專利名稱：：雙特異性抗體及其制備方法和用途的制作方法
背景技術(shù)：
：哺乳動物免疫系統(tǒng)包括B淋巴細(xì)胞，其總的說來，表達(dá)數(shù)千億具有不同抗體特異性的抗體組分。對特定抗原的標(biāo)準(zhǔn)免疫應(yīng)答包括從所有的抗體組分中篩選出一種或多種能與所述抗原特異結(jié)合的抗體，免疫應(yīng)答的成功至少部分基于這些抗體特異性識別(并最終排除)上述的刺激性抗原，并“忽略”抗體環(huán)境中的其他分子的能力。抗體特異性識別一種特定靶抗原的有用性導(dǎo)致了單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展。目前，標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)能夠制備對相關(guān)抗原具有單一特異性的抗體。最近，重組抗體技術(shù)已開發(fā)出來，例如體外抗體文庫。這些技術(shù)也能用于制備對相關(guān)抗原具有單一特異性的抗體。對單一的靶抗原具有特異性的抗體，至少在某些條件下可顯示出非所需要的交叉反應(yīng)性、或與其他抗原結(jié)合所造成的背景。然而，這種交叉反應(yīng)性或結(jié)合背景通常是不可預(yù)知的(也就是說，不可能預(yù)知所述的抗體與哪種抗原發(fā)生交叉反應(yīng))。而且上述情況通常可以與特定的抗原結(jié)合相區(qū)別，這是由于它們典型地只是表現(xiàn)所述抗體結(jié)合能力的非常次要的部分(例如，總的抗體結(jié)合能力的1％或更少)并且典型地，只是在高抗體濃度(例如，是可觀察到特異抗原結(jié)合的濃度的1000倍或更高)下才能觀察到。盡管存在屬于結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白家族的幾種抗原，所述抗體與特定的家族成員的應(yīng)答仍是高特異性的。另外，有這樣幾個例子，即蛋白家族成員(例如IL-1和TNF家族成員)可與相同受體、受體組分或結(jié)構(gòu)上相關(guān)的受體結(jié)合，但針對所述家族成員之一的單克隆抗體并不與其他家族成員表現(xiàn)高的交叉反應(yīng)性。Mabs對不同的家族成員缺乏交叉反應(yīng)性可能有兩種原因。首先，在標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤制備中，人們僅搜尋很少的對所述靶抗原具有高特異性/親合力的抗體，然后檢查所選擇的這少數(shù)抗體的交叉反應(yīng)性和結(jié)合背景。第二，盡管一個家族內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)上相關(guān)，它們可能具有唯一的優(yōu)勢免疫表位。因此，用全長蛋白培育的Mabs可能不與其他結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)。也存在下述的例子，即所培育的針對一個物種的某種抗原的單克隆抗體可與另一物種中具有相同功能的抗原特異性地結(jié)合。例如，抗-小鼠X抗體可迅速地與來自人的抗原X相結(jié)合。這是由于，盡管上述抗原不是同一的，但它們具有顯著的序列和結(jié)構(gòu)相似性。但是，鑒于這種物種-交叉反應(yīng)抗體對來自不同物種的相同抗原具有特異性，故而它們不構(gòu)成“雙特異性”抗體。因此，仍然需要具有可預(yù)測的雙或多特異性的單克隆抗體，即對兩種或兩種以上不同抗原具有準(zhǔn)確特異性的抗體。發(fā)明簡述本發(fā)明提供制備對至少兩種結(jié)構(gòu)上相關(guān)，但不同的抗原具有雙重特異性的抗體的方法。所述的方法通常包括提供一種抗原，這種抗原具有兩種不同、但結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子的共同結(jié)構(gòu)特征；將所有的抗體組成成分暴露于所述抗原；從所述的抗體組分中篩選出可與上述兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子特異結(jié)合的抗體，由此獲得雙特異性的抗體。在臨床狀況下，幾個相同蛋白家族的成員促成疾病過程中的不同癥狀。因此，使用本發(fā)明的可與同一蛋白家族的成員相結(jié)合以阻斷該蛋白家族中一個以上成員的功能的雙特異性抗體，有益于減輕疾病癥狀或中止該疾病過程本身。而且，本發(fā)明的這種雙特異性抗體對檢測結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原以純化結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原，并在包括結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原的診斷試驗中是有用的。在優(yōu)選的實施方案中，所述的抗原是基于兩個不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子間鄰近的拓?fù)渥R別區(qū)域而設(shè)計的。例如，兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子可以是蛋白，并且所述的抗原可以是包含兩蛋白間鄰近的拓?fù)渥R別區(qū)域的氨基酸序列的肽。在另一實施方案中，所述的抗原是基于結(jié)構(gòu)上模擬兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的共有折疊的環(huán)而設(shè)計的。在又一實施方案中，所述的抗原是基于共同剪接兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的交替和/或重疊部分，以產(chǎn)生新的雜交分子。例如，所述的抗原可以是共同剪接兩個不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白的交替和/或重疊氨基酸序列所形成的雜合肽。在又一實施方案中，所述的抗原可以包括兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的其中之一，并且所述的方法包括篩選特異性識別兩相關(guān)分子的抗體。在本發(fā)明的方法中，所述的抗體所有組分可在體內(nèi)或體外暴露于所述的相關(guān)抗原。例如在一個實施方案中，將所述的所有組分暴露于所述抗原包括用所述抗原對動物進(jìn)行體內(nèi)免疫。這一體內(nèi)方法可進(jìn)一步包括制備一組來自所述動物淋巴細(xì)胞的雜交瘤，并篩選能分泌可特異性地與兩個不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子相結(jié)合的抗體的雜交瘤。所免疫的動物可以是小鼠，大鼠，兔，或山羊或上述動物的轉(zhuǎn)基因形式，如轉(zhuǎn)入了人免疫球蛋白基因的小鼠在抗原刺激下產(chǎn)生人抗體。其他可免疫的動物類型包括經(jīng)下述處理的小鼠，即已用人外周血單核細(xì)胞(hu-PBMC-SCID嵌合小鼠)或淋巴細(xì)胞或其前體重建的具有重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)的小鼠，所述小鼠經(jīng)致死劑量全身輻射處理，接下來用重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)的小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行輻射防護(hù)，接下來移入功能性的人淋巴細(xì)胞(Trimera系統(tǒng))。另一種可被免疫的動物可以是其基因組中編碼相關(guān)抗原的內(nèi)源基因已被“剔除”(例如通過同源重組)的動物(例如小鼠)，當(dāng)用相關(guān)抗原免疫時，所述的KO動物將上述抗原作為外來物識別。在另一實施方案中，通過用所述抗原篩選重組抗體文庫，在體外使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原。所述的重組抗體文庫可以，例如在噬菌體表面或酵母細(xì)胞表面或細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)。在不同的實施方案中，所述的重組抗體文庫是，例如scFv文庫或Fab文庫。在又一實施方案中，抗體文庫作為RNA-蛋白融合體表達(dá)。另一種制備雙特異性抗體的方法包括，結(jié)合體內(nèi)和體外的方法使所述的所有抗體組分暴露于所述抗原，例如用所述抗原體內(nèi)免疫動物，接下來用所述抗原在體外篩選由所述動物淋巴細(xì)胞制備的抗體文庫。再一種方法包括通過下述步驟使所述的所有抗體組分暴露于所述抗原用所述抗原體內(nèi)免疫動物，接下來體外親和成熟由所述動物淋巴細(xì)胞制備的抗體文庫。又一種方法包括通過下述步驟使所述的所有抗體組分暴露于所述抗原用所述抗原體內(nèi)免疫動物，接下來篩選分泌相關(guān)抗體的抗體產(chǎn)生細(xì)胞，從這些所選擇的細(xì)胞中回收相關(guān)抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)cDNA(例如通過PCR的方法)，并在哺乳動物宿主細(xì)胞中體外表達(dá)上述重鏈和輕鏈可變區(qū)域(視為所選擇的淋巴細(xì)胞抗體方法或SLAM)，由此可以進(jìn)一步篩選，并對所選擇的抗體基因序列進(jìn)行操作。更進(jìn)一步，可通過表達(dá)克隆篩選單克隆抗體，在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重鏈和輕鏈抗體基因，再篩選分泌具有必需結(jié)合特異性的抗體的哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以制備多種不同類型的雙特異性抗體，包括完全的人抗體，嵌合抗體和DCR-嫁接的抗體和其抗原結(jié)合部分。還提供按照本發(fā)明的方法制備的雙特異性抗體。優(yōu)選的本發(fā)明的雙功能抗體是特異地與IL-1α和IL-1β結(jié)合的抗體。這種雙特異性抗體可用于檢測IL-1α或IL-1β的方法，其包括用所述的雙-特異性抗體，或其抗原-結(jié)合部分與IL-1α或IL-β相接觸，由此檢測出IL-1α或IL-β。中和雙特異性抗體也可用于本發(fā)明的抑制IL-1α或IL-1β活性的方法，該方法包括使IL-α或IL-β與所述雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分相接觸，由此使IL-1α或IL-β受到抑制。這種雙特異性抗體也可用于治療IL-1-相關(guān)疾病的方法，該方法包括向IL-1-相關(guān)疾病受試者施用所述的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分。在又一實施方案中，本發(fā)明提供制備抗體或其抗原結(jié)合部分文庫的方法，該方法包括下述步驟a)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A；b)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B；c)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C；d)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D；和e)將重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D相結(jié)合獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X和/或，將重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B結(jié)合獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y。在本發(fā)明的又一實施方案中，上述本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括下述步驟，即將抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X與抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y相結(jié)合以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Z。在又一實施方案中，本發(fā)明涉及抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X，Y和Z。在又一實施方案中，本發(fā)明的方法可用于通過選自文庫X，Y和/或Z的、與所述的第一和第二抗原均可結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分鑒定雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明涉及由任意一種本發(fā)明的方法所制備和/或篩選的雙特異性抗體。在又一實施方案中，本發(fā)明涉及編碼抗體或其抗原結(jié)合部分的文庫X，Y和Z中的任意成員的核苷酸序列；以及所述的雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分，含上述核酸序列的載體，和由所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實施方案中，所述的第一和第二抗原分別選自蛋白，多肽和肽，條件是所述的第一和第二抗原不相同。在進(jìn)一步的實施方案中，所述的蛋白，多肽和肽是分泌蛋白或表面受體，其中所述的分泌蛋白選自IFN，TNF和IL，IP-10，PF4，GRO，9E3，EMAP-II，，CSF，F(xiàn)GF和PDGF。在又一優(yōu)選的實施方案中，所述的第一抗原是BL-1α，所述的第二抗原是1L-1β。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及設(shè)計和應(yīng)用抗原以產(chǎn)生雙特異性抗體，即對至少兩個不同、但結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子具有特異性的抗體，以及這種雙特異性抗體的篩選，制備和應(yīng)用。本發(fā)明的抗原的結(jié)構(gòu)相關(guān)性可以是覆蓋整個抗原(例如，蛋白)或是在某個結(jié)構(gòu)相關(guān)區(qū)域中。本發(fā)明提供獲得可特異性地與兩不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子結(jié)合的雙特異性抗體的方法，所述的方法包括提供含有兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子結(jié)構(gòu)上共有特征的抗原；將所有抗體組分暴露于上述抗原；再篩選可特異地與兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子相結(jié)合的抗體，由此獲得所述的雙特異性抗體。