專(zhuān)利名稱(chēng)：用于聯(lián)合治療的crf的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體的藥物組合物；并且涉及治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，本發(fā)明的CRF受體配體是所述CRF受體的激動(dòng)劑或拮抗劑。除了作為CRF受體的本發(fā)明的藥物目標(biāo)之外，本發(fā)明還涉及針對(duì)CRF1和CRF2受體mRNA的藥用制劑。
背景技術(shù)：
大量研究業(yè)已證實(shí)了促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(CRF)在控制腦垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)，以及在調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)激的行為、自主神經(jīng)和免疫應(yīng)答方面的重要性。因此，這種肽被認(rèn)為參與了影響疾病的病理生理學(xué)。目前，業(yè)已鑒定了兩種能介導(dǎo)CRF的作用的兩個(gè)7次跨膜受體CRF1和CRF2。這兩種受體在大腦中是普遍表達(dá)的，盡管在這兩種受體亞型的高度表達(dá)部位之間幾乎不存在明顯的重疊。業(yè)已報(bào)導(dǎo)了CRF過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出致焦慮(產(chǎn)生焦慮)行為的增加(Stenzel-Poore等，促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的超量表達(dá)致焦慮行為的遺傳學(xué)模型。J.Neuroscience 14，2579-2584，1995)。特別重要的問(wèn)題是，上述致焦慮反應(yīng)是否是由CRF對(duì)CRF1受體、CRF2受體或?qū)@兩者的作用而介導(dǎo)的。
促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(CRF)拮抗劑披露于被以全文形式收作本文參考的以下美國(guó)專(zhuān)利中US4605642，5874227，5962479，5063245，5861398和6083948。若干公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)也披露了促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子拮抗化合物，其中包括杜邦Merck公司的PCT申請(qǐng)US94/11050，輝瑞公司的WO95/33750，輝瑞公司的WO95/34563，輝瑞公司的WO95/33727和US5424311。在US5063245和Pham.Rev.，43425-473(1991)中，討論了被認(rèn)為可以用CRF拮抗劑治療的疾病。
業(yè)已推測(cè)CRF在以下疾病的病因?qū)W和病理生理學(xué)方面起作用阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、神經(jīng)性厭食癥、漸進(jìn)性核上麻痹和肌萎縮性側(cè)索硬化，因?yàn)樗鼈兣c中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CRF神經(jīng)元的功能障礙相關(guān)[有關(guān)綜述參見(jiàn)E.B.De Souza，Hosp.Practice2359，1988，G.N.Smagin，L.A.Howell，D.H.Ryan，E.B.De Souza和R.B.S.Harris Neuroreport 9，1601-1601，1988；和J.Pharmacol.Exp.Therap.，293，700-806，2000]。被以全文形式收作本文參考的US6051578披露了可用于治療和預(yù)防以下疾病的(CRF)受體拮抗劑頭部創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、缺血性神經(jīng)元損傷(例如，大腦缺血，如大腦海馬缺血)、興奮性毒性神經(jīng)元損傷、癲癇、中風(fēng)、應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫功能障礙、恐怖癥、肌肉痙攣、帕金森氏病、亨廷頓氏病、尿失禁、阿爾茨海默型老年癡呆、多梗塞性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化、化學(xué)制品依賴性和成癮(例如，對(duì)酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮卓類(lèi)或其他藥物的依賴性)、和低血糖癥。
被以全文形式收作本文參考的美國(guó)專(zhuān)利US6001807披露了可用于治療和預(yù)防嘔吐的(CRF)受體拮抗劑。通過(guò)披露于以下文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CRF-拮抗劑的抗嘔吐活性Ueno等，LifeSciences 41513-518，1987；和Rudd等，British Journal ofPharmacology119931-936，1996。
另外，有多份文件披露了CRF1受體拮抗劑，例如Chen等，J.Med.Chem.394358-4360，1996；Whitten等，J.Med.Chem.394354-4357，1996；Chen等，J.Med.Chem.40(11)1749-1754，1997；Lundkvist等，Eur.J.Pharmacoloy309，198-200，1996；和Mansbach等，Eur.J.Pharmaco loy323，21-26，1997，以上文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考。更具體地講，Gilligan等(BioOrganic MedicinalChem.8，181-189，2000，被以全文形式收作本文參考)披露了CRF1受體配體DPC904。
另外，在以下文獻(xiàn)中披露了諸如蛙皮降壓肽、尿皮質(zhì)素(urocortin)和其他CRF2肽的CRF2受體配體Ho等，Mol.BrainRes.6，11，1998；J.Spiess等，Trends Endocrinology andMetabolism9，140-145，1998 CRF受體的分子特性；和D.P.Behan等，Mol.Psychiatryl，265-277，1996，以上文獻(xiàn)被以全文形式收作本文參考。
盡管業(yè)已在動(dòng)物上證實(shí)通過(guò)選擇性拮抗劑阻斷CRF1受體，能夠產(chǎn)生抗焦慮(緩解焦慮)和抗抑郁作用，對(duì)CRF2受體的功能進(jìn)行的研究還不夠。原位雜交和受體放射自顯影實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述受體主要位于大腦的邊緣和下丘腦部位，這表明它在介導(dǎo)CRF的致焦慮和厭食作用方面起作用。最近，業(yè)已證實(shí)了CRF2選擇性拮抗劑(抗-蛙皮降壓肽-30)(Gulyas J.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，10575-579)。業(yè)已鑒定了一種具有CRF1和CRF2的雙重活性的肽Astressin(Ruhmann，A.，Bonk，I.，Lin，C.R.Rosenfeld，M.G.&Spiess，J.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，15264-15269)。在缺乏這種受體的特異性激動(dòng)劑或拮抗劑的條件下，對(duì)CRF2受體表達(dá)的反義抑制可以提供有關(guān)該受體在正常生理學(xué)中的作用的證據(jù)。
反義核苷酸是設(shè)計(jì)出來(lái)的與感興趣的mRNA分子的互補(bǔ)的短的寡核苷酸(長(zhǎng)度通常為大約15-大約25個(gè)核苷酸)。反義寡核苷酸通過(guò)沃森-克里克堿基配對(duì)與其mRNA靶子的雜交，啟動(dòng)了一連串的事件，這些事件止于所述目標(biāo)mRNA分子的定位于寡核苷酸的降解。這種mRNA降解的直接后果是，抑制了所編碼的蛋白的合成。在存在明顯降低了的水平的所述靶蛋白的情況下進(jìn)行研究可以揭示其功能。在缺乏小分子配體(例如CRF2受體的配體)的情況下，反義寡核苷酸可能是用于蛋白功能研究的非常有用的工具。另外，可以將它們用于以小分子配體通常不可能實(shí)現(xiàn)的方式區(qū)分蛋白家族的密切相關(guān)的成員(如CRF1和CRF2)。
