專利名稱：對多個樣本進行多基因座基因分型的微陣列方法
技術領域：
本發(fā)明廣義地說涉及到基因分型，且更具體地涉及到用于疾病診斷的基因分型。
背景技術：
目前人類、動物和植物的許多病理疾病已在遺傳水平得以闡明。隨著人類基因組圖譜宣布完成，可以預期在不久的將來會鑒定出更多人類疾病的遺傳基礎。因此，來自個體的DNA分析原則上可使得在缺乏明顯癥狀的情況下診斷或鑒定出基于遺傳的疾病。這對于許多疾病例如代謝紊亂是有利的，其中早期診斷能防止后期生活中嚴重的醫(yī)學并發(fā)癥。
分析DNA序列的方法(其在遺傳學上通常指基因分型)在本領域公知。通常情況下，為判定樣本中的DNA是否對應于遺傳序列已知的特定疾病，將樣本在允許雜交的條件下暴露于與該疾病相關的核酸探針。核酸探針經(jīng)過標記，這樣使得探針可檢測是否探針已與DNA樣本進行了雜交。在一項技術中，探針以陣列形式排列在芯片上，每一探針位于特定的位置。陣列暴露于標記的DNA樣本后，掃描設備可檢查陣列中的每一位置，并判定目標分子是否與該位置處的探針相互作用。陣列芯片可由商業(yè)渠道提供，例如從Affymetrix(Santa Clara，CA)獲得，且在授予Affymetrix的專利中進行了描述(參見如美國專利號6,045,996、5,858,659和5,925,525，以及其中的參考文獻)。陣列也已用于DNA測序，如通過雜交方法的序列測定，例如在美國專利號6,025,136、6,018,041、5,525,464和5,202,231中所描述的。
盡管已經(jīng)存在用于疾病診斷的基因分型方法，但為使這些方法可用于公共健康，它們的費用必須適當。例如，盡管相關的遺傳鑒定法已為人所知，但新生兒的篩選目前仍通過質(zhì)譜的方法進行，這主要是基于費用的考慮。此外，用于公共健康的DNA診斷需要其可應用于多個樣本以及可應用于難以使用質(zhì)譜法的遺傳疾病。多樣本的需求可通過應用同時作用的多陣列芯片解決。如在美國專利號5,545,531(Rava等)中所描述，可使用包括標準的96孔微滴定板的排列，在所述標準的96孔微滴定板中每個孔的底部均含有一個陣列芯片。為在許多病人樣本上進行同一試驗，在溶液中的每個病人樣本經(jīng)過標記并導入不同的孔內(nèi)，其中每個孔具有相同的陣列芯片。這樣，在此方法中，每個樣本應用一個單獨的陣列芯片，由于每個病人的陣列、試劑、樣本處理等的固定費用，該方法對于大規(guī)模的應用過于昂貴。
美國專利號5,807,522(Brown等)描述的方法應用病人基因組DNA的多個微陣列和代表給定基因的所有已知突變的探針DNA片段來篩選多個病人是否在疾病基因中存在已知突變。微陣列制作在以塑料支持的硝化纖維片上，在單獨的陣列之間存在硅橡膠屏障以防止交叉污染。所有微陣列作為一單片材料操作。但Brown等的方法中，對篩選的每一突變等位基因或遺傳標記應用單獨的微陣列。
這樣，需要具有足夠精確度的用于診斷的基因分型方法，該方法的費用可以承受并可提供足夠的通量用于大規(guī)模篩選。理想的情況是，這樣的方法使得在一次檢測中可對多個病人篩選多種疾病。更通常的情況是，該方法使得在一次檢測中可對人類、動物、植物或微生物材料來源的多個樣本篩選位于多個基因座處的等位基因。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于在一次檢測中對多個樣本在多個基因座處進行基因分型的方法。根據(jù)本方法，來自多個樣本的基因組片段通過聚合酶鏈反應引物進行擴增，其中每個基因組片段包含一個基因座，即一個目的DNA標志?；蚪M片段在表面形成微陣列，其中在表面的每一位置處的材料基本上對應于來自單個樣本的單個基因組片段。微陣列與合成的寡核苷酸混合物雜交，所述合成的寡核苷酸與微陣列上的基因組片段互補。多個樣本的基因型信息通過讀取微陣列信號得以同時獲得。本方法可用于疾病診斷或從任何植物或動物物種中篩選等位基因，且因此具有廣闊的應用范圍。
附圖簡述本專利文件包含至少一張彩圖。在索要并交付所需的費用后，帶有彩圖的本專利的拷貝將由美國專利和商標局提供。


圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案同時對多個樣本進行多基因座基因分型的方法的流程圖。
圖2是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的一小部分微陣列的圖解式說明。
