專利名稱：具有神經(jīng)保護作用的7－β－羥基類固醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于保護神經(jīng)細(xì)胞免于死亡的一系列3-羥基-7β-羥基類固醇化合物及其一些酮衍生物的用途，它們因此可用于治療和預(yù)防如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、非癡呆性認(rèn)知損傷(Cognitive ImpairmentNo Dementia)(CIND)、中風(fēng)、腦外傷、脊髓損傷和周圍神經(jīng)損傷等疾病或其后遺癥；而且它們也可用于增強認(rèn)知功能。
由于在尿中鑒定了7α-羥基DHEA，自從1959年就已知在體內(nèi)可產(chǎn)生脫氫表雄酮(DHEA)的7α-羥基化代謝產(chǎn)物[J J Schneider，M L Lewbart，Recent Progr.Horm.Res.15(1959)201-230；L Starka等，Clin.Chim.Acta.7(1961)309-316]]。此后報道了來自人的許多器官，包括成人肝和胎肝、睪丸、附睪、皮膚、乳房組織、前列腺、脂肪基質(zhì)細(xì)胞和扁桃體的組織制品中3β-羥基類固醇底物(包括DHEA和表雄酮-EPIA)的廣泛7α-羥基化。在大鼠肝和大量的小鼠組織和器官中，DHEA在7位的羥基化也得到驗證。但是，對7β-等價物的關(guān)注較少或者沒有關(guān)注。所有這些研究中，7α-羥基-DHEA是迄今為止所產(chǎn)生的最主要的代謝物。事實上，Doostzadeh等[Steroids 63(1998)608-614]已報道由小鼠肝微粒體產(chǎn)生的7α-羥基-DHEA的生產(chǎn)率比7β-羥基-DHEA的生產(chǎn)率多15倍。
而且表明EPIA，DHEA和孕烯醇酮在大鼠腦中也可快速廣泛地轉(zhuǎn)化為它們相應(yīng)的7α-羥基代謝物[J M Guiraud等，Steroids 34(1979)241-248；M Warner等，Endocrinology 124(1989)2699-2706；Y Akwa等，Biochem.J.288(1992)959-964]]。
WO 97/37664公開了包括7α-羥基取代的類固醇的各種化合物在治療神經(jīng)精神病、免疫或內(nèi)分泌失調(diào)方面的用途。在WO 97/37664中建議可用這些化合物進行治療的疾病包括阿爾茨海默氏病。但由于該病的作用機制是假設(shè)腦中缺少7α-羥基取代的類固醇而引起的，因此WO 97/37664中所建議的治療通過服用7α-羥基取代的類固醇以替代缺少的化合物來調(diào)整這種缺乏。因此，WO 97/37664描述的程序是治療已有的疾病，而不是預(yù)防疾病或通過阻止神經(jīng)元的進一步損傷來防止疾病的惡化。所以WO 97/37664并沒有描述神經(jīng)保護作用。而且其還斷言活性劑是7α化合物，而7β化合物如果存在，是非活性的。
WO 94/20111還公開了一些DHEA衍生物用于預(yù)防或減少組織生存力的喪失，所述組織生存力的喪失是由嗜中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附引起的。但是，這不是引起本發(fā)明要治療的紊亂的機理。
雖然已知在WO 97/37664中公開的化合物的7β-羥基類似物可在體內(nèi)產(chǎn)生，但其產(chǎn)生的量低于5％，而7α-異構(gòu)體的產(chǎn)生量超過95％。而且，沒有表征負(fù)責(zé)將這些3-羥基類固醇轉(zhuǎn)化為它們相應(yīng)的7β-羥基衍生物的酶體系。由于這些理由并考慮到上面概述的研究，從文獻中可以清楚地看出，總的結(jié)論是7β-異構(gòu)體是非活性的。因此，如在上面概述的文獻中清楚看到的一樣，基本上不進行7β化合物的可能的生物活性的研究。
與此結(jié)論相反，我們很驚訝地發(fā)現(xiàn)7β-羥基取代的類固醇確實具有生物活性，并且該活性不是如WO 97/37664中對7α-羥基-取代的類固醇所描述的活性。更確切地說是神經(jīng)保護活性，如以前在WO 99/31049中所證實的，雖然是在不同類的化合物中。
對于長時間缺氧或缺血(ischaemia)，可能會或不會造成低血糖，但都會產(chǎn)生不同程度的神經(jīng)元損傷。
典型地，在心臟病發(fā)作時會發(fā)生缺血情況，但此時造成的損傷基本上局限在心臟組織，而且已經(jīng)研發(fā)了一些可靠的治療方法。對于本發(fā)明，我們考慮的是短時間或更長時間缺血對腦的影響，如在中風(fēng)病人中產(chǎn)生的缺血或由于頭損傷產(chǎn)生的缺血，以及在衰老過程中的更加緩慢發(fā)展的神經(jīng)變性疾病中的缺血，在衰老過程中，慢性閾下級缺血和/或調(diào)和的能量供給可能對觀察到的腦退化改變有貢獻。缺血的嚴(yán)重程度取決于中風(fēng)或損傷的性質(zhì)，但一致的是存在腦部損傷，這是本發(fā)明強調(diào)的情況。