有效的反義序列的設(shè)計(jì)和選擇并非是輕而易舉的工作。反義寡核苷酸有很大的不同，并且無(wú)法預(yù)測(cè)其活性，因?yàn)槠鋗RNA靶具有明顯的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)會(huì)使得mRNA分子的大部分無(wú)法進(jìn)行雜交。僅有20-35％的反義序列具有明顯的抑制活性(50％或更高)。使用我們開(kāi)發(fā)的分子技術(shù)鑒定了CRF2受體mRNA上的多個(gè)可及區(qū)(Ho等，通過(guò)用寡核苷酸文庫(kù)對(duì)RNA可及位點(diǎn)進(jìn)行作圖合理選擇了人多種藥物抗性-1mRNA的高效反義寡核苷酸。Nucl.Acids Res.24，1901-1907，1996；Ho等，通過(guò)寡核苷酸文庫(kù)對(duì)反義實(shí)驗(yàn)的RNA可及位點(diǎn)進(jìn)行作圖。Nature Biotech.16，59-63，1998)。針對(duì)所述可及位點(diǎn)的反義寡核苷酸，能夠在體內(nèi)對(duì)125I-蛙皮降壓肽與CRF2受體的結(jié)合產(chǎn)生至少50％的抑制作用。
業(yè)已報(bào)導(dǎo)了研究CRF2受體功能的兩個(gè)反義研究結(jié)果。這兩項(xiàng)研究都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)CRF2受體參與介導(dǎo)CRF2的致焦慮作用的證據(jù)。不過(guò)，在一項(xiàng)研究中(Heinrichs等，促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子CRF1而不是CRF2受體能介導(dǎo)致焦慮樣行為。Reg.Peptides71，15-21，1997)，CRF2受體僅僅減少了15-20％，而所使用的寡核苷酸產(chǎn)生了毒性副作用(顯著的體重下降)，這一結(jié)果使得混淆了學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在第二項(xiàng)報(bào)導(dǎo)中提供了很少的細(xì)節(jié)(Montkowski等，Biol.Psychiatry 39，566，1996；和Liebsch，G.Landgraf.R.，Engelmann，M.，Lorscher，P.&Holsboer，F(xiàn).1999，J.Psychiatric Res.33，153-163)。
不過(guò)，在披露于以其全文形式收作本文參考的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US00/0819和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9/481981中披露的使用CRF2反義寡核苷酸進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制CRF2受體表達(dá)能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗焦慮作用。
另外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)CRF2受體反義寡核苷酸與CRF1受體配體同時(shí)給藥時(shí)，可以大大加強(qiáng)抗焦慮作用。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF1受體配體是CRF1受體的激動(dòng)劑。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF1受體配體是CRF1受體的拮抗劑。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者服用治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體配體是CRF2受體的激動(dòng)劑。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體配體是CRF2受體的拮抗劑。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被選自下列一組的修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯和聚酰胺核酸，和具有以下結(jié)構(gòu)式的閉鎖(locked)核酸； 或 其中，B是嘌呤或嘧啶堿基。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代，其中，所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為大約15-大約25個(gè)核苷酸。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，所述反義寡核苷酸的60-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是包含以下序列的反義寡核苷酸(a)TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG；(b)GGT GGG CGA TGT GGG AAT G；(c)GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG；和(d)TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述疾病是精神疾病。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的精神疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述精神疾病選自下列一組焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥、神經(jīng)性厭食、和抑郁癥。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述疾病選自下列一組頭部創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、缺血性神經(jīng)元損傷(例如，大腦缺血，如大腦海馬缺血)、興奮性毒性神經(jīng)損傷、癲癇、中風(fēng)、應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫功能障礙、驚恐性障礙、肌肉痙攣、帕金森氏病、亨廷頓氏病、尿失禁、阿爾茨海默型老年癡呆、多梗塞性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化、化學(xué)制品依賴性和成癮(例如，對(duì)酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮卓類(lèi)或其他藥物的依賴性)、和低血糖癥。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是同時(shí)給藥的。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是序貫給藥的。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括讓有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體與一種含有CRF1受體和CRF2受體的組合物接觸。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括讓有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸與含有CRF1受體的組合物接觸，其中，CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療與CRF2受體活性相關(guān)的疾病，包括讓有效量的CRF2受體配體與一種含有CRF2受體的組合物接觸。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該組合物含有CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，以及藥用載體。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的藥用試劑盒，所述試劑盒包括多個(gè)獨(dú)立的容器，其中，至少有一個(gè)所述容器裝有CRF1受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且至少有另一個(gè)所述容器裝有CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且所述容器選擇性地裝有一種藥用載體。