專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子受體亞單位蛋白、相關(guān)試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及影響哺乳動(dòng)物生理(包括免疫系統(tǒng)功能)的組合物及方法。本發(fā)明特別涉及調(diào)節(jié)發(fā)育和/或免疫系統(tǒng)的方法。還公開了所述物質(zhì)的診斷及治療用途。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)一般是指將供體來源的遺傳信息整合入載體，然后例如導(dǎo)入宿主，因此所轉(zhuǎn)移的遺傳信息在新的環(huán)境中拷貝和/或表達(dá)。一般來說，遺傳信息以編碼需要蛋白產(chǎn)物的信使RNA(mRNA)產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA(cDNA)形式存在。載體通常為一種質(zhì)粒，能夠?qū)隿DNA，然后在宿主中復(fù)制，在某些情況下，實(shí)際上是控制cDNA表達(dá)，由此控制編碼產(chǎn)物在宿主中合成。參見例如Sambrook等，(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，(第二版)，第1-3卷，CSH Press，NY。
一段時(shí)間以來，人們知道，哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)是一系列的復(fù)雜細(xì)胞相互作用，稱之為“免疫網(wǎng)絡(luò)”。最新研究對(duì)該網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部作用機(jī)制獲得了新的認(rèn)識(shí)。盡管實(shí)際上許多免疫反應(yīng)均涉及淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和其它細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樣相互作用，但是免疫學(xué)者目前普遍認(rèn)為，稱為淋巴因子、細(xì)胞因子或單核細(xì)胞因子的可溶性蛋白在控制上述細(xì)胞相互作用中起重要作用。因此，細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分離、鑒定和作用機(jī)制非常引人注目，對(duì)它們的了解可使得眾多醫(yī)學(xué)上的異常例如免疫系統(tǒng)疾病的診斷和治療獲得顯著改善。
顯而易見的是，淋巴因子以多種方式介導(dǎo)細(xì)胞活動(dòng)。參見例如Paul(主編，1996)Fundamental Immunology，第三版，Raven Press，NewYork；Thomson(主編，1994)The Cytokine Handbook，第二版，AcademicPress，San Diego。已經(jīng)證實(shí)，它們促進(jìn)多能造血干細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和/或分化為數(shù)量巨大的祖細(xì)胞，包括構(gòu)成復(fù)雜免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞譜系。細(xì)胞組分之間的正常平衡的相互作用是健康免疫系統(tǒng)所必需的。當(dāng)淋巴因子與其它藥物一起給予時(shí)，常常不同細(xì)胞譜系的反應(yīng)不同。
免疫反應(yīng)特別重要的細(xì)胞譜系包括兩類淋巴細(xì)胞B細(xì)胞和各種亞型的T細(xì)胞，B細(xì)胞產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白(免疫球蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合外源物質(zhì)，以便消除外源物質(zhì))，T細(xì)胞分泌淋巴因子并誘導(dǎo)或抑制B細(xì)胞以及構(gòu)成免疫網(wǎng)絡(luò)的各種其它細(xì)胞(包括其它T細(xì)胞)。所述淋巴細(xì)胞與許多其它細(xì)胞類型相互作用。
一般不能在體外維持免疫系統(tǒng)細(xì)胞，這阻礙了目的在于更好地了解和治療各種免疫疾病的研究。免疫學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用包含各種生長(zhǎng)因子(包括許多淋巴因子)的T細(xì)胞上清液和其它細(xì)胞上清液可對(duì)許多上述細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
存在調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)育的各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。已知許多細(xì)胞因子受體。功能受體通常存在至少兩個(gè)重要亞單位。參見例如Heinrich等，(1998)Biochem.J.334297-314；Gonda和D’Andrea(1997)Blood89355-369；Presky等，(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9314002-14007；Drachman和Kaushansky(1995)Curr.Opin.Hematol.222-28；Theze(1994)Eur.Cytokine Netw.5353-368；Lemmon和Schlessinger(1994)Trends Biochem.Sci.19459-463。
如上所述，顯而易見的是，對(duì)于直接或間接涉及例如免疫系統(tǒng)和/或造血細(xì)胞的發(fā)育、分化或功能的各種變性性病癥或異常病癥而言，發(fā)現(xiàn)和研制新的可溶性蛋白及其受體，包括類似于淋巴因子的可溶性蛋白及其受體，應(yīng)該可以獲得新的治療方法。具體來說，發(fā)現(xiàn)和了解增強(qiáng)其它淋巴因子有益作用的淋巴樣分子的新型受體，應(yīng)該是非常有益的。本發(fā)明提供與細(xì)胞因子樣組合物和相關(guān)化合物相似的配體的新型受體及其使用方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與細(xì)胞因子受體有關(guān)的新型受體及其生物活性，例如靈長(zhǎng)類細(xì)胞因子受體樣分子結(jié)構(gòu)，稱為DNAX細(xì)胞因子受體亞單位(DCRS)。具體來說，本發(fā)明說明稱為DCRS5的一種亞單位。本發(fā)明包括編碼所述多肽本身的核酸及其生產(chǎn)和使用方法。本發(fā)明核酸的特征部分在于其與本文公開的克隆互補(bǔ)DNA(cDNA)序列同源。此外，本發(fā)明提供匹配的p40/IL-B30配體與受體亞單位DCRS5和IL-12Rβ1，所述受體配體對(duì)使得可以了解其直接涉及反應(yīng)物為基礎(chǔ)的激動(dòng)劑和拮抗劑的使用適應(yīng)癥。
本發(fā)明提供大致純多肽或重組多肽，該多肽包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)部分的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)部分的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸；為重組多肽，它包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)部分；還包含SEQ ID NO2非細(xì)胞內(nèi)部分的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸；包含SEQ ID NO2細(xì)胞外部分的至少25個(gè)氨基酸；包含成熟SEQ ID NO2；或者為大致純天然多肽。在其它實(shí)施方案中，所述重組多肽由表1的成熟序列組成；為非糖基化多肽；為來自人類的多肽；包含SEQ ID NO2的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸；具有SEQ ID NO2的至少3個(gè)非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少15個(gè)連續(xù)氨基酸；為SEQ ID NO2的天然多態(tài)性變異體；其長(zhǎng)度為至少約30個(gè)氨基酸；具有至少2個(gè)非重疊表位，其為靈長(zhǎng)類DCRS5特異性表位；其分子量至少為30kD，天然糖基化；為合成多肽；為無菌形式；為水性溶液或緩沖溶液；其附著在固體支持物上；其與另一個(gè)化學(xué)部分綴合；或者與IL-12Rβ1多肽物理性締合。
本發(fā)明其它實(shí)施方案提供包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)部分至少2個(gè)不同非重疊區(qū)段的大致純多肽或重組多肽，每個(gè)區(qū)段至少6個(gè)連續(xù)氨基酸；包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)部分至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的大致純多肽或重組多肽；或者包含成熟SEQ ID NO2的大致純天然序列多肽。在具體形式中，包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)部分至少2個(gè)不同非重疊區(qū)段(每個(gè)區(qū)段至少6個(gè)連續(xù)氨基酸)的多肽中，所述不同非重疊區(qū)段一個(gè)區(qū)段包含至少12個(gè)氨基酸；一個(gè)包含至少7個(gè)氨基酸的區(qū)段，以及第二個(gè)至少9個(gè)氨基酸的區(qū)段；包含第三個(gè)至少6個(gè)氨基酸的不同區(qū)段；或者包含以下其中之一R355-L373、P378-L405、V407-D426、K428-D439、P441-V452、I454-G460、I465-T587或N592-606；或者所述多肽還包含SEQ ID NO2細(xì)胞外部分的至少2個(gè)不同非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少6個(gè)連續(xù)氨基酸。或者，包含SEQ ID NO2細(xì)胞內(nèi)的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽中，所述至少12個(gè)連續(xù)氨基酸區(qū)段包含以下其中之一R355-L373、P378-L405、V407-D426、K428-D439、P441-V452、I454-G460、I465-T587或N592-606；或者所述多肽還包含SEQ ID NO2細(xì)胞外部分的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸的至少2個(gè)不同非重疊區(qū)段?；蛘撸墒霺EQ IDNO2的純化天然序列多肽還可包含純化或檢測(cè)表位。所述多肽可以由表1成熟序列組成；為非糖基化多肽；來自人類；包含SEQ IDNO2的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸；具有SEQ ID NO2的至少3個(gè)非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少15個(gè)連續(xù)氨基酸；為SEQ ID NO2的天然多態(tài)性變異體；長(zhǎng)度至少約30個(gè)氨基酸；具有至少2個(gè)靈長(zhǎng)類DCRS5特異性非重疊表位；分子量至少30kD(天然糖基化)；為合成多肽；為無菌形式；為水性溶液或緩沖溶液；與固體支持物連接；與另一個(gè)化學(xué)部分綴合；或者與IL-12β1多肽物理性締合。
提供各種其它組合物，例如其包含與IL-12β1蛋白混合的大致純多肽；或在載體中包含所述多肽，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖劑；和/或配制用于口服、直腸、鼻、局部、或胃腸外給藥。
提供試劑盒，其包含所述多肽以及包含所述多肽的區(qū)室；包含IL-12β1多肽的區(qū)室；包含p40、IL-B30或p40/IL-B30多肽的區(qū)室；或者試劑盒試劑的使用或處理說明書。
提供特異性結(jié)合DCRS5的細(xì)胞內(nèi)部分的抗體和其它結(jié)合化合物，例如包含抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中所述結(jié)合化合物裝在一個(gè)容器中；所述多肽來自人類；所述結(jié)合化合物為Fv、Fab或Fab2片段；所述結(jié)合化合物與另一個(gè)化學(xué)部分綴合；或者所述抗體針對(duì)表1成熟多肽的肽序列；針對(duì)成熟DCRS5；針對(duì)純化的人DCRS5；為免疫選擇性的；為多克隆抗體；結(jié)合變性DCRS5；對(duì)抗原的Kd至少為30μm；與固體支持物連接，包括珠子或塑料膜；為無菌組合物；或進(jìn)行可檢測(cè)性標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。還提供包含所述結(jié)合化合物的試劑盒包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；包含p40多肽、IL-B30多肽、DCRS5多肽和/或IL-12Rβ1多肽的區(qū)室；包含選擇性結(jié)合以下物質(zhì)的抗體的區(qū)室p40多肽、IL-B30多肽、DCRS5多肽和/或IL-12Rβ1多肽；或者試劑盒試劑的使用或處理說明書。
還提供生產(chǎn)抗原抗體復(fù)合物的方法，該方法包括在合適條件下使靈長(zhǎng)類DCRS5多肽與抗體接觸，由此形成所述復(fù)合物。所述方法可以從其它細(xì)胞因子受體純化所述復(fù)合物；從其它抗體純化所述復(fù)合物；所述接觸為與包含干擾素的樣品接觸；所述接觸允許定量檢測(cè)所述抗原；所述接觸與包含所述抗體的樣品接觸；或者所述接觸允許定量檢測(cè)所述抗體。提供其它組合物，例如包含以下組分的組合物無菌結(jié)合化合物或所述結(jié)合化合物和載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于口服、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
本發(fā)明還提供編碼DCRS5多肽的分離或重組核酸，其中DCRS5來自人類；或者所述核酸編碼表1的抗原肽序列；編碼表1的多個(gè)抗原肽序列；至少有13個(gè)核苷酸與編碼所述區(qū)段的天然cDNA相同；為表達(dá)載體；還包含復(fù)制起點(diǎn)；來自天然來源；包含可檢測(cè)標(biāo)記；包含合成核苷酸序列；小于6kb，優(yōu)選小于3kb；來自靈長(zhǎng)類；包含天然全長(zhǎng)編碼序列；為編碼DCRS5的基因的雜交探針；或者為PCR引物、PCR產(chǎn)物或突變引物。提供包含所述重組核酸的細(xì)胞，包括其中所述細(xì)胞為原核細(xì)胞；真核細(xì)胞；細(xì)菌細(xì)胞；酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞；小鼠細(xì)胞；靈長(zhǎng)類細(xì)胞；或人類細(xì)胞。
試劑盒實(shí)施方案包括所述核酸和包含所述核酸的區(qū)室；包含編碼以下組分的核酸的區(qū)室p40多肽、IL-B30多肽、DCRS5多肽、和/或IL-12Rβ1多肽；包含以下組分的區(qū)室p40多肽、IL-B30多肽、DCRS5多肽、和/或IL-12Rβ1多肽；包含選擇性結(jié)合以下組分的抗體的區(qū)室p40多肽、IL-B30多肽、DCRS5多肽、和/或IL-12Rβ1多肽；試劑盒試劑使用或處理的說明書。
其它核酸實(shí)施方案包括在30分鐘、30℃和2M以下鹽的洗滌條件下與SEQ ID NO1編碼細(xì)胞內(nèi)部分的部分雜交；在至少約30個(gè)核苷酸區(qū)段上與靈長(zhǎng)類DCRS5的細(xì)胞內(nèi)部分相同。優(yōu)選所述核酸為這樣的核酸，其中所述洗滌條件為45℃和/或500mM鹽；或55℃和/或150mM鹽；或者所述區(qū)段為至少55個(gè)或75個(gè)核苷酸。
治療應(yīng)用包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生理或發(fā)育的方法，該方法包括使所述細(xì)胞接觸p40/IL-B30的拮抗劑，所述拮抗劑是包含以下組份的復(fù)合物靈長(zhǎng)類DCRS5的細(xì)胞外部分和/或靈長(zhǎng)類IL-12Rβ1細(xì)胞外部分；p40/IL-B30的拮抗劑，為結(jié)合包含靈長(zhǎng)類DCRS5和/或靈長(zhǎng)類IL-12Rβ1的復(fù)合物的抗體；p40/IL-B30的拮抗劑，為結(jié)合DCRS5的抗體；p40/IL-B30的拮抗劑，為抗IL-12Rβ1的抗體；p40/IL-B30的拮抗劑，為DCRS5或IL-4Rβ1的反義核酸；或p40/IL-B30的激動(dòng)劑，為結(jié)合包含靈長(zhǎng)類DCRS5和/或靈長(zhǎng)類IL-12Rβ1的復(fù)合物的抗體。在一種類型的方法中，所述接觸為與拮抗劑接觸，而且所述接觸為與IL-12、IL-18、TNF和/或IFNγ的拮抗劑混合；或者所述細(xì)胞來自這樣的宿主，所述宿主表現(xiàn)出慢性TH1介導(dǎo)性疾病的體征或癥狀；表現(xiàn)出多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、糖尿病、牛皮癬或膿毒病的癥狀或體征；或者接受同種異體移植。相反，所述方法可與激動(dòng)劑接觸，而且所述接觸與IL-12、IL-18、TNF或IFNγ混合；或者所述細(xì)胞來自這樣的宿主表現(xiàn)出慢性Th2型反應(yīng)的體征或癥狀；存在腫瘤、病毒生長(zhǎng)或真菌生長(zhǎng)；接受疫苗；存在變態(tài)反應(yīng)。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述大綱I.總論II.活性III.核酸A.編碼片段、序列、探針B.突變、嵌合體、融合體C.制備核酸D.細(xì)胞包含的載體IV.蛋白質(zhì)、肽A.片段、序列、免疫原、抗原B.突變蛋白C.激動(dòng)劑/拮抗劑、功能等同物D.制備蛋白V.制備核酸、蛋白A.合成B.重組C.天然來源VI.抗體A.多克隆抗體B.單克隆抗體C.片段；KdD.抗同種型抗體E.雜交瘤細(xì)胞系
VII.試劑盒、診斷及定量檢測(cè)A.ELISAB.檢測(cè)編碼的mRNAC.定量/定性D.試劑盒VIII.治療組合物、方法A組合組合物B.單位劑量C.使用方法IX.篩選I.總論本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物(本文為靈長(zhǎng)類)細(xì)胞因子受體樣亞單位分子的氨基酸序列和DNA序列，所述細(xì)胞因子受體樣亞單位分子稱為DNAX細(xì)胞因子受體亞單位5(DCRS5)，其具有特別定義的結(jié)構(gòu)及生物特性。編碼上述分子的各種cDNA得自靈長(zhǎng)類(例如人類)cDNA序列文庫。其它靈長(zhǎng)類或其它哺乳動(dòng)物的相應(yīng)物質(zhì)也是所要求的。
此外，本發(fā)明提供匹配的p40/IL-B30和受體亞單位DCRS5和IL-12Rβ1，所述配對(duì)可了解基于其涉及試劑的激動(dòng)劑和拮抗劑的應(yīng)用適應(yīng)癥。
某些適用的標(biāo)準(zhǔn)方法可參見例如Maniatis等(1982)MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Press；Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，(第二版)，第13卷，CSH Press，NY；Ausubel等，Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel等(1987和定期增刊)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York；各參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
靈長(zhǎng)類(例如人類)的DCRS5的編碼區(qū)段的核苷酸序列(SEQ IDNO1)及相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO2)見表1。標(biāo)示出了預(yù)期的信號(hào)序列，但是所述信號(hào)序列可能取決于細(xì)胞類型，或者可能為任一方向的數(shù)個(gè)殘基。潛在的N糖基化位點(diǎn)為天冬酰胺殘基6、24、58、118、157、209和250。二硫鍵可能存在于位置29和78的半胱氨酸之間；保守的C_CXW基元存在于位置110/121/123。位置219的色氨酸以及281-285的WxxWS基元是值得注意的。約1-101區(qū)段為Ig結(jié)構(gòu)域；約102-195為細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域1；約196-297為細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域2；約298-330為接頭；約329-354為跨膜區(qū)段；約356-606為細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)特征包括Y374-I377、Y461-Q464和Y588-Q591的推定SH2結(jié)合位點(diǎn)；潛在重要的406、427、440和453酪氨酸殘基。這些位點(diǎn)和邊界是值得注意的。
ORF包含推定的信號(hào)序列，如上所述，預(yù)期信號(hào)序列于...CHG/GIT...切割。預(yù)期的328個(gè)氨基酸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域之后為推定的跨膜區(qū)段，最后為約252個(gè)氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
表2提供反向翻譯的核酸序列。
表1DNAX細(xì)胞因子受體亞單位樣實(shí)施方案(DCRS5)的核苷酸及多肽序列。靈長(zhǎng)類，例如人類實(shí)施方案(見SEQ ID NO1和2)。標(biāo)示出了預(yù)期的信號(hào)序列，但是可能在幾個(gè)位置有變化而且取決于細(xì)胞類型。鑒定的變異位置變異為核苷酸127和563；為配對(duì)的G和C(翻譯為Q和G組合)或者T和A(翻譯為H和R)。
gtggtacggg aattccattg tgttgggcag ccaacaaggg tggcagcctg gctctgaagt 60ggaattatgt gcttcaaaca ggttgaaaga gggaaacagt cttttcctgc ttccagac 118atg aat cak gtc act att caa tgg gat gca gta ata gcc ctt tac ata 166Met Asn Xaa Val Thr Ile Gln Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile-20 -15 -10ctc ttc agc tgg tgt cat gga gga att aca aat ata aac tgc tct ggc 214Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly-5 -1 1 5cac atc tgg gta gaa cca gcc aca att ttt aag atg ggt atg aat atc 262His Ile Trp Val Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile10 15 20 25tct ata tat tgc caa gca gca att aag aac tgc caa cca agg aaa ctt 310ser Ile Tyr Cys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu30 35 40cat ttt tat aaa aat ggc atc aaa gaa aga ttt caa atc aca agg att 358His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile45 50 55aat aaa aca aca gct cgg ctt tgg tat aaa aac ttt ctg gaa cca cat 406Asn Lys Thr Thr Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His60 65 70gct tct atg tac tgc act gct gaa tgt ccc aaa cat ttt caa gag aca 454Ala Set Met Tyr Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr75 80 85ctg ata tgt gga aaa gac att tct tct gga tat ccg cca gat att cct 502Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile Set Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro90 95 100 105gat gaa gta acc tgt gtc att tat gaa tat tca ggc aac atg act tgc 550Asp Glu Val Thr Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Set Gly Asn Met Thr Cys110 115 120acc tgg aat gct rgg aag ctc acc tac ata gac aca aaa tac gtg gta 598Thr Trp Asn Ala Xaa Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val125 130 135cat gtg aag agt tta gag aca gaa gaa gag caa cag tat ctc acc tca 646His Val Lys Set Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser140 145 150