本領(lǐng)域中已知的各種神經(jīng)保護制劑都嘗試用來減緩腦損傷問題，但就目前而言，所有已知的制劑都有不利的副作用。例如，MK801(dizocilpine maleate)是一種非常簡單的分子，可以對缺血病人提供一定程度的神經(jīng)保護作用。但MK801也具有一定的“神經(jīng)恐慌效應(yīng)”(Martindale)，以及不利的運動作用。神經(jīng)保護作用在Brain Research 755(1997)36-46(Pringle，A.K.，等)中有詳細(xì)介紹，其作為參考結(jié)合在此處。這些作者在早期文章中也介紹了芋螺毒素的神經(jīng)保護作用，但盡管該化合物具有神經(jīng)保護作用，在體內(nèi)卻觀察到其不利的副作用。
因此，本發(fā)明在于3-羥基-7β-羥基類固醇或3-氧代-7β-羥基類固醇及其藥用酯用于生產(chǎn)保護神經(jīng)元免受損傷的藥劑的應(yīng)用。
本發(fā)明尤其感興趣的一類具體的7β-羥基類固醇是3β，7β-二羥基類固醇及其藥用酯。
優(yōu)選的酯是羧酸酯。
可用于本發(fā)明的任選取代的3β，7β-二羥基類固醇及其藥用酯和它們的其它衍生物的實例是那些化學(xué)式(I)的化合物 其中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每個代表氫原子，含有1-6個碳原子的烷基，含有2-6個碳原子的烯基，含有2-6個碳原子的炔基，含有6-10個碳原子的芳基，甲酰基，含有2-7個碳原子的烷羰基，含有3-7個碳原子的烯羰基，含有3-7個碳原子的炔羰基，含有7-11個碳原子的芳羰基，含有8-15個碳原子的芳烷基羰基，含有9-15個碳原子的芳烯基羰基，或如下定義的雜環(huán)-羰基；Ra和Rb中的一個代表式-Rc的基團，優(yōu)選是β構(gòu)型，而另一個代表氫原子，或者Ra和Rb一起代表一個氧基；
Rc代表含有1-6個碳原子的烷酰基，芳基-羰基，其中芳基部分是含有6-10個環(huán)碳原子的芳香碳環(huán)基團，如下所定義的雜環(huán)-羰基，或者式-OR4的基團，其中R4代表上述對R1和R2所定義的任何一種基團或原子；環(huán)A， 是苯環(huán)或環(huán)己烷環(huán)；當(dāng)環(huán)A是環(huán)己烷環(huán)時，在環(huán)B中的虛線代表碳-碳單鍵或雙鍵，而n為1；或者當(dāng)環(huán)A是苯環(huán)時，環(huán)B中的虛線代表碳-碳單鍵，而n為0；所述的雜環(huán)-羰基是式R3-CO的基團，其中R3代表含有3-7個環(huán)原子的雜環(huán)基團，其中1-3個原子是選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子，剩余的一個或多個原子中至少有一個原子是碳原子。
所述的烷基、烯基和炔基和所述的烷羰基、烯羰基和炔羰基的烷基、烯基和炔基部分是取代的或具有至少一個下述的取代基Ψ取代基Ψ羥基，巰基，鹵素原子，氨基，含有1-6個碳原子的烷基氨基，其中每個烷基含有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基甲酰基，硝基，含有1-6個碳原子的烷氧基，含有1-6個碳原子的烷硫基，羧基，烷氧羰基和含有6-10個碳原子的非取代芳基；所述的芳基、所述的雜環(huán)基團、和所述芳羰基和所述芳烷基羰基的芳基部分是非取代的或具有至少一個下列的取代基ξ取代基ξ取代基Ψ中的任意一個，和含有1-6個碳原子的烷基，含有1-6個碳原子的羥烷基，和含有1-6個碳原子的鹵代烷基；以及藥用鹽及其酯。
更優(yōu)選地，在式(I)的化合物中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每個代表氫原子，含有1-6個碳原子的烷基，任選取代的苯基，甲?；?-5個碳原子的烷羰基，含有7-11個碳原子的芳羰基，含有8-15個碳原子的芳烷基羰基，或如下定義的雜環(huán)-羰基；Ra和Rb中的一個代表含有1-6個碳原子的烷?；蚴?OR4的基團，其中R4代表上述對R1和R2所定義的任何一種基團或原子，為β構(gòu)型，而另一個代表氫原子，或者Ra和Rb一起代表一個氧基；
所述的雜環(huán)-羰基是式R3-CO的基團，其中R3代表含有3-7個環(huán)原子的雜環(huán)基團，其中1-3個原子是選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子，剩余的一個或多個原子中至少有一個原子是碳原子。
在本發(fā)明中可以使用的3-氧代-7β-羥基類固醇的實例是那些化學(xué)式(II)的化合物 其中Ra和Rb和R2如上所定義，并優(yōu)選一起代表一個氧基。