應(yīng)當(dāng)提及的是，雖然本發(fā)明此處所述的是有關(guān)識別兩個不同的但相關(guān)的抗原，應(yīng)當(dāng)理解此處所述的“雙特異性抗體”指的是包括可特異性地識別兩個以上不同但相關(guān)的抗原的抗體，例如可識別三個，四個，五個或更多結(jié)構(gòu)相關(guān)但不同的抗原。而且，術(shù)語“不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原”是指包括其整個結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗原(例如，蛋白)，以及共有一個或多個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的區(qū)域但其它并不相關(guān)的抗原。因此“不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原”可能是例如，兩個具有共同結(jié)構(gòu)且屬于同一蛋白家族成員的蛋白，也可能是兩個整體結(jié)構(gòu)不類似(不相關(guān))但都包括結(jié)構(gòu)上相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。不同類型的抗原可用于引發(fā)本發(fā)明的抗體，可利用不同的制備抗體的方法獲得本發(fā)明的雙特異性抗體，這將在下述的各段中進(jìn)行詳細(xì)地描述。I.雙特異性抗原為了制備本發(fā)明的雙特異性抗體，針對能引發(fā)雙特異性抗體的抗原培養(yǎng)抗體。這種抗原通常指此處的雙特異性抗原。多種不同類型的雙特異性抗原均可用于本發(fā)明，在下述各段中詳細(xì)描述了多種不同類型的雙特異性抗原的設(shè)計。A.鄰近的拓?fù)鋮^(qū)域在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原包括，將針對其培養(yǎng)雙特異性抗體的，兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子間相同和/或相似區(qū)域的鄰近拓?fù)鋮^(qū)域。優(yōu)選地，所述抗原包括兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子間相同和/或相似區(qū)域的最大的臨近拓?fù)鋮^(qū)域。優(yōu)選地，兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子是蛋白，并且所述的雙特異性抗原包括相應(yīng)于兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子間相同和/或相似區(qū)域的最大(例如最長的)臨近拓?fù)鋮^(qū)域的線性肽。盡管也可以使用相同/相似區(qū)域的其它部分，上述所選擇的相同/相似的適當(dāng)區(qū)域，優(yōu)選地是受體或配體結(jié)合區(qū)域。為確定兩分子(例如蛋白)間同一區(qū)域的鄰近拓?fù)鋮^(qū)域，將兩分子(例如蛋白)相比較(例如同源性模擬，結(jié)構(gòu)信息或?qū)Ρ?，鑒定出相同或相似的區(qū)域。對于蛋白，可用對比算法創(chuàng)建理想的序列對比，并鑒定出兩蛋白間相同和/或相似區(qū)域的最大(例如最長的)臨近拓?fù)鋮^(qū)域。用于對兩序列進(jìn)行比較的，優(yōu)選但非限定性的數(shù)學(xué)算法是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-68的算法，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA905873-77中進(jìn)行了修改。此種算法已并入Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序中。若為比較的目的要獲得缺口對比(gappedalignments)，可依照Altschul等，(1997)NucleicAcidsResearch25(17)3389-3402中的描述應(yīng)用GappedBLAST。當(dāng)應(yīng)用BLAST和GappedBLAST程序時，可使用每個程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov?？蓱?yīng)用的另一種數(shù)學(xué)算法是在Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.411-17中描述的ALIGN程序中所應(yīng)用的。當(dāng)選擇出相同/相似區(qū)域中的合適區(qū)域后，相應(yīng)于該區(qū)域的所述的雙特異性抗原可通過化學(xué)合成。例如，對于肽抗原，所述的肽可通過標(biāo)準(zhǔn)的肽合成方法合成。在一個實施方案中，所述的肽抗原包含L氨基酸。在另一實施方案中，所述的肽抗原可能部分或全部由D氨基酸組成。在實施例1中進(jìn)行詳細(xì)描述了一個基于兩個不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)蛋白間相同和/或相關(guān)區(qū)域的連續(xù)拓?fù)鋮^(qū)域的雙特異性抗原的例子。B.模擬結(jié)構(gòu)環(huán)的環(huán)狀肽在又一實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原包括環(huán)狀分子，優(yōu)選環(huán)狀肽，其在結(jié)構(gòu)上模擬針對其培養(yǎng)雙特異性抗體的兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子(例如，蛋白)共有折疊中的關(guān)鍵環(huán)。為制備此種類型的抗原，比較兩個相關(guān)的分子的結(jié)構(gòu)，鑒定在兩分子中所發(fā)現(xiàn)的共有折疊的環(huán)。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)模型和晶體學(xué)分析有助于這種環(huán)和共有折疊的鑒定。鑒定了相同和相似的區(qū)域(例如，兩蛋白間的氨基酸序列)后，即可設(shè)計相對于相似、但不相同區(qū)域的共有序列。線性分子，例如線性肽是基于這些相似但不相同的區(qū)域而設(shè)計，并且此種線性分子可以通過已知的化學(xué)手段環(huán)化，以產(chǎn)生模擬該關(guān)鍵環(huán)的抗原。例如，可將脯氨酸或甘氨酸添加到線性肽的末端以使所述的肽環(huán)化。在實施例2中詳細(xì)的描述了設(shè)計雙特異性抗原的例子，所述的抗原是基于模擬兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白共有的結(jié)構(gòu)環(huán)的環(huán)狀肽。C.雜交分子在又一實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原包括雜交分子，優(yōu)選雜合肽，其包括用于培養(yǎng)雙特異性抗體的兩個不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子(例如，蛋白)可替換的和/或重疊的區(qū)域。為制備此種類型的抗原，比較兩分子的結(jié)構(gòu)，鑒定兩分子間的重疊區(qū)域(即同一的區(qū)域)以及非同一區(qū)域。制備雜交分子(例如，當(dāng)兩相關(guān)的分子是蛋白時的雜合肽)，其優(yōu)選的包括兩分子各自的(例如，氨基酸序列)可替換區(qū)域，以及兩分子所共有的重疊區(qū)域。按照圖示這種雜交分子可表示為X-Y-Z，其中Y代表兩相關(guān)分子間的同一或高度相似的區(qū)域(即，重疊區(qū)域)，X代表來自一個相關(guān)分子的區(qū)域，Z代表來自另一個相關(guān)分子的區(qū)域。在實施例3中詳細(xì)描述了設(shè)計雙特異性抗原的例子，所述的抗原是基于包含兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白序列的雜合肽。另一種雜交分子類型是將一種肽導(dǎo)入全長的蛋白(指“靶”蛋白)。選擇出代表兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白功能區(qū)域的肽，例如受體相互作用區(qū)域。這種肽在此處指功能肽。來自相關(guān)蛋白之一的功能肽引入其他相關(guān)蛋白或非相關(guān)蛋白的全長蛋白中。例如，鑒定了相應(yīng)于IL-1α受體相互作用區(qū)域的IL-1α肽，并且這一IL-1α功能肽引入全長的IL-1β蛋白以構(gòu)建IL-1α或/IL-β分子。類似地，鑒定了相應(yīng)于IL-1β受體相互作用區(qū)域的IL-1β肽，并且這一IL-1β功能肽引入全長的IL-1α蛋白以構(gòu)建IL-1α或/IL-β分子。這一功能肽引入相關(guān)的全長蛋白限制所述的功能肽在兩端，并保持所述功能肽的折疊結(jié)構(gòu)。對于IL-1α/IL-1β雜合體，所述的功能肽優(yōu)選地插入(替換天然的氨基酸)代表IL-1α和IL-1β共同折疊結(jié)構(gòu)的靶區(qū)域。這種區(qū)域出現(xiàn)在所述蛋白的全長區(qū)域內(nèi)(例如，N-末端區(qū)域，蛋白的中部或C-末端區(qū)域)。而且，所述的代表共有的IL-1α/IL-1β折疊結(jié)構(gòu)的功能肽也可能插入到非相關(guān)的蛋白中，例如白蛋白或其他天然存在的蛋白。在這種情況下所述肽的優(yōu)選插入位點是，允許其保持所需折疊結(jié)構(gòu)的區(qū)域。因此，所述的插入位點可能是在蛋白的N-末端，中部或C-末端。選擇所述肽在任何天然存在的靶蛋白中的定位，以模仿由衍生所述肽的天然蛋白施與所述肽的結(jié)構(gòu)限制。雖然所述的功能肽可簡單地插入到靶蛋白中，使所述的功能肽的氨基酸序列也添加到靶蛋白中，但優(yōu)選以所述功能肽的氨基酸替換所述靶蛋白中被插入的部分。作為一個非限制性的例子，構(gòu)建雜交分子作為培養(yǎng)針對IL-1α和IL-β的雙特異性抗體的雙特異性抗原，其中，將相應(yīng)于IL-α或IL-β特異結(jié)構(gòu)元件的所述的功能肽引入到全長的IL-1β或IL-1α的相應(yīng)結(jié)構(gòu)位置。所選擇的雜交分子用1L-1α的168-184位殘基替換IL-β的160-176位殘基所得的分子具有下述的氨基酸序列，其中帶有下劃線的是被取代的IL-1α序列(168-184位殘基)APVRSLNCTLRDSOOKSLVMSGPYELKALHLOGODMEQOVVFSMGAYKSSKDDAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS(SEQIDNO4)這一分子可利用公眾可以獲得的IL-1α和IL-βcDNA序列和重組蛋白表達(dá)技術(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法制備(例如，克隆，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))?？芍苽潆s合的cDNA，引入到合適的表達(dá)載體中，所述的多肽可通過將上述表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。D.基于疏水性圖的肽在又一實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗原基于疏水性圖選擇，以篩選出預(yù)計具有高抗原性的肽。例如，肽的抗原指數(shù)可利用Jameson和Wolf(CABIOS，4(1)，181-186(1988))中描述的，利用計算機(jī)軟件進(jìn)行計算?？蛇x擇抗體結(jié)合的相關(guān)區(qū)域使抗原性幾率最大化。E.用抗原轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫在又一實施方案中，本發(fā)明的雙特異性抗體通過抗原轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫制備(即，本發(fā)明的抗原-轉(zhuǎn)染細(xì)胞可能是雙特異性抗原)?？梢陨a(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)兩個不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原，或其雜交分子的細(xì)胞系。例如，可以生產(chǎn)穩(wěn)定表達(dá)IL-1α或1L-1β或IL1α/IL-β雜交分子(例如，SEQIDNO4)的細(xì)胞系。所述的相關(guān)分子可由所述細(xì)胞分泌(對于可溶性蛋白的情況)，或在細(xì)胞表面表達(dá)(針對受體和酶的情況)?？赏ㄟ^若干種常規(guī)的方法將基因遞送到宿主細(xì)胞中使所述抗原在宿主細(xì)胞中表達(dá)，上述的常規(guī)方法包括但不限于轉(zhuǎn)染，電穿孔，細(xì)胞融合，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，粒子轟擊，微注射或病毒轉(zhuǎn)染。表達(dá)相關(guān)抗原的細(xì)胞系可通過一種或一種以上不同的途徑(腹膜內(nèi)的，皮下的，肌內(nèi)的等)移植到動物中以產(chǎn)生相關(guān)抗體。使所述細(xì)胞成為相關(guān)抗原的緩釋源。優(yōu)選地，所述細(xì)胞表達(dá)全長的蛋白。但也可以表達(dá)抗原片段。對于可溶性蛋白，優(yōu)選地由所述細(xì)胞分泌所述蛋白。若要產(chǎn)生針對鄰近的相關(guān)受體的胞外結(jié)構(gòu)域，所述的受體優(yōu)選地在細(xì)胞表面表達(dá)。F.用結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子中的一個進(jìn)行免疫在又一實施方案中，所述的雙特異性抗原僅僅是兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子之一，并由此培養(yǎng)雙特異性抗體。將兩個相關(guān)分子之一用作免疫試劑，篩選所得的所有抗體組分以獲得能夠結(jié)合，優(yōu)選中和兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的抗體。例如可用IL-α或IL-1β進(jìn)行免疫，然后篩選α/β結(jié)合劑，或更優(yōu)選中和劑。在這一實施方案中所用到的術(shù)語“免疫”，廣義上包括在體內(nèi)或體外將所述的所有抗體組分暴露于所述抗原，例如IL-1α或IL-1β。因此，這一實施方案包括用IL-α或IL-1β篩選所得的用于選擇可與IL-α和IL-1β均可結(jié)合的抗體的抗體，以及在體外用IL-α或IL-β篩選重組抗體文庫，然后選擇可與IL-1α和IL-1β結(jié)合的重組抗體。II制備雙特異性抗體的方法為制備本發(fā)明的雙特異性抗體，按照前述部分中所描述的方法，將所有抗體組分(在體內(nèi)或體外)暴露于雙特異性抗原。然后從上述所有組分中篩選雙特異性抗體。某種抗原的關(guān)于抗體識別的兩個要素是結(jié)構(gòu)識別和基于特異分子相互作用的親和成熟。在天然免疫應(yīng)答過程中，易于培養(yǎng)識別結(jié)構(gòu)基元的低親和抗體(例如通過特定模式識別受體識別的抗原)，在天然免疫應(yīng)答的早期通過隨后的體細(xì)胞突變以提高一些克隆的親和性。