agc tat att aac atc tcc act gat tca tta caa ggt ggc aag aag tac 694Ser Tyr Ile Asn Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr155 160 165ttg gtt tgg gtc caa gca gca aac gca cta ggc atg gaa gag tca aaa 742Leu Val Trp Val Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys170 175 180 185caa ctg caa att cac ctg gat gat ata gtg ata cct tct gca gcc gtc 790Gln Leu Gln Ile His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val190 195 200att tcc agg gct gag act ata aat gct aca gtg ccc aag acc ata att 838Ile Ser Arg Ala Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile205 210 215tat tgg gat agt caa aca aca att gaa aag gtt tcc tgt gaa atg aga 886Tyr Trp Asp Ser Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg220 225 230tac aag gct aca aca aac caa act tgg aat gtt aaa gaa ttt gac acc 934Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr235 240 245aat ttt aca tat gtg caa cag tca gaa ttc tac ttg gag cca aac att 982Asn Phe Thr Tyr Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile250 255 260 265aag tac gta ttt caa gtg aga tgt caa gaa aca ggc aaa agg tac tgg 1030Lys Tyr Val Phe Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp270 275 280cag cct tgg agt tca ccg ttt ttt cat aaa aca cct gaa aca gtt ccc 1078Gln Pro Trp Ser Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro285 290 295cag gtc aca tca aaa gca ttc caa cat gac aca tgg aat tct ggg cta 1126Gln Val Thr Ser Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu300 305 310aca gtt gct tcc atc tct aca ggg cac ctt act tct gac aac aga gga 1174Thr Val Ala Ser Ile Set Thr Gly His Leu Thr Set Asp Asn Arg Gly315 320 325gac att gga ctt tta ttg gga atg atc gtc ttt gct gtt atg ttg tca 1222Asp Ile Gly Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser330 335 340 345att ctt tct ttg att ggg ata ttt aac aga tca ttc cga act ggg att 1270Ile Leu Ser Leu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly Ile350 355 360aaa aga agg atc tta ttg tta ata cca aag tgg ctt tat gaa gat att 1318Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile365 370 375
cct aat atg aaa aac agc aat gtt gtg aaa atg cta cag gaa aat agt 1366Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln Glu Asn Ser380 385 390gaa ctt atg aat aat aat tcc agt gag cag gtc cta tat gtt gat ccc 1414Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr Val Asp Pro395 400 405atg att aca gag ata aaa gaa atc ttc atc cca gaa cac aag cct aca 1462Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr410 415 420 425gac tac aag aag gag aat aca gga ccc ctg gag aca aga gac tac ccg 1510Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro430 435 440caa aac tcg cta ttc gac aat act aca gtt gta tat att cct gat ctc 1558Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu445 450 455aac act gga tat aaa ccc caa att tca aat ttt ctg cct gag gga agc 1606Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser460 465 470cat ctc agc aat aat aat gaa att act tcc tta aca ctt aaa cca cca 1654His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro475 480 485gtt gat tcc tta gac tca gga aat aat ccc agg tta caa aag cat cct 1702Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro490 495 500 505aat ttt gct ttt tct gtt tca agt gtg aat tca cta agc aac aca ata 1750Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile510 515 520ttt ctt gga gaa tta agc ctc ata tta aat caa gga gaa tgc agt tct 1798Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu Cys Ser Ser525 530 535cct gac ata caa aac tca gta gag gag gaa acc acc atg ctt ttg gaa 1846Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu540 545 550aat gat tca ccc agt gaa act att cca gaa cag acc ctg ctt cct gat 1894Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu Leu Pro Asp555 560 565gaa ttt gtc tcc tgt ttg ggg atc gtg aat gag gag ttg cca tct att 1942Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile570 575 580 585aat act tat ttt cca caa aat att ttg gaa agc cac ttc aat agg att 1990Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile Leu Glu Set His Phe Asn Arg Ile590 595 600
tca ctc ttg gaa aag tagagctgtg tggtcaaaat caatatgaga aagctgcctt 2045Ser Leu Leu Glu Lys605gcaatctgaa cttgggtttt ccctgcaata gaaattgaat tctgcctctt tttgaaaaaa 2105atgtattcac atacaaatct tcacatggac acatgttttc atttcccttg gataaatacc 2165taggtagggg attgctgggc catatgataa gcatatgttt cagttctacc aatcttgttt 2225ccagagtagt gacatttctg tgctcctacc atcaccatgt aagaattccc gggagctcca 2285tgccttttta attttagcca ttcttctgcc tmatttctta aaattagaga attaaggtcc 2345cgaaggtgga acatgcttca tggtcacaca tacaggcaca aaaacagcat tatgtggacg 2405cctcatgtat tttttataga gtcaactatt tcctctttat tttccctcat tgaaagatgc 2465aaaacagctc tctattgtgt acagaaaggg taaataatgc aaaatacctg gtagtaaaat 2525aaatgctgaa aattttcctt taaaatagaa tcattaggcc aggcgtggtg gctcatgctt 2585gtaatcccag cactttggta ggctgaggtr ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgagt 2645ccagcctggc caatatgctg aaaccctgtc tctactaaaa ttacaaaaat tagccggcca 2705tggtggcagg tgcttgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 2765ccaggaaggc agaggttgca ctgagctgag attgtgccac tgcactccag cctgggcaac 2825aagagcaaaa ctctgtctgg aaaaaaaaaa aaaa 2859MN(Q/H)VTIQWDAYIALYILFSWCHGGITNINCSGHIWVEPATIFKMGMNISIYCQAAIKNCQPRKLHFYKNGIKERFQITRINKTTARLWYKNFLEFHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMTCTWNA(G/R)KLTYIDTKYVVHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGGKKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKTIIYWDSQTTIEKVSCKMRYKATTNQTWNVKEFDTNFTYVQQSEFYLKPNIKYVFQVRCQETGKRYWQPWSSPFFHKTPETVPQVTSKAFQHDTWNSGLTVASISTGHLTSDNRGDIGLLLGMIVFAVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRRILLLIPKWLYEDIPNMKNSNVVKMLQENSELMNNNSSEQVLYVDPMITEIKEIFIPEHKPTDYKKENTGPLETRDYPQNSLFDNTTVVYIPDLNTGYKPQISNFLPEGSHLSNNNEITSLTLKPPVDSLDSGNNPRLQKHPNFAFSVSSVNSLSNTIFLGELSLILNQGECSSPDIQNSVEEETTMLLENDSPSETIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQNILESHFNRISLLEK
表2反向翻譯的靈長(zhǎng)類(例如人類)DCRS5(SEQ ID NO3)ATGAAYCAYGTNACNATHCARTGGGAYGCNGTNATHGCNYTNTAYATHYTNTTYWSNTGGTGYCAYGGNGGNATHACNAAYATHAAYTGYWSNGGNCAYATHTGGGTNGARCCNGCNACNATHTTYAARATGGGNATGAAYATHWSNATHTAYTGYCARGCNGCNATHAARAAYTGYCARCCNMGNAARYTNCAYTTYTAYAARAAYGGNATHAARGARMGNTTYCARATHACNMGNATHAAYAARACNACNGCNMGNYTNTGGTAYAARAAYTTYYTNGARCCNCAYGCNWSNATGTAYTGYACNGCNGARTGYCCNAARCAYTTYCARGARACNYTNATHTGYGGNAARGAYATHWSNWSNGGNTAYCCNCCNGAYATHCCNGAYGARYGARGTNACNTGYGHTAYGARTAYWSNGGNAAYATGACNTGYACNTGGAAYGCNMGNAARYTNACNTAYATHGAYACNAARTAYGTNGTNCAYGTNAARWSNYTNGARACNGARGARGARCARCARTAYYTNACNWSNWSNTAYATHAAYATHWSNACNGAYWSNYTNCARGGNGGNAARAARTAYYTNGTNTGGGTNCARGCNGCNAAYGCNYTNGGNATGGARGARWSNAARCARYTNCARATHCAYYTNGAYGAYATHGTNATHCCNWSNGCNGCNGTNATHWSNMGNGCNGARACNATHAAYGCNACNGTNCCNAARACNATHATHTAYTGGGAYWSNCARACNACNATHGARAARGTNWSNTGYGARATGMGNTAYAARGCNACNACNAAYCARACNTGGAAYGTNAARGARTTYGAYACNAAYTTYACNTAYGTNCARCARWSNGARTTYTAYYTNGARCCNAAYATHAARTAYGTNTTYCARGTNMGNTGYCARGARACNGGNAARMGNTAYTGGCARCCNTGGWSNWSNCCNTTYTTYCAYAARACNCCNGARACNGTNCCNCARGTNACNWSNAARGCNTTYCARCAYGAYACNTGGAAYWSNGGNYTNACNGTNGCNWSNATHWSNACNGGNCAYYTNACNWSNGAYAAYMGNGGNGAYATHGGNYTNYTNYTNGGNATGATHGTNTTYGCNGTNATGYTNWSNATHYTNWSNYTNATHGGNATHTTYAAYMGNWSNTTYMGNACNGGNATHAARMGNMGNATHYTNYTNYTNATHCCNAARTGGYTNTAYGARGAYATHCCNAAYATGAARAAYWSNAAYGTNGTNAARATGYTNCARGARAAYWSNGARYTNATGAAYAAYAAYWSNWSNGARCARGTNYTNTAYGTNGAYCCNATGATHACNGARATHAARGARATHTTYATHCCNGARCAYAARCCNACNGAYTAYAARAARGARAAYACNGGNCCNYTNGARACNMGNGAYTAYCCNCARAAYWSNYTNTTYGAYAAYACNACNGTNGTNTAYATHCCNGAYYTNAAYACNGGNTAYAARCCNCARATHWSNAAYTTYYTNCCNGARGGNWSNCAYYTNWSNAAYAAYAAYGARATHACNWSNYTNACNYTNAARCCNCCNGTNGAYWSNYTNGAYWSNGGNAAYAAYCCNMGNYTNCARAARCAYCCNAAYTTYGCNTTYWSNGTNWSNWSNGTNAAYWSNYTNWSNAAYACNATHTTYYTNGGNGARYTNWSNYTNATHYTNAAYCARGGNGARTGYWSNWSNCCNGAYATHCARAAYWSNGTNGARGARGARACNACNATGYTNYTNGARAAYGAYWSNCCNWSNGARACNATHCCNGARCARACNYTNYTNCCNGAYGARTTYGTNWSNTGYYTNGGNATHGTNAAYGARGARYTNCCNWSNATHAAYACNTAYTTYCCNCARAAYATHYTNGARWSNCAYTTYAAYMGNATHWSNYTNYTNGARAAR
表3各種細(xì)胞因子受體亞單位對(duì)比。人IL-6受體蛋白gp130為SEQ ID NO4(GenBank M57230)；人IL-12受體β2亞單位為SEQID NO5(GenBank U64198)。
huIL-12R 2 1 MAHTFRGCSLAFMFIITWLLIKAKIDACKRGDVTVKPSHVILLGSTVN 48hugp130 1 MLTLQTWVVQALFIFLTTESTGELLDPCG---YISPESPVVQLHSNFT 45huDCRS5 1 MNHVTIQWDAVIALYILFSWCHGGITNINCS-GHIWVEPATFFKMGMNIS 49* . * . . . .
huIL-12R 2 49 ITCSLKPRQGCFHYSRRNKLILYKFDRRINFHHGHSLNSQVTGLPLG--- 95hugp130 46 AVCVLKEKCMDYFHVNANYIVWKTNHFTIPKEQYTIINRTASSVTFTDIA 95huDCRS5 50 IYCQAAIKN--CQP---RKLHFYKNGIKER-FQITRINKTTARLWYKNFL 93*. .. .* . .
huIL-12R 2 96 --TTLFVCKLACINSD-EIQICGAEIFVGVAPEQPQNLSCIQKGEQGTVA 142hugp130 96 SLNIQLTCNILTFGQL-EQNVYGITIISGLPPEKPKNLSCIVN-EGKKMR 143huDCRS5 94 EPHASMYCTAECPKHFQETLICGKDISSGYPPDIPDEVTCVIYEYSGNMT 143* . * . * * * *. * ..*..
huIL-12R 2 143 CTWERGRDTHLYTEYTLQLSGPKNLTWQKQCKDIYCDYLDFGINLTPESP 192hugp130144 CEWDGGRETHLETNFTLKS--EWATHKFADCKAKRDTPTSCTVDYS-TVY 190huDCRS5144 CTWNARKLTYIDTKYVVHVKSLETEEEQQYLTSSYINISTDSLQGG---- 189**. * . * . ...
huIL-12R 2 193 ESNFTAXVTAVNSLGSSSSLPSTFTFLDIVRPLPPWDIRIKFQKASVSRC 242hugp130191 FVNIEVWVEAENALGKVTSDEINFDPVYKVKPNPPHNLSVINSEELSSIL 240
huDCRS5190 -KKYLVWVQAANALGMEESKQLQIHLDDIVIPSAAVISRAETINATVPKT 238***.** * * *huIL-12R 2 243 TLYWRD----EGLVLLNRLRYRPSNSRLWNMVN---VTKAKGRHDLLDLK 285hugp130241 KLTWTNPSIKSVIILKYNIQYRTKDASTWSQIPPEDTASTRSSFTVQDLK 290huDCRS5239 IIYWDS--QTTIEKVSCEMRYKATTNQTWNVKEFD-TNFTYVQQSEFYLE 285. * . ..*. * .*huIL-12R 2 286 PFTEYEFQISSKLHLYKGSWSDWSESLRAQTPEEEPTGMLDVWYMKRHID 335hugp130291 PFTEYVFRIRCMKEDGKGYWSDWSEEASGITYEDRPSKAPSFWYKIDPSH 340huDCRS5286 PNIKYVFQVRCQ-ETGKRYWQPWSSPFFHKTPETVP-------------- 320* **.. . * * ** ** *huIL-12R 2 336 YS-RQQISLFWKNLSVSEARGKILHYQVTLQELTGGKAMTQNITGHTSWT 384hugp130341 TQGYRTVQLVWKTLPPFEANGKILDYEVT---LTRWKSHLQNYTVNATKL 387huDCRS5321 -----QVTSKAFQHDTWNSGLTVASISTG------HLTSDN--RGDIGLL 357. . . . .
huIL-12R 2 385 TVIPRTGNWAVAVSAANSKGSSLPTRINIMNLCEAGLLAPRQVSANSEGM 434hugp130388 TVNLTNDRYLATLTVRNLVGKSDAAVLTIP-ACDFQATHPVMDLKAFPKD 436huDCRS5358 LGMIVFAVMLSILSLIGIFNRSFRTGIKRR-------------------- 387.. . . * . .
huIL-12R 2 435 DNILVTWQPPRKDPSAVQEYVVEWRELHPG-GDTQVPLNWLRSRPYNVSA 483hugp130437 NMLWVEWTTPRE---SVKKYILEWCVLS---DKAPCITDWQQEDGTVHRT 480huDCRS5388 ----------------ILLLIPKWLYEDIPNMKNSNVVKMLQEN----SE 417. . * .
huIL-12R 2 484 LISENIKSYICYEIRVYALSGDQ-GGCSSILGNSKHKAPLSGPHINAITE 532hugp130481 YLRGNLAESKCYLITVTPVYADGPGSPESIKAYLKQAPPSKGPTVRTKKV 530huDCRS5418 LMNNNSSE--------QVLYVDP-----MITEIKEIFIPEHKPTDYKKE- 453. * . * ** *huIL-12R 2 533 EKGSILISWNSIPVQEQMGCLLHYRIYWKERDSNSQPQLCEIPYRVSQNS 582hugP130531 GKNEAVLEWDQLPVDVQNGFIRNYTIFYRTIIGN----ETAVNVDSSHTE 576huDCRS5454 --NTGPLETRDYP---QNSLFDNTTVVYIPDLNTG------YKPQISN-- 490. . * * . . .*huIL-12R 2 583 HPINSLQPRVTYVLWMTALTAAGESSHGNEREFCLQGKAN-WMAFVAPSI 631hugp130577 YTLSSLTSDTLYMVRMAAYTDEG-GKDGPEFTFTTPKFAQGEIEAIVVPV 625huDCRS5491 ------------------FLPEG--------------------------- 495*huIL-12R 2 632 CIAIIMVGIFSTHYFQQKVFVLLAALRP-----------QWCSREIPDPA 670hugP130626 CLAFLLTTLLGVLFCFNKRDLIKKHIWPNVPDPSKSHIAQWSPHTPPRHN 675huDCRRS5 496 -----------SHLSNNN-EITSLTLKP--------------PVDSLDSG 519. .. *huIL-12R 2 671 NSTCAKKYPIAEEKTQLPLDRLLID-WPTPEDPEPLVIS--EVLHQVTPV 717hugp130676 FNSKDQMYSDGNFTDVSVVEIEANDKKPFPEDLKSLDLFKKEKINTEGHS 725huDCRS5520 NNPRLQKHPN-FAFSVSSVNSLSNT-------------I---FLGELSLI 552. . .
huIL-12R 2 718 FRHPPCSNWPQREKGIQGHQASEKDMMHSASSPPPPRALQAESRQLVDLY 767hugp13 726 SGIGGSSCMSSSRPSISSSDENESSQNTSSTVQYSTVVHSGYRHQVPSVQ 775huDCRS5553 LNQGKCS---S--PDIQNSVEEETTMLLENDSP----------------- 580.** *
huIL-12R 2 768 KVLESRGSDPKPENPACPWTVLPAGDLPTHDGYLPSN---IDDLPSHEAP 814hugp130776 VFSRSESTQPLLDSEERPEDLQLVDHVDGGDGILPRQQYFKQNCSQHESS 825huDCRS5581 --SETIPEQTLLPDEFVSCLGIVNEELPSINTYFPQN---ILESHFNR-- 623. . * . .