在本發(fā)明的化合物中，當(dāng)R1，R2，R4或取代基ξ是烷基時，所述烷基可以是含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，其實例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、2-乙基丙基、1，1-二甲基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、叔己基和1，1-二甲基戊基，其中含有1-4個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是甲基和乙基。
當(dāng)R1，R2或R4代表烯基時，所述烯基可以是含有2-6個碳原子的直鏈或支鏈烯基，其實例包括乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、異丙烯基，甲代烯丙基、1-，2-，3-丁烯基，異丁烯基，1-，2-，3-，4-戊烯基和1-，2-，3-，4-，5-己烯基，其中含有2-4個碳原子的那些烯基是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是乙烯基和烯丙基。
當(dāng)R1，R2或R4代表炔基時，所述炔基可以是含有2-6個碳原子的直鏈或支鏈炔基，其實例包括乙炔基、1-，2-丙炔基、1-，2-，3-丁炔基、異丁炔基、1-，2-，3-，4-戊炔基和1-，2-，3-，4-，5-己炔基，其中含有2-4個碳原子的那些炔基是優(yōu)選的。
當(dāng)R1，R2，R4或取代基Ψ代表芳基時，所述芳基是含有6-10個碳原子的芳香碳環(huán)。這些基團的實例包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚基，其中苯基是優(yōu)選的。除了取代基α的情況外，這些基團可以是取代的或非取代的。當(dāng)該基團被取代時，取代基的數(shù)量僅受可取代位置的數(shù)量所限制，也許在某些情況下受空間位阻所限制。因此，在苯基的情況下，取代基的最大數(shù)量為5，而在萘基的情況下，取代基的最大數(shù)量為7等。然而，取代基的優(yōu)選數(shù)量是1-3，取代基的描述如下。
當(dāng)R1，R2或R4代表烷羰基時，所述烷羰基是烷?；?，其可以是含有2-7個碳原子(即烷基部分有1-6個碳原子)的直鏈或支鏈的基團，其實例包括乙?；⒈；⒍□；?、異丁?；?、戊?；愇祯；⑿挛祯；?，己?；透；?，其中含有2-5個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是乙?；捅；Ｔ摶鶊F的烷基部分可以是取代的或非取代的，如果是取代的，則取代基選自取代基α。這種取代基的實例包括丙氨?；ⅵ?丙氨?；⒈交滨；?、天冬酰胺?；?、半胱氨?；⒁掖减；被阴；?、甲硫氨酰基、鳥氨?；?、甘油酰基、托品酰基、谷氨酰胺?；⒐劝滨；⒏甙腚装滨；?、絲氨?；?、高絲氨?；?、蘇氨?；?、乳?；?、亮氨?；惲涟滨；⒄涟滨；①嚢滨；?、纈氨?；⒄i氨?；图“滨；?br> 當(dāng)R1，R2或R4代表烯羰基時，所述烯羰基可以是含有3-7個碳原子的直鏈或支鏈烯羰基，其實例包括丙烯酰基、甲基丙烯?；?、丁烯?；?、異丁烯?；?、3-丁烯?；⑽煜；图合；?，其中含有3-5個碳原子的那些烯羰基是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是丙烯?；图谆；?。
當(dāng)R1，R2或R4代表炔羰基時，所述炔羰基可以是含有3-7個碳原子的直鏈或支鏈炔羰基，其實例包括丙炔?；?、3-丁炔羰基、戊炔羰基和己炔羰基，其中含有3-5個碳原子的炔羰基是優(yōu)選的。
當(dāng)Rc，R1，R2或R4代表芳羰基時，所述芳羰基的芳基部分可以是上述定義和列舉的芳基中的任意一個。優(yōu)選的芳羰基包括苯甲?；?、鄰-，間-，或?qū)?甲苯酰基，鄰-，間-，或?qū)?甲氧苯酰基，鄰-，間-，或?qū)?羥基苯甲酰基、間三硝苯基、3，4，5-三羥苯甲?；?、3，4-二羥苯甲?；⑾悴蒗；?、3，4-二甲氧苯甲?；?、鄰氨基苯甲?；?-萘?；?-萘?；?。
當(dāng)R1，R2或R4代表芳烷基羰基或芳烯基羰基時，其中的芳基、烷基或烯基視情況而定，可以是上述定義和列舉的那些基團中的任意一個。這種基團的具體實例包括苯乙?；?-苯基丙?；?、二苯乙醇?；?、酪氨?；?、2-苯基丙烯?；?、α-苯丙酰基和肉桂?；?br> 當(dāng)Rc，R1，R2或R4代表雜環(huán)-羰基時，所述雜環(huán)-羰基是式R3-CO-的基團，其中R3代表含有3-7個環(huán)原子的雜環(huán)基團，其中1-3個原子是氮原子、氧原子或硫原子，剩下的原子是碳原子。至少一個環(huán)原子應(yīng)該是碳原子。當(dāng)其中有3個雜原子時，優(yōu)選其中至少一個是氮原子。這種基團的實例包括2-和3-呋喃甲酰基，2-和3-噻吩甲?；?-吡啶羰基，煙酰基，異煙?；滨；哙驶?，哌嗪羰基和嗎啉代羰基。
當(dāng)Rc代表烷酰基時，所述烷酰基可以是含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈基團，其實例包括甲?；?，乙酰基，丙?；?，丁?；?，異丁酰基，戊?；?，新戊?；乎；透；?，其中含有2-5個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，更優(yōu)選的是乙酰基和丙?；?，最優(yōu)選的是乙酰基。