圖3A和3B顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，檢測出的分別由Cy3和Cy5發(fā)射的直接熒光信號，信號來自576個位點(從72個不同的病人樣本中制備)的微陣列，如在以下的實施例中所描述的。微陣列信號在100％光電倍增管(PMT)和80％激光設置下由共聚焦掃描器讀取。使用了常規(guī)的彩虹信號碼，其中紅色為強度最大，黑色為強度最小。
圖4A和4B分別為圖3A和3B中數(shù)據(jù)的放大部分。字母(a-c)和數(shù)字(1-28)如下表示了每個不同病人樣本的位置a 10-12，樣本1(S/S)；a 13-15，樣本2(A/S)；a 16-18，樣本3(S/C)；a 19-21，樣本4(C/C)；a 22-24，樣本5(A/C)；a 25-27，樣本6(A/A)；b 1-3，樣本7(E/E)；b 4-6，樣本8(A/E)；b 7-9，樣本9(A/A)；b 10-12，樣本10(野生型)；b 13-15，樣本11(雜合的)；b 16-18，樣本12(純合的)；b 19-21，樣本13(野生型)；b 22-24，樣本14(雜合的)；b 25-27，樣本15(純合的)。應用來自陰性對照印刷緩沖液的信號(a28-30)進行背景消減。也顯示了陽性雜交對照(b28-30、c1-3、c4-6、c7-9和c10-12)。距離條相當于1.0mm。
圖5顯示了在圖4A中彩虹信號碼所代表的信號的定量數(shù)值。消減背景后對三次檢測進行平均。每一病人樣本的基因型在圖表的上面和下面給出。
圖6A和6B顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案檢測出的分別由Cy3和Cy5發(fā)射的信號，信號來自通過間接標記法從與圖3A和3B為同一組病人樣本制備的微陣列，如在以下的實施例中所描述的。信號如圖3A和3B中所描述的方法進行檢測。
發(fā)明詳述基因分型方法同時獲得有關多個個體在多個疾病位點的信息。如此處所用，基因分型具體定義為在給定的基因座處以單核苷酸分辨來區(qū)分等位基因?；蜃?多個基因座)定義為遺傳標志或DNA標志的染色體位置。這樣，本發(fā)明方法具有所需的提供用于個人的篩選和診斷信息的精確度，所述信息可作為醫(yī)療決定的基礎。
本方法的總結(jié)在圖1中進行了圖解式的闡明。首先，在步驟10，將基因組DNA樣本從生物標本中分離出來。標本可為包括細菌、酵母、植物或動物的任何來源。任何含DNA的生物體均適用于本方法。在人類疾病診斷的應用中，生物樣本如從血液、羊膜液、新生兒血液卡、唾液、精液、上皮刮取物和針吸活組織檢查中獲得。對于某些的生物體，生物標本可能含有RNA而不是DNA。樣本應用標準的程序進行分離和純化。
然后在步驟12用基因特異的引物通過聚合酶鏈反應(PCR)對樣本DNA進行擴增，以產(chǎn)生所說的擴增子。PCR法已廣泛應用，并已在本領域中充分描述(參見如美國專利號4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,333,675，以及其中的參考文獻)。將特異的引物對應用于每個目標基因組片段，即用于每一含已知潛在突變或其它DNA改變的目標基因組片段。因此，本方法可應用于任一用DNA標記鑒定的疾病。這些疾病包括如名為囊性纖維化、酪氨酸血癥、槭糖尿病、α-l-抗胰蛋白酶缺乏癥、I型丙二酸尿癥、遺傳性聽力喪失、β-地中海貧血、長鏈3-羥酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥的一些疾病。本方法尤其用于如鐮形細胞性貧血和半乳糖血癥，其中已深入研究的單一基因的單一突變可產(chǎn)生疾病表型。DNA標志可代表任何已知類型的DNA改變，包括突變、單核苷酸多態(tài)性、小的缺失等。唯一的要求是目標DNA的改變必須處于用于產(chǎn)生擴增子的引物對內(nèi)。這保證了從所有標本(包括來自純合子、雜合子和正常個體的標本)中特定位點產(chǎn)生的復制子以近乎相等的效率進行擴增。
每一生物樣本應用多引物對分別進行處理，以產(chǎn)生每一個體的多擴增子，每一擴增子與來自特定個體的特定基因組片段相關，每一基因組片段包含一個目的基因座。每一擴增子的長度，在目前應用的方法中為約60個堿基對，盡管本方法也可應用于復制子的長度在約40-1000個堿基對之間。每一PCR反應的總體積如目前通常采用的為約50μl。預期進一步的優(yōu)化會將體積減少到5-10μl，其使用用于樣本制備所需的PCR擴增和純化的試劑數(shù)量的減少將進一步降低費用。