huIL-12R 2 815 LADSLEELEPQHISLS-----VFPSSSLHPLTFSCG-------------- 845hugp130826 PDISHFERSKQVSSVNEEDFVRLKQQISDHISQSCGSGQMKMFQEVSAAD 875huDCRS5624 ---ISLLEK 629* *hulL-12R 2 846 ----------DKLTLDQLKMRCDSLML 862hugp130876 AFGPGTEGQVERFETVGMEAATDEGMPKSYLPQTVRQGGYMPQ 918huDCRS5630 629“IL-30R”細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域最相關(guān)的是IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物gp130和IL-12Rβ2。略微相關(guān)的是GCSF受體、苗條蛋白受體、白血病抑制因子受體和CNTF受體。因此，“IL-30R”是I類細(xì)胞因子受體超家族成員，與IL-6R/IL-12R家族密切相關(guān)。
表3比較了現(xiàn)有的靈長(zhǎng)類受體亞單位序列和靈長(zhǎng)類例如人類DCRS5(IL-30R)。DCRS5與IL-6受體亞單位gp130(例如IL-6R亞單位)和IL12-Rβ2亞單位相似。DCRS5具有β亞單位特征，但是蛋白互作及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的真正序列仍然不清楚。
本文使用的術(shù)語DCRS5用以描述包含表1所示氨基酸序列的蛋白。大多數(shù)情況下，其主要片段在功能或結(jié)構(gòu)上相同，包括例如額外細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域區(qū)段。本發(fā)明還包括相應(yīng)DCRS5等位基因的序列已知的蛋白變異體，例如突變蛋白或其它結(jié)構(gòu)物。通常，所述變異體與目標(biāo)區(qū)段的序列差異約10％以下，通常具有1-11倍取代，例如2、3、5、7倍取代等。還包括所述蛋白的等位基因變異體和其它變異體，例如天然多態(tài)性。一般它結(jié)合其相應(yīng)生物配體，其可能為具有α受體亞單位的二聚體狀態(tài)，其結(jié)合親和力高，例如至少約100nM，通常約30nM以上，優(yōu)選約10nM以上，更優(yōu)選約3nM以上。所述術(shù)語在本文還用來指相關(guān)天然形式，例如等位基因、多態(tài)性變異體，以及哺乳動(dòng)物蛋白代謝變異體。所述受體復(fù)合物的優(yōu)選形式以適合配體-受體相互作用的親和選擇性結(jié)合適當(dāng)?shù)呐潴w。
本發(fā)明還包括與表1氨基酸序列具有顯著氨基酸序列同一性的各種蛋白或肽的組合。包括具有較少取代(例如最好約3-5個(gè)以下取代)的序列變異體。
主要多肽“片段”或“區(qū)段”為一個(gè)氨基酸殘基節(jié)段，其具有約8個(gè)氨基酸，一般至少10個(gè)氨基酸，更通常至少12個(gè)氨基酸，通常至少14個(gè)氨基酸，更常見至少16個(gè)氨基酸，通常至少18個(gè)氨基酸，更通常至少20個(gè)氨基酸，通常至少22個(gè)氨基酸，更常見至少24個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少26個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少28個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少約30個(gè)或30個(gè)以上的氨基酸。不同蛋白區(qū)段序列在合適長(zhǎng)度節(jié)段上可彼此比較。多數(shù)情況下，各種片段可能具有完整亞單位的功能特性，例如跨膜受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可保持所述配體的結(jié)合特性，可用以制備可溶性受體樣復(fù)合物。
通過優(yōu)化殘基匹配測(cè)定氨基酸序列同源性或序列同一性。在某些比較中，可以根據(jù)需要引入空隙。參見例如Needleham等，(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff等，(1983)Time Warps，String Edits，andMacromoleculesThe Theory and Practice of Sequence Comparison，第一章，Addison-Wesley，Reading，MA；IntelliGenetics的軟件包，Mountain View，CA；the University of Wisconsin Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，WI；各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。當(dāng)把保守取代當(dāng)成匹配時(shí)，序列同源性改變。保守取代通常包括以下類別中的取代甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。同源氨基酸序列包括細(xì)胞因子序列的天然等位基因變異體和種間變異體。通常同源蛋白或肽與表1氨基酸區(qū)段的同源性為50-100％(如果可以引入空隙的話)、60-100％(如果包括保守取代)。同源性檢測(cè)至少約70％，一般至少76％，更通常至少81％，常常至少85％，更常見至少88％，一般至少90％，更一般至少92％，通常至少94％，更通常至少95％，優(yōu)選至少96％，更優(yōu)選至少97％，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少98％或98％以上。同源性程度因所比較區(qū)段的長(zhǎng)度不同而不同。同源蛋白或肽，例如等位基因變異體，具有表1所述實(shí)施方案的最大生物活性，特別是細(xì)胞內(nèi)部分。
本文使用的術(shù)語“生物活性”用以描述(但不限于)細(xì)胞因子樣配體對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、天然免疫和/或形態(tài)發(fā)育的影響。例如上述受體應(yīng)該介導(dǎo)磷酸酶或磷酸化酶活性，所述酶活性容易用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。參見例如Hardie等(主編，1995)The Protein Kinase FactBook，第I和II卷，Academic Press，San Diego，CA；Hanks等(1991)Meth.Enzymol.20038-62；Hunter等(1992)Cell 70375-388；Lewin(1990)Cell 61743-752；Pines等(1991)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.56449-463；Parker等(1993)Nature 363736-738。所述受體或其部分可用作磷酸標(biāo)記酶，標(biāo)記普通或特異性底物。所述亞單位也可以為激發(fā)識(shí)別抗體的功能免疫原，或者為能夠結(jié)合抗體的抗原。
術(shù)語例如DCRS5的配體、激動(dòng)劑、拮抗劑和類似物呈現(xiàn)配體-受體相互作用的特性，例如其中所述受體為天然受體或抗體。細(xì)胞反應(yīng)可能通常通過受體酪氨酸激酶途徑介導(dǎo)。
此外，配體為所述受體或其類似物結(jié)合的天然配體分子，或者為天然配體的功能類似物分子。功能類似物可以為結(jié)構(gòu)修飾的配體，或者可為完全不相關(guān)分子，所述分子具有作用于合適配體結(jié)合決定簇的分子形狀。配體可用作激動(dòng)劑或拮抗劑，參見例如Goodman等(主編，1990)Goodman & Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics，Pergamon Press，New York。
也可以根據(jù)受體或抗體以及其它效應(yīng)物或配體的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)。參見例如Herz等(1997)J.Recept.SignalTransduct.Res.17671-776；Chaiken等(1996)Trends Biotechnol.14369-375。效應(yīng)物可以為在配體結(jié)合作用時(shí)介導(dǎo)其它功能的其它蛋白，或者為通常與所述受體相互作用的其它蛋白。一種測(cè)定什么位點(diǎn)與特異性其它蛋白相互作用的方法是物理結(jié)構(gòu)測(cè)定法，例如X-射線晶體照相術(shù)或二維NMR技術(shù)。它們可指示什么氨基酸殘基構(gòu)成分子接觸區(qū)。關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定的詳述介紹參見例如Blundell和Johnson(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York，其通過引用結(jié)合到本文中。
II.活性細(xì)胞因子受體樣蛋白具有許多不同生物活性，例如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如通過STAT4的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖或者磷酸代謝(在通常為蛋白質(zhì)的特異性底物上添加磷酸根或從其去除磷酸根)。所述作用的結(jié)果通常是調(diào)節(jié)炎癥功能、其它天然免疫反應(yīng)或形態(tài)效應(yīng)。所述亞單位可能對(duì)所述配體具有特異性低親和結(jié)合。
DCRS5具有通過JAK途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的受體的特征基元。參見例如Ihle等(1997)Stem Cells 15(增刊1)105-111；Silvennoinen等(1997)APMIS 105497-509；Levy(1997)Cytokine Growth Factor Review 881-90；Winston和Hunter(1996)Current Biol.6668-671；Barrett(1996)Baillieres Clin.Gastroenterol.101-15；Briscoe等(1996)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.351167-171。特別引人注目的是上述SH2結(jié)合基元。
細(xì)胞因子受體亞單位的生物活性與在底物上添加或去除磷酸根有關(guān)，通常為特異性方式，但是偶爾為非特異性方式。可以用例如以下文獻(xiàn)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定底物，或者分析酶活性條件Hardie等(主編，1995)The Protein Kinase FactBook，第I和II卷，AcademicPress，San Diego，CA；Hanks等(1991)Meth.Enzymol.20038-62；Hunter等(1992)Cell 70375-388；Lewin(1990)Cell 61743-752；Pines等(1991)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.56449-463；Parker等(1993)Nature 363736-738。
受體亞單位可以締合形成功能復(fù)合物，例如其可用于結(jié)合配體或制備抗體。它們具有顯著診斷用途，包括檢測(cè)或定量測(cè)定。所述受體與p40/IL-B30配體的功能性連接對(duì)于了解所述受體可應(yīng)用的適應(yīng)癥具有重要作用。因此，拮抗劑和激動(dòng)劑將具有預(yù)測(cè)作用。
III.核酸本發(fā)明設(shè)想應(yīng)用例如編碼上述蛋白或密切相關(guān)蛋白或其片段的分離核酸或片段用于例如編碼相應(yīng)多肽，優(yōu)選所述多肽具有生物活性。此外，本發(fā)明包括分離或重組的DNA，所述DNA編碼具有特征序列的所述蛋白或多肽的組合，所述特征序列是單獨(dú)DCRS5的特征序列、或者是DCRS5特征序列與其它例如IL-12Rβ1亞單位特征序列的組合(參見Showe等(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.795413-425；Gately等(1998)Ann.Rev.Immunol.16495-521；GenBank U03187，NM_005535)。通常，所述核酸在合適條件下與表1所示的核酸序列區(qū)段雜交，但是優(yōu)選不與表3所示其它受體的相應(yīng)區(qū)段雜交。所述生物活性蛋白多肽可以是全長(zhǎng)蛋白或片段，而且具有與表1所示序列具有高度同源性的氨基酸序列區(qū)段，例如相同的重要區(qū)段。此外，本發(fā)明還包括分離核酸或重組核酸或其片段的應(yīng)用，所述核酸或其片段編碼具有DCRS5蛋白等同片段(例如細(xì)胞內(nèi)部分)的蛋白。所述分離核酸可在5’和3’側(cè)具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、poly-A添加信號(hào)和來自天然基因的其它調(diào)節(jié)序列。還提供如上所述的組合物(如DCRS5與IL-12Rβ1)或它們的細(xì)胞外配體結(jié)合部分(配體拮抗劑)。此外，顯然多態(tài)性或其它變異體的診斷應(yīng)用也是重要的。
“分離的”核酸是指大致純的例如RNA、DNA或混合型聚合物的核酸，例如它與天然伴隨的天然序列的其它組分(例如核糖體、聚合酶和原物種的側(cè)翼基因組序列)分離開。該術(shù)語包括從其天然環(huán)境取出的核酸序列，而且包括重組或克隆DNA分離物(因此與天然存在組分不同)，以及包括化學(xué)合成的類似物或異源系統(tǒng)生物合成的類似物。大致純分子包括完全純或大致純的分離型分子。
分離核酸通常為均質(zhì)組分分子，但是在某些實(shí)施方案中，包含不同組分、優(yōu)選微小差異的不同組分。這種差異通常見于聚合物末端或?qū)π枰锕δ芑蚧钚圆恢匾牟糠帧?br> “重組”核酸通常用其制備方法或其結(jié)構(gòu)定義。涉及其制備方法時(shí)，例如一種方法制備的產(chǎn)品，所述方法應(yīng)用重組核酸技術(shù)，例如涉及人為干預(yù)核苷酸序列。通常這種干預(yù)涉及體外操作，然而在某些條件下可能涉及更經(jīng)典的動(dòng)物繁殖技術(shù)。另一方面，它可以是如下制備的核酸產(chǎn)生包含非天然彼此鄰接的兩種片段的融合物的序列，但是它不包括天然產(chǎn)物，例如天然狀態(tài)存在的天然突變體。因此，包括通過用非天然載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞制備的產(chǎn)物，同樣包括用任何合成寡核苷酸的方法獲得的序列的核酸。這種方法通常用于例如用編碼相同氨基酸或保守氨基酸的豐余密碼子取代另一種密碼子，而通常引入或去除限制酶序列識(shí)別位點(diǎn)，或者用于某種結(jié)構(gòu)功能分析。或者，所述方法用于將所需功能的核酸區(qū)段連接在一起，產(chǎn)生通常天然形式不存在的具有所需功能組合的單一遺傳實(shí)體，例如編碼融合蛋白。限制酶識(shí)別位點(diǎn)通常為所述人工操作的目標(biāo)，但是可以設(shè)計(jì)引入其它位點(diǎn)特異性靶，例如啟動(dòng)子、DNA復(fù)制位點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征。相同的原理用于重組多肽，例如融合多肽。這包括DCRS5和IL-12Rβ1亞單位的二聚體重復(fù)物或融合物。具體來說包括合成核酸，所述合成核酸因?yàn)檫z傳密碼豐余性而編碼DCRS5片段的等同多肽以及各種不同相關(guān)分子(例如其它細(xì)胞因子受體家族成員)的序列融合物。
核酸的“片段”為核苷酸連續(xù)節(jié)段，它包含至少約17個(gè)核苷酸，一般至少約21個(gè)核苷酸，更一般至少25個(gè)核苷酸，通常至少30個(gè)核苷酸，更一般至少35個(gè)核苷酸，通常至少39個(gè)核苷酸，更通常至少45個(gè)核苷酸，通常至少50個(gè)核苷酸，更常見至少55個(gè)核苷酸，常常至少60個(gè)核苷酸，更通常至少66個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少72個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少79個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選實(shí)施方案為至少85個(gè)核苷酸或更多核苷酸，包括90、100、120、140、160、180、200個(gè)核苷酸等。通常，不同遺傳序列片段可在合適長(zhǎng)度節(jié)段(特別定義的節(jié)段，例如下述結(jié)構(gòu)域)上彼此比較。
編碼DCRS5的核酸特別用于鑒定編碼DCRS5本身或密切相關(guān)蛋白的各種基因、mRNA和cDNA，以及用于鑒定編碼例如不同個(gè)體或相關(guān)物種的多態(tài)性、等位基因或其它遺傳變異體的DNA。這種篩選的優(yōu)選探針為不同多態(tài)性變異體之間保守的受體區(qū)段，或者所述區(qū)段包含非特異性核苷酸，優(yōu)選它為全長(zhǎng)序列或幾乎為全長(zhǎng)序列。在其它情況下，多態(tài)性變異體特異性序列更有用。也可以診斷組合的DCRS5多態(tài)性變異體和IL-12Rβ1變異體。
本發(fā)明還包括具有與本文所述分離DNA相同或高度同源的核酸序列的重組核酸分子和片段。具體來說，所述序列通常與控制轉(zhuǎn)錄、翻譯和DNA復(fù)制的DNA節(jié)段有效連接。這些額外區(qū)段通常有助于表達(dá)目的核酸區(qū)段。
同源或高度相同的核酸序列在相互比較時(shí)，例如與DCRS5序列比較時(shí)，表現(xiàn)出顯著相似性。核酸同源性標(biāo)準(zhǔn)為本領(lǐng)域一般使用的序列比較或根據(jù)雜交條件的同源性測(cè)量結(jié)果。下面更詳細(xì)地描述比較雜交條件。
核酸序列比較的大致同一性是指在引入適當(dāng)核苷酸插入或缺失的情況下優(yōu)化排列對(duì)比時(shí)，所比較的區(qū)段或其互補(bǔ)鏈相同核苷酸至少約60％，一般至少66％，普通至少71％，通常至少76％，更常見至少80％，通常至少84％，更常見至少88％，常常至少91％，更常見至少93％，優(yōu)選至少約95％，更優(yōu)選至少約96-98％或更高，在具體實(shí)施方案中，高達(dá)約99％或更高的相同核苷酸，包括例如編碼結(jié)構(gòu)域的區(qū)段或其它所述區(qū)段?；蛘撸?dāng)通常使用表1衍生序列在選擇性雜交條件下所述區(qū)段與另一條鏈或其互補(bǔ)鏈雜交，則所比較的區(qū)段大致相同。通常，當(dāng)在至少約14個(gè)核苷酸的節(jié)段上至少約55％同源，更常見至少約65％同源，優(yōu)選至少約75％同源，更優(yōu)選至少約90％同源時(shí)，則發(fā)生選擇性雜交。參見Kanehisa(1984)Nucl.AcidsRes.12203-213，其通過引用結(jié)合到本文中。上述同源性比較的長(zhǎng)度可以為更長(zhǎng)的節(jié)段，在某些實(shí)施方案中，比較節(jié)段長(zhǎng)度為至少約17個(gè)核苷酸，一般至少約20個(gè)核苷酸，通常至少約24個(gè)核苷酸，常見約28個(gè)核苷酸，通常至少約32個(gè)核苷酸，更常見至少約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少約75-100個(gè)核苷酸或更多核苷酸。包括125、150、175、200、225、250、275、300、325、350個(gè)核苷酸等以及其它長(zhǎng)度。
雜交同源性有關(guān)的嚴(yán)格條件是鹽、溫度、有機(jī)溶劑和雜交反應(yīng)中通?？刂频钠渌鼌?shù)的嚴(yán)格綜合條件。嚴(yán)格溫度條件通常包括超過約30℃溫度，更常見超過約37℃，通常超過約45℃，更常見超過55℃，優(yōu)選超過約65℃，更優(yōu)選超過約70℃。嚴(yán)格鹽條件一般低于約500mM，通常低于約400mM，更常見低于約300mM，常見低于約200mM，優(yōu)選低于約100mM，更優(yōu)選低于約80mM，甚至低于約50或20mM。然而，參數(shù)綜合比任何單一參數(shù)量值重要得多。參見例如Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370，其通過引用結(jié)合到本文中。
分離DNA可容易地通過核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸節(jié)段倒置進(jìn)行修飾。修飾產(chǎn)生編碼該蛋白或其衍生物的新的DNA序列。修飾序列可用于產(chǎn)生突變蛋白或增強(qiáng)變異體表達(dá)。表達(dá)增強(qiáng)可能涉及基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)、翻譯增強(qiáng)和其它機(jī)制。DCRS5可如上所述產(chǎn)生這樣的突變DCRS5，但是無論是因?yàn)槿笔?、取代還是插入，其氨基酸序列不同于天然存在的其它細(xì)胞因子受體蛋白。具體來說，“位點(diǎn)特異性突變DCRS5”包括與表1蛋白具有大致序列同一性的蛋白，而且通常具有本文公開形式的大多數(shù)生物活性或作用。還鑒定了各種天然多態(tài)性變異體序列。
盡管預(yù)定了位點(diǎn)特異性突變位點(diǎn)，但是突變不一定是位點(diǎn)特異性的。在表達(dá)偶聯(lián)的基因中產(chǎn)生氨基酸插入或缺失可實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物DCRS5突變?？僧a(chǎn)生取代、缺失、插入或許多組合以獲得最終構(gòu)建物。插入包括氨基或羧基末端融合?？蓪?duì)目標(biāo)密碼子進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后可對(duì)表達(dá)的哺乳動(dòng)物DCRS5突變體篩選目的活性，獲得某一方面的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系。在已知序列DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生取代突變的方法，例如應(yīng)用M13引物突變，是本領(lǐng)域眾所周知的。另見Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987和定期出版的增刊)。特別有用的構(gòu)建物為與IL-12Rβ1節(jié)段有關(guān)的DCRS5細(xì)胞外部分。
DNA突變通常不使編碼序列置于讀框外，優(yōu)選不產(chǎn)生能夠雜交產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)如環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862介紹的氨基磷酸酯法可產(chǎn)生合適合成DNA片段。通常通過合成互補(bǔ)鏈和在合適條件下使所述鏈退火在一起，或者通過使用DNA聚合酶和合適引物序列加上互補(bǔ)鏈，獲得雙鏈DNA片段。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)常常用于誘變?；蛘撸T變引物是常用的在預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生規(guī)定突變的方法。參見例如Innis等(主編，1990)PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego，CA；Dieffenbach和Dveksler(1995；主編)PCR PrimerALaboratory Manual Cold Spring Harbor Press，CSH，NY。
本發(fā)明某些實(shí)施方案涉及包含所述受體序列的組合組分。在其它實(shí)施方案中，所述序列的功能部分連接在一起編碼融合蛋白。在其它形式中，所述序列的變異體可以被取代。
IV.蛋白質(zhì)、肽如上所述，本發(fā)明還包括靈長(zhǎng)類DCRS5，例如其序列公開于表1，而且見上文介紹。也設(shè)想了等位基因變異體和其它變異體，包括例如綜合所述序列的各部分和其它序列(包括例如IL-12Rβ1、表位標(biāo)記和功能結(jié)構(gòu)域)的融合蛋白。
本發(fā)明還提供重組蛋白，例如使用上述靈長(zhǎng)類或嚙齒類蛋白的區(qū)段的異源融合蛋白。異源融合蛋白是天然情況下通常不以相同方式融合在一起的蛋白或區(qū)段融合物。因此，DCRS5和其它細(xì)胞因子受體的融合產(chǎn)物通常為連續(xù)蛋白分子，其序列以典型肽鍵融合在一起，通常制成單一翻譯產(chǎn)物而且表現(xiàn)各個(gè)來源肽的各種特性，例如序列或抗原性。相似原理可用于異源核酸序列。還提供各種設(shè)計(jì)蛋白組合成的復(fù)合物。
另外，通過組合其它相關(guān)蛋白(例如細(xì)胞因子受體或Toll樣受體，包括種變異體)的相似功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域可制備新的構(gòu)建物。例如，配體結(jié)合或其它區(qū)段可在不同新的融合多肽或片段之間“互換”。參見例如Cunningham等(1989)Science 2431330-1336；O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992，各文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。所以，具有新的綜合特異性的新型嵌合多肽可得自受體結(jié)合特異性的功能結(jié)合。例如，可將其它相關(guān)受體分子的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域加入這種蛋白或相關(guān)蛋白中或取代這種蛋白或相關(guān)蛋白的其它結(jié)構(gòu)域。獲得的蛋白通常具有雜合功能和特性。例如，融合蛋白可包含靶向結(jié)構(gòu)域，靶向結(jié)構(gòu)域的作用是使所述融合蛋白限定于特定亞細(xì)胞器。
可從各種序列數(shù)據(jù)庫選擇候選融合配偶體和序列，例如GenBank，c/o IntelliGenetics，Mountain View，CA；BCG，University of WisconsinBiotechnology Computing Group，Madison，WI，其均通過引用結(jié)合到本文中。具體來說，特別優(yōu)選表1和3中提供的多肽序列的組合物。上述組合物可代替變異體型所述蛋白。
本發(fā)明特別提供結(jié)合細(xì)胞因子樣配體和/或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及的突變蛋白。DCRS5與所述細(xì)胞因子受體家族的其它成員的結(jié)構(gòu)排列對(duì)比顯示出保守特征/殘基。見表3。人DCRS5序列與所述細(xì)胞因子受體家族其它成員的排列對(duì)比表明各種結(jié)構(gòu)和功能共同特征。另見Bazan等(1996)Nature 379591；Lodi等(1994)Science 2631762-1766；Sayle和Milner-White(1995)TIBS 20374-376；Gronenberg等(1991)ProteinEngineering 4263-269。
特別優(yōu)選以小鼠或人序列的取代。相反，遠(yuǎn)離配體結(jié)合互作區(qū)的保守取代可能保存大多數(shù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；遠(yuǎn)離細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的保守取代可能保存大多數(shù)配體結(jié)合特性。
靈長(zhǎng)類DCRS5的“衍生物”包括氨基酸序列突變體、糖基化變異體、代謝衍生物和與其它化學(xué)部分的共價(jià)或聚集綴合物。例如應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法使官能團(tuán)與DCRS5氨基酸側(cè)鏈或N末端存在的基團(tuán)鍵合可制備共價(jià)衍生物。這些衍生物包括但不限于羧基末端的脂族酯或酰胺、或者包含羧基側(cè)鏈的殘基的脂族酯或酰胺、含羥基殘基的O?；苌?、氨基末端氨基酸或含氨基殘基(例如賴氨酸或精氨酸)的N酰基衍生物。?；x自烷基部分基團(tuán)，包括C3-C18常見烷基，因此形成烷?；减；镔|(zhì)。
具體來說，包括糖基化改變，例如在其合成和加工過程中或在進(jìn)一步的加工步驟中改進(jìn)多肽的糖基化類型。特別優(yōu)選的改變糖基化方法是使所述多肽暴露于得自通常進(jìn)行所述加工的細(xì)胞的糖基化酶，例如哺乳動(dòng)物糖基化酶。也設(shè)想了去糖基化酶。還包括各種形式具有其它微小修飾的相同一級(jí)氨基酸序列，包括磷酸化氨基酸殘基，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
主要的一組衍生物為所述受體或其片段與其它多肽蛋白的共價(jià)綴合物。這些衍生物可在諸如N末端融合的重組物培養(yǎng)中合成，或者利用本領(lǐng)域已知的、其作用是通過活性側(cè)基交聯(lián)蛋白的物質(zhì)合成。交聯(lián)劑的優(yōu)選衍化位點(diǎn)為游離氨基、糖部分和半胱氨酸。