已通過不同的體內(nèi)和體外方法模仿這一天然過程。低親和性的雙特異性抗體可由此處所描述的任意一種體外和體內(nèi)方法制備，高親和性的雙特異性Mabs可通過此處所描述的體細(xì)胞誘變的方法制備。而且，為優(yōu)化高親和性雙特異性Mabs，可制備所需抗原與低親和力Mabs的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)。如此處所描述的，所獲得的結(jié)構(gòu)信息可以指導(dǎo)通過改變(突變)Mabs的特異接觸殘基進(jìn)一步加強(qiáng)特異分子的相互作用。下面將詳細(xì)介紹通過體內(nèi)、體外或兩者結(jié)合的途徑制備雙特異性抗體的方法。A.體內(nèi)途徑制備抗體的標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)途徑是用抗原免疫合適的受試動物，由此使體內(nèi)的所有抗體組分暴露于該抗原，接下來從相關(guān)的動物中回收抗體?？尚薷倪@種方法使其適用于用雙特異性抗原制備雙特異性抗體，然后篩選可特異性識別兩個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子的抗體。雙特異性抗體可通過雙特異性抗原的免疫原性制劑免疫合適的受試者(例如，兔，山羊，小鼠，或其它哺乳動物，包括轉(zhuǎn)基因的和經(jīng)剔除的上述哺乳動物)制備。合適的免疫原性制劑可以是，例如化學(xué)合成的或重組表達(dá)的雙特異性抗原。所述的制劑可進(jìn)一步包含佐劑，例如弗氏完全或不完全佐劑或類似的免疫刺激化合物。而且，當(dāng)用于制備抗體時，特別是通過體內(nèi)免疫的方式，本發(fā)明的雙特異性抗原可以單獨使用，或優(yōu)選地作為與載體蛋白的偶聯(lián)物。這種加強(qiáng)抗體應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域所公知的。與雙特異性抗原相偶聯(lián)的合適的載體蛋白包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和白蛋白。由受試動物中獲得抗體-產(chǎn)生細(xì)胞，并通過常規(guī)方法制備單克隆抗體，例如Kohler和Milstein(1975，Nature256495-497)的雜交瘤技術(shù)(再參見，Brown等(1981)J.Immunol127539-46；Brown等(1980)JBiolChem2554980-83；Yeh等(1976)PNAS762927-31；和Yeh等(1982)Irait.J.Cancer29269-75)。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見R.H.Kenneth，inmonocloneAntibodyANewDimensionInBiologicalAnalyses，PlenumPublishingCorp.，NewYork，NewYork(1980)；E.A.Lerner(1981)YaleJ.Biol.Med.，54387-402；M.L.Gefter等(1977)SomaticCellGenet.，3231-36)。簡言之，無限繁殖細(xì)胞系(典型地是骨髓瘤)與來自由上述雙特異性免疫源免疫的哺乳動物的淋巴細(xì)胞(典型地，脾細(xì)胞或淋巴結(jié)細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞)相融合，篩選所得雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，以鑒定產(chǎn)生對相關(guān)的兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子具有雙特異性的抗體的雜交瘤。任何一種已知的用于融合淋巴細(xì)胞和無限增殖細(xì)胞系的方法，均可以用于產(chǎn)生雙特異性單克隆抗體(參見，例如，G.Galfre等(1977)Nature266；550-52；Gefter等SomaticCellGenet.，citedsupra；Lerner，YaleJ.Biol.Med.，citedsupra；Kenneth，MonoclonalAntibody，citedsupra)。而且，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，這些方法可以有多種變換且都是有用的。典型地，所述的無限增殖細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)與淋巴細(xì)胞系衍生自相同的哺乳動物種。例如小鼠雜交瘤可通過用本發(fā)明的免疫原制劑免疫的小鼠淋巴細(xì)胞和無限增殖的小鼠細(xì)胞系相融合而制備。優(yōu)選的無限增殖細(xì)胞系是對含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和胸腺嘧啶核甙的培養(yǎng)基(″HAT培養(yǎng)基″)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。任何一定數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞系依照現(xiàn)有技術(shù)均可作為進(jìn)行融合的一部分，例如，P3-NSl/1-Ag4-1，P3-x63Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，Rockville，Md。典型地，HAT-sensitive小鼠骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞用聚乙二醇(″PEG″)融合。所得的雜交瘤用HAT培養(yǎng)基篩選，這種培養(yǎng)基能殺死非融合的和非成功融合的骨髓瘤細(xì)胞(非融合的脾細(xì)胞在幾天后，由于不轉(zhuǎn)化而死亡)。產(chǎn)生可特異地識別兩個有用的結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子的抗體的雜交瘤，通過在所述雜交瘤培養(yǎng)物上清液中篩選所述抗體進(jìn)行鑒定，例如用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗以篩選那些可特異地與兩個相關(guān)分子結(jié)合的抗體。根據(jù)所需的抗體不同，可使用不同的動物宿主進(jìn)行體內(nèi)免疫?？墒褂米陨肀磉_(dá)有用的內(nèi)源抗原的宿主，或使用已導(dǎo)致有用內(nèi)源抗原缺陷的宿主。例如，已表明在相應(yīng)的內(nèi)源基因處進(jìn)行同源重組而導(dǎo)致特定的內(nèi)源蛋白缺陷的小鼠(即，″剔除″小鼠)當(dāng)用所述蛋白進(jìn)行免疫時，可對該蛋白產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，因此，可用于產(chǎn)生對該蛋白具有高親和力的單克隆抗體(參見，例如，Roes，J.等(1995)J.Immunol.Methods183231-237；Lunn，M.P.等(2000)J.Neurochem.75404-412)。多種非人哺乳動物可作為生產(chǎn)非人抗體(例如，針對人雙特異性抗原的)的合適宿主，其包括但不限于小鼠，大鼠，兔和山羊(以及上述動物的剔除形式)，但對于生產(chǎn)雜交瘤而言，小鼠是優(yōu)選的。而且對于生產(chǎn)針對人雙特異性抗原的完全的人抗體，也可以利用表達(dá)所有人抗體組分的非人動物宿主。所述的非人動物包括轉(zhuǎn)基因帶有人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的動物(例如，小鼠)，hu-PBMC-SCID嵌合小鼠，和人/小鼠輻射嵌合體，其在下面進(jìn)行詳細(xì)討論。由此，在一個實施方案中，用雙特異性抗原免疫的動物是非人哺乳動物，優(yōu)選小鼠，其對于人免疫球蛋白而言是轉(zhuǎn)基因的，因此，這種非人哺乳動物(例如，小鼠)對于抗原刺激產(chǎn)生人抗體。在這些動物中，典型地，人種系結(jié)構(gòu)重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因引入工程化的動物，由此使所述動物的內(nèi)源重鏈和輕鏈位點失活。當(dāng)所述動物受到抗原(例如，人抗原)刺激時，產(chǎn)生人免疫球蛋白序列衍生的抗體(即，人抗體)，所述的人單克隆抗體可利用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)通過淋巴細(xì)胞制備。對人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠以及它們在生產(chǎn)人抗體中的用途的進(jìn)一步描述參見例如，U.S.PatentNo.5,939,598，PCTPublicationNo.WO96/33735，PCTPublicationNo.WO96/34096，PCTPublicationWO98/24893和PCTPublicationWO99/53049toAbgenixInc.，和U.S.PatentNo.5,545,806，No.5,569,825，No.5,625,126，No.5,633,425，No.5,661,016，No.5,770,429，No.5,814,318，No.5,877,397和PCTPublicationWO99/45962toGenpharmInc.SeealsoMacQuitty，J.J.和Kay，R.M.(1992)Science2571188；Taylor，L.D.等(1992)NucleicAcids.Res.206287-6295；Lonberg，N.等(1994)Nature368856-859；Lonberg，N.andHuszar，D.(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93；Harding，F(xiàn).A.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764536-546；Fishwild，D.M.等(1996)NatureBiotechnology14845-851；Mendez，M.J.等(1997)NatureGenetics15146-156；Green，L.L.和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188483-495；Green，L.L.(1999)J.Immunol.Methods23111-23；Yang，X.D.等(1999)J.Leukoc.Biol.66401-410；Gallo，M.L.等(2000)Eur.J.Immunol.30534-540。在又一實施方案中，所述的用雙特異性抗原免疫的小鼠是用人外周血單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞或其前體重建的重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)的小鼠。這種小鼠，即hu-PBMC-SCID嵌和小鼠，已表明其對抗原刺激產(chǎn)生人免疫球蛋白應(yīng)答。對于這些小鼠以及其在抗體產(chǎn)生方面的進(jìn)一步描述參見例如Leader，K.A.等(1992)Immunology76229-234；Bombil，F(xiàn).等(1996)Immunobiol.195360-375；Murphy，W.J.等(1996)Semin.Immunol.8233-241；Herz，U.等(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.113150-152；Albert，S.E.等(1997)J.Inanauol.1591393-1403；Nguyen，H.等(1997)Microbiol.Immunol.41901-907；Arai，K.等(1998)J.Immunol.Methods21779-85；Yoshinari，K.andArai，K.(1998)hybridoma1741-45；Hutchins，W.A.等(1999)hybridoma18121129；Murphy，W.J.等(1999)Clin.Immunol.9022-27；Smithson，S.L.等(1999)Mol.Immunol.36113-124；Chamat，S.等(1999)J.Infect.Diseases180268-277；和Heard，C.等(1999)Molec.Med.535-45。在又一實施方案中，所述的用雙特異性抗原免疫的動物是下述的小鼠，所述小鼠經(jīng)致死劑量全身輻射處理，接下來用重度聯(lián)合免疫缺損(SCID)的小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行輻射防護(hù)，接下來移入功能性的人淋巴細(xì)胞。這種嵌和類型指Trimera系統(tǒng)已用于通過有用抗原免疫小鼠產(chǎn)生單克隆抗體，再通過標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)篩選單克隆抗體。對于這些小鼠以及它們在抗體產(chǎn)生方面的用途的進(jìn)一步描述參見例如Eren，R.等(1998)Immunology93154-161；Reisner，Y和Dagan，S.(1998)TrendsBiotechnol.16242-246；Ilan，E.等(1999)Hepatology29553-562；和Bocher，W.O.等(1999)Immunology96634-641.B.體外途徑作為通過體內(nèi)免疫和篩選制備雙特異性抗體的替代方式，本發(fā)明的雙特異性抗體可通過，由雙特異性抗原篩選重組的免疫球蛋白文庫鑒定和分離(例如，抗體噬菌體展示文庫)，由此分離可特異性結(jié)合有用的兩個結(jié)構(gòu)上相關(guān)、但并不相同的免疫球蛋白文庫成員。產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的試劑盒是可商購的(例如，Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(tǒng)CatalogNo.279400-01；和theStratageneSu7JZAPTM噬菌體展示試劑盒，CatalogNo.240612)。在不同的實施方案中，所述的噬菌體展示文庫是scFv文庫或Fab文庫。篩選重組抗體文庫的噬菌體展示技術(shù)已在現(xiàn)有技術(shù)中有詳細(xì)描述。