純化基因組片段以移去污染物，如核苷酸、酶、引物和其它可干擾微陣列印刷、吸附或雜交的底物。用于PCR擴增子純化的方法可從一些供應商獲得，包括TeleChem(Sunnyvale，CA)和Qiagen(Valencia，CA)。純化的擴增子懸在緩沖液中，如氯化鈉和檸檬酸鈉溶液(SSC)，二甲基亞砜溶液(DMSO)，氯化鈉、磷酸鈉和乙二胺四乙酸鹽(SSPE)溶液或其它標準試劑。在步驟14中，將緩沖的擴增子排列在標準的96孔或384孔微板上，每孔分配一種擴增子溶液。盡管產(chǎn)物體積在2-20μl之間足以用于形成微陣列，但用于陣列步驟的純化產(chǎn)物的體積一般為每孔約3-4μl。
DNA分離和PCR過程易于在96孔或384孔結(jié)構(gòu)中大規(guī)模進行，這樣在自動化的實驗室設備中易于每天處理＞10,000個樣本。此通量使得每年可從240,000個病人中擴增10個位點。這樣，本方法可用于人群的大范圍篩選以及其它高通量應用如用于農(nóng)業(yè)中所需的作物繁育、法庭、軍事應用等。
在步驟16中，微板中基因組片段的高密度微陣列在基片上形成，目前微陣列的大小在基片上占約1.0cm2，基片一般為標準的25mm×76mm顯微鏡用載玻片。標準的點直徑為約100μm，點的中心到中心的距離約為140μm，以使每個點在基片上不同且獨立的位置處形成。在以下實施例描述的實驗中，在1.0cm2印刷面積上點的總數(shù)為576，盡管與目前微點樣技術的能力相關的樣本放大使得可在每cm2上點出超過1000個點，即估計每cm2上有5,184個點，這樣使得每個25mm×76mm微陣列玻片上的18mm×72mm微陣列可含約82,944個點。這樣本發(fā)明的方法允許同時從多個個體中獲得基因分型信息，即從至少10個、至少60個或至少5,000個個體中同時獲得基因分型信息。原則上，每個公民的微陣列可提供人群中個人的永久基因檔案。
在PCR方法的精確度范圍內(nèi)，微陣列上的每個點基本上與來自單一個體的單一擴增子對應。樣本目前以140μm的間距重復三次進行印刷。重復三次點樣增加了結(jié)果的可信度，且作為示例在圖2中以圖解顯示。前面的第26排從左到右含來自個體1的用PCR引物對A處理的擴增子對應的三個點，標記為1A，隨后是來自個體1的用PCR引物對B處理的三個點，等等。在圖2中，第28排顯示來自個體2的用PCR引物對A、B和C處理的擴增子。盡管來自不同擴增子溶液的點的確需要放置在不同的位置上，但是并不需要將不同樣本來源的點置于不同的排。也不必拘泥于重復三次點樣的樣式本身，并可使用單倍、兩倍、四倍或其它的點樣模式以產(chǎn)生可靠的基因分型信息。
目前已有的用于形成微陣列的技術包括接觸和非接觸的印刷技術。一個實例為來自Cartesian Technologies(Irvine，CA)的PixSys 5500運動控制系統(tǒng)，其配備有來自TeleChem(Sunnyvale，CA)的Stealth微點樣印刷頭。接觸印刷技術包括應用固體針、裂口針、鑷子、微點樣針及針和環(huán)的機械裝置。接觸印刷技術可從許多商業(yè)供應商處獲得，包括BioRobotics(Boston，MA)、Genetix(Christchurch，英國)、Incyte(Palo Alto，CA)、Genetic MicroSystems(Santa Clara，CA)、Affymetrix(Santa Clara，CA)、Synteni(Fremont，CA)、Cartesian Technologies(Irvine，CA)等。非接觸印刷技術包含如那些應用壓電體、泡沫噴氣機、微螺線管閥、注射器泵等的“噴墨”類裝置。非接觸印刷技術的供應商包括Packard Instruments(Meriden，CT)、Agilent(Palo Alto，CA)、Rosetta(Kirkland，WA)、Cartesian Technologies(Irvine，CA)、Protogene(Palo Alto，CA)和其它。接觸印刷裝置和非接觸印刷裝置均可應用在可三維運動的自制或商售的裝置上。購自Engineering Services Incorporated(Toronto，Canada)、IntelligentAutomation Systems(Cambridge，MA)、GeneMachines(San Carlos，CA)、Cartesian Technologies(Irvine，CA)、Genetix(Christchurch，UnitedKingdom)和其它公司的運動控制裝置也適用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的微陣列。