還提供所述受體與其它同源或異源蛋白的融合多肽。同源多肽可以為不同受體的融合物，獲得例如對(duì)多個(gè)不同細(xì)胞因子配體具有結(jié)合特異性的雜合蛋白或底物作用特異性增強(qiáng)或減弱的受體。同樣，可構(gòu)建具有所述衍生蛋白綜合特性或活性的異源融合物。典型實(shí)例有報(bào)道多肽(例如熒光素酶)與一種受體的一個(gè)區(qū)段或結(jié)構(gòu)域(例如配體結(jié)合區(qū)段)融合，使得可以容易地測(cè)定目的配體的存在或位置。參見例如Dull等的美國專利號(hào)4,859,609，其通過引用結(jié)合到本文中。其它基因融合配偶體包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、α-淀粉酶、乙醇脫氫酶和酵母α接合因子。參見例如Godowski等(1988)Science 241812-816。所述組合蛋白常?？纱鏄?biāo)記蛋白。如上所述，DCRS5與IL-12Rβ1締合特別有意義。
Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221859-1862介紹的氨基磷酸酯法可產(chǎn)生合適合成DNA片段。通常通過合成互補(bǔ)鏈并在合適條件下使所述鏈退火在一起，或者通過使用DNA聚合酶和合適引物序列加上互補(bǔ)鏈，獲得雙鏈片段。
所述多肽也可以含有通過磷酸化、磺化、生物素化或添加或去除其它部分而化學(xué)修飾的氨基酸殘基，尤其是含有與磷酸根基團(tuán)類似的分子形狀的氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，所述修飾為有用的標(biāo)記試劑或者用作純化靶例如親和配體。
融合蛋白通常用重組核酸法或合成多肽法制備。核酸操作表達(dá)的技術(shù)在例如以下文獻(xiàn)中有全面介紹Sambrook等(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual(第二版)，第13卷，Cold Spring HarborLaboratory，以及Ausubel等(主編，1987和定期出版的增刊)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York，均通過引用結(jié)合到本文中。多肽合成技術(shù)在例如以下文獻(xiàn)中有介紹Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science232341-347；Atherton等(1989)Solid Phase Peptide SvnthesisAPractical Approach，IRL Press，Oxford；均通過引用結(jié)合到本文中。關(guān)于制備更大的肽另見Dawson等(1994)Science 266776-779。
本發(fā)明還設(shè)想了氨基酸序列變化或糖基化以外的DCRS5衍生物的應(yīng)用。這種衍生物包括與化學(xué)部分共價(jià)或聚合締合。這樣的衍生物一般分為三類(1)鹽類，(2)側(cè)鏈和末端殘基共價(jià)修飾，(3)吸附復(fù)合物，例如吸附于細(xì)胞膜。這種共價(jià)或聚合衍生物可用作免疫原、免疫測(cè)定試劑，或者用于純化方法，例如受體或其它結(jié)合分子(例如抗體)的親和純化方法。例如，為了檢測(cè)或純化細(xì)胞因子受體、抗體或其它類似分子，細(xì)胞因子配體可應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的方法通過共價(jià)鍵合固定在固體支持物上，例如溴化氰活化Sepharose，或者使用或不使用戊二醛交聯(lián)結(jié)合吸附到聚烯烴表面上。為了用于診斷測(cè)定，也可用可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記所述配體，例如用氯胺T方法進(jìn)行放射性碘化標(biāo)記、與稀土螯合劑共價(jià)結(jié)合或與另一種熒光部分綴合。
本發(fā)明的組合物，例如包含DCRS5的組合物，可用作產(chǎn)生特異性針對(duì)所述組合物的抗血清或抗體，所述抗血清或抗體例如能夠區(qū)分其它細(xì)胞因子受體家族成員。所述復(fù)合物用于篩選通過用各種含所述蛋白的不純制品免疫制備的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。術(shù)語“抗體”還特別包括天然抗體的抗原結(jié)合片段，例如Fab、Fab2、Fv等。純化DCRS5也可用作檢測(cè)試劑，檢測(cè)在DCRS5表達(dá)升高作用下產(chǎn)生的抗體，或檢測(cè)導(dǎo)致產(chǎn)生抗內(nèi)源性受體抗體的免疫疾病。另外，DCRS5片段也可用作免疫原產(chǎn)生本發(fā)明抗體，見緊接著的下文介紹。例如本發(fā)明設(shè)想了對(duì)表1所示的氨基酸序列、其片段或各種同源肽具有結(jié)合親和力的抗體或者針對(duì)它們產(chǎn)生的抗體。具體來說，本發(fā)明設(shè)想了預(yù)期或?qū)嶋H對(duì)暴露在天然DCRS5蛋白外的特異性片段具有結(jié)合親和力的抗體或者針對(duì)所述特異性片段產(chǎn)生的抗體。組合蛋白的復(fù)合物也是有用的，而且可制備其抗體制劑。
在某些實(shí)施方案中，例如DCRS5細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)段與IL-12Rβ1的可溶性構(gòu)建物可以是所述配體的結(jié)合組合物，其可用作配體拮抗劑或者抗原以阻斷配體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。所述構(gòu)建物在診斷或治療上有用，例如對(duì)配體的診斷性組織學(xué)標(biāo)記，或者治療性用作配體拮抗劑。
對(duì)所述受體配體生理反應(yīng)的阻斷可能原因是對(duì)抑制所述配體與所述受體的結(jié)合，可能是通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此，在本發(fā)明體外測(cè)定中通常使用各種抗體或所述抗體的抗原結(jié)合區(qū)段、可溶性受體構(gòu)建物或與固相支持物結(jié)合的片段。這些檢測(cè)也可診斷性確定配體結(jié)合區(qū)突變和修飾或者例如影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或酶功能的其它突變和修飾的作用。
本發(fā)明還設(shè)想了競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選測(cè)定的應(yīng)用，例如其中抗所述受體復(fù)合物或片段的中和抗體與受試化合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合配體或其它抗體。這樣，中和抗體或片段可用于檢測(cè)對(duì)受體具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的多肽的存在，也可用于占據(jù)受體上可能另外結(jié)合配體的結(jié)合位點(diǎn)。DCRS5細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與IL-12Rβ1組合的可溶性受體構(gòu)建物可能是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合p40/IL-B30配體的有用拮抗劑。
V.制備核酸和蛋白質(zhì)編碼所述蛋白或其片段的DNA可以通過化學(xué)合成、篩選cDNA文庫或者篩選用各種細(xì)胞系或組織樣品制備的基因組文庫而獲得。可使用標(biāo)準(zhǔn)方法和本文例如表1提供的序列分離天然序列?？梢杂秒s交技術(shù)或各種PCR技術(shù)、聯(lián)合應(yīng)用或者單獨(dú)應(yīng)用篩選序列文庫(例如GenBank)或者通過篩選序列文庫(例如GenBank)，鑒定其它類型的相應(yīng)物。
這種DNA可以在各種宿主細(xì)胞中表達(dá)，以便合成全長(zhǎng)受體或片段，它們?cè)儆糜诶缰苽涠嗫寺】贵w或單克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激酶/磷酸酶結(jié)構(gòu)域；用于結(jié)構(gòu)/融合研究。變異體或片段可在用合適載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中表達(dá)。除了來自重組宿主的蛋白或細(xì)胞雜質(zhì)之外，上述分子基本上不含蛋白或細(xì)胞污染物，因此，特別可用于與藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑組合的藥用組合物。所述蛋白或其部分可表達(dá)為其它蛋白的融合蛋白。所述蛋白或其編碼核酸的組合物特別引人注目。
表達(dá)載體通常為含有目的受體基因、其片段或組合基因的自我復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)建物，所述目的受體基因、其片段或組合基因通常與在合適宿主細(xì)胞中被識(shí)別的合適遺傳控制元件有效連接。所述控制元件能夠在合適宿主中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。多個(gè)基因可協(xié)調(diào)表達(dá)，而且可位于多順反子信使上。實(shí)現(xiàn)表達(dá)所必需的特異型控制元件取決于所用的最終宿主細(xì)胞。一般來說，所述基因控制元件包括原核啟動(dòng)子系統(tǒng)或真核啟動(dòng)子表達(dá)控制系統(tǒng)，通常包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、控制轉(zhuǎn)錄發(fā)生的選擇操縱子、升高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、編碼合適核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。此外，表達(dá)載體常常含有使載體獨(dú)立于所述宿主細(xì)胞復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。
本發(fā)明載體包含編碼所述多種蛋白組合物或者生物活性等同多肽的組合物的DNA。所述DNA處于病毒啟動(dòng)子控制之下，而且它可編碼選擇標(biāo)記。本發(fā)明還設(shè)想了能夠在原核或真核宿主中表達(dá)編碼所述蛋白的真核cDNA的所述表達(dá)載體的應(yīng)用，其中所述載體與所述宿主匹配，而且所述真核cDNA插入所述載體，使得包含所述載體的宿主生長(zhǎng)表達(dá)所述cDNA。通常，設(shè)計(jì)表達(dá)載體在其宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制或者在其宿主細(xì)胞中擴(kuò)增而顯著增加每個(gè)細(xì)胞的目的基因總拷貝數(shù)。并不總是需要表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制，例如可能使用不含所述宿主細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)的載體在各種宿主中瞬時(shí)表達(dá)所述蛋白或其片段。也可使用使所述蛋白的編碼部分重組整合入所述宿主DNA的載體。
本文使用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、整合型DNA片段以及其它能夠使DNA片段整合入宿主基因組的載體。表達(dá)載體是含有實(shí)現(xiàn)有效連接基因表達(dá)的基因控制元件的特化載體。質(zhì)粒為最常用形式的載體，但是在功能上等同而且本領(lǐng)域已知或者將為本領(lǐng)域所知的所有其它形式載體也適用本發(fā)明。參見例如Pouwels等(1985和增刊)Cloning VectorsA Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，Rodriguez等(主編，1988)VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses，Buttersworth，Boston，它們的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞為用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(最好是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞通常表達(dá)目的蛋白，但是對(duì)于克隆、擴(kuò)增和操作其DNA的目的，不需要表達(dá)所述目的蛋白。本發(fā)明還設(shè)想了在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因此允許累積所述蛋白?？蓮呐囵B(yǎng)物回收所述蛋白，或者在某些情況下，從培養(yǎng)基中回收所述蛋白。
對(duì)于本發(fā)明目的而言，當(dāng)核酸序列在功能上彼此相關(guān)時(shí)，它們有效連接。例如，如果前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA表達(dá)為前蛋白或它參與引導(dǎo)所述多肽至細(xì)胞膜或參與所述多肽的分泌時(shí)，則它與多肽有效連接。如果啟動(dòng)子控制所述多肽的轉(zhuǎn)錄，則啟動(dòng)子與編碼序列有效連接；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置使得可以進(jìn)行翻譯，則它與編碼序列有效連接。通常，有效連接是指連續(xù)而且符合讀框的連接，但是，某些遺傳元件如阻抑基因不是連續(xù)連接，但是仍然約束操縱基因序列，操縱基因序列再控制表達(dá)。
合適宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、低等真核細(xì)胞和高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性和陽性生物，例如大腸桿菌和枯草桿菌(B.subtilis)。低等真核細(xì)胞包括酵母，例如釀酒酵母(S.cerevisiae)和畢赤酵母屬(Pichia)，以及網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)物種。高等真核細(xì)胞包括用動(dòng)物細(xì)胞建立的組織培養(yǎng)細(xì)胞系，所述動(dòng)物細(xì)胞為非哺乳動(dòng)物來源，例如昆蟲細(xì)胞和鳥類細(xì)胞，以及哺乳動(dòng)物來源，例如人類、靈長(zhǎng)類和嚙齒類。
原核宿主載體系統(tǒng)包括用于許多不同物種的各種載體。本文使用的大腸桿菌及其載體一般包括在其它原核細(xì)胞中使用的等同載體。用于擴(kuò)增DNA的典型載體為pBR322或其許多衍生物?？梢杂脕肀磉_(dá)所述受體或其片段的載體包括但不限于包含以下啟動(dòng)子的載體lac啟動(dòng)子(pUC系列)；trp啟動(dòng)子(pBR322 trp)；Ipp啟動(dòng)子(pIN系列)；λpP或pR啟動(dòng)子(pOTS)；或者雜合型啟動(dòng)子如ptac(pDR540)。參見Brosius等(1988)“應(yīng)用λ及Ipp衍生啟動(dòng)子的表達(dá)載體”，載于VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，(Rodriguez和Denhardt主編)，Buttersworth，Boston，第10章，pp.205-236，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
低等真核細(xì)胞，例如酵母和網(wǎng)柄菌屬，可用包含DCRS5序列的載體轉(zhuǎn)化。對(duì)于本發(fā)明目的，最常用低等真核宿主為面包酵母，即釀酒酵母。一般用其代表低等真核細(xì)胞，但是也可用許多其它菌株和種類。酵母載體的典型組成如下復(fù)制起點(diǎn)(整合型例外)、選擇基因、啟動(dòng)子、編碼所述受體或其片段的DNA、以及翻譯終止序列、聚腺苷酸序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。用于酵母的合適表達(dá)載體包括組成型啟動(dòng)子，例如3-磷酸甘油酸激酶和各種其它糖酵解酶基因啟動(dòng)子，或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如醇脫氫酶2啟動(dòng)子或金屬硫蛋白啟動(dòng)子。合適載體包括以下類型的衍生物自主復(fù)制低拷貝數(shù)載體(例如YRp系列)，自主復(fù)制高拷貝數(shù)載體(例如YEp系列)；整合型載體(例如YIp系列)，或者微小染色體(例如YCp系列)。
高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞通常是用于表達(dá)功能活性白介素或受體蛋白優(yōu)選宿主細(xì)胞。原則上，許多高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系無論是來自無脊椎動(dòng)物還是脊椎動(dòng)物，均可使用，例如昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。然而，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以及繁殖已成為常規(guī)方法。有用的細(xì)胞系實(shí)例包括HeLa細(xì)胞、中國蒼鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼齡大鼠腎臟(BRK)細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、鳥細(xì)胞系和猴(COS)細(xì)胞系。用于所述細(xì)胞系的表達(dá)載體通常包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、翻譯起始位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)(如果使用基因組DNA)、聚腺苷酸位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。這些載體還常常含有選擇基因或擴(kuò)增基因。合適表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒，它們含有例如衍生自腺病毒、SV40、細(xì)小病毒、痘苗病毒或巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子。合適表達(dá)載體的典型實(shí)例包括pCDNAl；pCD，參見Okayama等(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneo PolyA，參見Thomas等(1987)Cell 51503-512；桿狀病毒載體，例如pAC 373或pAC 610。
對(duì)于分泌蛋白和某些膜蛋白，讀框通常編碼由其N-末端共價(jià)連接信號(hào)肽的成熟或分泌產(chǎn)物組成的多肽。所述信號(hào)肽在所述成熟或活性多肽分泌之前切除。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)法則可非常準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)切割位點(diǎn)，例如von-Heijne(1986)Nucleic Acids Research 144683-4690和Nielsen等(1997)Protein Eng.101-12；信號(hào)肽的確切氨基酸組成對(duì)其功能似乎不重要，例如Randall等(1989)Science 2431156-1159；Kaiser等(1987)Science 235312-317。使用標(biāo)準(zhǔn)方法可容易地確定本發(fā)明的成熟蛋白。
常常需要在提供特異性或規(guī)定糖基化類型的系統(tǒng)中表達(dá)上述多肽。在這種情況下，一般糖基化類型為表達(dá)系統(tǒng)天然提供的糖基化類型。然而，所述糖基化類型可如下修飾使所述多肽(例如非糖基化型)暴露于已經(jīng)引入異源表達(dá)系統(tǒng)的合適糖基化蛋白。例如，所述受體基因可以與一種或多種編碼哺乳動(dòng)物糖基化酶或其它糖基化酶的基因共轉(zhuǎn)化。使用這種方法，某些哺乳動(dòng)物糖基化類型可在原核細(xì)胞或其它細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。原核細(xì)胞表達(dá)通常產(chǎn)生非糖基化型蛋白。
如上所述，DCRS5的來源可以為表達(dá)重組DCRS5的真核宿主或原核宿主。所述來源也可以是細(xì)胞系，但是本發(fā)明也設(shè)想了其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，優(yōu)選細(xì)胞系來自人類。
既然已知所述序列，可用合成肽的常規(guī)方法制備靈長(zhǎng)類DCRS5、其片段或衍生物。包括下列文獻(xiàn)介紹的方法Stewart和Young(1984)Solid Pbase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York；Bodanszky(1984)The Principles of PeptideSynthesis，Springer Verlag，New York；所有文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。例如，可以使用疊氮化物法、?；确?、酸酐法、混合酐法、活性酯法(例如對(duì)硝基苯基酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯或氰基甲基酯)、碳二咪唑法、氧化還原法或二環(huán)己基碳二亞胺(DCCD)加成法。前面方法可以使用固相合成以及液相合成。可以將相似技術(shù)用于部分DCRS5序列。
按照肽合成常規(guī)使用的上述方法適當(dāng)?shù)刂苽銬CRS5蛋白、片段或衍生物，通常是利用包括使氨基酸逐個(gè)按順序與末端氨基酸縮合的所謂的逐步法，或者使肽片段與末端氨基酸偶合。在偶合反應(yīng)中不使用的氨基通常必須進(jìn)行保護(hù)，以便防止在不正確的位置進(jìn)行偶合。
如果使用固相合成，則使C末端氨基酸通過其羧基與不溶性載體或支持物結(jié)合。不溶性載體沒有特別限制，只要它能與反應(yīng)性羧基結(jié)合則可。這樣的不溶性載體實(shí)例包括鹵代甲基樹脂(例如氯甲基樹脂或溴甲基樹脂)、羥基甲基樹脂、苯酚樹脂、叔烷氧基羰基肼化樹脂等。
氨基保護(hù)的氨基酸按順序通過其活化羧基與預(yù)先形成肽或鏈的反應(yīng)氨基縮合結(jié)合，從而逐步合成所述肽。合成完整序列后，從不溶性載體分離出所述肽，從而生產(chǎn)出所述肽。這種固相法在Merrifield等(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149-2156中有全面介紹，其通過引用結(jié)合到本文中。
制備的蛋白及其片段可通過肽分離(例如萃取、沉淀、電泳、各種形式的層析、免疫親和等)從反應(yīng)混合物中分離純化。根據(jù)所需要的用途，可獲得不同程度純度的本發(fā)明受體?？蓱?yīng)用本文公開的(見下文)蛋白純化技術(shù)或者應(yīng)用本文在免疫吸收親和層析法中描述的抗體完成純化。這種免疫吸收親和層析如下進(jìn)行首先，使所述抗體結(jié)合到固體支持物上，然后所連接的抗體與合適細(xì)胞的溶解裂解物、表達(dá)所述受體的其它細(xì)胞裂解物或因?yàn)镈NA技術(shù)而產(chǎn)生所述蛋白的細(xì)胞裂解物或上清液接觸，參見下文。
一般來說，純化蛋白的純度至少約40％，一般至少約50％，通常至少約60％，常見至少約70％，更常見至少約80％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約95％，在特別實(shí)施方案中，為97％-99％或更高。純化通常為重量純度，但是也可以為摩爾純度?？蛇m當(dāng)應(yīng)用不同測(cè)定?？杉兓鞣N蛋白，然后將其混合。
VI.抗體可制備針對(duì)各種哺乳動(dòng)物例如靈長(zhǎng)類DCRS5蛋白及其片段的抗體，所述蛋白及其片段可以為天然原型和其重組形式，差別在于針對(duì)所述活性受體的抗體更可能識(shí)別僅在天然構(gòu)象中存在的表位。還設(shè)想了識(shí)別DCRS5與IL-12Rβ1的組合物(例如官能團(tuán)組合)呈現(xiàn)的表位的抗體。變性抗原檢測(cè)例如在蛋白質(zhì)印跡中也是有用的。也設(shè)想了抗獨(dú)特型抗體，其可用作天然受體或抗體的激動(dòng)劑或拮抗劑。
可通過用所述片段與免疫原性蛋白的綴合物免疫動(dòng)物，制備抗所述蛋白預(yù)定片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈型抗體。用分泌目的抗體的細(xì)胞制備單克隆抗體。篩選其中結(jié)合正常蛋白或缺陷蛋白的抗體，或者篩選激動(dòng)劑活性或拮抗劑活性的抗體。單克隆抗體結(jié)合的KD通常約1mM，更常見至少約300μM，常常至少約100μM，更常見至少約30μM，優(yōu)選至少約10μM，更優(yōu)選至少約3μM或更低。
本發(fā)明的抗體，包括抗原結(jié)合片段，具有重要診斷或治療價(jià)值。它們可為結(jié)合所述受體并抑制與配體結(jié)合或抑制所述受體引發(fā)生物反應(yīng)(例如作用于其底物)的能力的有效拮抗劑。它們也可用作非中和抗體，它們可與毒素或放射性核素偶合，所述毒素或放射性核素結(jié)合生產(chǎn)細(xì)胞或局限于白介素來源的細(xì)胞。此外，上述抗體可與藥物或其它治療藥物直接綴合或通過接頭間接綴合。
本發(fā)明抗體在診斷應(yīng)用中也是有用的。作為捕獲抗體或非中和抗體，它們可結(jié)合所述受體而不抑制配體或底物結(jié)合。作為中和抗體，它們可用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。它們還可用于檢測(cè)或定量配體。它們可用作蛋白質(zhì)印跡分析、或者免疫沉淀或免疫純化相應(yīng)蛋白的試劑。同樣，核酸和蛋白質(zhì)可固定在固體支持物上，以進(jìn)行親和純化或檢測(cè)方法。所述支持物可以是例如固體樹脂珠或塑料片。
蛋白片段可與其它物質(zhì)、尤其是多肽結(jié)合，作為用作免疫原的融合或共價(jià)結(jié)合多肽。哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子受體和片段可與各種免疫原融合或共價(jià)結(jié)合，所述免疫原例如鑰孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素等。關(guān)于制備多克隆抗血清方法的介紹參見Microbiology，Hoeber Medical Division，Harper和Row 1969；Landsteiner(1962)Specificity of Serological Reactions，DoverPublications，New York；Williams等(1967)Methods in Immunology andImmunochemistry，第1卷，Academic Press，New York；所述文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。典型方法包括用抗原超免疫動(dòng)物。然后在重復(fù)免疫后立即收集動(dòng)物血液，分離γ球蛋白。
在某些情況下，需要從各種哺乳動(dòng)物宿主例如小鼠、嚙齒類、靈長(zhǎng)類、人類等制備單克隆抗體。制備所述單克隆抗體的方法介紹見例如Stites等(主編)Basic and Clinical Immunology(第四版)，LangeMedical Publications，Los Altos，CA，以及其中的參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CHS Press；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第二版)Academic Press，New York；尤其是Kohler和Milstein(1975)，Nature256495-497，它論述了一種制備單克隆抗體的方法。所有這些參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。簡(jiǎn)而言之，這種方法包括用一種免疫原注射免疫動(dòng)物。然后處死動(dòng)物，從其脾臟取出細(xì)胞，然后將其與雜交瘤細(xì)胞融合。獲得能夠體外增殖的雜交細(xì)胞或“雜交瘤”。之后，篩選雜交瘤細(xì)胞以分離單個(gè)克隆，每種克隆分泌一種抗所述免疫原的抗體。這樣，獲得的各種抗體為在免疫原物質(zhì)上的被識(shí)別的特異性位點(diǎn)作用下產(chǎn)生的免疫動(dòng)物的永生化單個(gè)克隆B細(xì)胞的產(chǎn)物。