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的藥用試劑盒，所述試劑盒包括多個(gè)獨(dú)立的容器，其中，至少有一個(gè)所述容器裝有CRF1受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且至少有另一個(gè)所述容器裝有CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且所述容器選擇性地裝有一種藥用載體。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療精神疾病的具有CRF1受體配體活性和CRF2受體配體活性的化合物。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了針對(duì)CRF2受體的mRNA的反義寡核苷酸，它能顯著減弱CRF2受體在嚙齒類(lèi)動(dòng)物腦中的表達(dá)。用上述寡核苷酸抑制CRF2受體功能，能在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生明顯的抗焦慮(緩解焦慮)的作用。上述資料首次提供了CRF2受體在介導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子的致焦慮(產(chǎn)生焦慮)作用方面起著重要作用的功能性證據(jù)。另外，以上資料證實(shí)了包括小分子在內(nèi)的CRF2受體拮抗劑用于有效治療包括焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥和抑郁癥在內(nèi)的多種精神疾病的潛力。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療包括，但不限于患者的焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥和抑郁癥的精神疾病的方法，包括給所述需要治療的患者服用治療有效量的藥用組合物，該組合物包括由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種篩選化合物以便確定用于治療包括，但不限于焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥和抑郁癥的精神疾病的活性的方法。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
附圖簡(jiǎn)述業(yè)已出于解釋和說(shuō)明目的選擇了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，不過(guò)，這些實(shí)施方案并不是要以任何方式限制本發(fā)明的范圍。這些實(shí)施方案示于下面所介紹的附圖中。


圖1a反義序列選擇的示意圖。
圖1b嵌合的、半隨機(jī)的寡核苷酸文庫(kù)的性質(zhì)。
圖2a在反義研究中最常使用的核苷酸類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)；硫代磷酸酯的改變會(huì)產(chǎn)生CNS毒性作用。
圖2b修飾過(guò)的寡核苷酸類(lèi)似物結(jié)構(gòu)，它保留了藥物效力，但消除了在摻入寡核苷酸上用于CNS用途時(shí)的毒性。
圖2c嵌合寡核苷酸的若干種可能的構(gòu)型之一。
圖3a反義寡核苷酸對(duì)大鼠凍結(jié)行為的影響。
圖3b在所述凍結(jié)測(cè)定中，反義治療的大鼠的對(duì)側(cè)間隔中的125I-蛙皮降壓肽結(jié)合的抑制作用。
圖4a反義治療對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物在抬高的正迷宮中的行為的影響。
圖4b在所述較高的正迷宮測(cè)定中反義治療的大鼠側(cè)間隔中對(duì)125I-蛙皮降壓肽結(jié)合的抑制作用。
圖5抗蛙皮降壓肽-30對(duì)大鼠凍結(jié)行為的影響。
圖6CRF2受體反義寡核苷酸與CRF1拮抗劑的結(jié)合對(duì)大鼠凍結(jié)行為的影響。
發(fā)明詳述并不是所有的反義寡核苷酸都能具有強(qiáng)效抑制活性，針對(duì)CRF2受體mRNA的寡核苷酸也不例外?；钚苑戳x序列的鑒定是一項(xiàng)更重要的參數(shù)，它能決定反義實(shí)驗(yàn)的成功。影響反義序列效力的因素是復(fù)雜的，并且對(duì)它的了解也不充分；因此，只有20-35％的測(cè)試過(guò)的反義寡核苷酸具有對(duì)目標(biāo)蛋白合成產(chǎn)生50％抑制作用的足夠活性。
活性反義序列的選擇在很大程度上是憑經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行的，并且相當(dāng)花費(fèi)時(shí)間。因此，設(shè)計(jì)了一種用于定位mRNA分子上的最有可能與反義寡核苷酸雜交的位點(diǎn)的方法(Ho等，1996；Ho等，1998)。這一目的是通過(guò)用化學(xué)合成的、半隨機(jī)的寡核苷酸文庫(kù)(圖1b)探測(cè)RNA轉(zhuǎn)錄物而實(shí)現(xiàn)的(圖1a)。在混合在一起之后，mRNA上的可及區(qū)能夠與存在于所述文庫(kù)中的互補(bǔ)序列雜交。然后用核糖核酸酶H(RNA酶H)鑒定所述區(qū)域，所述核糖核酸酶只能催化雜合的RNA-DNA雙鏈體中的RNA鏈的磷酸二酯主鏈水解性剪切。對(duì)所產(chǎn)生的RNA片段進(jìn)行測(cè)序，可以鑒定特定mRNA序列上的能夠用作導(dǎo)向于反義寡核苷酸的位點(diǎn)的區(qū)域。將該RNA作圖方法應(yīng)用于含有CRF2受體mRNA的完整編碼區(qū)的RNA轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致鑒定了可以與反義寡核苷酸雜交的多個(gè)RNA位點(diǎn)(表1)。
表1可及位點(diǎn)位置A 315-338B 417-455C 608-625D 677-731E 763-813F 859-882G 911-941H 1018-1031I 1161-1185J 1238-1258K 1385-1417表1CRF2受體mRNA上的寡核苷酸雜交可及位點(diǎn)。序列信息參見(jiàn)RNU16253.GB＿RO(GenBank序列，編號(hào)U16253)。
可以通過(guò)將反義寡核苷酸的5’末端導(dǎo)向于由表1中所提供的數(shù)據(jù)確定的可及位點(diǎn)，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為15-25個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸。例如，在下面所披露的研究中所使用的反義寡核苷酸，是導(dǎo)向于可及位點(diǎn)E的758-777號(hào)位置的20個(gè)核苷酸的序列(TGA CGC AGC GGC ACC AGACC)。
針對(duì)上述若干位點(diǎn)的反義序列能在基于細(xì)胞的測(cè)定中抑制至少50％的CRF2受體合成。上述測(cè)定是通過(guò)使用125I-蛙皮降壓肽進(jìn)行的CRF2放射性配體結(jié)合測(cè)定完成的。所述反義抑制是序列特異性的，因?yàn)榉戳x寡核苷酸的4個(gè)堿基的錯(cuò)配，只能導(dǎo)致125I-蛙皮降壓肽結(jié)合的很少的降低。另外，所述序列還能在體內(nèi)抑制CRF2受體合成。
在CNS體內(nèi)反義實(shí)驗(yàn)中最常使用的寡核苷酸的兩種化學(xué)形式是2’-脫氧核糖核苷磷酸二酯寡核苷酸和2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯寡核苷酸(圖2a)。盡管與基因中的雙鏈DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，單鏈的磷酸二酯寡核苷酸易受核酸外切和內(nèi)切降解，其血清半衰期為20分鐘。即使是在具有較低核酸酶活性水平的大腦的‘特殊’環(huán)境中，磷酸二酯寡核苷酸也能被降解，不過(guò)被降解的更緩慢一些。其中的一個(gè)非橋連磷酸氧分子被硫所取代的硫代磷酸酯寡核苷酸對(duì)降解酶的抗性更強(qiáng)。在血清和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，硫代磷酸酯寡核苷酸的半衰期超過(guò)12小時(shí)，并且對(duì)從大鼠腦中提取的硫代磷酸酯進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)，這種寡核苷酸至少在24小時(shí)之內(nèi)在化學(xué)上都是完整的。不過(guò)，在大腦中使用這種寡核苷酸，能產(chǎn)生化學(xué)相關(guān)的，但不是序列特異性的毒性作用。最近業(yè)已報(bào)導(dǎo)了發(fā)熱反應(yīng)、炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)、體重減輕和各種臨床癥狀。在我們的實(shí)驗(yàn)中，含有硫代磷酸酯的化合物的CRF2反義序列主要對(duì)CRF2受體產(chǎn)生抑制作用，但能導(dǎo)致顯著的體重減輕(類(lèi)似于Heinrichs的報(bào)導(dǎo))，并且在接受治療的動(dòng)物身上產(chǎn)生了多種病理生理學(xué)癥狀。用很多不同的序列、反義序列和對(duì)照序列都觀察到了上述作用，這樣就排除了它們是靶相關(guān)的作用的可能性。