當(dāng)取代基Ψ或取代基ξ是含有1-6個碳原子的烷基氨基時，烷基部分可以是上述定義和列舉的烷基中任意一個。這種烷基氨基的優(yōu)選實例包括甲氨基，乙氨基，丙氨基，異丙基氨基，丁氨基，異丁基氨基，仲丁基氨基，叔丁基氨基，戊氨基，異戊基氨基，新戊基氨基，叔戊基氨基，己氨基和異己基氨基，其中含有1-4個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是甲氨基和乙氨基。
當(dāng)取代基Ψ或取代基ξ是二烷基氨基時，每個烷基部分含有1-6個碳原子，并且兩個烷基彼此可以是相同的或不同的。烷基可以是上述定義和列舉的烷基中的任意一個。這種二烷基氨基的優(yōu)選實例包括二甲基氨基，甲乙基氨基，二乙基氨基，甲丙基氨基，二丙基氨基，二異丙基氨基，乙基丁基氨基，二丁基氨基，二-叔丁基氨基，甲基戊基氨基，二戊基氨基，二異戊基氨基和二己基氨基，其中每個烷基中含有1-4個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是二甲基氨基和二乙基氨基。
當(dāng)取代基Ψ或取代基ξ是烷氧基時，所述烷氧基可以是含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，其實例包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，異戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基和異己氧基，其中含有1-4個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是甲氧基和乙氧基。
當(dāng)取代基Ψ或取代基ξ是含有1-6碳原子的烷硫基時，烷基部分可以是上述定義和列舉的烷基中的任意一個。這種烷硫基的優(yōu)選實例包括甲硫基，乙硫基，丙硫基，異丙硫基，丁硫基，異丁硫基，仲丁硫基，叔丁硫基，戊硫基，異戊硫基，新戊硫基，叔戊硫基，己硫基和異己硫基，其中含有1-4個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是甲硫基和乙硫基。
當(dāng)取代基Ψ或取代基ξ是烷氧羰基時，所述烷氧羰基可以是含有2-7個碳原子的直鏈或支鏈烷氧羰基，其實例包括甲氧羰基，乙氧羰基，丙氧羰基，異丙氧羰基，丁氧羰基，異丁氧羰基，仲丁氧羰基，叔丁氧羰基，戊氧羰基，異戊氧羰基，新戊氧羰基，叔戊氧羰基，己氧羰基和異己氧羰基，其中含有1-4個碳原子的那些基團是優(yōu)選的，最優(yōu)選的是甲氧羰基和乙氧羰基。
當(dāng)取代基ξ是含有1-6個碳原子的羥烷基時，烷基部分可以是上述定義和列舉的烷基中的任意一個。這種羥烷基的優(yōu)選實例包括羥甲基，1-和2-羥乙基，1-，2-和3-羥丙基，1，2-二羥乙基，1，2，3-三羥丙基，4-羥丁基，5-羥戊基和6-羥己基。
當(dāng)取代基ξ是含有1-6個碳原子，優(yōu)選1-4個碳原子的鹵代烷基時，烷基部分可以是如上所定義和列舉的，并且鹵素原子優(yōu)選為氯，氟，溴或碘。這種基團的實例包括氟甲基，氯甲基，溴甲基，碘甲基，二氯甲基，二氟甲基，三氯甲基，三氟甲基，2，2，2-三氯乙基，2-氯乙基，2-氟乙基，2-溴乙基，2-碘乙基，2，2-二溴乙基，2，2，2-三溴乙基，3-氟丙基，3-氯丙基，4-溴丁基，4-氟丁基，5-氟戊基和6-氟己基。
應(yīng)該認(rèn)識到，當(dāng)化合物含有式-OR的基團時，其中R是上面對于R1等所定義的基團和原子中的任意一個，活性物種有可能是含有自由羥基的化合物。因此，可以用可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成羥基的任何基團來代替羥基。
本發(fā)明的化合物的具體實例包括 7β-羥基-表雄酮(7β-羥基-EPIA) 7β-羥基-脫氫表雄酮(7β-羥基-DHEA) 7β-羥基-17β-雌二醇 7β-羥基-孕烯醇酮 7β-羥基-雌酮此外，認(rèn)為下面的7α-羥基化合物以相同的方式被活化 7α-羥基-雌酮我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，這些化合物可用于保護由中風(fēng)、腦外傷、蛛網(wǎng)膜下haemhorrage或心臟分流手術(shù)導(dǎo)致的大腦缺血等事件所引起的急性和慢性神經(jīng)元損傷。
本發(fā)明的化合物可從母類固醇開始，采用各種眾所周知的方法來制備。例如，它們可采用在上面提及的文獻中公開的方法來制備，該方法將得到7β和相應(yīng)的7α化合物的混合物，該混合物然后可通過眾所周知的技術(shù)進行分離。
舉例說明，7β-羥基EPIA可以采用常規(guī)方法，在對DHEA的3β-羥基和17-酮基進行保護后，通過烯丙型氧化由DHEA獲得的。然后用可溶的金屬化合物催化劑(例如氫化鈉)對該產(chǎn)品進行還原，并對3β-羥基和17-酮基脫保護。然后可采用常規(guī)方法，例如柱色譜分離7α-羥基和7β-羥基差向異構(gòu)體，并且7β-羥基EPIA可通過結(jié)晶進行純化。