本方法PCR反應中應用的引物對一般包含活性基團，如烷基胺基團，該基團允許擴增子特異結(jié)合到微陣列的基片上，其中所述基片例如可經(jīng)化學處理的玻璃基片。例如基片可含有活性醛基，該基團允許連接有氨基的PCR產(chǎn)物通過席夫堿進行末端連接，產(chǎn)生反應產(chǎn)物。連接反應過程通過脫水反應進行。疏水印刷表面(如那些含活性醛基的印刷表面)用于防止樣本擴散，并因此使得可形成更小的點和更高的微陣列密度。帶有活性醛基的微陣列可通過許多供應商獲得，包括TeleChem(Sunnyvale，CA)和CELAssociates(Houston，TX)。但顯而易見，也可應用任何其它一些微陣列表面和連接化學品，包括那些含包被有多聚賴氨酸、有機硅烷、環(huán)氧硅烷、活性羧基、凝膠墊材料、硝化纖維的涂層或處理的玻璃和其它材料。同樣顯而易見的是，除了末端連接方案，也可另外應用許多非特異方案，包括用紫外光或熱、靜電作用、疏水及其它方法作用交聯(lián)到基片。
在步驟18中，微陣列經(jīng)處理并與標記的合成寡核苷酸混合物雜交。微陣列應用常規(guī)的方法(參見如Schena等，PNAS 93，10614-10619，1996)處理以移去未結(jié)合的DNA材料、使未反應的醛基失活并使印刷的PCR片段在微陣列雜交前變性。通常，雜交反應在含鹽和去污劑的水溶液中進行，且反應溫度比合成寡核苷酸的解鏈溫度(Tm)約低10℃。雜交混合物由合成的與存在于微陣列擴增子中的等位基因互補的寡核苷酸組成。即混合物中的每種合成寡核苷酸與通過PCR引物對選擇的一個基因座對應。根據(jù)本方法，實際上可制備出無限多的不同雜交混合物，以檢測來自任何含核酸生物體的目的擴增子的等位基因。同樣明顯的是，該過程是可大規(guī)模化的，這樣含幾十、幾百或可能幾千的不同寡核苷酸的混合物可用于同時檢測多種不同的目的等位基因并因此檢測許多不同的疾病。唯一需要的是野生型和改變的等位基因的序列信息及與每一PCR引物對互補的邊界基因序列是可獲得的。合成的寡核苷酸可由許多供應商提供，包括EOSBiotechnology(South San Francisco，CA)和Operon Technologies(Alameda，CA)。
混合物中的寡核苷酸長度一般約10-30個核苷酸，以優(yōu)化在擴增子內(nèi)區(qū)別單核苷酸變化的能力。例如寡核苷酸的長度可為15個核苷酸(15-mers)，其中目的等位基因位于與15mer相關的中間位置(位置8)。混合物中的合成寡核苷酸經(jīng)過標記，且標記可位于例如每一寡核苷酸的5′末端，盡管5′或3′末端標記或兩端均標記在描述的方法中均預期可起作用。直接和間接的方法均在本領域公知。在直接標記中應用的常見熒光標簽包括稱為Cy3和Cy5的染料，二者分別在約550nm和650nm處發(fā)出熒光。寡核苷酸混合物可含在多個波長處發(fā)出熒光的多種熒光標簽。可用任何數(shù)量的不同類型熒光標簽替換Cy3和Cy5標簽以允許檢測一種或多種不同的顏色。多色法預期是有用的，例如它允許野生型等位基因在一種顏色以最大效率檢測，且突變等位基因在另一種顏色以最大效率檢測。其它類型的標記物可包含許多商售染料和染料衍生物，如那些名為Alexa、熒光素、羅丹明、FAM、TAMRA、Joe、ROX、德克薩斯紅、BODIPY、FITC、Oregon Green、麗絲胺等的染料。許多此類染料和衍生物可從供應商獲得，如Molecular Probes(Eugene，OR)、Amersham Pharmacia(Bucks，英國)和Glen Research(Sterling，VT)。