降低所述寡核苷酸中硫代磷酸酯的總體含量的方法在保持寡核苷酸的效力，同時(shí)又避免所述毒性作用方面是最有效的。其中最多達(dá)60％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核糖核苷磷酸二酯殘基所取代的嵌合寡核苷酸消除了體重減輕和所有其他毒性癥狀(參見(jiàn)圖2b)。其余的40％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基存在于一個(gè)連續(xù)的片段上，以便有利于RNA酶H對(duì)靶mRNA的剪切(圖2a)。摻入諸如5-丙炔基-2’-脫氧胞苷、5-丙炔基-2’-脫氧尿苷和5-甲基-2’-脫氧胞苷(但具有硫代磷酸酯鍵，圖2b)的其他化學(xué)類(lèi)似物，也可明顯降低所述毒性作用。除了具有較弱的毒性之外，所述修飾過(guò)的核苷酸殘基對(duì)系統(tǒng)核酸酶降解的抗性，比2’-脫氧核糖核苷磷酸二酯殘基的抗性更強(qiáng)。
由小的反義抑制作用所導(dǎo)致的功能改變的缺乏，通常會(huì)導(dǎo)致無(wú)法解釋的結(jié)果。這是由于實(shí)驗(yàn)是否產(chǎn)生了真實(shí)的陰性結(jié)果或者反義抑制是否不足以揭示功能性改變的不確定性。除了反義序列之外，反義抑制作用的強(qiáng)弱還要受反義治療時(shí)間，及其與靶蛋白的半衰期的關(guān)系的影響。盡管CRF2受體的半衰期是未知的，但是嚙齒類(lèi)動(dòng)物大腦內(nèi)的其他7次跨膜受體(CRF2受體是其中的一員)的半衰期在2-3天的級(jí)別上。最大抑制作用通常出現(xiàn)在反義治療之后至少3個(gè)蛋白半衰期的時(shí)間。盡管CRF2反義給藥5天能產(chǎn)生對(duì)所述受體40-50％的抑制作用，將用藥時(shí)間延長(zhǎng)到9天，可以導(dǎo)致對(duì)受體結(jié)合70-80％的抑制作用。另外，對(duì)定量原位雜交發(fā)現(xiàn)了CRF2受體mRNA的相當(dāng)?shù)臏p少。在上述條件下，四堿基錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸在受體和mRNA結(jié)合中都產(chǎn)生了很小的減弱。因此，與Heinrichs等的結(jié)果不同，該作者的CRF2反義寡核苷酸只能產(chǎn)生15-20％的CRF2受體減少，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致接受治療的動(dòng)物體重的顯著下降，我們對(duì)反義試劑進(jìn)行了優(yōu)化，以便研究CRF2受體功能。用RNA作圖方法進(jìn)行反義序列篩選，同時(shí)結(jié)合優(yōu)化的寡核苷酸化學(xué)，從而得到了的有效的反義序列。在給予嚙齒類(lèi)動(dòng)物8-10天之后，能導(dǎo)致CRF2受體結(jié)合的大幅度的(大約70％)減少。
將CRF2反義寡核苷酸腦室內(nèi)注射到側(cè)間隔部位，該部位是含有大量CRF2受體和mRNA的大腦部位。側(cè)間隔是邊緣腦區(qū)的一部分，已知該部分參與調(diào)節(jié)恐懼和情緒。用兩種不同的焦慮行為模型測(cè)試用鹽水、反義和錯(cuò)配對(duì)照寡核苷酸處理過(guò)的大鼠。嚙齒類(lèi)動(dòng)物在經(jīng)歷恐懼和焦慮時(shí)，都表現(xiàn)出特有的凍結(jié)(freezing)行為。在焦慮的凍結(jié)模型中，所述行為是通過(guò)接觸短暫的足電擊而誘導(dǎo)的。在經(jīng)過(guò)若干天的干涉之后，將所述大鼠送回到電擊盒中時(shí)，即使是在不進(jìn)行進(jìn)一步的電擊處理的情況下，這些大鼠也表現(xiàn)出凍結(jié)行為。當(dāng)預(yù)先電擊過(guò)的動(dòng)物被送回到電擊盒中時(shí)，給予諸如苯并二氮卓類(lèi)和選擇性的血清緊張素再吸收抑制劑的抗焦慮藥物，能縮短凍結(jié)的時(shí)間。在反義實(shí)驗(yàn)中，在經(jīng)過(guò)2天連續(xù)的足電擊之后開(kāi)始給予寡核苷酸。在用藥第8天的最后1次給予寡核苷酸之后2小時(shí)，將大鼠送回到所述電擊盒中，并觀察10分鐘。在這一部分實(shí)驗(yàn)中，檢驗(yàn)了藥理學(xué)制劑對(duì)條件恐懼的作用，所述反義寡核苷酸，而不是其錯(cuò)配對(duì)照能將凍結(jié)時(shí)間減少50％(圖3a)。在最初的10分鐘時(shí)間之后，對(duì)所述大鼠進(jìn)行2次短暫的足底電擊，并且再觀察10分鐘時(shí)間。同樣，與鹽水或錯(cuò)配寡核苷酸處理的動(dòng)物相比，反義處理的大鼠表現(xiàn)出凍結(jié)時(shí)間降低50％(圖3a)。上述數(shù)據(jù)構(gòu)成了對(duì)CRF2受體功能的首次驗(yàn)證。對(duì)所述大鼠的大腦間隔區(qū)的受體放射性自顯影分析表明，在反義治療的大鼠中，125I-蛙皮降壓肽與CRF2受體的結(jié)合減弱了70％(圖3b)。因此，抑制CRF2受體會(huì)導(dǎo)致焦慮水平的降低，這表明CRF致焦慮作用不僅僅是通過(guò)CRF1受體介導(dǎo)的，而且還能通過(guò)CRF2受體介導(dǎo)。另外，有效抑制CRF2受體，能產(chǎn)生重要的功能后果，這種后果在較低的CRF2受體抑制水平上可能不明顯。以上結(jié)果表明，CRF2受體在調(diào)節(jié)恐懼和焦慮反應(yīng)方面起作用。
抬高的正迷宮(elevated plus maze)(EPM)被廣泛用于測(cè)定抗焦慮或致焦慮藥物效果。該裝置包括+-形式的迷宮，高出地面50厘米。將兩個(gè)相對(duì)的臂打開(kāi)并暴露于環(huán)境中，而將另外兩個(gè)臂用黑色Plexiglas側(cè)板封閉。對(duì)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，暴露于EPM程序會(huì)產(chǎn)生接近/規(guī)避沖突，這通常會(huì)導(dǎo)致這種動(dòng)物將大部分時(shí)間花費(fèi)在所述迷宮的封閉的臂中。這種接近/規(guī)避沖突被認(rèn)為是導(dǎo)致發(fā)生某些類(lèi)型的人類(lèi)焦慮疾病的重要因素。重要的是，目前被推薦用于治療焦慮癥的藥物，能在EPM實(shí)驗(yàn)中在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中有效產(chǎn)生抗焦慮反應(yīng)。
在反義實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)大鼠用藥8天，然后在最后1次注射寡核苷酸之后2小時(shí)在EPM中進(jìn)行測(cè)試。用反義寡核苷酸治療的大鼠明顯將更多的時(shí)間花費(fèi)在所述迷宮開(kāi)放的、外露的臂中(圖4a)。這種行為是焦慮減輕狀態(tài)的指標(biāo)。從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看，錯(cuò)配寡核苷酸治療的大鼠與鹽水治療的大鼠沒(méi)有差別。在該實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)反義寡核苷酸治療，可以將側(cè)間隔中125I-蛙皮降壓肽與CRF2受體的結(jié)合減弱60％(圖4b)。
對(duì)進(jìn)入所述迷宮的開(kāi)放的和閉合的臂中的總次數(shù)進(jìn)行分析，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在三種治療組之間有差別(數(shù)據(jù)未示出)。另外，在運(yùn)動(dòng)器官活性實(shí)驗(yàn)中，所有三種處理組同樣沒(méi)有差別(數(shù)據(jù)未示出)。綜上所述，以上結(jié)果表明，通過(guò)寡核苷酸治療沒(méi)有明顯改變大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。