特別適合于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫的方法實施例和化合物可以參考例如，McCafferty等InternationalPublicationNo.WO92/01047，U.S.PatentNo.5,969,108和EP589,877(特別描述了scFv的展示)，Ladner等U.S.PatentNo.5,223,409，No.5,403,484，No.5,571,698，No.5,837,500和EP436,597(描述了例如，pIII融合)；Dower等InternationalPublicationNo.WO91/17271，U.S.PatentNo.5,427,908，U.S.PatentNo.5,580,717和EP527,839(特別描述了Fab的展示)；Winter等InternationalPublicationWO92/20791和EP368,684(特別描述了免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的克隆)；Griffiths等U.S.PatentNo.5,885,793和EP589,877(特別描述了通過重組文庫篩選針對人抗原的人抗體)；Garrard等InternationalPublicationNo.WO92/09690(特別描述了噬菌體表達(dá)技術(shù))；Knappik等InternationalPublicationNo.WO97/08320(描述了人重組抗體文庫HuCal)；Salfeld等InternationalPublicationNo.WO97/29131，描述了針對人抗原(人腫瘤壞死因子α)的重組人抗體的制備，以及重組抗體的體外親和成熟)，Salfeld等U.S.ProvisionalApplicationNo.60/126,603描述了針對人抗原(人IL-12)的重組人抗體的制備體外，以及重組抗體的體外親和成熟)。其他有關(guān)篩選重組抗體文庫的描述參見科學(xué)出版物，例如Fuchs等(1991)Bio/technique91370-1372；Hay等(1992)HumAntibodhybridomas381-85；Huse等(1989)Science2461275-1281；Griffiths等(1993)EMBOJ12725-734；Hawkins等(1992)JMolBiol226889-896；Clarkson等(1991)Nature352624-628；Gram等(1992)PNAS893576-3580；Garrad等(1991)Biol技術(shù)91373-1377；Hoogenboom等(1991)NucAcidRes194133-4137；Barbas等(1991)PNAS887978-7982；McCafferty等Nature(1990)348552-554；和Knappik等(2000)J.Mol.Biol.29657-86。作為使用細(xì)菌噬菌體展示系統(tǒng)的替代，重組抗體也可以在酵母細(xì)胞表面和細(xì)菌細(xì)胞表面表達(dá)。制備和篩選在酵母細(xì)胞表面表達(dá)的文庫的方法在PCTPublicationWO99/36569中有進(jìn)一步的描述。制備和篩選在酵母細(xì)胞表面表達(dá)的文庫的方法在PCTPublicationWO98/49286中有進(jìn)一步的描述。當(dāng)有用的抗體從重組文庫中鑒定出來后，可通過標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)技術(shù)分離編碼所述抗體重鏈和輕鏈的DNAs，例如通過PCR擴(kuò)增在文庫篩選過程中分離的展示包裝(例如，噬菌體)的DNA。現(xiàn)有技術(shù)中已知由抗體輕鏈和重鏈的核苷酸序列可制備PCR引物。例如，已公開了許多這樣的序列，如Kabat，E.A.，等(1991)SequencesofproteinofImmunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealth和HumanServices，NIHPublicationNo.91-3242和″Vbase″人種系序列數(shù)據(jù)庫?？贵w，或抗體的一部分可通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因而制備。為表達(dá)重組抗體，用一種或多種帶有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，以使得所述的輕鏈和重鏈在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并優(yōu)選地，分泌到培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，再從所述培養(yǎng)基中回收所述的抗體。用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因整合到重組表達(dá)載體中，再將所述載體引入宿主細(xì)胞，如下述文獻(xiàn)中所述例如Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis(eds)，MolecularCloning；ALaboratoryManual，SecondEdition，ColdSpringHarbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F(xiàn).M.等(eds.)CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates，(1989)和inU.S.PatentNo.4,816,397byBoss等。在獲得了編碼有用抗體VH和VL節(jié)段的DNA片段后，這些片段可通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變?yōu)槿L的抗體鏈基因，F(xiàn)ab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL-或VH的DNA片段可操作地與編碼另一蛋白，例如抗體恒定區(qū)或可變接頭的DNA片段相連接。在本文中所用的術(shù)語“可操作地連接”是指結(jié)合所述的DNA片段，使得所述氨基酸序列的編碼DNA片段的保持閱讀框不變。所分離的編碼VH區(qū)域的DNA可通過下述方式轉(zhuǎn)化成全長的重鏈基因，所述的方式為將所述的VH-編碼DNA可操作地與另一編碼重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)DNA的分子相連接。所述的人重鏈恒定區(qū)基因是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat，E.A.，等(1991)SequencesofproteinofImmunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242)包含這些區(qū)域的DNA片段可由標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增獲得。所述的重鏈恒定區(qū)可能是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選的是IgG1或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，所述VH-編碼DNA可以可操作地與另一僅編碼重鏈恒定區(qū)的DNA分子相連接。所分離的編碼VL區(qū)域的DNA可通過下述的方式轉(zhuǎn)化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)，所述的方式為，將VL-編碼DNA與另一編碼所述輕鏈恒定區(qū)，CL的DNA分子可操作地連接。所述的人輕鏈恒定區(qū)基因序列是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Kabat，E.A.，等(1991)SequencesofproteinofInarynunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242)包含這些區(qū)域的DNA片段可通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增獲得。所述的輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)，但最優(yōu)選的是κ恒定區(qū)。為構(gòu)建scFv基因，所述的VH-和VL-編碼DNA片段可操作地與另一編碼可變接頭的片段相連接，例如編碼所述氨基酸序列(Gly4-Ser)3，從而使所述的VH和VL序列作為連續(xù)的單鏈蛋白表達(dá)，所述的VL和VH由可變接頭連接(參見例如，Bird等(1988)Science242423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883；McCafferty等，Nature(1990)348552-554)。為表達(dá)本發(fā)明的重組抗體，或抗體的一部分，由上述方法獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA可以插入到表達(dá)載體中，從而使所述基因可操作地與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列相連接。在本文中所用的術(shù)語“可操作地與……相連接”是指將抗體基因連接到載體中，以使得在所述載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮其各自的功能，調(diào)節(jié)所述抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。選擇所述的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列要適合于表達(dá)用的宿主細(xì)胞。所述的抗體輕鏈和抗體重鏈可插入到不同的載體中，或典型地，兩基因均插入到同一表達(dá)載體中。所述的抗體基因可通過標(biāo)準(zhǔn)的方法(例如，將抗體基因片段和載體上互補(bǔ)的限制性酶切位點相連接，或者在沒有限制性位點時用平末端連接)插入到載體中。在插入輕或重鏈序列之前，所述的載體可能已經(jīng)載有抗體恒定區(qū)序列。例如一種將VH和VL序列轉(zhuǎn)化為全長抗體基因的方法是將它們插入到已分別包含編碼重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，由此使所述VH節(jié)段在載體內(nèi)即與CH節(jié)段可操作地連接，所述的VL節(jié)段也在載體內(nèi)與CL節(jié)段相連接。附加的或可替代地，所述的重組表達(dá)載體可編碼使所述抗體鏈易于從宿主細(xì)胞中分泌出來的信號肽。所述的抗體鏈基因可以克隆到載體中，由此使得所述信號肽框內(nèi)連接到所述抗體鏈基因的氨基末端。所述的信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來源于非免疫球蛋白的信號肽)。除所述抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組帶有在宿主細(xì)胞中控制抗體鏈基因表達(dá)的調(diào)控序列。所用的術(shù)語“調(diào)控序列”是指包括控制抗體鏈基因表達(dá)的啟動子，增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控元件(例如，聚腺苷酸信號)。這些調(diào)控序列在下述文獻(xiàn)中已有描述，例如，Goeddel；GeneExpression技術(shù)MethodsinEnvmology185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對所述表達(dá)載體的設(shè)計，包括選擇調(diào)控序列應(yīng)當(dāng)根據(jù)與對被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白的表達(dá)水平等相同的影響因素進(jìn)行。優(yōu)選地用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控序列包括可指導(dǎo)蛋白在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如來自下述病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子，來自巨細(xì)胞病毒(CMV)的(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)，來自猴病毒40(SV40)的(例如SV40啟動子/增強(qiáng)子)，來自腺病毒的(例如腺病毒主要的晚期啟動子(AdMLP))和來自多瘤病毒的。對病毒調(diào)控元件和其序列的詳細(xì)描述參見例如，U.S.PatentNo.5,168,062byStinski，U.S.PatentNo.4,510,245byBell等和U.S.PatentNo.4,968,615bySchaffner等。除所述的抗體鏈基因和調(diào)控序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以帶有其它的序列，例如調(diào)控載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點)和選擇標(biāo)記基因。所述的選擇標(biāo)記基因便于將已引入了所述載體的宿主細(xì)胞篩選出來(參見例如，U.S.PatentsNos.4,399,216，4,634,665和5,179,017，allbyAxel等)。例如典型地，所述選擇標(biāo)記基因賦予轉(zhuǎn)入了所述載體的宿主細(xì)胞對藥物的抗性，例如G418，潮霉素或氨甲喋呤。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(對dhfr-的宿主細(xì)胞用氨甲喋呤篩選/擴(kuò)增)和neo基因(G418篩選)。為使輕和重鏈表達(dá)，所述的編碼重和輕鏈的表達(dá)載體通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的多種形式指包括多種通常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細(xì)胞的方法，例如電穿孔，磷酸鈣沉淀，DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管從理論上講，在原核和真核宿主細(xì)胞中均可以表達(dá)本發(fā)明的抗體，但最優(yōu)選的是真核細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞，這是因為與原核細(xì)胞相比，真核細(xì)胞特別是哺乳動物細(xì)胞更易于分泌經(jīng)適當(dāng)折疊并具有免疫活性的抗體。有報道，抗體基因在原核生物中表達(dá)高收率的活性抗體的效率低(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)ImmunologyToday612-13)。優(yōu)選的表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括dhfr-CHO細(xì)胞，參見Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220，usedwithaDHFRselectablemarker，例如，asdescribedinR.