其它合適技術(shù)包括使淋巴細(xì)胞暴露于抗原性多肽或者選擇噬菌體或相似載體的抗體文庫。參見Huse等(1989)“Generation of a LargeCombinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in PhageLambda，”Science 2461275-1281；Ward等(1989)Nature 341544-546，均通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明多肽和抗體可以修飾后使用或者不經(jīng)修飾即使用，包括嵌合抗體或人源化抗體。所述多肽和抗體常常通過共價(jià)或非共價(jià)與提供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)結(jié)合而標(biāo)記。各種各樣的標(biāo)記及結(jié)合技術(shù)是已知的，而且在科學(xué)及專利文獻(xiàn)中有廣泛報(bào)道。合適標(biāo)記物包括放射性核素、酶、底物、輔助因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁粒等。指出所述標(biāo)記物的應(yīng)用的專利包括美國專利號(hào)3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。此外，可生產(chǎn)重組或嵌合免疫球蛋白，參見Caliblly，美國專利號(hào)4,816,567；或者應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠制備，參見Mendez等(1997)Nature Genetics 15146-156。這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明抗體還可用于分離DCRS5蛋白或肽的親和層析。制備層析柱，其中所述抗體與固體支持物結(jié)合，例如顆粒(例如瓊脂糖、Sephadex等)，其中使細(xì)胞裂解物通過層析柱，洗柱，然后增加溫和變性劑濃度，因此釋放出純化蛋白。或者，所述蛋白可用于純化抗體?？墒褂煤线m交叉吸收或去除。
所述抗體也可用于篩選表達(dá)文庫的特定表達(dá)產(chǎn)物。通常對(duì)用于所述方法的抗體進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記部分使得通過抗體結(jié)合可以容易地檢測(cè)抗原的存在。
針對(duì)細(xì)胞因子受體產(chǎn)生的抗體還可用于產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。它們用于檢測(cè)或診斷與所述蛋白表達(dá)或表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞有關(guān)的各種病癥。它們還可用作所述配體的激動(dòng)劑或拮抗劑，其為競(jìng)爭(zhēng)性受體抑制劑或代替天然配體。某些受體亞單位或組合物的抗體可用作激活抗體，它可影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此用作例如配體激動(dòng)劑。
特異性結(jié)合針對(duì)特定免疫原(例如由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成的免疫原)產(chǎn)生的抗體或特異性與所述抗體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子受體蛋白通常以免疫測(cè)定進(jìn)行測(cè)定。免疫測(cè)定通常采用例如針對(duì)例如SEQ ID NO2蛋白產(chǎn)生的多克隆抗血清。選擇對(duì)其它細(xì)胞因子受體家族成員(例如IL-12Rβ2受體亞單位或IL-6受體亞單位gp130，優(yōu)選來自相同物種)交叉反應(yīng)性低的抗血清，在用于免疫測(cè)定之前通過免疫吸收去除任何這樣的交叉反應(yīng)性。
為了制備用于免疫測(cè)定的抗血清，如本文所述分離例如SEQ IDNO2的蛋白。例如可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中產(chǎn)生重組蛋白。通常使用標(biāo)準(zhǔn)佐劑例如弗氏佐劑以及標(biāo)準(zhǔn)小鼠免疫接種方案(參見Harlow和Lane，同上)，用選定蛋白免疫合適宿主，例如小鼠近交系(如Balb/c)?；蛘撸米员疚墓_序列而且與載體蛋白綴合的合成肽可用作免疫原。收集多克隆抗血清，用免疫測(cè)定(例如免疫原固定在固體支持物上的固相免疫測(cè)定)對(duì)免疫原蛋白進(jìn)行滴定。選擇滴度104或更高的多克隆抗血清，使用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫測(cè)定，例如Harlow和Lane，同上，第570-573頁介紹的一種方法，測(cè)試其對(duì)其它細(xì)胞因子受體家族成員如gp130或IL-12Rβ1的交叉反應(yīng)性。優(yōu)選在該測(cè)定中使用至少兩種細(xì)胞因子受體家族成員。這些細(xì)胞因子受體家族成員可生產(chǎn)為重組蛋白，使用本文介紹的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)進(jìn)行分離。
競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合形式的免疫測(cè)定可用于測(cè)定交叉反應(yīng)性。例如，SEQID NO2蛋白可固定在固體支持物上。加入所述測(cè)定中蛋白與抗血清競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合固定抗原。上述蛋白與抗血清競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合固定蛋白的能力與例如gp130或IL-12Rβ2蛋白進(jìn)行比較。使用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算方法計(jì)算上述蛋白的交叉反應(yīng)百分率。選擇并合并與以上所列各蛋白的交叉反應(yīng)性百分率低于10％的抗血清。然后用上述蛋白通過免疫吸收從合并抗血清中去除交叉反應(yīng)抗體。
然后免疫吸收的合并抗血清用于上述競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫測(cè)定，以比較第二種蛋白與所述免疫原蛋白(例如SEQ ID NO2的DCRS5樣蛋白)。為了進(jìn)行這種比較，分別分析廣泛濃度的兩種蛋白，確定抑制50％抗血清與固定蛋白結(jié)合需要的各蛋白量。如果第二種蛋白的需要量是選定蛋白需要量的三分之一以下，則認(rèn)為第二種蛋白特異性結(jié)合針對(duì)所述免疫原產(chǎn)生的抗體。
當(dāng)然，這些細(xì)胞因子受體蛋白是包括許多鑒定基因的同源蛋白家族成員。對(duì)于特定基因產(chǎn)物來說，例如DCRS5，該術(shù)語不僅指本文公開的氨基酸序列，而且指為等位基因、非等位基因或種變異體的其它蛋白。還應(yīng)該理解的是，該術(shù)語包括使用常規(guī)重組技術(shù)如單一位點(diǎn)突變的精細(xì)突變引入的非天然突變，或者通過切除編碼相應(yīng)蛋白的DNA的很短部分、或取代新的氨基酸、或加入新的氨基酸而引入的非天然突變。所述細(xì)微改變通?；旧媳３衷肿拥拿庖咛匦院?或其生物活性。因此，這些改變包括與指定天然DCRS5蛋白特異性免疫反應(yīng)的蛋白。改變蛋白的生物特性可如下測(cè)定在合適細(xì)胞系中表達(dá)所述蛋白，然后檢測(cè)對(duì)例如轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞的合適作用。被認(rèn)為是微小改變的特定蛋白修飾包括相似化學(xué)性質(zhì)氨基酸的保守取代，見以上對(duì)整個(gè)細(xì)胞因子受體家族的論述。通過使一種蛋白與所述細(xì)胞因子受體蛋白優(yōu)化排列對(duì)比，以及使用本文介紹的常規(guī)免疫測(cè)定測(cè)定免疫特性，人們可確定本發(fā)明的蛋白質(zhì)組成。
而且，抗受體亞單位的抗體可用以空間性阻斷配體結(jié)合功能受體。所述抗體可只針對(duì)其中任何一個(gè)亞單位或針對(duì)DCRS5和IL-12Rβ1組合結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生。可得到抗體拮抗劑。
VII.試劑盒、診斷及定量本發(fā)明的天然和重組形式的細(xì)胞因子受體樣分子特別可用于試劑盒和檢測(cè)方法。例如，這些方法還可用于篩選例如配體對(duì)這些蛋白的結(jié)合活性。近年來開發(fā)了若干自動(dòng)檢測(cè)方法，以便每年可篩選成千上萬的化合物。參見例如BIOMEK自動(dòng)工作站，BeckmanInstruments，Palo Alto，California，以及Fodor等(1991)Science251767-773，它們均通過引用結(jié)合到本文中。后者介紹了通過在固體支持物上合成的多個(gè)規(guī)定聚合物的結(jié)合測(cè)試方法。提供大量純化活性可溶性細(xì)胞因子受體(例如本發(fā)明提供的細(xì)胞因子受體)可大大促進(jìn)開發(fā)篩選配體或激動(dòng)劑/拮抗劑同源蛋白的合適方法。
純化DCRS5可直接包被在板上，以用于上述配體篩選技術(shù)。然而，上述蛋白的非中和抗體可用作捕獲抗體，以使相應(yīng)的受體固定在用于例如診斷用途的固體相上。
本發(fā)明還設(shè)想了DCRS5、其片段、肽及其融合產(chǎn)物在檢測(cè)所述蛋白或其配體的存在的各種診斷試劑盒以及方法中的應(yīng)用?；蛘?，抗所述分子的抗體可加入所述試劑盒和方法中。通常試劑盒具有含DCRS5肽或基因節(jié)段或者識(shí)別一種或另一種物質(zhì)的試劑的區(qū)室。如果為肽，識(shí)別試劑通常為受體或抗體，如果為基因節(jié)段，則識(shí)別試劑通常為雜交探針。其它試劑盒組分可包括與配體/受體對(duì)的p40、IL-B30或IL-12Rβ1相關(guān)的其它蛋白或試劑。
測(cè)定樣品的DCRS5濃度的優(yōu)選試劑盒通常包括對(duì)DCRS5具有已知結(jié)合親和性的標(biāo)記化合物如配體或抗體、作為陽性對(duì)照的DCRS5源(天然或重組DCRS5)和分離結(jié)合標(biāo)記化合物與游離標(biāo)記化合物的手段，例如固定試樣中的DCRS5的固相體。通常提供包含試劑的區(qū)室和說明書。還提供包含合適核酸或蛋白的試劑盒。
哺乳動(dòng)物DCRS5或肽片段或者受體片段特異性抗體(包括抗原結(jié)合片段)可用于診斷用途，以便檢測(cè)升高水平的配體和/或其片段的存在。診斷檢測(cè)可以是均相檢測(cè)(沒有游離試劑和抗體抗原復(fù)合物的分離步驟)或非均相(具有分離步驟)。存在各種商業(yè)測(cè)定法，例如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、酶放大免疫分析技術(shù)(EMIT)、底物標(biāo)記的熒光免疫測(cè)定(SLFIA)等。例如，可以如下使用未標(biāo)記抗體使用標(biāo)記而且識(shí)別所述抗體的第二種抗體，前一種抗體針對(duì)細(xì)胞因子受體或其特定片段。這些檢測(cè)還在文獻(xiàn)中有深入的論述。參見例如Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH.，以及Coligan(主編，1991和定期增刊)Current Protocols In Immunology Greene/Wiley，New York。
抗獨(dú)特型抗體具有用作細(xì)胞因子受體的激動(dòng)劑或拮抗劑的相似用途。它們?cè)诤线m條件下可用作治療藥物。
一般來說，用于診斷測(cè)定的試劑以試劑盒供應(yīng)，以便優(yōu)化所述測(cè)定的敏感性。對(duì)于本發(fā)明目的，根據(jù)測(cè)定、方法和標(biāo)記物的性質(zhì)，提供標(biāo)記或未標(biāo)記抗體、或者提供標(biāo)記配體。通常結(jié)合提供其它添加劑，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、信號(hào)產(chǎn)生必需的物質(zhì)如酶的底物等。優(yōu)選所述試劑盒還包括正確使用和內(nèi)容物用后處理的說明書。通常，試劑盒具有各有用試劑的區(qū)室，而且包含正確使用以及試劑處理的說明書。最好，所述試劑以干燥凍干粉提供，其中試劑可重新配制為含有合適濃度的水性溶液，從而進(jìn)行測(cè)定。
可以勿須改進(jìn)直接使用所述診斷測(cè)定的上述組分，或者可以以多種方式進(jìn)行改進(jìn)。例如，可通過共價(jià)或非共價(jià)連接直接或間接提供檢測(cè)信號(hào)的部分而完成標(biāo)記。在其中許多測(cè)定中，可直接或間接標(biāo)記受試化合物、細(xì)胞因子受體或其抗體。可用于直接標(biāo)記的標(biāo)記物包括放射性標(biāo)記物如125I、酶(美國專利號(hào)3,645,090)如過氧化物酶和堿性磷酸酶、以及能夠監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)位移或熒光極化變化的熒光標(biāo)記物(美國專利號(hào)3,940,475)。兩個(gè)專利均通過引用結(jié)合到本文中。可間接標(biāo)記的標(biāo)記物包括一種組分的生物素化，然后結(jié)合與一種上述標(biāo)記物偶合的抗生物素蛋白。
此外，有許多分離結(jié)合配體與游離配體、或者分離結(jié)合受試化合物或游離受試化合物的方法。細(xì)胞因子受體可固定在各種基體，然后洗滌。合適基體包括塑料如ELISA板、濾膜和珠。使受體固定在基體上的方法包括但不限于直接粘附到塑料上、應(yīng)用捕獲抗體、化學(xué)偶合和生物素抗生物素蛋白。這種方法的最后一步包括通過若干方法中的任何一種方法沉淀抗體/抗原復(fù)合物，包括應(yīng)用例如有機(jī)溶劑如聚乙二醇或者鹽如硫酸銨。其它合適的分離技術(shù)包括但不限于Rattle等(1984)Clin.Chem.30(9)1457-1461介紹的熒光素抗體磁粒方法和美國專利號(hào)4,659,678介紹的雙抗磁粒分離法，它們均通過引用結(jié)合到本文中。
連接蛋白或片段與各種標(biāo)記物的方法在文獻(xiàn)中有廣泛報(bào)道，在此不需要詳細(xì)論述。其中許多技術(shù)涉及應(yīng)用活化羧基通過碳二亞胺或活性酯形成肽鍵、疏基與活化鹵素(如氯乙?；?反應(yīng)形成硫醚、或者活化烯烴如馬來酰亞胺，以進(jìn)行連接等。融合蛋白也具有這些用途。
本發(fā)明的另一個(gè)診斷方面涉及取自細(xì)胞因子受體序列的寡核苷酸或多核苷酸序列的應(yīng)用。這些序列可用作檢測(cè)懷疑患有免疫疾病的患者的相應(yīng)細(xì)胞因子受體水平的探針。制備RNA和DNA核苷酸序列，對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，所述的序列的優(yōu)選大小均在文獻(xiàn)中有大量介紹和論述。通常寡核苷酸具有至少約14個(gè)核苷酸，常常至少約18個(gè)核苷酸，多核苷酸探針可多至數(shù)千個(gè)堿基?？墒褂酶鞣N標(biāo)記物，最常用放射性核素，特別是32P。然而，也可使用其它技術(shù)，例如生物素修飾的核苷酸引入多核苷酸。然后，生物素用作結(jié)合抗生物素蛋白或抗體的位點(diǎn)，所述抗生物素蛋白或抗體可用各種標(biāo)記物標(biāo)記，例如放射性核素、熒光、酶等。或者，可使用能夠識(shí)別特異性雙鏈體(包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、DNA RNA雜合雙鏈體或DNA蛋白質(zhì)雙鏈體)的抗體。然后，再標(biāo)記所述抗體，進(jìn)行檢測(cè)，其中所述雙鏈體結(jié)合在表面上，這樣當(dāng)在表面形成雙鏈體時(shí)，可檢測(cè)結(jié)合所述雙鏈體的抗體的存在?？梢杂贸Ｒ?guī)技術(shù)對(duì)新的反義RNA進(jìn)行探針，例如核酸雜交，加上或減去篩選，重組探測(cè)，雜交體釋放的翻譯(HRT)和雜交體中止的翻譯(HART)。還包括擴(kuò)增技術(shù)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
還設(shè)想了也測(cè)試其它標(biāo)記的定性或定量存在的診斷試劑盒。診斷或預(yù)后可能取決于用作標(biāo)記的多個(gè)指標(biāo)的綜合考慮。因此，試劑盒可測(cè)試綜合標(biāo)記。見，如Viallet等(1989)Progress in Growth FactorRes.189-97。檢測(cè)可能反映功能受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)差異的多態(tài)性可用于決定治療策略。反映對(duì)配體的更強(qiáng)或更弱反應(yīng)的差異可進(jìn)一步區(qū)分反應(yīng)/非反應(yīng)患者亞群。
VIII.治療應(yīng)用本發(fā)明提供具有重要治療價(jià)值的試劑。參見例如Levitzki(1996)Curr.Opin.Cell Biol.8239-244。細(xì)胞因子受體(天然或重組)、其片段、突變蛋白受體和抗體以及經(jīng)鑒定對(duì)所述受體或抗體具有結(jié)合親和力的化合物均可用于治療所述受體或其配體表達(dá)異常的病癥。所述異常通常表現(xiàn)為免疫紊亂。參見WO 01/18051，其通過引用結(jié)合到本文中。另外，本發(fā)明在各種與異常表達(dá)或異常引發(fā)對(duì)所述配體的反應(yīng)有關(guān)的疾病或病癥方面具有治療價(jià)值。例如，已經(jīng)提出p40/IL B30配體參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫的產(chǎn)生，例如抗腫瘤活性，建立體液和細(xì)胞免疫以及抗病毒作用。所述配體似乎特別激活NK細(xì)胞和T細(xì)胞。治療可與IL-18、IL-12、TNF、IFNγ、放射/化療、輔助治療或抗腫瘤、抗病毒、或抗真菌化合物聯(lián)合應(yīng)用。
相反，可與TNF、IFNγ、IL-18或IL-12拮抗劑、或與IL-10、或與類固醇聯(lián)合應(yīng)用的拮抗劑適用于慢性Th1介導(dǎo)性疾病、自身免疫性疾病、或移植和/或排斥、多發(fā)性硬化、牛皮癬、慢性炎癥性病癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、或炎癥性腸病。拮抗劑可以為抗所述受體亞單位、可溶性受體結(jié)構(gòu)的抗體形式，或者是一種或多種所述受體亞單位的反義核酸。p40/IL-B30配體與受體亞單位DCRS5和IL-12Rβ1的配對(duì)對(duì)激動(dòng)劑和拮抗劑的應(yīng)用提供了了解。
根據(jù)所述p40/IL-B30活性，在治療上，可溶性DCRS5(同時(shí)存在或不存在可溶性IL-12Rβ1)或任一受體亞單位的抗體可實(shí)現(xiàn)所述細(xì)胞因子的拮抗劑作用。拮抗劑可用作不需要免疫反應(yīng)或炎癥反應(yīng)的拮抗劑、用以針對(duì)記憶T細(xì)胞，或者與IL-12/IL-12R拮抗劑或其它抗炎劑或免疫抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。臨床適應(yīng)癥可以為慢性炎癥或移植。各種多態(tài)性可增強(qiáng)或降低受體功能，如果作用明顯的話，可用作治療藥物。所述變異的鑒定可進(jìn)一步區(qū)分反應(yīng)或非反應(yīng)患者亞群。所述試劑可用作記憶T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞的檢測(cè)或標(biāo)記試劑或燒蝕試劑。
基因治療可使目的細(xì)胞群對(duì)p40/IL-B30配體產(chǎn)生反應(yīng)，例如用作腫瘤免疫治療的輔助治療，以便促進(jìn)活化腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞或NK細(xì)胞。反義策略可用于例如阻止受體反應(yīng)。
已知RNA印跡分析顯示產(chǎn)生IL-12 p40和/或IL-B30 mRNA的細(xì)胞類型的各種異常病癥。參見Berkow(主編)The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，Merck & Co.，Rahway，N.J.；Thorn等，Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，N.Y.；Weatherall等(主編)Oxford Textbook of Medicine，Oxford University Press，Oxford。許多其它醫(yī)學(xué)病癥對(duì)本發(fā)明提供的激動(dòng)劑或拮抗劑治療有效。參見例如Stites和Terr(主編；1991)Basic and Clinical Immunology Appleton and Lange，Norwalk，Connecticut；Samter等(主編)Immunologicai Diseases Little，Brown and Co.。其它可能的治療適應(yīng)癥包括骨重建、性功能異常、預(yù)防神經(jīng)變性性疾病、癡呆、應(yīng)激等。這些病癥易于應(yīng)用本發(fā)明提供的組合物預(yù)防或治療。
可以純化重組細(xì)胞因子受體、突變蛋白、激動(dòng)劑或其拮抗劑抗體、或抗體，然后給予患者。這些藥物可與其它活性成分聯(lián)合治療應(yīng)用，例如利用常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑以及生理學(xué)上沒有副作用的穩(wěn)定劑和賦形劑。這些組合物可以無菌(例如過濾)，用劑量小瓶?jī)龈桑蛘咭苑€(wěn)定水性制劑保藏。本發(fā)明還設(shè)想了抗體或其非補(bǔ)體結(jié)合性的結(jié)合片段的應(yīng)用。
利用細(xì)胞因子受體或其片段篩選配體，以鑒定對(duì)所述受體具有結(jié)合親和性的分子。然后利用生物學(xué)測(cè)定確定推定配體能否可阻斷固有刺激活性的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。受體片段可用作阻滯劑或拮抗劑，因?yàn)樗钄嗯潴w的活性。同樣，具有固有刺激活性的化合物可激活所述受體，因此為激動(dòng)劑，因?yàn)樗碳づ潴w活性，例如誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明還設(shè)想了細(xì)胞因子受體抗體用作拮抗劑的治療用途。
有效治療必需的試劑量取決于許多不同因素，包括給藥方法、目標(biāo)部位、試劑的生理周期、藥理周期、患者的生理狀態(tài)和給予的其它藥物。因此，應(yīng)該逐漸增加治療劑量以達(dá)到最佳安全性和療效。通常體外使用劑量對(duì)于原位給予所述試劑所用的量提供有用的指導(dǎo)。對(duì)特定疾病的有效治療劑量的動(dòng)物試驗(yàn)可進(jìn)一步預(yù)示人類劑量。在例如以下文獻(xiàn)中介紹了對(duì)各種因素的考慮Gilman等(主編，1990)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases of Therapeutics，第八版，Pergamon Press；Remington’s Pharmaceutical Scienees，第17版(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；各文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中。其中以及下文討論了給藥方法，例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥、透皮擴(kuò)散等。藥學(xué)上可接受的載體包括水、鹽水、緩沖劑和例如Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jersey中介紹的其它化合物。因?yàn)橥贫ㄅ潴w和其受體之間的可能的高親和性結(jié)合或者轉(zhuǎn)換數(shù)，預(yù)期開始的低劑量的所述試劑應(yīng)該有效。而且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提示，極低劑量的配體可能有效。因此，預(yù)期采用合適載體時(shí)，劑量范圍為低于1mM濃度，通常低于約10μM濃度，常常低于約100nM，優(yōu)選低于約10pM(皮摩爾)，最優(yōu)選低于約1fM(費(fèi)摩爾)。緩釋制劑或緩釋裝置常常用來連續(xù)給藥。
細(xì)胞因子受體、其片段、及抗體或其片段、拮抗劑、以及激動(dòng)劑可直接給予要治療的宿主，或者根據(jù)所述化合物的大小，最好在其給藥前將其與載體蛋白如卵清蛋白或血清白蛋白綴合。治療制劑可以按照許多常規(guī)劑型給藥。盡管所述活性成分可以單獨(dú)給藥，但是優(yōu)選以藥用制劑給藥。制劑包含至少一種以上定義的活性成分和其一種或多種合格的載體。每種載體必須在與所述其它成分匹配和對(duì)患者無害的意義上在藥學(xué)和生理學(xué)上可接受。制劑包含適合口服、直腸、鼻或胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮肉)給藥的載體。制劑可以常規(guī)以單位劑型提供，而且可用藥學(xué)領(lǐng)域周知的方法制備。參見例如Gilman等(主編，1990)Goodman and Gilman’sThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版(1990)，Mack PublishingCo.，Easton，Penn；Avis等(主編，1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications Dekker，NY；Lieberman等(主編，1990)Pharmaceutical Dosage Forms；Tablets Dekker，NY；Lieberman等(主編，1990)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems Dekker，NY。本發(fā)明療法可與其它治療藥物、尤其是其它細(xì)胞因子受體家族成員的激動(dòng)劑或拮抗劑聯(lián)合應(yīng)用或結(jié)合使用。
IX.篩選可用DCRS5或其片段進(jìn)行藥物篩選，以鑒定對(duì)所述受體單位具有結(jié)合親和力的化合物，包括分離結(jié)合組分。然后，可應(yīng)用后續(xù)生物學(xué)測(cè)定確定所述化合物是否具有特有刺激活性，因此它為阻滯劑或拮抗劑，因?yàn)樗钄嗯潴w的活性。
p40/IL-B30配體與功能受體DCRS3和IL-12Rβ1的匹配使得可篩選拮抗劑和具有正信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制的激動(dòng)劑?？蛇M(jìn)行小分子或抗體篩選。
一種藥物篩選方法利用表達(dá)DCRS5和另一種細(xì)胞因子受體亞單位例如IL-12Rβ1的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞或原核宿主細(xì)胞。據(jù)認(rèn)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)利用STAT4。分離表達(dá)獨(dú)立于其它功能受體的受體的細(xì)胞?？蓪⒒畹幕蚬潭ǖ乃黾?xì)胞用于標(biāo)準(zhǔn)抗體/抗原或配體/受體結(jié)合測(cè)定。參見例如Parce等(1989)Science 246243-247；Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 874007-4011，該文獻(xiàn)了檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)的敏感方法。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定特別有用，其中使細(xì)胞與對(duì)所述配體具有已知結(jié)合親和性的標(biāo)記受體或抗體接觸溫育，例如125I-抗體，然后測(cè)定試樣對(duì)結(jié)合組合物的結(jié)合親和性。之后分離結(jié)合與游離標(biāo)記結(jié)合組合物，以評(píng)價(jià)配體結(jié)合程度。結(jié)合的受試化合物量與標(biāo)記受體對(duì)已知來源的結(jié)合量成反比。許多技術(shù)可用來分離結(jié)合與游離配體以評(píng)價(jià)配體結(jié)合程度。分離步驟通常包括的程序例如為粘附至濾膜上然后洗滌，粘附至塑料上然后洗滌，或離心細(xì)胞膜?；罴?xì)胞也可用來篩選藥物對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)功能的影響，例如STAT4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。某些檢測(cè)方法可以消除分離步驟，例如近接敏感檢測(cè)系統(tǒng)。
參考以下實(shí)施例可深入理解本發(fā)明的廣泛范圍，而下列實(shí)施例不是用來將本發(fā)明限制于具體實(shí)施方案。