業(yè)已證實(shí)，反義抑制7次跨膜受體系統(tǒng)所產(chǎn)生的生理學(xué)效果，類(lèi)似于通過(guò)用選擇性小分子拮抗劑抑制受體所獲得的效果(Ho等，1998)。因此，我們的CRF2反義結(jié)果意味著除了反義抑制CRF2受體之外，通過(guò)小分子配體抑制該受體同樣會(huì)導(dǎo)致抗焦慮作用。因此，CRF2受體的小分子或肽拮抗劑，應(yīng)當(dāng)是具有有用的治療價(jià)值的有效抗焦慮制劑。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“可以藥用的藥物前體”表示可用于本發(fā)明的化合物的藥物前體，這種藥物前體屬于正確的醫(yī)學(xué)判斷范圍，適合用于與人類(lèi)和低等動(dòng)物的組織接觸而又沒(méi)有過(guò)高的毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)等，與合理的優(yōu)點(diǎn)/風(fēng)險(xiǎn)比例匹配，并且能實(shí)現(xiàn)其預(yù)期的用途，以及如果可能的話，是本發(fā)明化合物的兩性離子形式。術(shù)語(yǔ)“藥物前體”表示在體內(nèi)能迅速轉(zhuǎn)化成母體化合物的化合物，例如，通過(guò)在血液中水解。能通過(guò)代謝解離迅速轉(zhuǎn)變的官能團(tuán)，在體內(nèi)形成一種能與本發(fā)明化合物的羧基發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。其中包括，但不限于諸如烷?；?如乙酰基、丙?；?、丁?；?、未取代的和取代的芳酰基(如苯甲?；腿〈谋郊柞；?、烷氧基羰基(如乙氧基羰基)、三烷基甲硅烷基(如三甲基-和三乙基甲硅烷基)、與二羧酸形成的單酯(如琥珀酰基)等。由于可用于本發(fā)明的所述化合物的可代謝解離的基團(tuán)在體內(nèi)很容易解離，具有所述基團(tuán)的化合物可以用作藥物前體。具有可代謝解離基團(tuán)的化合物的優(yōu)點(diǎn)是，它們具有改善了的生物利用度，因?yàn)橛捎谒隹纱x解離基團(tuán)的存在，就會(huì)使所述母體化合物具有提高了的溶解度和/或吸收速度。在以下文獻(xiàn)中提供了對(duì)藥物前體的充分討論Design of Prodrugs，H.Bundgaard，ed.，Elsevier，1985；Methodsin Enzymology，K.Widder等；Ed.，Academic Press，42，p.309-396，1985；A Textbook of Drug Design and Development，Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard，ed.，Chapter5；“Design and Applicationsof Prodrugs”p.113-191，1991；Advanced Drug Dellivery Reviews，H.Bundgard，8，p.1-38，1992；Journal of Pharmaceutical Sciences，77，p.285，1988；Chem.Pharm.Bull.，N.Nakeya et al；32，p.692，1984；Pro-drugs as Novel Delivery Systems，T.Higuchi and V.Stella，Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series，and BioreversibleCarriers in Drug Design，Edward B.Roche，ed.，AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press，1987，以上文獻(xiàn)被收作本文參考。
術(shù)語(yǔ)“可以藥用的鹽”表示本發(fā)明化合物的相對(duì)無(wú)毒的無(wú)機(jī)和有機(jī)酸加成鹽和堿加成鹽。所述鹽可以在所述化合物的最終分離和純化期間在現(xiàn)場(chǎng)制備。具體地講，酸加成鹽可以這樣制備分別讓游離堿形式的純化的化合物與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)酸起反應(yīng)，并分離由此形成的鹽。典型的酸加成鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽、氨基磺酸鹽、丙二酸鹽、水楊酸鹽、丙酸鹽、亞甲基-雙-b-羥基硫代萘酸鹽、二羥基苯甲酸鹽、isethionates、二-p-甲苯酰酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯甲磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽和奎尼酸月桂基磺酸鹽等(例如，參見(jiàn)S.M.Berge等，“藥用鹽”，J.Pharm.Sci.，66p.1-19，1977，該文獻(xiàn)被收作本文參考)。堿加成鹽也可以通過(guò)以下方法制備讓酸形式的純化化合物分別與合適的有機(jī)或無(wú)機(jī)堿起反應(yīng)，并分離由此形成的鹽。堿加成鹽包括可以藥用的金屬鹽和胺鹽。合適的金屬鹽包括鈉、鉀、鈣、鋇、鋅、鎂和鋁鹽。優(yōu)選鈉鹽和鉀鹽。合適的無(wú)機(jī)堿加成鹽是用金屬堿制備的，其中包括氫化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁、氫氧化鋰、氫氧化鎂、氫氧化鋅。合適的胺加成鹽是用具有足夠形成穩(wěn)定鹽的堿性的胺制備的，并且優(yōu)選包括通常被用于醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域的胺，因?yàn)檫@種胺具有較低的毒性和可以接受的醫(yī)療用途。氨水、乙二胺、N-甲基葡糖胺、賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、膽堿、N，N’-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、普魯卡因、N-芐基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羥基甲基)-氨基乙烷、四甲基氫氧化銨、三乙胺、二芐胺、ephenamine、脫氫樅胺、N-乙基哌啶、芐胺、四甲基胺鹽、四乙基胺鹽、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、堿性氨基酸，例如，賴氨酸和精氨酸，以及二環(huán)己胺等。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“CRF2反義寡核苷酸”表示被設(shè)計(jì)成互補(bǔ)于CRF2受體mRNA的一部分的短的寡核苷酸(其長(zhǎng)度通常為大約15-大約25個(gè)核苷酸)。反義寡核苷酸通過(guò)沃森-克里克堿基配對(duì)與其mRNA靶位點(diǎn)進(jìn)行的雜交啟動(dòng)了一連串事件，這些事件止于CRF2受體所導(dǎo)向的mRNA的寡核苷酸定向降解。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“CRF2受體”表示披露于1998年7月28日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利5786203中的細(xì)胞表面受體，該專(zhuān)利的內(nèi)容被收作本文參考。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“限定的可及位點(diǎn)”表示CRF2受體mRNA上可用于與反義寡核苷酸雜交的多個(gè)位點(diǎn)。這些位點(diǎn)在上面的表1中有進(jìn)一步的說(shuō)明。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“修飾過(guò)的核苷酸殘基”包括，但不限于2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯、聚酰胺核酸、和具有以下結(jié)構(gòu)式的閉鎖的核酸 或 其中，B是嘌呤或嘧啶堿。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案提供了一種用于治療患者體內(nèi)的包括，但不限于焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥、神經(jīng)性厭食、和抑郁癥的精神疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的藥物組合物，該組合物含有由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