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159601-621)，NSO骨髓瘤細(xì)胞，COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體引入哺乳動物細(xì)胞中后，所述的抗體由該宿主細(xì)胞在足以使所述抗體在該宿主細(xì)胞中表達(dá)或分泌到該宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中的一段時間內(nèi)產(chǎn)生?？衫脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白純化方法從培養(yǎng)基中回收所述的抗體。宿主細(xì)胞也可用于生產(chǎn)完整抗體的一個部分，例如Fab片段或scFv分子。應(yīng)當(dāng)理解，對上述方法的變異也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可能需要用編碼本發(fā)明的抗體的重鏈或輕鏈(不是兩者兼有)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。重組DNA技術(shù)也可以用于去除一些或全部與結(jié)合有用抗原無關(guān)的編碼輕鏈和/或重鏈的DNA。由截短的DNA分子表達(dá)的分子也包含在本發(fā)明的抗體的范圍內(nèi)。另外，雙功能抗體也可通過下述方式產(chǎn)生，其中一條輕鏈和一條重鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的抗體，另一條重鏈和輕鏈對所述有用抗原之外的抗原具有特異性，它們是通過化學(xué)交聯(lián)方法使本發(fā)明的抗體和另外的抗體交聯(lián)起來形成的。優(yōu)選的用于使本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分重組表達(dá)的系統(tǒng)，編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達(dá)載體通過磷酸鈣沉淀介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染引入到dhfr-CHO細(xì)胞中。在重組表達(dá)載體內(nèi)，所述的抗體重鏈和輕鏈基因分別可操作地連接到CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動子上，以驅(qū)動所述基因的高水平轉(zhuǎn)錄。所述的重組表達(dá)載體還帶有DHFR基因，以利于通過氨甲喋呤篩選/擴(kuò)增篩選已經(jīng)所述載體的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。培養(yǎng)篩選出的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞使抗體重鏈和輕鏈表達(dá)，并從培養(yǎng)基中回收完整的抗體。可利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基中回收抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供合成本發(fā)明的重組抗體的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，直到本發(fā)明的重組抗體合成為止。該方法進(jìn)一步包括從培養(yǎng)基中分離重組抗體。作為用噬菌體展示篩選重組抗體文庫的替代，本領(lǐng)域已知的其他用于大量篩選重組文庫的方法均可用于鑒定本發(fā)明的雙特異性抗體。一種作為替代的表達(dá)系統(tǒng)是重組抗體文庫作為RNA-蛋白融合體表達(dá)，參見PCTPublicationNo.WO98/31700bySzostak和Roberts，和inRoberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9412297-12302。在這一系統(tǒng)中創(chuàng)建了mRNA和肽或蛋白的共價融合，其通過合成mRNA的體外翻譯編碼，所述的mRNA的3′末端帶有嘌呤霉素，肽基受體抗生素。由此可以從基于所編碼的肽或蛋白例如，抗體，或其中部分的復(fù)雜mRNA混合物(例如重組文庫)中富集mRNA例如，使抗體，或其中的部分與所述的雙特異性抗原相結(jié)合。通過篩選這種文庫回收的編碼抗體或其部分的核酸序列可通過上述的重組方式表達(dá)(例如在哺乳動物宿主細(xì)胞中)，并且可通過下述方式進(jìn)行進(jìn)一步的親和成熟，即通過附加的對mRNA-肽融合體的篩選，其中在最初篩選出的序列中已引入了突變；或通過上述的其他重組抗體體外親和成熟方式C.組合的方法本發(fā)明的雙特異性抗體可通過結(jié)合了體內(nèi)和體外方法制備，例如下述的方法，其中，所述的雙特異性抗原暴露于哺乳動物體內(nèi)所有抗體組分以刺激可與所述的雙特異性抗原結(jié)合的抗體產(chǎn)生，但進(jìn)一步用一種或多種體外技術(shù)進(jìn)行抗體篩選和/或成熟(即改進(jìn))。在一個實施方案中，這種組合方法包括，首先免疫非人動物(例如，小鼠，大鼠，兔或山羊或或這些動物的轉(zhuǎn)基因形式，或嵌合小鼠)用所述的雙特異性抗原刺激針對所述抗原的抗體應(yīng)答，接下來用淋巴細(xì)胞的免疫球蛋白序列制備和篩選噬菌體展示抗體文庫，所述的淋巴細(xì)胞在體內(nèi)通過暴露于所述的雙特異性抗原而受到刺激。這一結(jié)合方法的第一步驟可通過上述的IIA部分進(jìn)行，第二步可通過上述的IIB部分進(jìn)行。優(yōu)選的非人動物超免疫方法，接下去是體外噬菌體展示文庫的體外篩選，所述的噬菌體文庫是通過受到刺激的淋巴細(xì)胞制備的，包括BioSiteInc.所描述的，參見例如，PCTPublicationWO98/47343，PCTPublicationWO91/17271，U.S.PatentNo.5,427,908和U.S.PatentNo.5,580,717。在又一實施方案中，組合的方法包括，首先免疫非人動物(例如，小鼠，大鼠，兔或山羊或這些動物的剔除和/或轉(zhuǎn)基因形式或嵌合小鼠)，用所述的雙特異性抗原刺激針對該抗原的抗體應(yīng)答，并篩選產(chǎn)生所需雙特異性抗體(例如通過篩選所免疫的動物制備的雜交瘤)的淋巴細(xì)胞。然后分離來自所選擇的克隆的抗體基因(通過標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法，例如反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和易于體外親和成熟，由此增強(qiáng)所選擇的抗體的結(jié)合特性。這一結(jié)合方法的第一步驟可通過上述的IIA部分進(jìn)行，第二步可通過上述的IIB部分進(jìn)行，具體說來利用體外親和方法，例如在PCTPublicationWO97/29131和PCTPublicationWO00/56772中所描述的。在另一組合方法中，利用在本領(lǐng)域中稱為篩選的淋巴細(xì)胞抗體方法(SLAM)通過單一的、分離的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，參見U.S.PatentNo.5,627,052，PCTPublicationWO92/02551和Babcock，J.S.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA937843-7848。在這一方法中，在應(yīng)用于本發(fā)明的雙特異性抗體時，首先用所述的雙特異性抗原在體內(nèi)免疫非人動物(例如，小鼠，大鼠，兔，山羊，或這些動物的轉(zhuǎn)基因形式，或嵌合小鼠)，刺激針對所述抗原的抗體應(yīng)答，然后通過抗原-特異的溶血空斑試驗(例如，所述的雙特異性抗原自身，或所述的有用的結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子用接頭，例如生物素與綿羊紅細(xì)胞相偶聯(lián)，由此通過溶血空斑試驗鑒定分泌具有合適特異性的抗體的單細(xì)胞)篩選分泌有用抗體的單細(xì)胞，例如對所述的雙特異性抗原具有特異性的抗體。在鑒定了有用的抗體-分泌細(xì)胞后，從所述細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)錄酶-PCR回收重-和輕-鏈可變區(qū)域cDNA，然后這些可變區(qū)域可在所述哺乳動物宿主細(xì)胞，例如COS或CHO細(xì)胞中的適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍缀愣▍^(qū)(例如，人恒定區(qū)s)表達(dá)。用擴(kuò)增的免疫球蛋白序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可進(jìn)行進(jìn)一步地分析和體外篩選，例如通過從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中淘選表達(dá)具有所需的雙特異性的抗體的分離細(xì)胞，所述的免疫球蛋白可來自體內(nèi)篩選的淋巴細(xì)胞。所擴(kuò)增的免疫球蛋白序列可進(jìn)一步進(jìn)行體外操作，例如通過上述的體外親和成熟。在又一實施方案中，所述的產(chǎn)生雙特異性抗體的結(jié)合方法包括下述步驟。首先用第一抗原免疫非人動物，用第二個不同的抗原免疫第二非人動物體內(nèi)刺激抗體應(yīng)答，其中，優(yōu)選地，第二抗原與第一抗原結(jié)構(gòu)上類似。如IIB中所述，分別由第一非人動物和第二非人動物構(gòu)建重組重鏈文庫和重組輕鏈文庫。將用第一抗原免疫的動物制備的所述的重鏈文庫與用第二抗原免疫的動物制備的所述的輕鏈文庫結(jié)合產(chǎn)生抗體文庫X。類似地，由用第二抗原免疫的動物制備的所述重鏈文庫與用第一抗原免疫的動物制備的所述的輕鏈文庫結(jié)合制備抗體文庫Y。此外，可結(jié)合文庫X和Y以產(chǎn)生文庫XY?？捎蒟，Y和/或XY文庫鑒定和分離可與第一和第二抗原結(jié)合的雙特異性抗體。III雙特異性抗體的特征本發(fā)明提供雙特異性抗體及其抗體部分，其可依照本發(fā)明的方法制備。優(yōu)選地，所述的抗體，或其部分，是分離的抗體。優(yōu)選地，所述抗體，或其部分是中和抗體。本發(fā)明的抗體包括單克隆和重組抗體，及其部分。在多種實施方案中，所述的抗體，或其部分可以包括完全由單一的種衍生的氨基酸序列，例如完全的人或完全的小鼠抗體，或其部分。在另一實施方案中，所述的抗體，或其部分可以是嵌合抗體或CDR-移植的抗體或其他人源抗體形式。此處所用的術(shù)語″抗體″是指免疫球蛋白分子，其包括四條多肽鏈，兩重鏈(H)鏈和兩輕(L)鏈通過二硫鍵在中間連接起來。每一重鏈包括重鏈可變(在此處縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。所述的重鏈恒定區(qū)由三個結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3。每一條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)域(此處縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。所述的輕鏈恒定區(qū)包括一個結(jié)構(gòu)域CL。所述的VH和VL區(qū)域可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，成為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間散布的較為保守的區(qū)域，成為框架區(qū)(FR)。每一VH和VL包括三個CDRs和四個FR，依照下述順序從氨基末端到羧基末端排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。此處所用術(shù)語抗體的″抗原-結(jié)合部分″(或簡寫為″抗體部分″)是指一個或多個保持了與兩個不同、但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原相結(jié)合能力的雙特異性抗體結(jié)合片段。已表明抗體的抗原-結(jié)合功能也可由全長抗體的片段執(zhí)行。包含在術(shù)語抗體的″抗原-結(jié)合部分″中的結(jié)合片段包括(i)Fab片段，由VL，VH，CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段包括在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵相結(jié)合的兩個Fab片段的二價片段(iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)域(CDR)。而且，盡管Fv片段的兩個區(qū)域，VL和VH由不同的基因編碼，但可以利用重組技術(shù)通過合成的接頭相連接，從而使它們成為單一的蛋白鏈，其中VL和VH區(qū)域配對形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等(1988)Science242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。這種抗體也包含在術(shù)語抗體的″抗原-結(jié)合部分″中。其它形式的單鏈抗體，例如雙抗也包含在內(nèi)。雙抗是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在一條多肽鏈上表達(dá)，但使用一種過短以至于不能在一條鏈的兩結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行配對的接頭，由此迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，從而創(chuàng)建了兩個抗原結(jié)合位點(參見例如，Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure21121-1123)。更進(jìn)一步，所述的抗體或其抗原結(jié)合部分可以是大的免疫粘附分子的一部分，由抗體或抗體的一部分與一個或多個其他蛋白或肽通過供價或非共價方式締合。這種免疫粘附分子的例子包括應(yīng)用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)域制備四部分的scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1995)HumanAntibodiesandHybridomass693-101)和利用半胱氨酸殘基，標(biāo)記肽和C-末端聚組氨酸標(biāo)記以制備二價和生物素?；膕cFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1994)Mol.Immunol.311047-1058)?？贵w部分，例如Fab和F(ab′)2片段可由完整的抗體通過常規(guī)技術(shù)，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，分別消化完整抗體制備。而且，抗體，抗體部分和免疫粘附分子可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)制備。