實(shí)施例I.通用方法標(biāo)準(zhǔn)方法在例如以下文獻(xiàn)中有介紹或涉及Maniatis等(1982)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press；Sambrook等(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，(第2版)，第1-3卷，CSH Press，NY；或者Ausubel等(1987和增刊)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York。蛋白純化方法包括例如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶等。參見例如Ausubel等(1987和定期出版的增刊)；Coligan等(主編，1996)和定期出版的增刊，Current Protocols In Protein ScienceGreene/Wiley，New York；Deutscher(1990)“Guide to ProteinPurification”，Methods in Enzymology，第82卷，以及該系列的其它卷號(hào)；以及生產(chǎn)商關(guān)于蛋白純化產(chǎn)物的應(yīng)用的文獻(xiàn)，例如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，CA。與重組技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用使得可融合至合適節(jié)段，例如通過蛋白酶取出序列融合的FLAG序列或等同物。參見例如Hochuli(1990)“Purification of RecombinantProteins with Metal Chelate Absorbent”，載于Setlow(主編)GeneticEngjneering，Principle and Methods 1287-98，Plenum Press，N.Y.；Crowe等(1992)QIAexpressThe High Level Expression & Protein PurificationSystem QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如使用計(jì)算機(jī)軟件程序進(jìn)行計(jì)算機(jī)序列分析，例如GCG(U.Wisconsin)和GenBank來源的程序。公共序列數(shù)據(jù)庫也可使用，例如GenBank等數(shù)據(jù)庫。
適用于IL-10受體的許多方法可用于DCRS5，例如美國專利號(hào)5,789,192(IL-10受體)所述，其通過引用結(jié)合到本文中。
II.功能克隆觀測(cè)到抗hIL-12Rβ1抗體阻斷人T細(xì)胞對(duì)p40/IL-B30的反應(yīng)，以及阻斷p40/IL-30B結(jié)合IL-12Rβ1。提示IL-12Rβ1是受體復(fù)合物對(duì)p40/IL-B30的一個(gè)亞單位。
鑒定對(duì)p40/IL-B30反應(yīng)但是對(duì)IL-12不反應(yīng)的小鼠T細(xì)胞群，以及對(duì)IL-12反應(yīng)但是對(duì)p40/IL-B30不反應(yīng)的另一種T細(xì)胞群。此外，觀測(cè)到表達(dá)重組mIL-12Rβ1和mIL-12Rβ2的Ba/F3細(xì)胞對(duì)IL-12反應(yīng)，但是對(duì)p40/IL-B30不反應(yīng)。綜合上述結(jié)果表明，對(duì)p40/IL-B30的受體復(fù)合物包含IL-12Rβ1和至少一種非IL-12Rβ2的其它亞單位。因此，設(shè)計(jì)表達(dá)克隆策略，以分離所述第二種受體組分。
用從Kit225細(xì)胞(對(duì)IL-12和p40/IL-B30均反應(yīng)的IL-2依賴性人T細(xì)胞系)分離的mRNA制備cDNA文庫。用反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMX制備cDNA文庫。用該cDNA文庫感染表達(dá)重組hIL-12Rβ1的Ba/F3細(xì)胞，使其在IL-3中恢復(fù)3-4天，然后用含50ng/ml hyper-hp40/hIL-B30的培養(yǎng)基洗滌并以約15,000細(xì)胞/孔接種在96孔板中。見WO 01/18051。培養(yǎng)物每約5天補(bǔ)充額外的hyper-hp40/hIL-B30。約2周后，5-10％孔細(xì)胞生長(zhǎng)。從各孔收集細(xì)胞，用hyper-hp40/hIL-B30分別進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，測(cè)試對(duì)hyper-hp40/hIL-B30的生長(zhǎng)依賴性。
通過PCR分析p40/IL-B30依賴性生長(zhǎng)細(xì)胞的反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA插入片段。分析了其中40個(gè)以上的分離物，所有分離物(除1個(gè)外)包含編碼新的受體DCRS5的cDNA。將該候選人cDNA克隆入表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染入表達(dá)hIL-12Rβ1的Ba/F3細(xì)胞。這些細(xì)胞成為對(duì)p40/IL-B30反應(yīng)的細(xì)胞；因此，我們的結(jié)論是，新的cDNA編碼目的DCRS5，它為功能性IL-B30受體亞單位。
III.全長(zhǎng)DCRS5的特征；染色體定位DCRS5的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域整體上不與其它細(xì)胞因子受體胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(在該家族分子中觀測(cè)到的共有結(jié)構(gòu)域)密切相關(guān)。所述胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含7個(gè)tyr殘基，至少其中3個(gè)構(gòu)成可識(shí)別的SH2-結(jié)合基元YEDI、YKPQ和YFPQ的組成部分。YEDI基元類似于鑒定的酪氨酸磷酸酶shp2的結(jié)合位點(diǎn)。后兩個(gè)基元分別非常類似于已知結(jié)合Stat1/Stat3或Stat3的序列。YKPQ基元與鄰近側(cè)翼序列在一定程度上類似于已知結(jié)合Stat1-3的Stat4和IL-12Rβ2中的基元。這與初步的數(shù)據(jù)一致，說明p40/IL-B30如IL-12激活Stat4。
得自DCRS5序列的PCR引物用來探測(cè)人cDNA文庫。序列可得自例如表1，優(yōu)選鄰近序列末端的序列。例如通過λgt10噬菌體的DNA雜交篩選克隆靈長(zhǎng)類、嚙齒類或其它物種DCRS5的全長(zhǎng)cDNA。使用T.aquaticus Taqplus DNA聚合酶(Stratagene)在合適條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。
比較染色體分布制品。對(duì)用培養(yǎng)72小時(shí)的植物凝集素刺激的人淋巴細(xì)胞獲得的染色體制品進(jìn)行原位雜交。在培養(yǎng)的最后7小時(shí)加入5-溴脫氧尿苷(60μg/ml培養(yǎng)基)，保證雜交后染色體形成良好的帶。
將借助于引物擴(kuò)增的PCR片段克隆入合適載體。用3H通過缺口翻譯標(biāo)記載體。如Mattei等(1985)Hum.Genet.69327-331所述，以200ng/ml終濃度的雜交溶液使放射性標(biāo)記的探針與分開的中期染色體雜交。
用核示蹤乳液(KODAK NTB2)包被后，使載玻片曝光。為了避免形成帶方法中的任何銀顆?；瑒?dòng)，首先用緩沖的姬姆沙溶液將分開的中期染色體染色，并照相。然后通過熒光染料-光解-姬姆沙(FPG)方法形成R帶，再照相，然后分析。
相似的合適方法用于其它物種。
IV.DCRS5 mRNA的定位包含約2μg poly(A)+RNA/道的人多組織(Cat#1，2)和癌細(xì)胞系印跡(Cat#7757-1)購自Clontech(Palo Alto，CA)。例如使用AmershamRediprime隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(RPN1633)用[α-32P]dATP放射性標(biāo)記探針。例如于65℃在0.5M Na2HPO4，7％ SDS，0.5M EDTA(pH8.0)中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。例如開始于65℃在2xSSC，0.1％ SDS中洗滌40分鐘，然后在0.1xSSC，0.1％ SDS中洗滌20分鐘，從而進(jìn)行嚴(yán)格洗滌。之后將膜于-70℃對(duì)X光膠片(Kodak)在存在增感屏下曝光。用選定的合適人DCRS5克隆通過cDNA文庫的DNA印跡進(jìn)行更詳細(xì)的研究，以檢測(cè)其在造血細(xì)胞或其它細(xì)胞亞群中的表達(dá)。
或者，從表1選擇2個(gè)合適引物。對(duì)根據(jù)存在信使RNA選擇的合適mRNA樣品(例如表達(dá)所述基因的樣品)使用RT-PCR以獲得cDNA。
通過PCR信號(hào)預(yù)選擇的合適組織的cDNA文庫的雜交分離全長(zhǎng)克隆。可進(jìn)行RNA印跡。
利用合適技術(shù)如PCR、免疫測(cè)定、雜交等分析編碼DCRS5的基因的信息。組織和器官cDNA制品可得自例如Clontech，Mountain View，CA。如上所述，鑒定天然表達(dá)的來源是有用的。而鑒定功能受體亞單位對(duì)可預(yù)測(cè)什么細(xì)胞表達(dá)對(duì)各細(xì)胞因子配體產(chǎn)生生理反應(yīng)的組合受體亞單位。
對(duì)于小鼠分布，例如可進(jìn)行DNA印跡分析用合適限制酶消化第一次擴(kuò)增的cDNA文庫的DNA(5μg)，釋放插入片段，在1％瓊脂糖凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Schleicher和Schuell，Keene，NY)。
小鼠mRNA分離樣品包括靜止的小鼠成纖維L細(xì)胞系(C200)；BrafER(雌激素受體的Braf融合物)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照(C201)；T細(xì)胞，TH1型極化(脾細(xì)胞的Mell4亮、CD4+細(xì)胞，用IFN-γ和抗IL-4極化7天；T200)；T細(xì)胞，TH2型極化(脾細(xì)胞的Mell亮、CD4+細(xì)胞，用IL-4和抗IFN-γ極化7天；T201)；T細(xì)胞，高度TH1型極化(參見Openshaw等(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗CD3活化2、6、16小時(shí)，合并物；T202)；T細(xì)胞，高度TH2型極化(參見Openshaw等(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗CD3活化2、6、16小時(shí)，合并物；T203)；CD44-CD25+pre T細(xì)胞，從胸腺分選出(T204)；TH1T細(xì)胞克隆D1.1，最后一次抗原刺激后靜息3周(T205)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，10μg/ml ConA刺激15小時(shí)(T206)；TH2T細(xì)胞克隆CDC35，最后一次抗原刺激后靜息3周(T207)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，10μg/ml ConA刺激15小時(shí)(T208)；脾的Mell4+原初T細(xì)胞，靜息(T209)；Mell4+T細(xì)胞，用IFN-γ-/IL-12/抗IL-4極化為Th1 6、12、24小時(shí)，合并物(T210)；Mell4+T細(xì)胞，用IL-4/抗IFN-γ極化為Th2 6、13、24小時(shí)，合并物(T211)；未刺激的成熟B細(xì)胞白血病細(xì)胞系A(chǔ)20(B200)；未刺激的B細(xì)胞系CH12(B201)；未刺激的脾大B細(xì)胞(B202)；整個(gè)脾的B細(xì)胞，LPS活化(B203)；甲泛影酰胺富集的脾樹突細(xì)胞，靜息(D200)；骨髓樹突細(xì)胞，靜息(D201)；用LPS活化4小時(shí)的單核細(xì)胞系RAW 264.7(M200)；用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬細(xì)胞(M201)；巨噬細(xì)胞系J774，靜息(M202)；巨噬細(xì)胞系J774+LPS+抗IL-10，0.5、1、3、6、12小時(shí)，合并物(M203)；巨噬細(xì)胞系J774+LPS+IL-10，0.5、1、3、5、12小時(shí)，合并物(M204)；氣霧劑刺激的小鼠肺組織，Th2型激發(fā)，氣霧劑OVA刺激7、14、23小時(shí)，合并物(參見Garlisi等(1995)Clinical Immunology and Immunopathology 7575-83，X206)；日?qǐng)A線蟲感染的肺組織(參見Coffman等(1989)Science245308-310；X200)；完整成年肺，正常(O200)；完整肺，rag-1(參見Schwarz等(1993)Immunodeficiency 4249-252；O205)；IL-10 K.O.脾(參見Kuhn等(1991)Cell 75263-274；X201)；完整成年脾，正常(O201)；完整脾，rag-1(O207)；IL-10 K.O.集合淋巴結(jié)(O202)；完整集合淋巴結(jié)，正常(O210)；IL-10 K.O.腸系膜淋巴結(jié)(X203)；完整腸系膜淋巴結(jié)，正常(O211)；IL-10 K.O.結(jié)腸(X203)；完整結(jié)腸，正常(O212)；NOD小鼠胰腺(參見Makino等(1980)Jikken Dobutsu 291-13；X205)；完整胸腺，rag-1(O208)；完整腎臟，rag-1(O209)；完整心臟，rag-1(O202)；完整大腦，rag-1(O203)；完整睪丸，rag-1(O204)；完整肝臟，rag-1(O206)；大鼠正常關(guān)節(jié)組織(O300)；大鼠關(guān)節(jié)炎性關(guān)節(jié)組織(X300)。
人mRNA分離樣品包括外周血單核細(xì)胞(單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞)，靜息(T100)；外周血單核細(xì)胞，用抗CD3活化2、6、12小時(shí)，合并物(T101)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，靜息(T102)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用抗CD28和抗CD3活化3、6、12小時(shí)，合并物(T103)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用特異性肽無變應(yīng)性處理7、12小時(shí)，合并物(T104)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，靜息(T107)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用抗CD28和抗CD3活化3、6、12小時(shí)，合并物(T108)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用特異性肽無變應(yīng)性處理2、6、12小時(shí)，合并物(T109)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，靜息(T110)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，用抗CD28和抗CD3活化2、7、12小時(shí)，合并物(T111)；T細(xì)胞CD4+CD45RO用抗CD28、IL-4和抗IFNγ極化27天的T細(xì)胞，TH2型極化，用抗CD3和抗CD28活化4小時(shí)(T116)；T細(xì)胞腫瘤系Jurkat和Hut78，靜息(T117)；T細(xì)胞克隆，合并物的AD130.2、Tc783.12、Tc783.13、Tc783.58、Tc782.69，靜息(T118)；T細(xì)胞隨機(jī)γδ T細(xì)胞克隆，靜息(T119)；脾細(xì)胞，靜息(B100)；脾細(xì)胞，用抗CD40和IL-4活化(B101)；B細(xì)胞EBV系，合并的WT49、RSB、JY、CVIR、721.221、RM3、HSY，靜息(B102)；B細(xì)胞系JY，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(B103)；合并的NK20克隆，靜息(K100)；合并的NK20克隆，用PMA和離子霉素活化6小時(shí)(K101)；NKL克隆，得自LGL白血病患者的外周血，IL-2處理(K106)；NK細(xì)胞毒性克隆640-A30-1，靜息(K107)；造血前體細(xì)胞系TF1，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(C100)；U937前單核細(xì)胞系，靜息(M100)；U937前單核細(xì)胞系，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(M101)；淘洗的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10活化1、2、6、12、24小時(shí)，合并物(M102)；淘洗的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10活化1、2、6、12、24小時(shí)，合并物(M103)；淘洗的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10活化4、16小時(shí)，合并物(M106)；淘洗的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10活化4、16小時(shí)，合并物(M107)；淘洗的單核細(xì)胞，用LPS活化1小時(shí)(M108)；淘洗的單核細(xì)胞，LPS活化6小時(shí)(M109)；DC70％CD1a+，得自CD34+GM-CSF、TNFα12天，靜息(D101)；DC70％CD1a+，得自CD34+GM-CSF、TNFα12天，用PMA和離子霉素活化1小時(shí)(D102)；DC70％CD1a+，得自CD34+GM-CSF、TNFα12天，用PMA和離子霉素活化6小時(shí)(D103)；DC95％CD1a+，得自CD34+GM-CSF、TNFα12天，F(xiàn)ACS分選，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(D104)；DC95％CD1a+，沒有CD34+GM-CSF、TNFα12天，F(xiàn)ACS分選，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(D105)；DC CD1a+CD86+，得自CD34+GM-CSF、TNFα12天，F(xiàn)ACS分選，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(K106)；DC，得自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，靜息(D107)；DC，得自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，靜息(D108)；DC，得自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，用LPS活化4、16小時(shí)，合并物(D109)；DC，得自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-4 5天，用TNFα、單核細(xì)胞上清液(supe)活化4、16小時(shí)，合并物(D110)；平滑肌瘤L11良性腫瘤(X101)；正常子宮肌層M5(O115)；惡性平滑肌瘤GS1(X103)；肺成纖維細(xì)胞肉瘤系MRC5，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(C101)；腎上皮癌細(xì)胞系CHA，用PMA和離子霉素活化1、6小時(shí)，合并物(C102)；雄性28周胚胎腎(O100)；雄性20周胚胎肺(O101)；雄性28周胚胎肝臟(O102)；雄性28周胚胎心臟(O103)；雄性28周胚胎大腦(O104)；雄性28周胚胎膀胱(O106)；雄性28周胚胎小腸(O107)；雄性28周胚胎脂肪組織(O108)；雌性28周胚胎卵巢(O109)；雌性28周胚胎子宮(O110)；雄性28周胚胎睪丸(O111)；雄性28周胚胎脾(O112)；成熟28周胎盤(O113)；12歲齡發(fā)炎的扁桃體(X100)。
可分離其它物種的相似樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。
V.克隆DCRS5的物種相應(yīng)物各種策略用來獲得DCRS5的種相應(yīng)物，優(yōu)選其它靈長(zhǎng)類或嚙齒類。一種方法是使用密切相關(guān)的種DNA探針的交叉雜交。該方法可用來作為中間步驟研究進(jìn)化相似的物種。另一種方法是使用基于鑒定基因之間的相似或不同區(qū)段的特異性PCR引物，例如高度保守或非保守多肽或核苷酸序列區(qū)段。
數(shù)據(jù)庫檢索可鑒定相似序列，可獲得合適探針。
VI.產(chǎn)生哺乳動(dòng)物DCRS5蛋白工程合適的融合構(gòu)建物(如GST)用于在例如大腸桿菌中表達(dá)。例如構(gòu)建小鼠IGIF pGex質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。例如在包含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)新轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，用IPTG(Sigma，St.Louis，MO)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過夜后，收獲細(xì)菌，分離含DCRS5蛋白的沉淀。例如用2L TE緩沖液(50mM Tris-堿pH8.0，10mM EDTA和2mMpefabloc)勻化沉淀。使其通過微型流化儀(Microfluidics，Newton，MA)3次。液化上清液用Sorvall GS-3轉(zhuǎn)子以13,000rpm離心1小時(shí)。過濾所得的包含所述細(xì)胞因子受體蛋白的上清液，通過用50mM Tris-堿pH8.0平衡的谷胱甘肽-SEPHAROSE柱。合并含DCRS5-GST融合蛋白的流分，例如用凝血酶(Enzyme Research Laboratories，Inc.，SouthBend，IN)切割。切割的合并物然后通過用50mM Tris-堿平衡的Q-SEPHAROSE柱。合并含DCRS5的流分，用冷的蒸餾水稀釋，以降低導(dǎo)電性，再次通過新的Q-Sepharose柱，或者接著再通過免疫親和抗體柱。合并含DCRS5蛋白的流分，等分，貯藏于-70℃冷藏機(jī)。
比較細(xì)胞因子受體蛋白的CD譜提示，所述蛋白正確折疊。參見Hazuda等(1969)J.Biol.Chem.2641689-1693。
VII.制備DCRS5特異性抗體用重組型所述蛋白，例如純化DCRS5或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細(xì)胞，腹膜內(nèi)免疫近交Balb/c小鼠。用蛋白在合適時(shí)間點(diǎn)加強(qiáng)免疫小鼠，用額外的佐劑或不用額外的佐劑，以便進(jìn)一步刺激產(chǎn)生抗體。收集血清，或者用收獲的脾細(xì)胞制備雜交瘤。
或者，用所述基因或其片段轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(內(nèi)源或外源細(xì)胞)免疫Balb/c小鼠，或者用富集表達(dá)所述抗原的分離膜免疫小鼠。適當(dāng)時(shí)，通常在進(jìn)一步給予數(shù)次后，收集血清。各種基因治療技術(shù)可用于例如原位產(chǎn)生蛋白，以便產(chǎn)生免疫反應(yīng)?？山徊嫖栈蛎庖哌x擇血清或抗體制品，從而制備特定特異性和高度親和性的大致純抗體。
可制備單克隆抗體。例如使脾細(xì)胞與合適融合伴侶融合，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中通過標(biāo)準(zhǔn)方法選擇雜交瘤。通過ELISA或其它測(cè)定篩選雜交瘤上清液中的結(jié)合DCRS5的抗體的存在。還選擇或制備特異性識(shí)別具體DCRS5的抗體。
另一種方法中，將合成肽或純化蛋白提呈給免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆抗體或多克隆抗體。參見例如Coligan(主編，1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene；Harlow和Lane(1989)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press。適當(dāng)?shù)那闆r下，結(jié)合試劑或者如上所述用例如熒光或其它方法標(biāo)記，或者固定在用于淘選方法的支持物上。核酸也可導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生抗原，抗原再刺激免疫反應(yīng)。參見例如Wang等(1993)Poc.Nat’1.Acad.Sci.904156-4160；Barry等(1994)BioTechniques 16616-619；Xiang等(1995)Immunity 2129-135。
VIII.產(chǎn)生DCRS5的融合蛋白用DCRS5制備各種融合構(gòu)建物，包括組合它與IL-12Rβ1序列的實(shí)施方案。將合適基因的一部分與表位標(biāo)記融合，例如FLAG標(biāo)記，或者構(gòu)建雙雜交系統(tǒng)。參見例如Fields和Song(1989)Nature340245-246。
表位標(biāo)記可用于用抗FLAG抗體檢測(cè)的表達(dá)克隆方法，以檢測(cè)結(jié)合配偶體，例如相應(yīng)細(xì)胞因子受體的配體。雙雜交系統(tǒng)也可用來分離特異性結(jié)合DCRS5的蛋白。
IX.結(jié)構(gòu)活性關(guān)系采用標(biāo)準(zhǔn)方法和分析確定特定殘基的重要信息。例如通過在確定位點(diǎn)(例如在以上鑒定的位點(diǎn))產(chǎn)生許多不同變異，評(píng)價(jià)所述變異體的生物活性，從而進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)突變分析?？蛇M(jìn)行到確定改進(jìn)活性的位點(diǎn)的程度，或者集中在特定位點(diǎn)以確定保留、阻斷或改進(jìn)生物活性的可取代殘基。
或者，天然變異體分析可揭示什么位點(diǎn)耐受天然突變。這種結(jié)果得自個(gè)體變異的群體分析或跨品系或物種的變異群體分析。分析選定個(gè)體的樣品，例如應(yīng)用PCR分析和測(cè)序。這可評(píng)價(jià)群體多態(tài)性。
X.DCRS5和IL-12Rβ1的共表達(dá)編碼相應(yīng)基因的載體可轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。優(yōu)選所述載體含有選擇標(biāo)記，以鑒定哪些細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化。兩種基因的共表達(dá)使兩種基因產(chǎn)物正確締合形成活性受體復(fù)合物。
或者，可用使功能二聚體締合的方法。參見例如O’Shea等(1989)Science 245646-648；Kostelny等(1992)J.Immunol.1481547-1553；Patel等(1996)J.Biol.Chem.27130386-30391。胞外結(jié)構(gòu)域表達(dá)和物理締合，例如Fos/Jun亮氨酸拉鏈?zhǔn)接H和力驅(qū)動(dòng)的物理締合，產(chǎn)生配體結(jié)合結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)用作診斷作用或治療作用的結(jié)合化合物。
本文中引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中，其引用程度如同各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e具體指出的引用結(jié)合。
可在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多改進(jìn)和改變，這對(duì)本發(fā)明技術(shù)人員而言是顯而易見的。本文所述具體實(shí)施方案僅僅是舉例性提供，本發(fā)明由所附權(quán)利要求書和所述權(quán)利要求主題的完全等同范圍限定；而本發(fā)明不受本文舉例性提供的具體序列表<110>Schering Corporation<120>哺乳動(dòng)物受體蛋白、相關(guān)試劑及方法<130>DX01074<140>PCT/US01/15057<150>US 60/203,426<151>2000-05-10<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2859<212>DNA<213>未知<220>
<223>未知生物描述靈長(zhǎng)類；推測(cè)為人類<220>
<221>CDS<222>(119)..(2005)<220>