間接標記的方法包括如用生物素或二硝基酚進行標記，二者為自身并不發(fā)出熒光的有機分子，但可與抗體結(jié)合物反應，所述抗體結(jié)合物含與抗體結(jié)合的熒光基團。因此標記、半抗原或抗原表位如生物素和二硝基酚允許通過所謂的間接方法進行熒光檢測，因為在每個點的熒光由抗體結(jié)合物提供，所述抗體結(jié)合物與微陣列通過非熒光標記相互作用。某些抗體結(jié)合物含酶類，如辣根過氧化物酶，該酶催化短壽Tyramide自由基與吸附在微陣列表面的蛋白質(zhì)的酪氨酸部分結(jié)合。通過將Tyramide與多種熒光部分連接，采用涉及生物素和二硝基酚標記、抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物和Tyramide-Cy3和Tyramide-Cy5衍生物的間接方法來檢測雜交產(chǎn)物是可能的。但本領域的任何技術人員理解任何數(shù)量的直接和間接標記方案可用于檢測，包括熒光法和非熒光法。一個備選的熒光法應用由Genisphere(Oakland，NJ)所描述的樹枝狀分子(Dendrimer)技術。一個備選的非熒光法應用珠子和微粒，如Genicon(San Diego，CA)描述的共振光散射(RLS)微粒。
與標記的合成寡核苷酸混合物雜交之后，在步驟20微陣列用已知的方法進行掃描或讀取，以檢測基因型信息。檢測例如可應用帶有激光激發(fā)和光電倍增管的共聚焦掃描設備進行(如由GSI Lumonics(Bellerica，MA)提供的ScanArray 3000)。另外，許多不同類型的共聚焦和非共聚焦熒光檢測系統(tǒng)可用于實施該方法，例如那些由Axon Instruments(Foster City，CA)、Genetic MicroSystems(Santa Clara，CA)、Molecular Dynamics(Sunnyvale，CA)和Virtek(Woburn，MA)提供的檢測系統(tǒng)。其它的檢測系統(tǒng)包括應用氣體、二級管和固態(tài)激光以及那些應用許多其它類型發(fā)光源(如氙和鹵素燈泡)的掃描系統(tǒng)。除光電倍增管外，檢測器還可包括應用帶有充電設備(CCD)和互補金屬氧化硅(CMOS)芯片的照相機。
不論是直接標記的或間接標記的寡核苷酸用于雜交，從特定的微陣列點檢測出的信號強度是與在該特定點處混合物內(nèi)的寡核苷酸與基因組片段雜交的程度直接成比例的。寡核苷酸混合物可包含與野生型或突變等位基因互補的核苷酸，因此野生型或突變基因組片段得以檢測，這取決于雜交混合物制備的方式。來自相同的微陣列點的信號，例如來自圖2中標記為1A的三個點的信號，經(jīng)過平均以提高精確度，并因此提供小的變異系數(shù)(CVs)。
許多方法可用于獲取并評估基因型信息。如以上所描述，絕對熒光信號可用于判定特定擴增子的等位基因組成。另外，也可應用帶有兩種或多種顏色的寡核苷酸混合物，其中特定的顏色代表特定的等位基因，例如野生型為綠色熒光且突變等位基因為紅色熒光。許多其它的方案如熒光染色也可與直接標記聯(lián)合應用以評定每個點的DNA含量。來自MolecularProbes(Eugene，OR)的SYBR Green染料允許在異硫氰酸熒光素(FITC)染料的波長范圍內(nèi)檢測染色的DNA。
本發(fā)明的特性和優(yōu)點將通過以下的(但不限于)實施例進一步闡明，所述實施例從新生兒血液樣本篩選鐮形細胞性貧血和半乳糖血癥的各種等位基因。
實施例分離來自72個不同新生兒的血液樣本，并用下表1中命名的基因特異的引物ARDC100-109進行擴增。這5對引物對含有來自Glen Research(Sterling，VT)的與C6氨基修飾對應的活性氨基，該基團允許擴增子特異連接到微陣列的基片。以下表1中每一寡核苷酸序列的“N”位置代表C6氨基修飾。這些引物對包含5種不連續(xù)的基因組片段，與共3個人類基因?qū)?珠蛋白、CFTR和GALT。人類與β-珠蛋白、CFTR和GALT基因相關的疾病分別是鐮形細胞性貧血、囊性纖維化和半乳糖血癥?；蚪M片段包含存在于3個基因中的5個疾病位點，且每個擴增子的大概長度是60個堿基對。每個PCR反應的總體積為50μl。