此處所用的″分離的雙特異性抗體″是指基本上沒有具有不同抗原特異性抗體的雙特異性抗體(例如經(jīng)分離的抗體，其能特異性結(jié)合兩個不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原，或其它非相關(guān)的抗原的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的區(qū)域，但其基本上不含與其它非相關(guān)的抗原特異結(jié)合的抗體)。而且，分離的雙特異性抗體可基本上不含有任何細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)物質(zhì)。此處所用到的″中和抗體″是指某種抗體，其與特定抗原的結(jié)合導(dǎo)致該抗原生物活性受到抑制。該抗原生物活性的抑制可以用合適的體外或體內(nèi)試驗測定一種或多種該抗原生物活性的指示物進(jìn)行評估。此處所用到的″單克隆抗體″是指雜交瘤衍生的抗體(例如，通過雜交瘤技術(shù)，例如標(biāo)準(zhǔn)的Kohler和Milstein雜交瘤方法，制備的雜交瘤分泌的抗體)。因此，雜交瘤-衍生的本發(fā)明的雙特異性抗體也指對不止一種抗原具有抗原特異性的單克隆抗體。詞組″重組抗體″指通過重組技術(shù)制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的抗體，例如由轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，由重組子、重組抗體文庫分離的抗體，由轉(zhuǎn)入了人免疫球蛋白基因的動物(例如，小鼠)中分離的抗體(參見例如，Taylor，L.D.，等(1992)Nucl.AcidsRes.206287-6295)或由其它，包括剪接特定的免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)成為其它DNA序列的途徑制備、表達(dá)、創(chuàng)建或分離的抗體。重組抗體的例子包括嵌合的，CDR-移植的和人化的抗體。術(shù)語″人抗體″指具有相應(yīng)于或來源于人種免疫球蛋白可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體，參見例如，Kabat等(SeeKabat，等(1991)SequencesofproteinofImmunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIHPublicationNo.91-3242)。本發(fā)明所述的人抗體可以包括不由人種免疫球蛋白編碼的氨基酸殘基(例如，由隨機(jī)或體外定點誘變或體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)，例如在CDRs和特別是CDR3。本發(fā)明的重組人抗體具有可變區(qū)，也可能包括來源于人種免疫球蛋白序列的恒定區(qū)(參見Kabat，E.A.，等(1991)SequencesofproteinofImmunologicalInterest，F(xiàn)ifthEdition，U.S.DepartmentofHealth和HumanServices，NIHPublicationNo.913242)。在特定的實施方案中，這種重組人抗體易于進(jìn)行體外誘變(或當(dāng)用人Ig序列轉(zhuǎn)化動物時是體內(nèi)體細(xì)胞突變)因此，當(dāng)衍生自或與人種VH和VL序列相關(guān)時，所述的重組抗體的VH和VL區(qū)域的氨基酸序列不是天然存在于人抗體種系所有組分中的序列。在特定的實施方案中，這種重組抗體是選擇性誘變或回復(fù)突變的結(jié)果。術(shù)語″回復(fù)突變″指一個過程，其中一些或全部體細(xì)胞突變的人抗體氨基酸被來自同源種系抗體序列的相應(yīng)種系殘基所替代。本發(fā)明人抗體的重和輕鏈序列分別與VBASE數(shù)據(jù)庫中的種系序列相對比以鑒定出具有最高同源性的序列。通過對所定義的編碼這些不同氨基酸的核苷酸位置突變，使在本發(fā)明人抗體的差異恢復(fù)到所述的種系序列。應(yīng)當(dāng)研究通過回復(fù)突變鑒定出的每一氨基酸的功能在抗原結(jié)合中的直接或間接的作用，突變后影響所需人抗體特性的任何氨基酸都不應(yīng)當(dāng)包括在最終的人抗體中。為減少易于回復(fù)突變的氨基酸的數(shù)量那些與最接近的種系序列不同但與第二種系相應(yīng)氨基酸相同的氨基酸的位置可以保留，條件是上述第二種系序列與本發(fā)明的人抗體序列在所研究的氨基酸的兩側(cè)有至少10，優(yōu)選12個氨基酸是相同或共線性的?；謴?fù)突變可能出現(xiàn)在抗體優(yōu)化的任何階段。術(shù)語″嵌合抗體″指包含來自一個種的重和輕鏈可變區(qū)序列和來自另一種的恒定區(qū)序列的抗體，例如鼠重和輕鏈可變區(qū)與人恒定區(qū)相連接的抗體。術(shù)語″CDR-移植的抗體″指包含來自一個種的重和輕鏈可變區(qū)序列，但其中VH和/或VL的一個或多個CDR區(qū)域被另一種的CDR序列所替代的抗體，例如具有鼠重和輕鏈可變區(qū)，但其中一個或多個鼠CDR(例如，CDR3)被人CDR序列所替代的抗體。術(shù)語″人化的抗體″指包含來自非人種(例如，小鼠)的重和輕鏈可變區(qū)序列，但其中VH和/或VL序列的至少一部分被改變?yōu)楦邦愃朴谌恕?，即與人種可變區(qū)序列更相似的抗體。人化的抗體的一種類型是CDR-移植的抗體，其中將人CDR序列引入到非人VH和VL序列中以替代相應(yīng)的非人CDR序列。一種測定抗體結(jié)合動力學(xué)的方法是通過表面胞質(zhì)團(tuán)共振。此處所用的術(shù)語″表面胞質(zhì)團(tuán)共振″指一種光學(xué)現(xiàn)象，其通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)蛋白濃度的改變，例如利用BIAcore系統(tǒng)(PharmaciaBiosensorAB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)可進(jìn)行實時生物特異的相互作用分析。進(jìn)一步的描述參見Jnsson，U.，等(1993)Ann.Biol.Clin.5119-26；Jnsson，U.，等(1991)Biotechniques11620-627；Johnsson，B.，等(1995)J.Mol.Recognit.8125-131；andJohnnson，B.，etal.(1991)Anal.Biocllem.198268-277。此處所用的術(shù)語″Koff″是指抗體從抗體/抗原復(fù)合物中解離出來的解離速率常數(shù)。此處所用的術(shù)語″Kd″是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。用上述第II部分中所描述的不同的制備抗體的方法制備本發(fā)明的雙特異性抗體。本發(fā)明的雙特異性抗體可直接針對本質(zhì)上任何結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原，而優(yōu)選地，本發(fā)明的雙特異性抗體是那些特異結(jié)合于IL-1α和IL-β的抗體，其可用雙特異性抗原，例如那些在實施例1-4中描述的特異性抗原制備。其他可應(yīng)用于本發(fā)明的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原包括，但不限于caspase家族成發(fā)員，細(xì)胞因子家族，例如IL-1家族成員(例如，IL-l/IL-18)，TNF家族成員(例如，TNFα/TNFβ)，IL-6家族成員，干擾素，TGFβ家族成員，EGF家族成員，F(xiàn)GF家族成員，PDGF家族成員，VEGF家族成員，血管形成素(Angiopoietin)家族成員，骨形成蛋白，分泌的蛋白酶(金屬蛋白酶)，和細(xì)胞因子受體家族，例如IL-1-受體家族成員，TNF-受體家族成員TGFβ受體家族成員，EGF受體家族成員，F(xiàn)GF受體家族成員，PDGF受體家族成員，VEGF受體家族成員和血管形成素(Angiopoietin)受體家族成員。本發(fā)明的雙特異性抗體可表現(xiàn)對其所結(jié)合的兩個不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原等同的結(jié)合活性，或者所述的雙特異性抗體優(yōu)先與上述兩抗原之一結(jié)合，但與非相關(guān)的抗原相比，對上述兩個相關(guān)的抗原仍具有特異性。雙特異性抗體對上述結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原以及對非相關(guān)的抗原的結(jié)合活性可利用標(biāo)準(zhǔn)的體外免疫測定，例如ELISA或BIAcore試驗進(jìn)行評估。優(yōu)選地，所述抗體對非相關(guān)的抗原的Kd與抗體對結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原的Kd的比率應(yīng)當(dāng)至少為3，更優(yōu)選地，所述比率至少為5，更優(yōu)選地，所述比率至少為10，或更優(yōu)選地，所述比率至少為50，100，200，300，400，500，600，700，800，900或1000。在定量的術(shù)語中，背景結(jié)合及雙特異性是水平或程度上的差異。例如，背景結(jié)合是低水平結(jié)合，如低于5％，更優(yōu)選低于3％和最優(yōu)選約為0.1-1％，而特異性交叉反應(yīng)性或雙特異性結(jié)合是高水平結(jié)合如，高于1％，更優(yōu)選高于3％，更優(yōu)選高于5％和更優(yōu)選高于10％。另外，優(yōu)選地，針對靶抗原的雙特異性抗體的IC50接近于給定生物實驗中抗原的ED50s。優(yōu)選地選擇本發(fā)明的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分是對其所結(jié)合的一個，優(yōu)選兩個抗原具有所需的結(jié)合動力學(xué)的(例如高親和，低解離，慢解離速率，強(qiáng)中和活性)例如，所述的雙特異性抗體，或其部分與一個或優(yōu)選兩個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原以由表面胞質(zhì)團(tuán)共振測定的下述koff速率常數(shù)相結(jié)合，koff速率常數(shù)為0.1s-1或更低，更優(yōu)選koff常數(shù)為1×10-2s-1或更低，更優(yōu)選koff速率常數(shù)為1×10-3s-1或更低，更優(yōu)選koff速率常數(shù)為1×10-4s-1或更低，或更優(yōu)選koff速率常數(shù)為1×10-5s-1或更低?？商娲?，或可附加地，雙特異性抗體，或其部分可以下述IC50抑制一個，優(yōu)選兩個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原的活性，IC50為1×10-6M或更低，更優(yōu)選IC50為1×107M或更低，更優(yōu)選IC50為1×10-8M或更低，更優(yōu)選IC50為1×10-9M或更低，更優(yōu)選IC50為1×10-1M或更低，或更優(yōu)選IC50為1×10-11M或更低。優(yōu)選地，IC50應(yīng)當(dāng)用靈敏的生物學(xué)實驗測定，在所述實驗中，IC50值應(yīng)當(dāng)接近于抗原的ED50值。本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含至少一種附加的治療試劑，例如一種或多種治療疾病的附加試劑，其中應(yīng)用所述的雙特異性抗體有利于改善所述疾病。例如，當(dāng)所述的雙特異性抗體特異性地與IL-α和IL-β結(jié)合時，所述的藥物組合物可進(jìn)一步包含一種或多種治療試劑，在所述疾病中IL-1的活性是有害的。本發(fā)明的抗體和抗體-部分可并入適合施用于受試者的藥物組合物中。典型地，所述藥物組合物包括本發(fā)明的抗體或抗體部分和藥學(xué)上可接受的載體。此處所用的″藥學(xué)上可接受的載體″包括任意或全部的溶劑，分散介質(zhì)，糖衣，抗菌劑和抗真菌劑，等滲的和延遲吸收試劑等生理上可配伍的試劑。藥學(xué)上可接受的載體的例子包括，一種或多種水，鹽溶液，磷酸鹽緩沖液，葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它們的組合。在許多情況下，其優(yōu)選地在組合物中包括等滲劑，例如，糖，聚乙醇，如甘露醇，山梨醇，或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載體可進(jìn)一步包括微量的輔助物質(zhì)，例如濕潤或乳化劑，防腐劑或緩沖劑，其可增強(qiáng)抗體或抗體部分的保存期或效力。本發(fā)明的抗體和抗體-部分可并入適合于非腸道施用的藥物組合物中。優(yōu)選地，抗體或抗體-部分制備成含有0.1250mg/ml抗體的可注射溶液。所述的可注射溶液可以液體或凍干的劑量形式包含在打火石或琥珀瓶，安瓿瓶或預(yù)先灌注的注射器中。緩沖液可以是L-組氨酸(1-50mM)，理想的是5-10mM，pH5.0到7.0(理想的是pH6.0)。其他合適的緩沖液包括，但不限于琥珀酸鈉，檸檬酸鈉，磷酸鈉或磷酸鉀。氯化鈉可在0-300mM(理想的是150mM的液體劑量形式)的濃度范圍內(nèi)用于改變?nèi)芤旱亩拘?。凍干的劑量形式還可以包含抗凍劑，主要是0-10％的蔗糖(理想的是0.5-1.0％)。其他合適的抗凍劑包括海藻糖和乳糖。凍干的劑量形式還可以包括膨脹劑，主要是1-10％甘露糖醇(理想的是2-4％)。在液體和和凍干的劑量形式中還可以包含穩(wěn)定劑，主要是1-50mML-甲硫氨酸(理想的是5-10mM)。其它合適的膨脹劑包括甘氨酸，精氨酸，可以0-0.05％的聚山梨酸酯-80(理想的是0.005-0.01％)的形式。其他的表面活性劑包括但不限于聚山梨酸酯20和BRU表面活性劑。本發(fā)明的組合物可以是多種形式。其包括例如，液體，半固體和固體的劑量形式，例如液體溶液(例如，可注射的和不熔化的溶液)分散劑或懸浮劑片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的方式依賴于施用方式和治療用途。典型的優(yōu)選組合物是可注射的或不熔化的溶液，例如那些類似于用其他抗體對人進(jìn)行被動免疫的組合物。優(yōu)選的施用形式是非腸道的(例如靜脈內(nèi)，皮下，腹膜內(nèi)，肌內(nèi))。在優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體通過靜脈內(nèi)注入或注射施用。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述的抗體通過肌內(nèi)或皮下注射。治療組合物典型地需經(jīng)過滅菌并在操作和貯存條件下保持穩(wěn)定。所述的組合物的配置成溶液，微量乳化作用，分散劑，脂質(zhì)體，或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。無菌注射溶液可通過下述方式制備，將所需劑量的活性化合物(即，抗體或抗體部分)按照要求摻入帶有一種或相組合的上述成分的溶劑中，然后過濾除菌。