在下面的反應(yīng)路線中示出了可選擇的合成方法
在上述化學(xué)式中，TBDMSO代表叔丁基二甲基甲硅氧基，而Ac代表乙?；?。
在上述反應(yīng)路線的第一步中，以常規(guī)的方式采用叔丁基二甲基甲硅氧基對式(III)的化合物雌酮進行保護，得到保護的式(IV)化合物。然后在酸催化劑(例如對甲苯磺酸)的存在下，將其與乙二醇反應(yīng)，以保護17位的酮基，得到式(V)的化合物。然后如后面的實施例3所述，在6位進入羥基，得到式(VI)的化合物，該化合物然后脫氫得到式(VII)的化合物。式(VII)化合物環(huán)氧化得到式(VIII)的化合物，然后式(VIII)化合物還原得到帶7α-羥基的式(IX)的化合物。脫去叔丁基二甲基甲硅烷基保護基，得到式(X)的化合物，其與催化量的酸一起加熱，得到7α-羥基-雌酮(XI)。例如使用鉻酸/硫酸對其進行氧化，得到7-酮基-雌酮(XII)，然后其與乙酸酐反應(yīng)，得到式(XIII)的化合物。例如使用氫，在鈀催化劑存在下將式(XIII)的化合物氫化，得到式(XIV)的化合物，最后脫去乙?；?，得到本發(fā)明的化合物7β-羥基-雌酮(XV)。如果需要，其可被還原，得到也是本發(fā)明化合物的7β-羥基-雌二醇(XVI)。
本發(fā)明的其它7β-羥基化合物可以按照類似的方式制備，例如，7β-羥基-DHEA可通過下列反應(yīng)路線來制備 在該反應(yīng)路線中，DHEA(XVII)乙?；玫较鄳?yīng)的式(XVIII)的乙酸酯，然后其與乙二醇反應(yīng)，得到式(XIX)的縮酮。然后將縮酮(XIX)如實施例16所述進行氧化，得到相應(yīng)的7-酮基化合物(XX)，然后該化合物進行脫乙酰化，得到式(XXI)的化合物。將該化合物還原得到式(XXII)的7-羥基-17-縮酮基-EPIA，然后它用酸處理來除去縮酮基而得到7-羥基-EPIA，最后通過色譜分離成7β-和7α-異構(gòu)體，得到7α-羥基-EPIA(XXIV)和7β-羥基-EPIA(XXV)。
本發(fā)明中的化合物可用于治療可能有缺血危險，特別是中風(fēng)或頭損傷危險的病人。這種預(yù)防性應(yīng)用是很有用的。然而，也已證實本發(fā)明的化合物具有有用的活性，即使在缺血情況發(fā)生后應(yīng)用也是具有有用的活性的，但推薦盡早用藥，以盡可能避免神經(jīng)元的變性。在有些情況下，特別是在病人仍處于缺血危險中時，可以使用重復(fù)的劑量。
為了盡早得到期望的效果，用藥的合適方式一般是注射。因此，靜脈注射是特別優(yōu)選的，但在有些情況下，優(yōu)選的用藥方式是直接將化合物注射到腦脊髓液中。
本發(fā)明中化合物的劑量可根據(jù)很多因素進行改變，包括患者的年齡、體重和全身狀態(tài)、及用藥方式、頻率和途徑。但一般推薦的劑量是從0.01到50mg/kg體重，更優(yōu)選的是從0.05到20mg/kg體重的劑量?？梢砸淮蔚膭┝炕蚍珠_的劑量進行用藥。
通過下面的非限制性實施例進一步描述本發(fā)明，其中實施例1到20描述的是本發(fā)明中化合物的制備，實施例21和22描述的是它們的活性。在實施例1到20中，羅馬數(shù)字代表上述反應(yīng)路線中的化學(xué)式。
在1巴的氫氣壓力下，用200mg10％的鈀/活性炭催化劑對80ml含有1.0g7-羥基-6-脫氫雌酮-3，7-二乙酸酯(XIII)(2.72mmol)的冰醋酸溶液進行脫氫。2小時后過濾反應(yīng)介質(zhì)并蒸發(fā)至干燥。殘余物用快速色譜(SiO2/乙酸乙酯∶環(huán)己烷為1/9)純化。得到855mg7-羥基雌酮-3，7-二乙酸酯(XIV)(2.31mmol，85％)。
如前所述進行實驗性缺氧操作(Pringle等，1996；1997)。簡要來說，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有5μg/ml熒光排斥染料碘化丙錠(PI)的無血清培養(yǎng)基(SFM-75％MEM，補加1mM谷氨酰胺和4.5mg/ml葡萄糖的25％ HBSS)中。成象前培養(yǎng)物在SFM中平衡60分鐘。然后用裝有一套若丹明濾光片的Leica倒置顯微鏡檢測PI熒光。該步驟中任何可檢測到PI熒光的培養(yǎng)物在以后的實驗中舍棄。通過將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到已用95％ N2/5％ CO2飽和的SFM(+PI)中來誘導(dǎo)缺氧。然后將培養(yǎng)皿(無蓋)封口成密閉室，其中的空氣已在密閉前通過以1OL/min的速度連續(xù)鼓氣10分鐘用95％N2/5％ CO2飽和了。然后在培養(yǎng)箱中放170分鐘(因此缺氧總時間為180分鐘)。在缺氧期的最后時刻，將培養(yǎng)物放回到含PI的含氧量正常的SFM中，再將其放回培養(yǎng)箱中維持24小時。