擴增基因組片段然后純化以移去污染物。根據(jù)廠商的說明書應用TeleChem(Sunnyvale，CA)的384孔PCR純化試劑盒。純化產(chǎn)物重懸在10μl無菌蒸餾水中，且10μl中的2μl與2μl的2X微點樣溶液混合(該溶液由TeleChem(Sunnyvale，CA)提供)，以提供總共4μl的樣本用于印刷。在樣本平板上的每一PCR擴增子的濃度為100μg/μl。72個樣本的擴增子每種取4μl放置在384孔板的臨近孔內(nèi)，外加總共24個只含印刷緩沖液或合成寡核苷酸的對照樣本。實驗中24個對照樣本提供陽性和陰性的雜交對照。共96個樣本(72個新生兒擴增子和24個對照)置于384孔微板，以使前4排的所有孔內(nèi)(A1-24到D1-24)都含有4μl的樣本。應用來自ComingCostar(Corning，NY)的聚丙烯384孔微板，盡管作為備選來自其它供應商(如Whatman Polyfiltronics(Rockland，MA))的平板也可應用。盡管有多種不同類型的微板足以滿足裝載樣本的需求，但與含如聚苯乙烯的微板

表6為了計算該桶的輸入?yún)?shù)，對于包含1，3，5和8次讀的服務，在不同的流量速度下運行該模型。在圖10中示出了95％的反應時間和X＝占用率/(1-占用率)的函數(shù)關系圖。
注意，一次讀的線性擬合不是很好。原因如下在圖中，占用率是SDP的cpu占用率。即，假定延遲從排隊等候SDP上的cpu時間開始。但是，對于一次讀服務來說，在SCP(C)上一個電話花費cpu時間4.618ms，在SDP上花費3.19ms，這意味著雙箱且每箱2個cpu的SCP(C)上的占用率將大于雙箱且每箱2個cpu的SDP上的占用率。因此，對于大流量來說，最顯著的延遲來自在SCP(C)上排隊等待cpu時間，而不是來自在SDP上排隊等待cpu時間。這種影響使得尋找反應時間的最合適公式的程序預測結(jié)果有所偏離。使用圖9中顯示的數(shù)據(jù)(除了來自寫過程的數(shù)據(jù))得到的該公式的Mathematica生成表格和預測結(jié)果如下(Mathematica是由Wolfram研究有限公司擁有的軟件程序注冊商標)TR95的公式為TR95＝69.733+1.85971*n次讀懲罰標志token大小的公式為token＝0.327565+23.8191*n次讀得到表格讀取數(shù) T_95(測得) T_95(預測)標志(測得)標志(預測)1 98.761771.5927 23.9156 24.14672 ...73.4524 ... 47.96583 44.084175.3121 71.92671.78494 ...77.1718 ... 95.6045 67.683679.0315 119.491 119.4236 ...80.8912 ... 143.2427 ...82.7509 ... 167.0618 100.07184.6106 191.065 190.88
雜交步驟后，微陣列在微陣列設備的臺板上室溫干燥過夜，然后進行處理，在微陣列雜交之前移去未結(jié)合的DNA材料、使未反應的醛基失活以及使印刷的PCR片段變性。處理步驟如下室溫條件下在0.2％SDS中浸泡兩次，每次2分鐘，劇烈振搖，室溫下在蒸餾水中浸泡兩次，每次2分鐘，劇烈振搖，將基片在蒸餾水中于100℃處理2分鐘使DNA變性，使基片室溫風干5分鐘，在硼氫化鈉溶液中(制備時將1.2g NaBH4溶解在330ml磷酸鹽緩沖液(PBS))處理基片5分鐘，加入120ml 100％乙醇以減少泡沫生成，室溫將基片在0.2％SDS中漂洗3次，每次1分鐘，室溫將基片在蒸餾水中漂洗1分鐘，將玻片浸沒在100℃蒸餾水中5秒鐘，將玻片風干并避光室溫儲存。應當指出，由于硼氫化鈉是高活性的還原劑，應在每次應用前新鮮配制以保證表面的未反應醛基以高效率進行還原。
應用合成的寡核苷酸制備雜交混合物，所述寡核苷酸由生產(chǎn)商EOSBiotechnology(South San Francisco，CA)提供。每一合成的寡核苷酸與存在于特定擴增子的等位基因互補。用于新生兒樣本的等位基因與目的疾病位點對應。為說明直接的檢測，應用含Cy3或Cy5標記的15-mers混合物(在表2中表示為混合物1)。表2混合物1中的Cy3和Cy5標記分別用在各自核苷酸序列中的數(shù)字″3″和″5″表示。為說明間接的檢測，應用含生物素或二硝基酚標記的15-mers混合物(在表2中表示為混合物2)。
表2混合物2中的生物素和二硝基酚標記分別通過在各自核苷酸序列中的<p>表5試驗香煙吸完之后回收醋酸生育酚

表5概括地給出了吸煙過程中ToAc的分布和吸完后的余量。表5第二欄為開始吸時的ToAc的量(mg/支吸煙)。這些是根據(jù)每支香煙的特定量和每種情況下加到煙草中的ToAc量計算獲得的。