<221>成熟肽<222>(188)..(2005)<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2859)<223>Xaa根據(jù)遺傳密碼翻譯<400>1gtggtacggg aattccattg tgttgggcag ccaacaaggg tggcagcctg gctctgaagt 60ggaattatgt gcttcaaaca ggttgaaaga gggaaacagt cttttcctgc ttccagac 118atg aat cak gtc act att caa tgg gat gca gta ata gcc ctt tac ata 166Met Asn Xaa Val Thr Ile Gln Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile-20 -15 -10
ctc ttc agc tgg tgt cat gga gga att aca aat ata aac tgc tct ggc 214Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly-5 -1 1 5cac atc tgg gta gaa cca gcc aca att ttt aag atg ggt atg aat atc 262His Ile Trp Val Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile10 15 20 25tct ata tat tgc caa gca gca att aag aac tgc caa cca agg aaa ctt 310Ser Ile Tyr Cys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu30 35 40cat ttt tat aaa aat ggc atc aaa gaa aga ttt caa atc aca agg att 358His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile45 50 55aat aaa aca aca gct cgg ctt tgg tat aaa aac ttt ctg gaa cca cat 406Asn Lys Thr Thr Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His60 65 70gct tct atg tac tgc act gct gaa tgt ccc aaa cat ttt caa gag aca 454Ala Ser Met Tyr Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr75 80 85ctg ata tgt gga aaa gac att tct tct gga tat ccg cca gat att cct 502Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro90 95 100 105gat gaa gta acc tgt gtc att tat gaa tat tca ggc aac atg act tgc 550Asp Glu Val Thr Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys110 115 120acc tgg aat gct rgg aag ctc acc tac ata gac aca aaa tac gtg gta 598Thr Trp Asn Ala Xaa Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val125 130 135cat gtg aag agt tta gag aca gaa gaa gag caa cag tat ctc acc tca 646His Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser140 145 150agc tat att aac atc tcc act gat tca tta caa ggt ggc aag aag tac 694Ser Tyr Ile Asn Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr155 160165ttg gtt tgg gtc caa gca gca aac gca cta ggc atg gaa gag tca aaa 742Leu Val Trp Val Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys170 175 180 185
caa ctg caa att cac ctg gat gat ata gtg ata cct tct gca gcc gtc 790Gln Leu Gln Ile His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val190 195 200att tcc agg gct gag act ata aat gct aca gtg ccc aag acc ata att 838Ile Ser Arg Ala Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile205 210 215tat tgg gat agt caa aca aca att gaa aag gtt tcc tgt gaa atg aga 886Tyr Trp Asp Ser Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg220 225 230tac aag gct aca aca aac caa act tgg aat gtt aaa gaa ttt gac acc 934Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr235 240 245aat ttt aca tat gtg caa cag tca gaa ttc tac ttg gag cca aac att 982Asn Phe Thr Tyr Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile250 255 260 265aag tac gta ttt caa gtg aga tgt caa gaa aca ggc aaa agg tac tgg 1030Lys Tyr Val Phe Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp270 275 280cag cct tgg agt tca ccg ttt ttt cat aaa aca cct gaa aca gtt ccc 1078Gln Pro Trp Ser Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro285 290 295cag gtc aca tca aaa gca ttc caa cat gac aca tgg aat tct ggg cta 1126Gln Val Thr Ser Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu300 305 310aca gtt gct tcc atc tct aca ggg cac ctt act tct gac aac aga gga 1174Thr Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn Arg Gly315 320 325gac att gga ctt tta ttg gga atg atc gtc ttt gct gtt atg ttg tca 1222Asp Ile Gly Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser330 335 340 345att ctt tct ttg att ggg ata ttt aac aga tca ttc cga act ggg att 1270Ile Leu Ser Leu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly Ile350 355 360aaa aga agg atc tta ttg tta ata cca aag tgg ctt tat gaa gat att 1318Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile365 370 375cct aat atg aaa aac agc aat gtt gtg aaa atg cta cag gaa aat agt 1366
Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln Glu Asn Ser380 385 390gaa ctt atg aat aat aat tcc agt gag cag gtc cta tat gtt gat ccc 1414Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr Val Asp Pro395 400 405atg att aca gag ata aaa gaa atc ttc atc cca gaa cac aag cct aca 1462Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr410 415 420 425gac tac aag aag gag aat aca gga ccc ctg gag aca aga gac tac ccg 1510Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro430 435 440caa aac tcg cta ttc gac aat act aca gtt gta tat att cct gat ctc 1558Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu445 450 455aac act gga tat aaa ccc caa att tca aat ttt ctg cct gag gga agc 1606Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser460 465 470cat ctc agc aat aat aat gaa att act tcc tta aca ctt aaa cca cca 1654His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro475 480 485gtt gat tcc tta gac rca gga aat aat ccc agg tta caa aag cat cct 1702Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro490 495 500 505aat ttt gct ttt tct gtt tca agt gtg aat tca cta agc aac aca ata 1750Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile510 515 520ttt ctt gga gaa tta agc ctc ata tta aat caa gga gaa tgc agt tct 1798Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu Cys Ser Ser525 530 535cct gac ata caa aac tca gta gag gag gaa acc acc atg ctt ttg gaa 1846Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu540 545 550aat gat tca ccc agt gaa act att cca gaa cag acc ctg ctt cct gat 1894Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu Leu Pro Asp555 560 565gaa ttt gtc tcc tgt ttg ggg atc gtg aat gag gag ttg cca tct att 1942
Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile570 575 580 585aat act tat ttt cca caa aat att ttg gaa agc cac ttc aat agg att 1990Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile Leu Glu Ser His Phe Asn Arg Ile590 595 600tca ctc ttg gaa aag tagagctgtg tggtcaaaat caatatgaga aagctgcctt 2045Ser Leu Leu Glu Lys605gcaatctgaa cttgggtttt ccctgcaata gaaattgaat tctgcctctt tttgaaaaaa 2105atgtattcac atacaaatct tcacatggac acatgttttc atttcccttg gataaatacc 2165taggtagggg attgctgggc catatgataa gcatatgttt cagttctacc aatcttgttt 2225ccagagtagt gacatttctg tgctcctacc atcaccatgt aagaattccc gggagctcca 2285tgccttttta attttagcca ttcttctgcc tmatttctta aaattagaga attaaggtcc 2345cgaaggtgga acatgcttca tggtcacaca tacaggcaca aaaacagcat tatgtggacg 2405cctcatgtat tttttataga gtcaactatt tcctctttat tttccctcat tgaaagatgc 2465aaaacagctc tctattgtgt acagaaaggg taaataatgc aaaatacctg gtagtaaaat 2525aaatgctgaa aattttcctt taaaatagaa tcattaggcc aggcgtggtg gctcatgctt 2585gtaatcccag cactttggta ggctgaggtr ggtggatcac ctgaggtcag gagttcgagt 2645ccagcctggc caatatgctg aaaccctgtc tctactaaaa ttacaaaaat tagccggcca 2705tggtggcagg tgcttgtaat cccagctact tgggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 2765ccaggaaggc agaggttgca ctgagctgag attgtgccac tgcactccag cctgggcaac 2825aagagcaaaa ctctgtctgg aaaaaaaaaa aaaa 2859<210>2<211>629<212>PRT<213>未知<400>2Met Asn Xaa Val Thr Ile Gln Trp Asp Ala Val Ile Ala Leu Tyr Ile-20 -15 -10
Leu Phe Ser Trp Cys His Gly Gly Ile Thr Asn Ile Asn Cys Ser Gly-5 -1 1 5His Ile Trp Val Glu Pro Ala Thr Ile Phe Lys Met Gly Met Asn Ile10 15 20 25Ser Ile Tyr Cys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Cys Gln Pro Arg Lys Leu30 35 40His Phe Tyr Lys Asn Gly Ile Lys Glu Arg Phe Gln Ile Thr Arg Ile45 50 55Asn Lys Thr Thr Ala Arg Leu Trp Tyr Lys Asn Phe Leu Glu Pro His60 65 70Ala Ser Met Tyr Cys Thr Ala Glu Cys Pro Lys His Phe Gln Glu Thr75 80 85Leu Ile Cys Gly Lys Asp Ile Ser Ser Gly Tyr Pro Pro Asp Ile Pro90 95 100 105Asp Glu Val Thr Cys Val Ile Tyr Glu Tyr Ser Gly Asn Met Thr Cys110 115 120Thr Trp Asn Ala Xaa Lys Leu Thr Tyr Ile Asp Thr Lys Tyr Val Val125 130 135His Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Glu Glu Gln Gln Tyr Leu Thr Ser140 145 150Ser Tyr Ile Asn Ile Ser Thr Asp Ser Leu Gln Gly Gly Lys Lys Tyr155 160 165Leu Val Trp Val Gln Ala Ala Asn Ala Leu Gly Met Glu Glu Ser Lys170 175 180 185Gln Leu Gln Ile His Leu Asp Asp Ile Val Ile Pro Ser Ala Ala Val190 195 200Ile Ser Arg Ala Glu Thr Ile Asn Ala Thr Val Pro Lys Thr Ile Ile205 210 215Tyr Trp Asp Ser Gln Thr Thr Ile Glu Lys Val Ser Cys Glu Met Arg220 225 230Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gln Thr Trp Asn Val Lys Glu Phe Asp Thr235 240 245Asn Phe Thr Tyr Val Gln Gln Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn Ile
250 255 260 265Lys Tyr Val Phe Gln Val Arg Cys Gln Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp270 275 280Gln Pro Trp Ser Ser Pro Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro285 290 295Gln Val Thr Ser Lys Ala Phe Gln His Asp Thr Trp Asn Ser Gly Leu300 305 310Thr Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly His Leu Thr Ser Asp Asn Arg Gly315 320 325Asp Ile Gly Leu Leu Leu Gly Met Ile Val Phe Ala Val Met Leu Ser330 335 340 345Ile Leu Ser Leu Ile Gly Ile Phe Asn Arg Ser Phe Arg Thr Gly Ile350 355 360Lys Arg Arg Ile Leu Leu Leu Ile Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp Ile365 370 375Pro Asn Met Lys Asn Ser Asn Val Val Lys Met Leu Gln Glu Asn Ser380 385 390Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gln Val Leu Tyr Val Asp Pro395 400 405Met Ile Thr Glu Ile Lys Glu Ile Phe Ile Pro Glu His Lys Pro Thr410 415 420 425Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr Pro430 435 440Gln Asn Ser Leu Phe Asp Asn Thr Thr Val Val Tyr Ile Pro Asp Leu445 450 455Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gln Ile Ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser460 465 470His Leu Ser Asn Asn Asn Glu Ile Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro475 480 485Val Asp Ser Leu Asp Ser Gly Asn Asn Pro Arg Leu Gln Lys His Pro490 495 500 505Asn Phe Ala Phe Ser Val Ser Ser Val Asn Ser Leu Ser Asn Thr Ile510 515 520
Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gln Gly Glu Cys Ser Ser525 530 535Pro Asp Ile Gln Asn Ser Val Glu Glu Glu Thr Thr Met Leu Leu Glu540 545 550Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr Ile Pro Glu Gln Thr Leu Leu Pro Asp555 560 565Glu Phe Val Ser Cys Leu Gly Ile Val Asn Glu Glu Leu Pro Ser Ile570 575 580 585Asn Thr Tyr Phe Pro Gln Asn Ile Leu Glu Ser His Phe Asn Arg Ile590 595 600Ser Leu Leu Glu Lys605<210>3<211>1887<212>DNA<213>反向翻譯<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1887)<223>n可為a，c，g或t<400>3atgaaycayg tnacnathca rtgggaygcn gtnathgcny tntayathyt nttywsntgg 60tgycayggng gnathacnaa yathaaytgy wsnggncaya thtgggtnga rccngcnacn 120athttyaara tgggnatgaa yathwsnath taytgycarg cngcnathaa raaytgycar 180ccnmgnaary tncayttyta yaaraayggn athaargarm gnttycarat hacnmgnath 240aayaaracna cngcnmgnyt ntggtayaar aayttyytng arccncaygc nwsnatgtay 300tgyacngcng artgyccnaa rcayttycar garacnytna thtgyggnaa rgayathwsn 360wsnggntayc cnccngayat hccngaygar gtnacntgyg tnathtayga rtaywsnggn 420aayatgacnt gyacntggaa ygcnmgnaar ytnacntaya thgayacnaa rtaygtngtn 480caygtnaarw snytngarac ngargargar carcartayy tnacnwsnws ntayathaay 540
athwsnacng aywsnytnca rggnggnaar aartayytng tntgggtnca rgcngcnaay 600gcnytnggna tggargarws naarcarytn carathcayy tngaygayat hgtnathccn 660wsngcngcng tnathwsnmg ngcngaracn athaaygcna cngtnccnaa racnathath 720taytgggayw sncaracnac nathgaraar gtnwsntgyg aratgmgnta yaargcnacn 780acnaaycara cntggaaygt naargartty gayacnaayt tyacntaygt ncarcarwsn 840garttytayy tngarccnaa yathaartay gtnttycarg tnmgntgyca rgaracnggn 900aarmgntayt ggcarccntg gwsnwsnccn ttyttycaya aracnccnga racngtnccn 960cargtnacnw snaargcntt ycarcaygay acntggaayw snggnytnac ngtngcnwsn 1020athwsnacng gncayytnac nwsngayaay mgnggngaya thggnytnyt nytnggnatg 1080athgtnttyg cngtnatgyt nwsnathytn wsnytnathg gnathttyaa ymgnwsntty 1140mgnacnggna thaarmgnmg nathytnytn ytnathccna artggytnta ygargayath 1200ccnaayatga araaywsnaa ygtngtnaar atgytncarg araaywsnga rytnatgaay 1260aayaaywsnw sngarcargt nytntaygtn gayccnatga thacngarat haargarath 1320ttyathccng arcayaarcc nacngaytay aaraargara ayacnggncc nytngaracn 1380mgngaytayc cncaraayws nytnttygay aayacnacng tngtntayat hccngayytn 1440aayacnggnt ayaarccnca rathwsnaay ttyytnccng arggnwsnca yytnwsnaay 1500aayaaygara thacnwsnyt nacnytnaar ccnccngtng aywsnytnga ywsnggnaay 1560aayccnmgny tncaraarca yccnaaytty gcnttywsng tnwsnwsngt naaywsnytn 1620wsnaayacna thttyytngg ngarytnwsn ytnathytna aycarggnga rtgywsnwsn 1680ccngayathc araaywsngt ngargargar acnacnatgy tnytngaraa ygaywsnccn 1740wsngaracna thccngarca racnytnytn ccngaygart tygtnwsntg yytnggnath 1800gtnaaygarg arytnccnws nathaayacn tayttyccnc araayathyt ngarwsncay 1860ttyaaymgna thwsnytnyt ngaraar 1887<210>4<211>918
<212>PRT<213>未知<220>
<223>未知生物描述靈長(zhǎng)類；推測(cè)為人類<400>4Met Leu Thr Leu Gln Thr Trp Val Val Gln Ala Leu Phe Ile Phe Leu1 5 10 15Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser20 25 30Pro Glu Ser Pro Val Val Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys35 40 45Val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr50 55 60Ile Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr65 70 75 80Ile Ile Asn Arg Thr Ala Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser85 90 95Leu Asn Ile Gln Leu Thr Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu100 105 110Gln Asn Val Tyr Gly Ile Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys115 120 125Pro Lys Asn Leu Ser Cys Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys130 135 140Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu145 150 155 160Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg165 170 175Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val180 185 190Asn Ile Glu Val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr195 200 205Ser Asp His Ile Asn Phe Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro210 215 220