按前述方法(Pringle等.，1996；1997)用Apple IIsi計算機運行NIHImage1.60或Macintosh G4/400計算機運行OpenLab2.1(Improvision)對神經(jīng)元損傷進行評估。圖像用單色相機拍攝，并保存在光盤中以備脫機分析。在加入藥品之前拍攝光透射圖像，而在24小時缺氧后的恢復(fù)期結(jié)束時拍攝PI熒光圖像。CA1細(xì)胞層的范圍可從透射圖像中確定。而CA1中的PI熒光區(qū)域可用NIH Image或Openlab中的密度分割功能進行計算。神經(jīng)元損傷以PI熒光高于背景的CA1的百分比來表示。
類固醇化合物是通過制造最初的溶在乙醇中的1mg/ml溶液并進一步在SFM中稀釋制得的。在缺氧之前、缺氧之中及缺氧之后的恢復(fù)期將化合物加入到培養(yǎng)物中45分鐘。對照實驗由只用載體處理的培養(yǎng)物構(gòu)成。結(jié)果實驗1進行最初的實驗以確定7αOH-EPIA和7βOH-EPIA在100nM的高濃度下是否具有神經(jīng)保護作用。缺氧在25.5±6.4％的CA1中產(chǎn)生損傷。在缺氧之前、之中及之后，7αOH-EPIA和7βOH-EPIA均可顯著降低這種損傷(見表1)。
表1
實驗2已確定7OH-EPIA的α和β異構(gòu)體均具有神經(jīng)保護作用，我們推測這種作用具有濃度依賴性。對照組缺氧對31.9±4.7％的CA1造成神經(jīng)元損傷。7βOH-EPIA在10nM和100nM均具有顯著的神經(jīng)保護作用，但在濃度降低到1nM時活性喪失，如下面的表2所示。
表2
實驗3已觀測到7βOH-EPIA的神經(jīng)保護作用，下面我們研究7βOH-DHEA是否有神經(jīng)保護作用。在缺血之前、之中及之后，將培養(yǎng)物與100nM7βOH-DHEA或載體一起培育。缺氧在29.0±6.2％的CA1中產(chǎn)生損傷。在用7βOH-DHEA處理的培養(yǎng)物中，可以觀察到極其明顯地降低神經(jīng)原損傷，如下面的表3所示。
表3
實施例22大鼠全腦缺血實驗(4血管閉塞法)通過4血管閉塞法(4VO)在雄性Wistar大鼠(250-280g)中誘導(dǎo)腦缺血。兩個椎動脈在戊巴比妥麻醉(60mg/kg腹腔注射)下通過電烙術(shù)進行閉塞。然后允許動物在自由進水但無食物的情況下恢復(fù)24小時。第二天頸動脈在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露在2％氟烷中，并用微脈管鉗閉塞10分鐘。隨后，松開二只鉗子，并檢查二個動脈以進行立刻的再灌注。在手術(shù)時和隨后的3小時中，通過用連有肛表的恒溫控制的加熱毯來維持其正常體溫(37.5±0.5℃)。對于對照組，假手術(shù)動物的兩個椎動脈在戊巴比妥麻醉下被電烙，兩個普通的頸動脈在30％氧/70％一氧化二氮麻醉下暴露于氟烷但第二天不被夾緊。傷口用利多卡因膠處理，然后進行縫合。動物在環(huán)境溫度30℃的情況下保持在加熱燈下直至恢復(fù)意識。
共研究了7組動物1.(n＝8)類固醇化合物，7β-OH EPIA(0.1mg/kg，通過尾靜脈注射，共注射3次分別在誘導(dǎo)缺血前15分鐘、缺血中及再灌注后5分鐘)；2.(n＝8)類固醇，7β-OH EPIA(0.3mg/kg，如1所述靜脈注射3次)；3.(n＝8)類固醇，7β-OH EPIA(1mg/kg，如1所述靜脈注射3次)；4.(n＝8)NBQX(二鈉鹽，因為更溶于水)作為參照物和陽性對照(TOCRIS，德國，30mg/kg，如1所述腹膜注射3次)；5.(n＝8)標(biāo)準(zhǔn)載體(0.9％ NaCl，含100μl乙醇)，如1所述靜脈注射3次)；6.(n＝8)單獨缺血；7.(n＝8)假手術(shù)對照組。
NBQX是2，3-二羥基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并(F)喹喔啉，并已知具有神經(jīng)保護活性[Gill，R.，Nordholm，L.，Lodge D.Theneuroprotective action of 2，3-dihydroxy-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo(F)quinoxaline(NBQX)in a rat focal ischaemia model.BrainRes.580，35-43，1992]。
7β-OH EPIA是本發(fā)明的化合物7β-羥基表雄酮。
將上述物質(zhì)溶解在100μl乙醇中，最后用0.9％NaCl稀釋。