表5還顯示了在HSR、NSR、過濾嘴和煙蒂中回收的ToAc量(mg/支香煙)，以及由此獲得的總量和每種情況下回收的量(％)(以吸之前存在的量為基礎)。
實施例3A、證實對微循環(huán)影響的常規(guī)研究設計材料和方法1.試驗對象通過實施例研究以下4個試驗對象。所有試驗對象以蒙蔽形式用于研究，即受試者和研究主管都不能確定所吸的香煙。香煙為具有按照實施例1的以下設計的全風味部分的那些1A、1B、1C和1D2.受試者均勻隨機抽樣，8個受試者(N＝8)；男性、高加索人、適度吸煙者；沒有發(fā)現(xiàn)牙齒和醫(yī)學病態(tài)(除弱的慢性支氣管炎之外)；牙列經(jīng)清洗；按照Good Clinical Practice(GCP)-Standard(適度藥理臨床試驗的指導方針)定義的包含標準和排除標準。
年齡38-43歲(平均40.5歲)體重73-78kg(平均75.3kg)身高172-176cm(平均174.1cm)3.適宜作為受試者的接收標準的定義男性高加索人，38-43歲，能走動的人；沒有藥物治療；公平的

*所有顯示的序列從左到右為5′-3′。3代表Cy3；5代表Cy5；B代表生物素；D代表二硝基酚。
雜交和洗滌步驟之后，檢測微陣列用以獲得基因型信息。對于涉及混合物1的直接標記實驗，通過在沖洗步驟后立即掃描微陣列的熒光發(fā)射進行檢測步驟。檢測應用來自GSI Lumonics(Bellerica，MA)的ScanArray3000共聚焦掃描裝置，該裝置設置為100％用于光電倍增管(PMT)且80％用于激光設置。掃描器的雙色能力用于在Cy3和Cy5兩種途徑檢測熒光微陣列信號，與混合物1寡核苷酸的雜交對應。結(jié)果在圖3A和3B顯示，其中圖3A對應于來自Cy3的熒光檢測，且圖3B對應于來自Cy5的熒光檢測。數(shù)據(jù)以常規(guī)的的彩虹信號碼表示，紅色為強度最高且黑色為強度最低；距離條相當于1.0mm。圖4A顯示的是圖3A中部分微陣列的放大圖。微陣列信號以三聯(lián)形式出現(xiàn)，是因為每個擴增的新生兒病人樣本或?qū)φ諛颖驹谙噜彽奈㈥嚵胁课挥∷⒘巳?。微陣列中樣本的位置用沿y軸(垂直方向)的字母和沿x軸(水平方向)的數(shù)字表示。應用來自GSI Lumonics(Bellerica，MA)的ScanArray軟件進行熒光微陣列信號的定量。與微陣列信號對應的數(shù)值在圖5中進行標繪。數(shù)據(jù)揭示出在所有的受檢測樣本中，從鐮形細胞和半乳糖血癥位點易于區(qū)分野生型、雜合子和純合子。所有樣本三個數(shù)值的變異系數(shù)(CVs)均＜10％。
來自三個個體的三個樣本的基因組片段，其β-珠蛋白位點232不同，分別放置在微陣列的位置b1-3；b4-6和b7-9。三個個體分別命名為基因型E/E、A/E和A/A。E/E新生兒由于突變等位基因是β-珠蛋白序列232位的從G到A的單核苷酸突變，因此為純合子，A/E新生兒在232位存在一個突變等位基因和一個正常等位基因，因此為雜合子，且A/A新生兒在232位存在兩個正常等位基因(即兩個等位基因均在β-珠蛋白的232位含有一個G殘基)。雜交混合物中相應的合成寡核苷酸(ARDC113，表2)與E/E新生兒的兩個等位基因均完全互補，與A/E新生兒的一個等位基因完全互補且與A/E新生兒的另一等位基因存在一個核苷酸的不匹配，并與A/A新生兒的兩個等位基因均含有一個不匹配核苷酸。與預期相符，微陣列信號在b1-3位增強；b4-6和b7-9位顯示為減弱的信號強度，與新生兒樣本在微陣列每一位置的基因型一致。其余樣本的結(jié)果為類似的結(jié)果且在圖5中以表格顯示。
在第二個實驗中，應用混合物2寡核苷酸闡明間接標記法。除了染色應用MICROMAX染色試劑盒(根據(jù)制造商NEN Life Sciences(Boston，MA)的指導)外，微陣列的雜交和洗滌均與用混合物1的直接標記實驗完全一致。染色試劑盒應用的抗體結(jié)合物分別識別生物素和二硝基酚表位，并應用辣根過氧化物酶(HRP)催化tyramide Cy3和tyramide Cy5沉積到微陣列表面。與直接標記法一樣，用GSI Lumonics(Bellerica，MA)的ScanArray 3000進行Cy3和Cy5波道的檢測。與直接標記途徑的結(jié)果類似，通過間接標記進行的方法顯示了微陣列信號，可從中獲取精確的基因型信息，如在6A、6B和4B中所闡述的。