提供所述反義寡核苷酸修飾的核苷酸殘基的優(yōu)選實(shí)施方案選自下列一組2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯和聚酰胺核酸。
一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了長(zhǎng)度為大約15-大約25個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸。
另一種實(shí)施方案提供了一種治療患有由CRF受體蛋白介導(dǎo)的疾病的患者的方法，包括(a)設(shè)計(jì)一種對(duì)CRF受體mRNA特異的嵌合反義寡核苷酸；(b)確定模擬所述反義寡核苷酸的生物學(xué)作用的組合物；和(c)給予所述患者能抑制內(nèi)源配體與其CRF受體結(jié)合的所述組合物。
另一種實(shí)施方案提供了一種用于治療患有由CRF受體蛋白介導(dǎo)的疾病的患者的方法，包括
(a)設(shè)計(jì)一種對(duì)CRF受體mRNA特異的嵌合反義寡核苷酸；(b)確定模擬所述反義寡核苷酸的生物學(xué)作用的組合物；和(c)給予所述患者能模擬內(nèi)源配體在CRF受體上的作用的組合物。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了一種用于治療患有由CRF介導(dǎo)的疾病的患者的方法，包括給予所述患者能有效抑制CRF或其他密切相關(guān)的肽與CRF2受體結(jié)合的組合物。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了一種設(shè)計(jì)CRF2受體抑制劑的方法，包括以下步驟確定所述受體的三維結(jié)構(gòu)，分析所述三維結(jié)構(gòu)，尋找可能的底物結(jié)合位點(diǎn)，合成一種能結(jié)合推測(cè)的反應(yīng)位點(diǎn)的分子，以及確定所述分子的受體抑制活性。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，15-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，20-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，25-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，30-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，35-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，40-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，45-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，50-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，55-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的一種更優(yōu)選的實(shí)施方案提供了由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸的序列，其中，60-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案提供了具有位于特定進(jìn)入位點(diǎn)內(nèi)的靶堿基、具有位于所述特定進(jìn)入位點(diǎn)內(nèi)的任何堿基上的起始位點(diǎn)、以及具有大約15-大約25個(gè)堿基長(zhǎng)度的反義寡核苷酸。
本發(fā)明的一種最優(yōu)選的實(shí)施方案提供了包含以下序列的反義寡核苷酸(a)TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG；(b)GGT GGG CGA TGT GGG AAT G；(c)GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG；和(d)TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了一種用于利用反義寡核苷酸確定可用于治療精神疾病的化合物的篩選測(cè)定，所述疾病包括，但不限于焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥、和抑郁癥。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案提供了一種確定CRF2受體的結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)的方法。
CRF1受體配體和CRF2受體配體的聯(lián)合給藥，能夠提供超過(guò)聯(lián)合給藥CRF1受體配體和CRF2受體配體單獨(dú)給藥的效力，并且在聯(lián)合給藥時(shí)，可以使用較低劑量的每一種配體。較低的劑量減少了副作用的可能性，從而提供了較大的安全范圍。本發(fā)明化合物與所述其他治療劑的聯(lián)合優(yōu)選是協(xié)同聯(lián)合。例如，正如Chou和Talalay(Adv.EnzymeRegu1.2227-55，1984)所披露的，協(xié)同作用是指當(dāng)所述化合物和制劑聯(lián)合給藥時(shí)所產(chǎn)生的治療效果大于CRF1受體配體和CRF2受體配體單獨(dú)給藥時(shí)的累加效果的現(xiàn)象。一般，協(xié)同作用在CRF1受體配體或CRF2受體配體各自單獨(dú)的治療性次最佳水平上表現(xiàn)的最明顯，不過(guò)，在聯(lián)合以后具有很高效力。
CRF1受體拮抗劑能在若干種焦慮動(dòng)物模型中起作用(Lundkvist，J.，Chai.Z.，Teheranian，R.，Hasanvan，H.，Bartfai，T.，Jenck，F(xiàn).，Widmer，U.&Moreau，J.L.，1996，Eur.J.Pharmacol.309，195-2 00；和Weninger，S.C.，Dunn，A.J.，Muglia，L.J.，Dikkes，P.Miczek，K.A.，Swiergiel，A.H.，Berridge，C.W.&Majzoub，J.A.1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，8283-8288)。在條件焦慮實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了CRF1受體的一種高度選擇性的和強(qiáng)效的吡唑-嘧啶拮抗劑DPC904(Gilligan，P.J.，Baldauf，C.，Cocuzza，A.，Chidester，D.，Zaczek，R.，F(xiàn)itgerald，L.，McElroy，J.，Smith，M.A.，Shen，H.S.L.，Saye，J.A.，Christ，D.，Trainor，G.L.，Robertson，D.W.&Hartig，P.R.，2000，Bioorganic Med.Chem.8，181-189，2000)，并且發(fā)現(xiàn)了凍結(jié)持續(xù)時(shí)間的劑量依賴性減少(圖7a)。由于中樞CRF1和CRF2受體在其解剖學(xué)分布上沒(méi)有明顯的重疊(Chalmers.D.T.，Lovenberg，T.W.&DeSouga，E.B.，1995，J.Neuroscience15，6340-6350；和Rominger，D.H.，Rominger，C.M.Fitzgerald，L.W.，Grzanna，R.，Largent，B.L.&Zaczek，R.，1998，J.Pharmacol.Exp.Ther.286，459-468)，因此設(shè)計(jì)了一種研究，以便確定同時(shí)抑制這兩種受體亞型是否能導(dǎo)致對(duì)凍結(jié)更有效的減輕。用鹽水或反義寡核苷酸通過(guò)腦室內(nèi)注射給動(dòng)物用藥7天。在最后一次腦室內(nèi)注射之后24小時(shí)，給大鼠口服載體(methocel)或DPC904。在DPC904或反義寡核苷酸單獨(dú)給藥的動(dòng)物中，在凍結(jié)方面表現(xiàn)出比以前觀察到的凍結(jié)明顯減弱。在同時(shí)給予DPC904和反義寡核苷酸的動(dòng)物中，凍結(jié)明顯減弱到低于在所述條件焦慮實(shí)驗(yàn)中DPC904治療的或反義治療的動(dòng)物的水平(圖7b)。盡管用DPC904急性治療在所述電擊再暴露實(shí)驗(yàn)中縮短了凍結(jié)時(shí)間，但同時(shí)抑制這兩種受體未能產(chǎn)生與單獨(dú)使用CRF2反義寡核苷酸所獲得的效果不同的效果(圖7b)。在兩組反義治療的動(dòng)物中，CRF2受體結(jié)合都降低到類(lèi)似水平(鹽水/methocel1.20±0.05nCi/mg，鹽水/DPC9041.21±0.05nCi/mg，反義寡核苷酸/methocel0.51±0.08nCi/mg，反義寡核苷酸/DPC9040.45±0.04nCi/mg，反義組與非寡核苷酸治療組的p＜0.001)。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明包括本文所提到的特定的和優(yōu)選的類(lèi)型或?qū)嵤┓桨傅乃泻线m的組合。