Pro His Asn Leu Ser Val Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu225 230 235 240Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys245 250 255Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile260 265 270Pro Pro Glu Asp Thr Ala Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp275 280 285Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu290 295 300Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile305 310 315 320Thr Tyr Glu Asp Arg Pro Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile325 330 335Asp Pro Ser His Thr Gln Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys340 345 350Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val355 360 365Thr Leu Thr Arg Trp Lys Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala370 375 380Thr Lys Leu Thr Val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu385 390 395 400Thr Val Arg Asn Leu Val Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile405 410 415Pro Ala Cys Asp Phe Gln Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala420 425 430Phe Pro Lys Asp Asn Met Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu435 440 445Ser Val Lys Lys Tyr Ile Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala450 455 460Pro Cys Ile Thr Asp Trp Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr465 470 475 480Tyr Leu Arg Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val
485 490 495Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala500 505 510Tyr Leu Lys Gln Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys515 520 525Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val530 535 540Asp Val Gln Asn Gly Phe Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr545 550 555 560Ile Ile Gly Asn Glu Thr AlaVal Ash Val Asp Ser Ser His Thr Glu565570 575Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met580 585 590Ala Ala Tyr Thr Asp Glu Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe595 600 605Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val Val Pro610 615 620Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu Phe Cys625 630 635 640Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn Val Pro645 650 655Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr Pro Pro660 665 670Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly Asn Phe675 680 685Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys Pro Phe690 695 700Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys Ile Asn705 710 715 720Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met Ser Ser725 730 735Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser Gln Asn
740 745 750Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly Tyr Arg755 760 765His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser Thr Gln770 775 780Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu Val Asp785 790 795 800His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr Phe Lys805 810 815Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His Phe Glu820 825 830Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val Arg Leu835 840 845Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser Gly Gln850 855 860Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly Pro Gly865 870 875 880Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu Ala Ala885 890 895Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val Arg Gln900 905 910Gly Gly Tyr Met Pro Gln915<210>5<211>862<212>PRT<213>未知<220>
<223>未知生物描述靈長(zhǎng)類；推測(cè)為人類<400>5Met Ala His Thr Phe Arg Gly Cys Ser Leu Ala Phe Met Phe Ile Ilel 5 10 15
Thr Trp Leu Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asp Ala Cys Lys Arg Gly Asp20 25 30Val Thr Val Lys Pro Ser His Val Ile Leu Leu Gly Ser Thr Val Asn35 40 45Ile Thr Cys Ser Leu Lys Pro Arg Gln Gly Cys Phe His Tyr Ser Arg50 55 60Arg Asn Lys Leu Ile Leu Tyr Lys Phe Asp Arg Arg Ile Asn Phe His65 70 75 80His Gly His Ser Leu Asn Ser Gln Val Thr Gly Leu Pro Leu Gly Thr85 90 95Thr Leu Phe Val Cys Lys Leu Ala Cys Ile Asn Ser Asp Glu Ile Gln100 105 110Ile Cys Gly Ala Glu Ile Phe Val Gly Val Ala Pro Glu Gln Pro Gln115 120 125Asn Leu Ser Cys Ile Gln Lys Gly Glu Gln Gly Thr Val Ala Cys Thr130 135 140Trp Glu Arg Gly Arg Asp Thr His Leu Tyr Thr Glu Tyr Thr Leu Gln145 150 155 160Leu Ser Gly Pro Lys Asn Leu Thr Trp Gln Lys Gln Cys Lys Asp Ile165 170 175Tyr Cys Asp Tyr Leu Asp Phe Gly Ile Asn Leu Thr Pro Glu Ser Pro180185 190Glu Ser Asn Phe Thr Ala Lys Val Thr Ala Val Asn Ser Leu Gly Ser195 200 205Ser Ser Ser Leu Pro Ser Thr Phe Thr Phe Leu Asp Ile Val Arg Pro210 215 220Leu Pro Pro Trp Asp Ile Arg Ile Lys Phe Gln Lys Ala Ser Val Ser225 230 235 240Arg Cys Thr Leu Tyr Trp Arg Asp Glu Gly Leu Val Leu Leu Asn Arg245 250 255Leu Arg Tyr Arg Pro Ser Asn Ser Arg Leu Trp Asn Met Val Asn Val260 265 270Thr Lys Ala Lys Gly Arg His Asp Leu Leu Asp Leu Lys Pro Phe Thr
275 280 285Glu Tyr Glu Phe Gln Ile Ser Ser Lys Leu His Leu Tyr Lys Gly Ser290 295 300Trp Ser Asp Trp Ser Glu Ser Leu Arg Ala Gln Thr Pro Glu Glu Glu305 310 315 320Pro Thr Gly Met Leu Asp Val Trp Tyr Met Lys Arg His Ile Asp Tyr325 330 335Ser Arg Gln Gln Ile Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ser Val Ser Glu340 345 350Ala Arg Gly Lys Ile Leu His Tyr Gln Val Thr Leu Gln Glu Leu Thr355 360 365Gly Gly Lys Ala Met Thr Gln Asn Ile Thr Gly His Thr Ser Trp Thr370 375 380Thr Val Ile Pro Arg Thr Gly Asn Trp Ala Val Ala Val Ser Ala Ala385 390 395 400Asn Ser Lys Gly Ser Ser Leu Pro Thr Arg Ile Asn Ile Met Asn Leu405 410 415Cys Glu Ala Gly Leu Leu Ala Pro Arg Gln Val Ser Ala Asn Ser Glu420 425 430Gly Met Asp Asn Ile Leu Val Thr Trp Gln Pro Pro Arg Lys Asp Pro435 440 445Ser Ala Val Gln Glu Tyr Val Val Glu Trp Arg Glu Leu His Pro Gly450 455 460Gly Asp Thr Gln Val Pro Leu Asn Trp Leu Arg Ser Arg Pro Tyr Asn465 470 475 480Val Ser Ala Leu Ile Ser Glu Asn Ile Lys Ser Tyr Ile Cys Tyr Glu485 490 495Ile Arg Val Tyr Ala Leu Ser Gly Asp Gln Gly Gly Cys Ser Ser Ile500 505 510Leu Gly Asn Ser Lys His Lys Ala Pro Leu Ser Gly Pro His Ile Asn515 520 525Ala Ile Thr Glu Glu Lys Gly Ser Ile Leu Ile Ser Trp Asn Ser Ile530 535 540
Pro Val Gln Glu Gln Met Gly Cys Leu Leu His Tyr Arg Ile Tyr Trp545 550 555 560Lys Glu Arg Asp Ser Asn Ser Gln Pro Gln Leu Cys Glu Ile Pro Tyr565 570 575Arg Val Ser Gln Asn Ser His Pro Ile Asn Ser Leu Gln Pro Arg Val580 585 590Thr Tyr Val Leu Trp Met Thr Ala Leu Thr Ala Ala Gly Glu Ser Ser595 600 605His Gly Asn Glu Arg Glu Phe Cys Leu Gln Gly Lys Ala Asn Trp Met610 615 620Ala Phe Val Ala Pro Ser Ile Cys Ile Ala Ile Ile Met Val Gly Ile625 630 635 640Phe Ser Thr His Tyr Phe Gln Gln Lys Val Phe Val Leu Leu Ala Ala645 650 655Leu Arg Pro Gln Trp Cys Ser Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Asn Ser660 665 670Thr Cys Ala Lys Lys Tyr Pro Ile Ala Glu Glu Lys Thr Gln Leu Pro675 680 685Leu Asp Arg Leu Leu Ile Asp Trp Pro Thr Pro Glu Asp Pro Glu Pro690 695 700Leu Val Ile Ser Glu Val Leu His Gln Val Thr Pro Val Phe Arg His705 710 715 720Pro Pro Cys Ser Asn Trp Pro Gln Arg Glu Lys Gly Ile Gln Gly His725 730 735Gln Ala Ser Glu Lys Asp Met Met His Ser Ala Ser Ser Pro Pro Pro740 745 750Pro Arg Ala Leu Gln Ala Glu Ser Arg Gln Leu Val Asp Leu Tyr Lys755 760 765Val Leu Glu Ser Arg Gly Ser Asp Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys770 775 780Pro Trp Thr Val Leu Pro Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr785 790 795 800
Leu Pro Ser Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala805 810 815Asp Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Gln His Ile Ser Leu Ser Val Phe820 825 830Pro Ser Ser Ser Leu His Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu835 840 845Thr Leu Asp Gln Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu850 855 860
權(quán)利要求
1.一種大致純或重組多肽，它包含SEQ ID NO2胞內(nèi)部分的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中a)所述多肽包含SEQ ID NO2胞內(nèi)部分的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸；b)所述多肽為重組多肽，它包含SEQ ID NO2的胞內(nèi)部分；c)所述多肽還包含SEQ ID NO2非胞內(nèi)部分的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸；d)所述多肽包含SEQ ID NO2胞外部分的至少25個(gè)氨基酸；e)所述多肽包含成熟SEQ ID NO2，或者f)所述多肽為大致純天然多肽。
3.權(quán)利要求1的重組多肽，它a)由表1的成熟序列組成；b)為非糖基化多肽；c)來自人類；d)包含SEQ ID NO2的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸；e)具有SEQ ID NO2的至少3個(gè)非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少15個(gè)連續(xù)氨基酸；f)為SEQ ID NO2的天然多態(tài)性變異體；g)具有至少約30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；h)具有至少2個(gè)靈長(zhǎng)類DCRS5特異性非重疊表位；i)其分子量至少30kD的天然糖基化多肽；j)為合成多肽；k)為無菌形式；l)為水性溶液或緩沖溶液；m)與固體支持物結(jié)合；n)與另一種化學(xué)部分綴合；或者o)與IL-12Rβ1多肽物理締合。
4.一種組合物，它包含的物質(zhì)選自a)包含SEQ ID NO2胞內(nèi)部分的至少2個(gè)不同的非重疊區(qū)段、每個(gè)區(qū)段至少6個(gè)連續(xù)氨基酸的大致純或重組多肽；b)包含SEQ ID NO2胞內(nèi)部分的至少12個(gè)連續(xù)氨基酸的大致純或重組多肽；或者c)包含成熟SEQ ID NO2的大致純天然序列多肽。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中1)權(quán)利要求4a多肽，其中a)所述不同的非重疊區(qū)段i)包括至少12個(gè)氨基酸的一種區(qū)段；ii)包括至少7個(gè)氨基酸的一種區(qū)段和至少9個(gè)氨基酸的第二種區(qū)段；iii)包括至少6個(gè)氨基酸的第三種不同區(qū)段；iv)包含以下之一R355-L373、P378-L405、V407-D426、K428-D439、P441-V452、I454-G460、I465-T587或N592-606；或b)所述多肽還包含SEQ ID NO2胞外部分的至少2個(gè)不同的非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少6個(gè)連續(xù)氨基酸；2)權(quán)利要求4b的多肽，其中a)所述至少12個(gè)連續(xù)氨基酸區(qū)段包含以下之一R355-L373、P378-L405、V407-D426、K428-D439、P441-V452、I454-G460、I465-T587或N592-606；或b)所述多肽還包含SEQ ID NO2胞外部分的至少2個(gè)不同的非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少6個(gè)連續(xù)氨基酸；或3)權(quán)利要求4c的多肽，它還包含純化或檢測(cè)表位。
6.權(quán)利要求4的多肽，它a)由表1的成熟序列組成；b)為非糖基化多肽；c)來自人類；d)包含SEQ ID NO2的至少40個(gè)連續(xù)氨基酸；e)具有SEQ ID NO2的至少3個(gè)非重疊區(qū)段，每個(gè)區(qū)段至少15個(gè)連續(xù)氨基酸；f)為SEQ ID NO2的天然多態(tài)性變異體；g)具有至少約30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度；h)具有至少2個(gè)靈長(zhǎng)類DCRS5特異性非重疊表位；i)其分子量至少30kD的天然糖基化多肽；j)為合成多肽；k)為無菌形式；l)為水性溶液或緩沖溶液；m)與固體支持物結(jié)合；n)與另一種化學(xué)部分綴合；或者o)與IL-12Rβ1多肽物理締合。
7.一種組合物，它包含a)與IL-12Rβ1蛋白組合的大致純的權(quán)利要求4多肽；或b)權(quán)利要求4的所述多肽和載體，其中所述載體為i)水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或ii)配制用于口服、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
8.一種試劑盒，它包含權(quán)利要求4的多肽和a)包含所述多肽的區(qū)室；b)包含IL-12Rβ1多肽的區(qū)室；c)包含p40、IL-B30或p40/IL-B30多肽的區(qū)室；或者d)所述試劑盒試劑的使用或處理說明書。
9.一種包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合化合物，它特異性結(jié)合權(quán)利要求1所述多肽的所述胞內(nèi)部分，其中a)所述結(jié)合化合物裝在一個(gè)容器中；b)所述多肽來自人類；c)所述結(jié)合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；d)所述結(jié)合化合物與另一種化學(xué)部分綴合；或者e)所述抗體i)是針對(duì)表1成熟多肽的肽序列產(chǎn)生的抗體；ii)是針對(duì)成熟DCRS5產(chǎn)生的抗體；iii)是針對(duì)純化的人DCRS5產(chǎn)生的抗體；iv)為免疫選擇性抗體；v)為多克隆抗體；熒光標(biāo)記；vi)結(jié)合變性DCRS5；vii)對(duì)抗原的Kd至少30μM；viii)與固體支持物結(jié)合，包括珠子或塑料膜；ix)為無菌組合物；或者x)為檢測(cè)性標(biāo)記的抗體，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。
10.一種試劑盒，它包含權(quán)利要求9所述結(jié)合化合物和a)包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；b)包含以下組分的區(qū)室i)p40多肽ii)IL-B30多肽；iii)DCRS5多肽；和/或iv)IL-12Rβ1多肽；c)包含選擇性結(jié)合以下組分的抗體的區(qū)室i)p40多肽ii)IL-B30多肽；iii)DCRS5多肽；和/或iv)IL-12Rβ1多肽；或者d)所述試劑盒試劑使用或處理的說明書。
11.一種生產(chǎn)抗原抗體復(fù)合物的方法，該方法包括在合適條件下使靈長(zhǎng)類DCRS5多肽與權(quán)利要求9的抗體接觸，由此形成所述復(fù)合物。
12.權(quán)利要求11的方法，其中a)所述復(fù)合物純化自其它細(xì)胞因子受體；b)所述復(fù)合物純化自其它抗體；c)所述接觸是與包含干擾素的樣品接觸；d)所述接觸使得可定量檢測(cè)所述抗原；e)所述接觸是與包含所述抗體的樣品接觸；或者f)所述接觸使得可定量檢測(cè)所述抗體。
13.一種組合物，它包含a)權(quán)利要求9的無菌結(jié)合化合物，或b)權(quán)利要求9的所述結(jié)合化合物和載體，其中所述載體為i)水性化合物，包括水、鹽水和或緩沖液；和/或ii)配制用于口服、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
14.一種編碼權(quán)利要求1的所述DCRS5多肽的分離或重組核酸，其中所述a)DCRS5來自人類；或者b)所述核酸i)編碼表1的抗原性肽序列；ii)編碼表1的多個(gè)抗原性肽序列；iii)在至少13個(gè)核苷酸上與編碼所述區(qū)段的天然cDNA相同；iv)為表達(dá)載體；v)還包含復(fù)制起點(diǎn)；vi)來自天然來源；vii)包含可檢測(cè)標(biāo)記；viii)包含合成核苷酸序列；ix)小于6kb，優(yōu)選小于3kb；x)來自靈長(zhǎng)類；xi)包含天然全長(zhǎng)編碼序列；xii)為編碼所述DCRS5的基因的雜交探針；或者xiii)為PCR引物、PCR產(chǎn)物或突變引物。
15.一種細(xì)胞或組織，它包含權(quán)利要求14的所述重組核酸。
16.權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是a)原核細(xì)胞；b)真核細(xì)胞；c)細(xì)菌細(xì)胞；d)酵母細(xì)胞；e)昆蟲細(xì)胞；f)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；g)小鼠細(xì)胞；h)靈長(zhǎng)類細(xì)胞；或者i)人類細(xì)胞。
17.一種試劑盒，它包含權(quán)利要求14的所述核酸和a)包含所述核酸的區(qū)室；b)包含編碼以下組分的核酸的區(qū)室i)p40多肽ii)IL-B30多肽；iii)DCRS5多肽；和/或iv)IL-12Rβ1多肽；c)包含以下組分的區(qū)室i)p40多肽ii)IL-B30多肽；iii)DCRS5多肽；和/或iv)IL-12Rβ1多肽；d)包含選擇性結(jié)合以下組分的抗體的區(qū)室i)p40多肽ii)IL-B30多肽；iii)DCRS5多肽；和/或iv)IL-12Rβ1多肽；或者f)所述試劑盒試劑使用或處理的說明書。
18.一種核酸，它a)在30分鐘、30℃和低于2M鹽的洗滌條件下與編碼細(xì)胞內(nèi)部分的SEQ ID NO1部分雜交；或者b)在至少約30個(gè)核苷酸的節(jié)段上與靈長(zhǎng)類DCRS5的細(xì)胞內(nèi)部分相同。
19.權(quán)利要求18的核酸，其中a)所述洗滌條件為45℃和/或500mM鹽；或者b)所述節(jié)段為至少55個(gè)核苷酸。
20.權(quán)利要求18的核酸，其中a)所述洗滌條件為55℃和/或150mM鹽；或者b)所述節(jié)段為至少75個(gè)核苷酸。
21.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生理或發(fā)育的方法，該方法包括所述細(xì)胞與以下組分接觸a)p40/IL-B30的拮抗劑，該拮抗劑為包含以下組分的復(fù)合物i)靈長(zhǎng)類DCRS5胞外部分；和/或ii)靈長(zhǎng)類IL-12Rβ1胞外部分；b)p40/IL-B30的拮抗劑，它為結(jié)合包含以下組分的復(fù)合物的抗體i)靈長(zhǎng)類DCRS5；和/或ii)靈長(zhǎng)類IL-12Rβ1；c)p40/IL-B30的拮抗劑，它為結(jié)合DCRS5的抗體；d)p40/IL-B30的拮抗劑，它為抗IL-12Rβ1的抗體；e)p40/IL-B30的拮抗劑，它為DCRS5或IL-12Rβ1的反義核酸；或者f)p40/IL-B30的激動(dòng)劑，它為結(jié)合包含以下組分的復(fù)合物的抗體i)靈長(zhǎng)類DCRS5；和/或ii)靈長(zhǎng)類IL-12Rβ1。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述接觸為與拮抗劑接觸，而且a)所述接觸與以下組分的拮抗劑混合i)IL-12；ii)IL-18；iii)TNF；或iv)IFNγ；或者b)所述細(xì)胞來自宿主，所述宿主i)表現(xiàn)出慢性Th1介導(dǎo)性疾病的體征或癥狀；ii)表現(xiàn)出多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、糖尿病、牛皮癬或膿毒病的癥狀或體征；或者iii)接受同種異體移植。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述接觸是與激動(dòng)劑接觸，而且a)所述接觸與以下組分混合i)IL-12；ii)IL-18；iii)TNF；或iv)IFNγ；或者b)所述細(xì)胞來自宿主，所述宿主i)表現(xiàn)出慢性TH2反應(yīng)的體征或癥狀；ii)罹患腫瘤或存在病毒或真菌生長(zhǎng)；iii)接受疫苗；或者iv)存在變態(tài)反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供編碼哺乳動(dòng)物(例如靈長(zhǎng)類)受體的核酸、純化受體蛋白及其片段。還提供多克隆抗體和單克隆抗體。描述了使用所述組合物進(jìn)行診斷及治療的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1575337SQ01812411
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2001年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月10日
發(fā)明者M·基里卡, R·A·卡斯特萊恩, K·W·穆爾, C·L·帕哈姆 申請(qǐng)人:先靈公司