從前述中可明顯看出，本方法所提供的基因分型的新方法比目前的方法有顯著的改良。該方法首次使得可在一次檢測中對多個病人和多個位點進行基因分型。本方法的關鍵特征是每個微陣列點代表來自單一病人的單一遺傳片段或位點，因此使得擴增序列和雜交混合物的合成寡核苷酸之間具有高度的特異性。在單一微陣列步驟中檢測成千上萬個病人的多種疾病的能力提供了可立即應用的用于新生兒篩選的方法，例如，該方法代表了顯著的省時和低費用。該方法使得新生兒篩選的費用低于10美元($10 U.S.)/每個疾病位點，并因此可立即適用于大范圍的商業(yè)應用。早期篩選先天性遺傳疾病的能力將對人類健康產(chǎn)生直接的和有益的影響。
盡管本發(fā)明已就特定的實施例進行了描述，該描述僅是本發(fā)明應用中的一個實施例，且不應將此作為限制。所公開實施例特征的各種修改和組合均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，如以下權利要求所定義的。
權利要求
1.同時對多個樣本進行基因分型的方法，該方法包括應用多個聚合酶鏈反應引物從多個樣本中擴增多個基因組片段，每一基因組片段包含不同的基因座；來自擴增的基因組片段在表面形成微陣列，其中表面上的每一位點含有源于單一樣本的擴增材料，并基本上由單一的基因組片段組成；將微陣列與標記的合成寡核苷酸混合物雜交，其中混合物包含與基因組片段互補的寡核苷酸；以及通過檢測來自雜交的微陣列的信號同時獲得多個樣本在多個基因座處的基因型信息，以由此對多個樣本進行基因分型。
2.權利要求1的方法，其中多個樣本包含至少10個不同的樣本。
3.權利要求2的方法，其中多個樣本包含至少5,000個不同的樣本。
4.權利要求1的方法，其中基因組片段包含人類疾病基因座。
5.權利要求4的方法，其中樣本為新生兒血液樣本。
6.權利要求5的方法，其中基因座包含與選自β-珠蛋白、CFTR和GALT的人類基因相關的基因座。
7.權利要求1的方法，其中表面上微陣列的密度為每平方厘米至少1000個點。
8.權利要求1的方法，其中標記的合成寡核苷酸混合物包含十種不同的寡核苷酸序列。
9.權利要求1的方法，其中標記的合成寡核苷酸的長度在約10至約30個核苷酸之間。
10.權利要求1的方法，其中每一基因組片段包含約40至約1000個堿基對。
11.權利要求1的方法，其中雜交在包含鹽和去污劑的水溶液中進行。
12.權利要求1的方法，其中雜交在約低于標記的合成寡核苷酸解鏈溫度10℃的溫度下進行。
13.權利要求1的方法，其中標記的合成寡核苷酸包含熒光標記。
14.權利要求1的方法，其中標記的合成寡核苷酸包含非熒光標記。
15.權利要求1的方法，其中基因分型信息在特定基因座處將樣本區(qū)別于純合子并將樣本區(qū)別于雜合子。
16.權利要求13的方法，其中信號由標記的合成寡核苷酸的熒光發(fā)射得以產(chǎn)生。
17.權利要求13的方法，其中信號由多于一個光波長處的熒光發(fā)射得以產(chǎn)生。
18.權利要求14的方法，其中信號在抗體染色后通過熒光發(fā)射得以產(chǎn)生。
19.權利要求14的方法，其中信號在抗體染色后通過多于一個光波長處的熒光發(fā)射得以產(chǎn)生。
20.權利要求13的方法，其中熒光標記包含樹枝狀分子標記。
21.權利要求1的方法，其中表面包括玻璃。
22.權利要求1的方法，其中擴增的基因組片段包含氨基接頭。
23.權利要求22的方法，其中表面包含活性醛基。
24.權利要求1的方法，其中微陣列由機械微點樣形成。
25.同時對多個樣本進行基因分型的方法，該方法包括應用聚合酶鏈反應引物從多個樣本中擴增包含基因座的基因組片段；來自擴增的基因組片段在表面形成微陣列，其中表面上的每一位點含有源于單一樣本的擴增材料；將微陣列與標記的合成寡核苷酸混合物雜交，其中混合物包含與基因組片段互補的寡核苷酸；以及通過檢測來自雜交的微陣列的信號同時獲得多個樣本的基因型信息，以由此對多個樣本進行基因分型。
全文摘要
提供了在一次檢測中對多個樣本在多個基因座進行基因分型的方法。形成代表分立位點的基因組片段的微陣列，并與互補于基因組片段的合成寡核苷酸混合物雜交。通過讀取微陣列信號獲得基因型信息。本方法可用于鑒定來自多種生物源的樣本，并可用于多種用途。
文檔編號A61B10/00GK1636137SQ01813972
公開日2005年7月6日 申請日期2001年7月3日 優(yōu)先權日2000年7月10日
發(fā)明者M·A·斯凱納 申請人:泰利凱姆國際公司