通過(guò)以下實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中，有關(guān)份數(shù)和百分比是以重量為基礎(chǔ)的，除非另有說(shuō)明。
實(shí)施例1合成并純化用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的寡核苷酸使用標(biāo)準(zhǔn)合成方案，用自動(dòng)化ABI 394 RNA/DNA合成儀合成寡核苷酸。在圖3和4所示實(shí)驗(yàn)中所使用的反義寡核苷酸和錯(cuò)配寡核苷酸由以下序列組成反義TGA CGC agc ggc acC AGA CC錯(cuò)配TGA GGC acc gga acC ACA CC其中，大寫(xiě)字母表示2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯殘基，而小寫(xiě)字母表示2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基。2’-甲氧基核糖核苷亞胺磷酸酯是從Chem Genes購(gòu)買(mǎi)的，丙炔基和5-甲基胞苷亞胺磷酸酯是從Glen Research獲得的，而2’-氟代亞胺磷酸酯是從NeXstar獲得的。用于合成硫代磷酸酯鍵的Beaucage試劑和用于對(duì)寡核苷酸進(jìn)行5’標(biāo)記的熒光素亞磷酰胺是從Glen Research購(gòu)買(mǎi)的。所述試劑是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用的。
在PRP-3柱(Hamilton Co.)上通過(guò)反相HPLC純化粗制寡核苷酸混合物，使用乙腈和0.1M三乙基乙酸銨水溶液的梯度洗脫。將從HPLC柱上采集的級(jí)份凍結(jié)干燥2次，以便除去多余的三乙基乙酸銨。然后用丁醇提取所述寡核苷酸的水溶液若干次。在存在0.3M乙酸鈉的條件下，使用乙醇沉淀完成陽(yáng)離子交換。然后通過(guò)添加0.01M氫氧化鈉，將所述寡核苷酸溶液的pH調(diào)節(jié)到7.0。通過(guò)用NAP-25柱(Pharmacia)進(jìn)行大小排阻層析，對(duì)所述寡核苷酸做進(jìn)一步的純化，以便除去殘余的熒光素亞胺磷酸酯試劑。通過(guò)用0.2微米的乙酸纖維素濾膜(Rainin)過(guò)濾進(jìn)行消毒，并通過(guò)紫外線光譜測(cè)定進(jìn)行定量。通過(guò)毛細(xì)管凝膠電泳(PACE2100，Beckman Instruments)測(cè)定寡核苷酸的純度。將溶解在蒸餾水中的寡核苷酸母液放在-20℃下保存。
實(shí)施例2動(dòng)物和手術(shù)將在手術(shù)時(shí)重量為320-360克的雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River)單獨(dú)圈養(yǎng)在不銹鋼籠子里，并且提供能自由接觸食物和水的通道。在經(jīng)過(guò)4天的適應(yīng)期之后，在用Rompun(100毫克/公斤)和氯胺酮(9毫克/千克)麻醉的條件下，在大鼠雙側(cè)定向植入長(zhǎng)期的26號(hào)導(dǎo)管，導(dǎo)管定位于側(cè)心室。定向坐標(biāo)為切開(kāi)線位于耳間線下面3.3毫米；鹵后0.2毫米；中線側(cè)面±2.7毫米；顱骨表面腹側(cè)3.8毫米，和24°角。注射器(33號(hào))突出超過(guò)所述導(dǎo)管尖0.5毫米。在手術(shù)后2天開(kāi)始對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行每日的適應(yīng)控制。
所有動(dòng)物護(hù)理使用Institutional Animal Care and UseCommittee(IACUC)批準(zhǔn)的公開(kāi)方法。杜邦藥物研究實(shí)驗(yàn)室得到了實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理評(píng)估和認(rèn)證聯(lián)合會(huì)(國(guó)際AAALAC)的認(rèn)可。
實(shí)施例3寡核苷酸給藥寡核苷酸輸注是在手術(shù)之后第8天開(kāi)始的，此時(shí)大鼠體重高于手術(shù)時(shí)的重量大約20克。每天通過(guò)將凍結(jié)干燥的寡核苷酸顆粒溶解在無(wú)菌鹽水中制備新的寡核苷酸溶液。在用寡核苷酸輸液之前，每天上午9點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行稱(chēng)重。使用微處理器控制的注射泵(Stoelting)用2分鐘時(shí)間將1微升的溶液注射到每一個(gè)心室中。在每天的注射之間，用乙醇和無(wú)菌水清洗用于每一只大鼠的注射器，并且干燥。
實(shí)施例4焦慮的凍結(jié)測(cè)定電擊盒由具有壁和蓋的黑色的Plexiglas室組成。所述盒子的門(mén)用透明的Plexiglas制成，在它上面安裝了一個(gè)用于觀察的單向鏡子。所述盒子的地板包括一個(gè)Coulbourn不銹鋼電擊格柵，格柵條間隔1厘米。在手術(shù)置入所述導(dǎo)管之后第8天，將大鼠放入所述盒子，并讓其適應(yīng)2分鐘。然后以20秒的間隔對(duì)所述格柵地板輸送總共3次不規(guī)則的、隨機(jī)的、無(wú)可逃避的足底電擊(1.0mA，持續(xù)1秒鐘)。用15分鐘時(shí)間觀察所述大鼠的凍結(jié)行為，然后將它送回到它所居住的籠子里。
在刺激處理之后次日開(kāi)始寡核苷酸治療。給動(dòng)物連續(xù)用藥7天。將大鼠送回到電擊盒中24小時(shí)之后，用10分鐘時(shí)間觀察凍結(jié)行為。然后進(jìn)行2次足底電擊(1.0mA，持續(xù)1秒鐘，間隔20秒)，然后再用10分鐘時(shí)間觀察大鼠的凍結(jié)。在緊接著這最后的10分鐘時(shí)間之后，對(duì)所述大鼠實(shí)施安樂(lè)死。
實(shí)施例5抬高的正迷宮測(cè)定對(duì)大鼠的寡核苷酸治療始于手術(shù)后第8天。在治療的第8天用藥之后2小時(shí)，在EPM中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將大鼠放在迷宮的中央場(chǎng)地上，并通過(guò)攝象機(jī)記錄在隨后的10分鐘內(nèi)大鼠的探詢行為。由坐在所述實(shí)驗(yàn)室外面的觀察者統(tǒng)計(jì)大鼠花費(fèi)在開(kāi)放的臂和閉合的臂中的時(shí)間，以及大鼠進(jìn)入迷宮的每一個(gè)臂的次數(shù)。在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，馬上對(duì)所述大鼠實(shí)施安樂(lè)死。
實(shí)施例6組織制備通過(guò)暴露于二氧化碳將大鼠處死。取出大腦，并在放在干冰上冷卻的甲基丁烷中凍結(jié)，然后在-80℃下保存。在低溫恒溫器(KopfInstruments)上通過(guò)側(cè)間隔切除20微米的切片，用于受體放射自顯影。
實(shí)施例7CRF2受體放射自顯影在回溫到室溫1小時(shí)之后，將大腦切片放在50mM Tris-HCl(pH7.5)中預(yù)孵育5分鐘，該緩沖液中含有10mM氯化鎂，2mM EGTA(乙二醇雙(β-氨基乙基醚)N，N，N’，N’-四乙酸)、0.1％卵白蛋白、0.08TIU抑蛋白酶肽和0.1mM桿菌肽。用0.15nM125I-蛙皮降壓肽(NewEngland Nuclear)確定總的結(jié)合。在存在1μM SC-241-CRF1選擇性受體拮抗劑的條件下測(cè)定CRF2特異性結(jié)合(D.H.Rominger等，J.Pharmacol.Exp.Therap.，286，459-468，1998)。用1μMα螺旋CRF(American Peptide)測(cè)定非特異性結(jié)合。在含有放射性配體和合適的拮抗劑的預(yù)孵育緩沖液中進(jìn)行孵育150分鐘。然后用含有0.01％Triton X-100的PBS洗滌組織切片2次，每次5分鐘。在最后1次用水清洗之后，吸掉多余的水分，并將所述切片空氣風(fēng)干過(guò)夜。讓所述切片和125I標(biāo)準(zhǔn)條(Amersham)對(duì)Hyper膠片μ-Max(Amersham)曝光72小時(shí)。
