗原是細(xì)菌或病毒抗原。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的糖是單糖、二糖或糖醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的粉末，其中的糖選自由葡萄糖、木糖、半乳糖、果糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、蔗二糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、丙三醇、赤蘚醇和阿糖醇組成的組。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的氨基酸是酸性、中性或堿性的氨基酸。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的氨基酸或其鹽選自由甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸和谷氨酸單鈉鹽組成的組。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的膠體物質(zhì)選自由多糖、水凝膠和蛋白質(zhì)組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的粉末，其中所述物質(zhì)選自由葡聚糖、麥芽糖-葡聚糖復(fù)合劑、白明膠、瓊脂糖和人的血清蛋白組成的組。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的水懸浮液含有0.2到0.4％重量的吸附了抗原的佐劑，2到4％重量的糖，0.75％到1.25％重量的氨基酸或其鹽，以及0.07％到0.3％重量的膠體物質(zhì)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中含有(i)吸附了抗原的7-50％重量的佐劑；(ii)30-80％重量的糖；(iii)7-30％重量的氨基酸或其鹽；和(iv)0.8-6％重量的膠體物質(zhì)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，所述粉末的質(zhì)量中位空氣動(dòng)力學(xué)直徑是10到100μm，堆密度是0.8到1.5g/cm3。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的粉末，其中的粉末被加入蒸餾水(重量比為1∶500)中并搖晃3分鐘后，形成了類似于凝膠體的懸浮液而沒有形成沉淀。
15.適于用作疫苗的粉末的制備方法，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)，所述方法包括將含有如下組分的水懸浮液噴霧干燥或噴霧凍干的步驟(a)吸附了抗原的0.1-0.95％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(b)0.5-6％重量的糖；(c)0.1-2％重量的氨基酸或其鹽；和(d)0.02-1％重量的膠體物質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中的水懸浮液含有吸附了抗原的0.2-0.4％重量的佐劑，2-4％重量的糖，0.75-1.25％重量的氨基酸或其鹽，以及0.07-0.3％重量的膠體物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其中所得到的粉末被加入蒸餾水(重量比為1∶500)中并搖晃3分鐘后，形成了類似于凝膠體的懸浮液而沒有形成沉淀。
18.無(wú)針注射器的劑量容器，所述容器裝有有效量的權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)所定義的粉末，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的容器，其中的容器選自由膠囊、箔袋、小袋和盒子組成的組。
20.無(wú)針注射器，其中裝有權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)所定義的粉末，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)。
21.疫苗組合物，其中含有藥用載體或稀釋劑，以及權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)所定義的粉末，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)。
22.對(duì)受試者免疫的方法，其中的方法包括給所述受試者施用權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)所定義的粉末的步驟，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中的粉末采用無(wú)針注射器給藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中的粉末與藥用載體或稀釋劑一起配制。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的制劑經(jīng)皮下或肌肉施用。
26.適于用作疫苗的可形成凝膠體的自由流動(dòng)的粉末，所述粉末含有(i)吸附了抗原的5-60％重量的鋁鹽或鈣鹽佐劑；(ii)25-90％重量的糖；(iii)4.5-40％重量的氨基酸或其鹽；和(iv)0.5-10％重量的膠體物質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的粉末，其中含有(i)吸附了抗原的7-50％重量的佐劑；(ii)30-80％重量的糖；(iii)7-30％重量的氨基酸或其鹽；和(iv)0.8-6％重量的膠體物質(zhì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的粉末，其中的粉末被加入蒸餾水(重量比為1∶500)中并搖晃3分鐘后，形成了類似于凝膠體的懸浮液而沒有形成沉淀。
29.適于用作疫苗的粉末，所述粉末由噴霧凍干水懸浮液而得到，所述水懸浮液含有吸附了抗原的鋁鹽或鈣鹽佐劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的粉末，其中的佐劑是氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或磷酸鈣。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的粉末，其中的抗原是細(xì)菌或病毒抗原。
32.根據(jù)權(quán)利要求29到31任一項(xiàng)的粉末，其中的水懸浮液含有少于10％重量的吸附了抗原的佐劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求29到32任一項(xiàng)的粉末，所述粉末的質(zhì)量中位空氣動(dòng)力學(xué)直徑是1到100μm，堆密度是0.8到1.5g/cm3。
34.根據(jù)權(quán)利要求29到33任一項(xiàng)的粉末，其中的懸浮液進(jìn)一步含有無(wú)定形糖、結(jié)晶糖和選擇性地含有聚合物和/或氨基酸或其鹽。
35.根據(jù)權(quán)利要求29到34任一項(xiàng)的粉末，其中的粉末被加入蒸餾水(重量比為1∶500)中并搖晃3分鐘后，形成了類似于凝膠體的懸浮液而沒有形成沉淀。
36.適于用作疫苗的粉末的制備方法，所述方法包括噴霧凍干水懸浮液的步驟，所述水懸浮液含有吸附了抗原的鋁鹽或鈣鹽佐劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中的佐劑是氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁或磷酸鈣。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中的抗原是細(xì)菌或病毒抗原。
39.根據(jù)權(quán)利要求36到38任一項(xiàng)的方法，其中的水懸浮液含有少于10％重量的吸附了抗原的佐劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求36到39任一項(xiàng)的方法，其中的懸浮液進(jìn)一步含有無(wú)定形糖、結(jié)晶糖和選擇性地含有聚合物和/或氨基酸或其鹽。
41.根據(jù)權(quán)利要求36到40任一項(xiàng)的方法，其中所得到的噴霧凍干的粉末被加入蒸餾水(重量比為1∶500)中并搖晃3分鐘后，形成了類似于凝膠體的懸浮液而沒有形成沉淀。
43.無(wú)針注射器的劑量容器，所述容器裝有有效量的權(quán)利要求29到35任一項(xiàng)所定義的粉末。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的容器，其中的容器選自由膠囊、箔袋、小袋和盒子組成的組。
45.無(wú)針注射器，其中裝有權(quán)利要求29到35任一項(xiàng)所定義的粉末。
46.疫苗組合物，其中含有藥用載體或稀釋劑，以及權(quán)利要求29到35任一項(xiàng)所定義的粉末。
47.對(duì)受試者免疫的方法，其中的方法包括給所述受試者施用有效量的權(quán)利要求29到35任一項(xiàng)所定義的粉末的步驟。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中的粉末采用無(wú)針注射器給藥。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中的粉末與藥用載體或稀釋劑一起配制。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中的制劑經(jīng)皮下或肌肉施用。
全文摘要
通過將水懸浮液噴霧干燥或噴霧凍干制備了適于用作疫苗的粉末，所述粉末可形成凝膠體并可自由流動(dòng)，所述水懸浮液含有吸附了抗原的鋁鹽或鈣鹽佐劑、糖、氨基酸或其鹽以及膠體物質(zhì)。還通過將此吸附了抗原的佐劑的水懸浮液噴霧凍干，制備了用作疫苗的粉末。還描述了制備此類粉末組合物的方法以及在免疫過程中使用此類組合物的方法。
文檔編號(hào)A61K47/16GK1438874SQ01811745
公開日2003年8月27日 申請(qǐng)日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月8日
發(fā)明者尤哈·富恩·馬, 趙路, 史蒂文·約瑟夫·普雷斯蒂若斯科 申請(qǐng)人:寶德杰克特疫苗有限公司