一般將活性化合物與無菌載體整合以制備分散劑，所述的載體包含堿性分散介質(zhì)和上述列舉的其他所需成分。對于用無菌凍干粉末制備無菌的可注射溶液的情況，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和噴霧干燥獲得活性組分粉末，以及來自預(yù)先無菌過濾的溶液的其他所需的附加成分?？杀３忠后w的適當(dāng)流動性，例如可以利用包膜，如卵磷脂，對于分散劑的情況保持所需的顆粒大小以及利用表面活性劑?？赏ㄟ^在所述組合物中添加延遲吸收的試劑，例如一硬脂酸鹽和明膠以延長可注射組合物的吸收。本發(fā)明的抗體和抗體-部分可以通過多種已知的方式施用，盡管對于許多治療應(yīng)用而言優(yōu)選的施用途徑/方式是皮下注射，靜脈內(nèi)注射或注入。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是所述的施用途徑和/或方式依所需結(jié)果而定。在一定的實施方案中，所述的活性化合物可與載體一起制備，所述的載體可以保護(hù)上述化合物，使之不至于急速釋放，例如可控制的釋放配方，包括嵌入，透皮貼劑，和微膠囊包裹的釋放系統(tǒng)。可使用能進(jìn)行生物降解的，生物親和的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯(ethylenevinylacetate)，聚酐類，聚乙二醇酸(polyglycolicacid)，膠原，聚原酸酯(polyorthoesters)，和聚乳酸(polylacticacid)。許多制備這些試劑的方法都是已有專利或為本領(lǐng)域已知的，參見例如，Sustained和ControlledReleaseDrugDeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1978。在一定的實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以口頭施用，例如利用惰性稀釋劑或可同化的食用載體。所述的化合物(和其它組分，如果需要的話)可包裹在硬或軟殼明膠膠囊中，壓縮成片狀或直接摻入受試者的日常飲食中。對于口服治療施用所述的化合物可與賦形劑一起，以可攝取的片劑，口腔片劑，錠劑，膠囊，酏劑，懸浮液，糖漿，糯米紙囊劑等形式使用。若以除非腸道之外的途徑施用本發(fā)明的化合物，則需要用防止所述化合物滅活的物質(zhì)包被，或與防止所述化合物滅活的物質(zhì)共同施用。所述組合物中還可以包含追加的活性化合物。在一定的實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種其他的治療試劑共同配制和/或共同施用，上述的其他治療試劑是對IL-1活性對起有害的疾病的治療中有用。例如，本發(fā)明的抗-IL-α/IL-1β雙特異性抗體，或抗體部分可與一種或多種附加的與其他靶物質(zhì)物結(jié)合的抗體(例如，與其他細(xì)胞因子結(jié)合的抗體或與細(xì)胞表面分子相結(jié)合的抗體)共同配置和/或共同施用。而且本發(fā)明的一種或多種抗體還可以與兩種或兩種以上的上述的治療試劑結(jié)合施用。這種結(jié)合治療的益處在于可以使用低劑量的治療試劑，從而避免了可能的毒性或與多種單一療法相關(guān)的復(fù)雜作用。IV.雙特異性抗體的應(yīng)用鑒于它們具有與兩個不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原相結(jié)合的能力，本發(fā)明的雙特異性抗體，或其部分可通過常規(guī)的免疫學(xué)分析方法，例如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，放射免疫分析(RIA)或組織免疫組織化學(xué)用于檢測任一或所有這些抗原(例如在生物樣品，如血清或血漿中)。本發(fā)明提供檢測生物樣品中的抗原的方法，該方法包括使所述生物樣品與本發(fā)明的可特異識別所述抗原的雙特異性抗體，或抗體部分抗原相接觸，并檢測與抗原結(jié)合的抗體(或抗體部分)，或非結(jié)合抗體(或抗體部分)，由此檢測所述生物樣品中的所述抗原。所述抗體用可檢測的物質(zhì)進(jìn)行直接或間接的標(biāo)記，以便于檢測結(jié)合或非結(jié)合抗體。合適的可檢測物質(zhì)包括多種酶，修復(fù)基團(tuán)，熒光物質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，乙酰膽堿酯酶；合適的修復(fù)基團(tuán)復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括7-羥基香豆素，熒光素，熒光素異硫氰酸鹽，鹼性蕊香紅B，二氯三嗪基胺熒光素，丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括3-氨基鄰苯二甲酰環(huán)肼；合適的放射性物質(zhì)的例子包括I125，I131，35S或3H。作為對抗體進(jìn)行標(biāo)記的替代，用可檢測的物質(zhì)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原物質(zhì)和所述抗原特異的未標(biāo)記的雙特異性抗體通過競爭免疫分析，在生物流體中對所述的抗原進(jìn)行試驗。在這一試驗中，所述的生物樣品，經(jīng)標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原和所述的雙特異性抗體相結(jié)合，確定與非標(biāo)記的抗體相結(jié)合的標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原的量。在所述生物樣品中的抗原的量和與非標(biāo)記的抗體相結(jié)合的標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原的量成反比。在優(yōu)選的實施方案中，所述的雙特異性抗體特異性識別IL-1α和IL-β和前述的檢測方法用于檢測IL-1α和/或IL-β。由此，本發(fā)明進(jìn)一步提供檢測生物樣品或組織中的IL-α或IL-β的方法，該方法包括使懷疑含有IL-α或IL-β的生物樣品或組織與本發(fā)明的雙特異性抗體，或抗原結(jié)合部分相接觸，并檢測所述生物樣品或組織中的IL-α或IL-β。所述的生物樣品可以是，例如體外樣品，如細(xì)胞、組織或體液樣品(例如血液，血漿，尿，唾液等)。而且，所檢測的組織可以是定位于受試者體內(nèi)的樣品，例如通過所述組織體內(nèi)成象所觀察的組織(例如，利用標(biāo)記的抗體)。本發(fā)明的雙特異性抗體也可用于診斷目的。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體用于體外診斷試驗，例如檢測有用抗原的實驗室試驗或在檢測有用抗原的保健試驗(caretest)中。已建立的應(yīng)用抗體的體外試驗包括ELISAs，RIAs，Western印跡等。在又一實施方案中，本發(fā)明的抗體用于體內(nèi)診斷試驗，例如體內(nèi)成象試驗。例如所述的抗體用能在體內(nèi)檢測的可檢測的物質(zhì)標(biāo)記，所述的標(biāo)記抗體可施用于受試者，并且所述的標(biāo)記抗體可在體內(nèi)檢測，由此可以進(jìn)行體內(nèi)成像。本發(fā)明的可特異識別IL-1α和IL-β的雙特異性抗體可用于診斷目的檢測IL-α和/或IL-β，例如在多種炎癥疾病和機(jī)能紊亂，以及胎兒自發(fā)的吸收作用疾病中。對于特異的疾病和機(jī)能紊亂類型，本發(fā)明的抗-IL-1α/IL-β雙特異性抗體可以診斷目的用于此處所描述的任何涉及所述抗體(見下)治療用途的疾病/技能紊亂，例如IL-1活性在其中起有害作用的疾病，以下進(jìn)行詳細(xì)討論。本發(fā)明的雙特異性抗體和抗體部分，優(yōu)選地，能在體外和體內(nèi)中和其所結(jié)合的抗原。因此本發(fā)明的這種抗體和抗體部分可用于抑制上述抗原的活性，例如包括所述抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物，或具有能與本發(fā)明的抗體相互作用的抗原的人受試者或其他哺乳動物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供抑制抗原活性的方法，該方法包括使所述抗原與本發(fā)明的雙特異性抗體或抗體部分相接觸，以使所述抗原活性受到抑制。在優(yōu)選的實施方案中，所述的雙特異性抗體與IL-1α和IL-β相結(jié)合，所述的方法通過IL-1α和/或IL-1β與雙特異性抗體，或其部分相結(jié)合可以抑制IL-1α和/或IL-β的活性。所述的IL-1α和/或IL-1β活性可以受到抑制，例如在體外。例如，在含有或懷疑含有IL-1α和/或IL-1β的細(xì)胞培養(yǎng)物中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以添加到培養(yǎng)基中以抑制培養(yǎng)物中的IL-1α和/或IL-1β活性。另外，也可以在受試者體內(nèi)抑制IL-1α和/或IL-1β的活性。在又一實施方案中，本發(fā)明提供抑制受試者中抗原活性的方法，所述的受試者患有某種上述抗原在其中其有害作用的疾病。本發(fā)明提供抑制患有疾病的受試者中抗原活性的方法，該方法包括對受試者施用本發(fā)明的雙特異性抗體或抗體部分，從而使受試者中的抗原活性受到抑制。優(yōu)選地，所述抗原是人抗原，所述受試者是人。本發(fā)明的抗體可以治療目的施用于人受試者。而且本發(fā)明的抗體可以施用于表達(dá)某種上述抗體可以獸醫(yī)目的與之結(jié)合的抗原的非人哺乳動物或作為人疾病的動物模型的非人哺乳動物。對于后者，所述的動物模型可用于評價本發(fā)明的抗體的治療效果(例如試驗劑量和施用的時間過程)。優(yōu)選地，所述雙特異性抗體結(jié)合IL-1α和IL-β，所述的在受試者中抑制抗原活性的方法是在受試者中抑制IL-1活性的方法，例如患有IL-1活性在其中起有害作用的疾病的受試者。此處所用到的術(shù)語″IL-1活性在其中起有害作用的疾病″指包括下述的疾病或技能紊亂，在患有所述疾病的受試者中已表明IL-1(其包括IL-1α和IL-β)或是或懷疑是與所述疾病的病理學(xué)相關(guān)，或者是與所述疾病惡化相關(guān)的因素。因此，對于IL-1活性起有害作用的疾病，抑制IL-1的活性(即，IL-1α和IL-1β之一或兩者)有望減輕所述癥狀和/或疾病的進(jìn)程。這種疾病可由下述證明，例如，患有所述疾病的受試者的生物流體中IL-1濃度升高(例如，受試者的血清，血漿，滑液等處的IL-1濃度升高)，其可由，例如上述的抗-IL-1抗體檢測。IL-1在與包括免疫和炎癥因素的多種疾病的相關(guān)病理學(xué)中起關(guān)鍵作用。上述的疾病包括但不限于類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，少年慢性關(guān)節(jié)炎，Lyme關(guān)節(jié)炎，牛皮癬的關(guān)節(jié)炎，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，脊椎關(guān)節(jié)病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)腸炎，炎癥性腸疾病，胰島素依賴性糖尿病，甲狀腺炎，哮喘，變態(tài)反應(yīng)性疾病，牛皮癬，硬皮病皮炎，移植物抗宿主病，器官移植排異反應(yīng)，與器官移植相關(guān)的急性或慢性免疫疾病，結(jié)節(jié)病，動脈粥樣硬化，散播性血管性凝血，Kawasaki病，Grave病，腎變病綜合癥，慢性疲勞綜合癥，眶壞死性肉芽腫病，荷-索紫癜癥，微觀腎脈管炎，慢性活動性肝炎，葡萄膜炎，膿毒性休克，毒性休克綜合癥，膿毒綜合癥，惡病質(zhì)，傳染性疾病，寄生蟲病，獲得性免疫缺陷綜合癥，急性橫貫性脊髓炎，慢性舞蹈病，帕金森氏病，阿爾察默病，中風(fēng)，夏科氏肝硬變，溶血性貧血，惡性腫瘤，心力衰竭，心肌梗塞，阿狄森病，偶發(fā)性I型多腺缺陷和II型多腺缺陷，施密特氏綜合癥，成人(急性)呼吸困難綜合癥，脫發(fā)，斑禿，血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病，關(guān)節(jié)病，菜特爾氏病，牛皮癬關(guān)節(jié)病，潰瘍性鮞狀結(jié)構(gòu)關(guān)節(jié)病，腸滑膜炎(enteropathicsynovitis)，衣原體，耶爾森氏菌屬和沙門氏菌屬相關(guān)的關(guān)節(jié)病，脊椎結(jié)核關(guān)節(jié)病，粥樣疾病/動脈硬化，特異反應(yīng)性過敏，自身免疫腸疾病，慢性天皰瘡，落葉狀天皰瘡，類天皰瘡，線性IgA疾病(linearIgAdisease)，自身免疫溶血性貧血，庫姆斯陽性溶血性貧血，獲得性惡性貧血，幼年惡性貧血，肌痛性腦炎/RoyalFreeDisease，慢性皮膚粘膜假絲酵母病，巨細(xì)胞性動脈炎，原發(fā)性硬化性肝炎(primarysclerosinghepatitis)，隱原性自身免疫肝炎，獲得性免疫缺陷疾病綜合癥，獲得性免疫缺陷相關(guān)疾病，丙型肝炎，共有變換免疫缺陷(commonvariedimmunodeficiency)(共有可變化的血內(nèi)丙種免疫球蛋白過少)，擴(kuò)張性心肌病，女性不育癥，卵巢衰竭，卵巢功能早期衰退，纖維變性的肺部疾病，隱原性纖維肺泡炎，炎癥后的間質(zhì)肺疾病(postinflammatoryinterstitiallungdisease)，間質(zhì)肺炎，與結(jié)締組織疾病相關(guān)的間質(zhì)肺部疾病，混合結(jié)締組織疾病相關(guān)的肺部疾病，全身硬化相關(guān)的間質(zhì)肺病，類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎相關(guān)的間質(zhì)肺病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)的肺部疾病，皮肌炎/多肌炎相關(guān)的肺部疾病，sjgren病相關(guān)的肺部疾病，強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)的肺部疾病，脈管炎彌漫性肺部疾病，含鐵血黃素沉著病相關(guān)的肺部疾病，藥物誘導(dǎo)的間質(zhì)肺部疾病，輻射纖維化，閉塞性支氣管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴細(xì)胞浸潤的肺部疾病，感染后間質(zhì)肺部疾病，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，自身免疫性肝炎，I型自身免疫性肝炎(典型地自身免疫的或狼瘡狀肝炎)，II型自身免疫的肝炎(抗-LKM抗體肝炎)，自身免疫介導(dǎo)的低血糖，B型抗胰島素微黑的棘皮癥，甲狀旁腺機(jī)能減退，與器官移植相關(guān)的急性免疫疾病，與器官移植相關(guān)的慢性免疫疾病，骨關(guān)節(jié)病，初期的致硬化膽管炎，I型牛皮癬，II型牛皮癬，自發(fā)性leucopaenia，自身免疫性中性白細(xì)胞減少癥，腎臟疾病NOS，腎小球腎炎(glomerulonephritides)，腎微觀vasulitis，萊姆病，盤狀紅斑狼瘡，自發(fā)的或NOS雄性不育，精子自身免疫，多發(fā)性硬化(所有的亞型)，交感性眼炎，肺動脈高血壓癥繼發(fā)性結(jié)締組織疾病(pulmonaryhypertensionsecondarytoconnectivetissuedisease)，古德帕斯徹氏綜合癥，結(jié)節(jié)性動脈周圍炎的肺部表現(xiàn)，急性風(fēng)濕熱，類風(fēng)濕性脊椎炎，斯提耳病，系統(tǒng)性硬化，sjorgren綜合癥，高安氏病/動脈炎，自身免疫血小板病，自發(fā)性血小板病，自身免疫甲狀腺病，甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)，致甲狀腺腫的自身免疫的甲狀腺機(jī)能減退(Hashimoto病)，萎縮的自身免疫甲狀腺功能減退，初期的粘液水腫，晶狀體眼色素層炎，初期的結(jié)節(jié)性脈管炎，白癜風(fēng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(例如，抑郁，精神分裂癥，阿爾采默氏病，帕金森氏癥等)，急性和慢性疼痛，和脂質(zhì)失調(diào)。