用NIH ImageMG1.44程序?qū)RF2特異性結(jié)合進(jìn)行定量。使用125I標(biāo)準(zhǔn)條將光密度讀數(shù)轉(zhuǎn)換成每克蛋白組織結(jié)合的配體的nCi。對(duì)每只大鼠的7-9個(gè)相鄰的切片進(jìn)行定量。
實(shí)施例8用CRF1受體拮抗劑和CRF2反義寡核苷酸聯(lián)合治療按實(shí)施例4所述方法(第一段)對(duì)32-40只大鼠進(jìn)行條件足底電擊處理。在足底電擊之后，將所述動(dòng)物等分成兩組。第一組連續(xù)7天腦室內(nèi)注射鹽水，而第二組動(dòng)物連續(xù)7天腦室內(nèi)注射反義寡核苷酸(每一個(gè)側(cè)腦室注射2.5納摩爾)。在第8天，將每一組動(dòng)物再分成兩組。用鹽水處理的動(dòng)物的一半以10毫克/千克的口服劑量給予DPC904(溶解在methocel中)(被稱(chēng)為S/R1組)。所述鹽水處理動(dòng)物的另一組接受載體methocel(被稱(chēng)為S/M組)。對(duì)給予反義寡核苷酸的大鼠作類(lèi)似處理，即這些動(dòng)物的一半以10毫克/千克的口服劑量給予DPC904(溶解在methocel中)(被稱(chēng)為R2/R1組)。反義治療動(dòng)物的另一半使用載體methocel(被稱(chēng)為R2/M組)。在口服用藥30分鐘之后，按例4所述方法在電擊盒中對(duì)所述動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試(第二段)。
在不超出本發(fā)明的精神或?qū)嵸|(zhì)性范圍的前提下，可以用其他具體形式實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CRF1配體受體是CRF1受體的激動(dòng)劑。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CRF1配體受體是CRF1受體的拮抗劑。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CRF2配體受體是CRF2受體的激動(dòng)劑。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CRF2配體受體是CRF2受體的拮抗劑。
6.一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體反義寡核苷酸或其可以藥用的鹽或藥物前體，其中，所述CRF2受體反義寡核苷酸是由嵌合寡核苷酸組成的反義寡核苷酸，其中，10-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
7.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述修飾過(guò)的核苷酸殘基選自下列一組2’-甲氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-甲氧基-乙氧基核糖核苷磷酸二酯、2’-氟代-核糖核苷磷酸二酯、5-(1-丙炔基)胞嘧啶硫代磷酸酯、5-(1-丙炔基)尿嘧啶硫代磷酸酯、5-甲基胞嘧啶硫代磷酸酯、2’-脫氧核糖核苷-N3’-P5’氨基磷酸酯和聚酰胺核酸，和具有以下結(jié)構(gòu)式的閉鎖核酸； 或 其中，B是嘌呤或嘧啶堿。
8.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為大約15-大約25個(gè)核苷酸。
9.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述反義寡核苷酸的60-70％的2’-脫氧核糖核苷硫代磷酸酯殘基被修飾過(guò)的核苷酸殘基所取代。
10.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述反義寡核苷酸包含以下序列(a)TGT ACG TGT TGC GCA AGA GG；(b)GGT GGG CGA TGT GGG AAT G；(c)GGA TGA AGG TGG TGA TGA GG；和(d)TGA CGC AGC GGC ACC AGA CC。
11.如權(quán)利要求1或6的方法，，其中，所述疾病是精神疾病。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中，所述精神疾病選自下列一組焦慮癥、強(qiáng)迫性神經(jīng)失調(diào)、驚恐性障礙、創(chuàng)傷后應(yīng)激疾病、恐怖癥、厭食、和抑郁癥。
13.如權(quán)利要求1或6的方法，其中，所述疾病選自下列一組頭部創(chuàng)傷、脊髓創(chuàng)傷、缺血性神經(jīng)元損傷(例如，大腦缺血，如大腦海馬缺血)、興奮性毒性神經(jīng)元損傷、癲癇、中風(fēng)、應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫功能障礙、恐怖癥、肌肉痙攣、帕金森氏病、亨廷頓氏病、尿失禁、阿爾茨海默型老年癡呆、多梗塞性癡呆、肌萎縮性側(cè)索硬化、化學(xué)制品依賴性和成癮(例如，對(duì)酒精、可卡因、海洛因、苯并二氮卓類(lèi)或其他藥物的依賴性)、和低血糖癥。
14.如權(quán)利要求1的方法，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是同時(shí)給藥的。
15.如權(quán)利要求6的方法，其中，CRF1受體配體和CRF2受體配體是序貫給藥的。
16.一種治療與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括讓有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體與一種含有CRF1受體和CRF2受體的組合物接觸。
17.一種治療與CRF2受體活性相關(guān)的疾病的方法，包括讓有效量的CRF2受體配體與一種含有CRF2受體的組合物接觸。
18.一種藥物組合物，該組合物含有CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，以及藥用載體。
19.一種用于治療或預(yù)防與CRF1和CRF2受體活性相關(guān)的疾病的藥用試劑盒，所述試劑盒包括多個(gè)獨(dú)立的容器，其中，至少有一個(gè)所述容器裝有CRF1受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且至少有另一個(gè)所述容器裝有CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體，并且所述容器選擇性地裝有一種藥用載體。
20.一種用于治療精神疾病的具有CRF1受體配體活性和CRF2受體配體活性的化合物。
21.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述CRF1受體配體是DPC904或SC-241。
22.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述CRF2受體配體是蛙皮降壓肽、尿皮質(zhì)素或其他CRF2肽。
23.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述CRF2受體配體是抗蛙皮降壓肽。
24.一種增強(qiáng)對(duì)精神疾病的治療的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的CRF1受體配體和CRF2受體配體或其可以藥用的鹽或藥物前體。
25.一種增強(qiáng)對(duì)精神疾病的治療的方法，包括給予需要治療的患者治療有效量的具有CRF1配體受體和CRF2配體受體活性的化合物或其可以藥用的鹽或藥物前體。
26.如權(quán)利要求25的方法，其中，所述化合物是astressin。
27.如權(quán)利要求6的方法，其中，所述反義寡核苷酸針對(duì)表1所示的區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及能顯著減少CRF
文檔編號(hào)A61P25/16GK1501976SQ01814084
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月19日
發(fā)明者S·P·候, S P 候 申請(qǐng)人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布藥品公司