缺血后經(jīng)過7天的生存期，所有動物用4％低聚甲醛穿心灌注固定。然后小心地除去腦并在相同的固定液中后固定2小時。腦在30％蔗糖中超低溫保護后，放到異戊烷中快速冷凍并保存在-80℃。將含有海馬結(jié)構(gòu)的20微米低溫恒溫器部件用甲苯胺藍(lán)或Neuro Trace熒光進行Nissl染色。數(shù)據(jù)分析Nissl染色后，通過存活神經(jīng)元的數(shù)量可評價缺血后海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷的嚴(yán)重程度。計算每組CA1區(qū)域中每400μm長度上形態(tài)學(xué)完整的神經(jīng)元的平均數(shù)。用裝有20倍物鏡的光學(xué)顯微鏡對每只動物的3-5個連續(xù)切片進行細(xì)胞計數(shù)，并對每個切片的400μm CA1區(qū)域進行6次計數(shù)。通過成對的Student’s t-測試對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均值±SEM來表示。結(jié)果和討論結(jié)果如附

圖1至3所示。
形態(tài)學(xué)完整的海馬CA1神經(jīng)元在Nissl染色(甲苯胺藍(lán)或NeuroTrace，如圖2)后根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)來體現(xiàn)清晰的神經(jīng)元核周體形狀，帶有陽性標(biāo)記的核仁的大神經(jīng)核，在具有Nissl染色的核周圍的小細(xì)胞質(zhì)區(qū)，表明具有完整的含核糖體的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此具有完整的蛋白合成系統(tǒng)。
全腦缺血(輕度缺血)10分鐘及7天的生存期導(dǎo)致海馬CA1區(qū)域錐體細(xì)胞的選擇性神經(jīng)變性(圖1A-1C)。在假手術(shù)動物的CA1中，錐體細(xì)胞平均數(shù)目為121.5±4.3(設(shè)為100％)。因此，在全腦缺血10分鐘后，60％CA1神經(jīng)元死亡(圖1B)。缺血并如實驗所述用載體(NaCl+100μl乙醇)進行靜脈注射的動物組神經(jīng)元數(shù)目與單獨缺血動物組進行比較(圖1A，1B)。NBQX(30mg/kg，如實驗所述靜脈注射三次)與缺血組比較，CA1錐體細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的(p＝0.03)神經(jīng)保護作用。與單獨缺血組比較，NBQX表現(xiàn)出47.5％的神經(jīng)保護作用，而與假手術(shù)組動物相比較，保護作用為68.5％。NBQX引起的神經(jīng)保護作用與Gill等，1992和Gill 1994的結(jié)果是一致的，表明我們實驗中所用的全腦缺血模式是有效的。7β-OH EPIA在全腦缺血10分鐘和7天生存期后，對海馬CA1錐體細(xì)胞具有濃度依賴性的神經(jīng)保護作用(圖1A)。T-測試分析表明，7β-OH EPIA在濃度為0.1mg/kg(p＝0.01)和0.3mg/kg(p＝0.0008)時具有非常顯著的神經(jīng)保護作用。與假手術(shù)組相比較，7β-OH EPIA對CA1錐體細(xì)胞分別表現(xiàn)出74.8％(0.1mg/kg)和83.9％(0.3mg/kg)的神經(jīng)保護作用(圖1C)。但7β-OH EPIA在濃度為1.0mg/kg時僅表現(xiàn)出神經(jīng)保護的趨勢，但作用不顯著。
在缺血之前、之中和之后用7β-OH EPIA進行靜脈注射的所有實驗中，我們從未觀察到動物的任何行為異常。
圖1A數(shù)據(jù)以CA1區(qū)域每400μm長度的完整神經(jīng)元的平均數(shù)目±SEM表示。
圖1B數(shù)據(jù)以CA1區(qū)域每400μm長度的完整神經(jīng)元與假手術(shù)動物的百分比表示，假手術(shù)組動物的完整神經(jīng)元設(shè)為100％。
圖1C當(dāng)缺血組存活神經(jīng)元數(shù)目設(shè)為0，而假手術(shù)組設(shè)為100％時，數(shù)據(jù)以神經(jīng)保護作用的絕對百分比表示。
權(quán)利要求
1.3-羥基-7β-羥基類固醇或3-氧代-7β-羥基類固醇及其藥用酯用于生產(chǎn)保護神經(jīng)元免受損傷的藥劑的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是化學(xué)式(I)的化合物 其中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每個代表氫原子，含有1-6個碳原子的烷基，含有2-6個碳原子的烯基，含有2-6個碳原子的炔基，含有6-10個碳原子的芳基，甲?；?-7個碳原子的烷羰基，含有3-7個碳原子的烯羰基，含有3-7個碳原子的炔羰基，含有7-11個碳原子的芳羰基，含有8-15個碳原子的芳烷基羰基，含有9-15個碳原子的芳烯基羰基，或如下定義的雜環(huán)-羰基；Ra和Rb中的一個代表式-Rc的基團，優(yōu)選是β構(gòu)型，而另一個代表氫原子，或者Ra和Rb一起代表一個氧基；Rc代表含有1-6個碳原子的烷?；蓟?羰基，其中芳基部分是含有6-10個環(huán)碳原子的芳香碳環(huán)基團，如下所定義的雜環(huán)-羰基，或者式-OR4的基團，其中R4代表上述對R1和R2所定義的任何一種基團或原子；環(huán)A， 是苯環(huán)或環(huán)己烷環(huán)；當(dāng)環(huán)A是環(huán)己烷環(huán)時，在環(huán)B中的虛線代表碳-碳單鍵或雙鍵，而n為1；或者當(dāng)環(huán)A是苯環(huán)時，環(huán)B中的虛線代表碳-碳單鍵，而n為0；所述的雜環(huán)-羰基是式R3-CO的基團，其中R3代表含有3-7個環(huán)原子的雜環(huán)基團，其中1-3個原子是選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子，剩余的一個或多個原子中至少有一個原子是碳原子。所述的烷基、烯基和炔基和所述的烷羰基、烯羰基和炔羰基的烷基、烯基和炔基部分是非取代的或具有至少一個下述的取代基Ψ取代基Ψ羥基，巰基，鹵素原子，氨基，含有1-6個碳原子的烷基氨基，其中每個烷基含有1-6個碳原子的二烷基氨基，氨基甲?；趸?，含有1-6個碳原子的烷氧基，含有1-6個碳原子的烷硫基，羧基，烷氧羰基和含有6-10個碳原子的非取代芳基；所述的芳基、所述的雜環(huán)基團、和所述芳羰基和所述芳烷基羰基的芳基部分是非取代的或具有至少一個下列的取代基ξ取代基ξ取代基Ψ中的任意一個，和含有1-6個碳原子的烷基，含有1-6個碳原子的羥烷基，和含有1-6個碳原子的鹵代烷基；以及藥用鹽及其酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求的用途，其中R1和R2彼此是相同的或不同的，并且每個代表氫原子，含有1-6個碳原子的烷基，任選取代的苯基，甲?；?-5個碳原子的烷羰基，含有7-11個碳原子的芳羰基，含有8-15個碳原子的芳烷基羰基，或如下定義的雜環(huán)-羰基；Ra和Rb中的一個代表含有1-6個碳原子的烷?；蚴?OR4的基團，其中R4代表上述對R1和R2所定義的任何一種基團或原子，為β構(gòu)型，而另一個代表氫原子，或者Ra和Rb一起代表一個氧基；所述的雜環(huán)-羰基是式R3-CO的基團，其中R3代表含有3-7個環(huán)原子的雜環(huán)基團，其中1-3個原子是選自氮原子、氧原子和硫原子的雜原子，剩余的一個或多個原子中至少有一個原子是碳原子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是化學(xué)式(II)的化合物 其中Ra和Rb中的一個代表式-Rc的基團，優(yōu)選是β構(gòu)型，而另一個代表氫原子，或者Ra和Rb一起代表一個氧基；Rc代表含有1-6個碳原子的烷酰基，芳基-羰基，其中芳基部分是含有6-10個環(huán)碳原子的芳香碳環(huán)基團，如下所定義的雜環(huán)-羰基，或者式-OR4的基團，其中R4代表上述對R1和R2所定義的任何一種基團或原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是7β-羥基-表雄酮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是7β-羥基-脫氫-表雄酮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是7β-羥基-17β-雌二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是7β-羥基-孕烯醇酮。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是7β-羥基-雌酮。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中的類固醇是7α-羥基-雌酮。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一個的用途，其中的神經(jīng)元損傷是由慢性紊亂引起的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的用途，其中的慢性紊亂是阿爾茨海默氏病、帕金森氏病或非癡呆性認(rèn)知損傷。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一個的用途，其中的神經(jīng)元損傷是由急性紊亂引起的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中的急性紊亂是由中風(fēng)、腦外傷、脊髓損傷或周圍神經(jīng)損傷引起的。
15.一種保護哺乳動物免受神經(jīng)元損傷的方法，該方法通過給哺乳動物服用有效量的3-羥基-7β-羥基類固醇或3-氧代-7β-羥基類固醇或其藥用酯來進行。
全文摘要
3－羥基－7β－羥基類固醇和3－氧代－7β－羥基類固醇或其藥用酯可用于保護神經(jīng)元免受損傷。
文檔編號A61K31/5685GK1443071SQ0181319
公開日2003年9月17日 申請日期2001年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者恩斯特·武爾費特, 阿什利·克爾·普林格爾, 拉爾斯·埃里克·森德斯特羅姆 申請人:亨特-弗萊明有限公司