本發(fā)明的人抗體及其抗體部分可用于治療自身免疫疾病的病人，具體說來是與炎癥，包括類風(fēng)濕病性脊椎炎，變態(tài)反應(yīng)，自身免疫的糖尿病，自身免疫的眼色素層炎。優(yōu)選地，本發(fā)明的IL-α或/IL-β雙特異性抗體或其抗原-結(jié)合部分用于治療類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎，克羅恩氏病，多發(fā)性硬化，胰島素依賴的糖尿病，糖尿癥和牛皮癬。本發(fā)明的IL-1α/IL-β雙特異性抗體，或抗體部分也可以與一種或多種對治療自身免疫和炎癥性疾病有用的其他治療試劑一起施用。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以單獨地，也可以與其他治療試劑相結(jié)合以治療上述疾病。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可以單獨使用也可以與其他的試劑，例如治療試劑結(jié)合使用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)其需要選擇所述的附加試劑。例如，所述的附加試劑可以是本領(lǐng)域已知的對由本發(fā)明的抗體所治療的疾病或機(jī)能紊亂有用治療試劑。所述的附加試劑也可以是能賦予所述治療組合物有益屬性的試劑，例如，影響組合物粘性的試劑。還應(yīng)當(dāng)理解的是包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的組合是指那些有益于相應(yīng)目的的組合。下述的試劑只是為了進(jìn)行說明，不起任何限定作用。作為本發(fā)明一部分的所述組合可以是本發(fā)明的抗體和至少一種選自下述的試劑。所述的組合還可以包含多余一種附加試劑。例如，如果所形成的組合能夠行使相關(guān)的功能其可包含兩種或三種附加的試劑。優(yōu)選的組合是非類固醇抗炎癥藥物，也指NSAIDS其包括類似于布洛芬和COX-2抑制劑的藥物。其他優(yōu)選的組合是包括氫化潑尼松的皮質(zhì)類固醇；使用類固醇已知的副作用可通過下述方式降低或根除，即在與本發(fā)明的抗-IL-1抗體結(jié)合對病人進(jìn)行治療時逐漸減少所需類固醇的劑量。與本發(fā)明的抗體或抗體部分相結(jié)合治療類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎的治療性試劑的非限制性的例子包括細(xì)胞因子抑制的抗-炎癥藥物(CSAIDs)；人細(xì)胞因子或生長因子的抗體或拮抗物，例如，TNF，LT，IL-2，IL6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-18，EMAP-II，GM-CSF，F(xiàn)GF，和PDGF。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可與下述的細(xì)胞表面分子相結(jié)合，如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD90，或其配體包括(gp39或CD40L)。優(yōu)選的治療試劑組合可干預(yù)自身免疫的和后續(xù)炎癥級聯(lián)的不同點；優(yōu)選的例子包括TNF拮抗物，如嵌和的人化的或人TNF抗體，D2E7，(PCTPublicationNo.WO97/29131)，CA2(Remicade)，CDP571，CDP870，薩力多胺和可溶的p55或p75TNF受體及其衍生物(p75TNFRlgG(Enbrel)或p55TNFRlgG(Lenercept)，和TNF(X轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑；類似地，IL-1抑制劑(IL-1-轉(zhuǎn)化酶抑制劑，IL-1RA等)也由于相同的原因而起作用。其他優(yōu)選的組合包括IL11。再有優(yōu)選的組合是其他平行于，依賴于或與IL-1功能一致的自身免疫應(yīng)答關(guān)鍵因素；特別優(yōu)選的是IL-12和/或IL-18拮抗劑，包括IL-12和/或IL-18抗體或可溶性的IL-12和/或IL-18受體，或IL-12和/或IL-18結(jié)合蛋白。已表明IL-12和IL-18具有相重疊但有區(qū)別的功能，與兩者拮抗劑的組合可能是最有效的。另一優(yōu)選的組合是非耗減的抗-CD4抑制劑。另一優(yōu)選的組合包括共刺激途徑CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗劑，包括抗體，可溶受體或拮抗性配體。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分也可以與下述試劑結(jié)合，例如氨甲喋呤，6-MP，硫唑嘌呤柳氮磺胺吡啶，5-氨基水楊酸，偶氮水楊酸奎寧/羥氯喹，青霉胺，金硫蘋果酸鹽(肌內(nèi)和口服)，硫唑嘌呤，cochicine，皮質(zhì)類固醇(口服，吸入和局部注射)，β-2腎上腺受體激動劑(沙丁胺醇，特布他林，沙美特羅)，黃嘌呤(茶葉堿，氨茶堿)，色甘酸鹽，萘多羅米，甲哌唑庚酮，已丙基阿托品和乙東茛菪堿，環(huán)孢菌素，F(xiàn)K506，雷帕霉素，霉酚酸莫非替克，來氟米特，NSAIDs，例如，布洛芬，皮質(zhì)類固醇例如氫化潑尼松，磷酸二酯酶抑制劑，阿糖腺苷激動劑，抗血栓形成試劑，補(bǔ)體抑制劑，釋放出腎上腺素的試劑，所述試劑通過下述前炎癥細(xì)胞因子干擾信號傳輸，所述細(xì)胞因子例如TNFa或IL-1(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制劑)，IL-β轉(zhuǎn)化酶抑制劑，TNFoc轉(zhuǎn)化酶(TACE)抑制劑，T-細(xì)胞信號傳輸抑制劑，例如激酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，水楊酸偶氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可溶性細(xì)胞因子受體及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受體及其衍生物p75TNFRIgG(Enbrel和p55TNFRIgG(Lenercept))，sIL-1RI，sIL-1RII，slL-6R)和抗炎癥細(xì)胞因子(例如IL-4，IL10，IL-11，IL-13和TGFss)。優(yōu)選的組合包括氨甲喋呤或來氟米特，對于中等或嚴(yán)重的類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎包括環(huán)胞菌素。本發(fā)明的抗體或抗體部分可與之結(jié)合的治療炎癥性腸疾病治療劑的非限定性的例子包括布地奈德；表皮生長因子；皮質(zhì)類固醇；環(huán)孢菌素，水楊酸偶氮磺胺吡啶；氨基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制劑；mesalamine；奧沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化劑；血栓烷抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗-IL-1β單克隆抗體；抗-IL-6單克隆抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；pyridinyl-咪唑化合物；其他人細(xì)胞因子或生長因子的抗體或拮抗劑，例如，TNF，LT，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-18，EMAP-II，GMCSF，F(xiàn)GF，和PDGF。本發(fā)明的抗體可與細(xì)胞表面分子，例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD90或它們的配基的抗體相結(jié)合。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可與下述試劑相結(jié)合，例如氨甲喋呤，環(huán)孢菌素，F(xiàn)K506，雷帕霉素，霉酚酸莫非替克，來氟米特，NSAIDs，例如，布洛芬，皮質(zhì)類固醇，例如氫化潑尼松，磷酸二酯酶抑制劑，腺苷激動劑，抗血栓形成劑，補(bǔ)體抑制劑，腎上腺素試劑，所述試劑通過下述前炎癥細(xì)胞因子干擾信號傳輸，所述的細(xì)胞因子例如TNF(X或IL-1β例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制劑)，IL-1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑，TNFα轉(zhuǎn)化酶抑制劑，T-細(xì)胞信號傳輸抑制劑例如激酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，水楊酸偶氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可溶性細(xì)胞因子受體及其衍生物(例如可溶的p55或p75TNF受體，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)和抗炎癥的細(xì)胞因子(例如IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ)。優(yōu)選地治療克羅恩氏病且本發(fā)明的抗體或其抗體部分能與之結(jié)合的試劑包括TNF拮抗劑，例如，抗-TNF抗體，D2E7(PCTPublicationNo.WO97/29131)，CA2(Remicade)，CDP571，TNFR-Ig構(gòu)建體，(p75TNFRIgG(Enbrel)和p55TNFRIgG(Lenercept))抑制劑和PDE4抑制劑?？贵w，或其抗原結(jié)合部分可與皮質(zhì)類固醇結(jié)合，例如，布地奈德和地塞米松。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分，還可與下述試劑結(jié)合，例如水楊酸偶氮磺胺吡啶，5-對氨基水楊酸和奧沙拉嗪，所述試劑可干擾前炎癥細(xì)胞因子，例如IL-1，的合成或作用，例如，1L-β轉(zhuǎn)化酶抑制劑和IL-lra。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分還可以與T細(xì)胞信號傳輸抑制劑，例如，酪氨酸激酶抑制劑6-巰基嘌呤。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可與IL-11相結(jié)合。非限制性的治療多發(fā)性硬化且可與本發(fā)明的抗體或其抗提部分相結(jié)合的治療試劑包括皮質(zhì)類固醇；氫化潑尼松；甲基強(qiáng)的松龍；硫唑嘌呤；環(huán)磷酰胺；環(huán)胞菌素；氨甲喋呤；4-氨基吡啶；替托尼定；干擾素-βla(Avonex；Biogen)；干擾素-βlb(Betaseron；Chiron/Berlex)；Copolymer1(Cop-1；Copaxone；TevaPharmaceuticalIndustries，Inc.)；高壓氧；靜脈內(nèi)的免疫球蛋白；clabribine；其他人細(xì)胞因子或生長因子的抗體或拮抗劑，例如，TNF，LT，IL-2，IL-6，1L-7，IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-18，EMAP-II，GMCSF，F(xiàn)GF，和PDGF。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分可與細(xì)胞表面分子，例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80，CD86，CD90或其配基的抗體相結(jié)合。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分還可與下述試劑相結(jié)合，例如氨甲喋呤，環(huán)胞菌素，F(xiàn)K506，雷帕霉素，霉酚酸莫非替克，來氟米特，NSAIDs，例如，布洛芬，COX-2抑制劑，皮質(zhì)類固醇，例如氫化潑尼松，磷酸二酯酶抑制劑，腺苷激動劑，抗血栓形成劑，補(bǔ)體抑制劑，腎上腺素能的劑，所述試劑通過下述細(xì)胞因子干擾信號傳輸，所述細(xì)胞因子例如TNF(X或IL-1(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制劑)，IL-β轉(zhuǎn)化酶抑制劑，TACE抑制劑，T-細(xì)胞信號傳輸抑制劑，例如激酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，水楊酸偶氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巰基嘌呤，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，可溶性細(xì)胞因子受體及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受體，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)和抗炎癥細(xì)胞因子(例如IL-4，IL-10，IL-13和TGFβ)。優(yōu)選的治療多發(fā)性硬化且可與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分相結(jié)合的治療試劑包括干擾素-β，例如，IFNβ1a和IFNβ1b；copaxone，皮質(zhì)類固醇，IL-1抑制劑，TNF抑制劑，和CD40配體和CD80的抗體。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括″治療有效量的″或″預(yù)防有效量的″本發(fā)明的抗體或其抗體部分。″治療有效量″指為達(dá)到所需的治療效果，在劑量和所需的時間階段內(nèi)的總共的效果。所述抗體或抗體部分的治療有效量因下述因素而不同，例如個體的疾病狀態(tài)，年齡，性別和重量，以及所述的抗體或抗體部分在所述個體中引發(fā)所需應(yīng)答的能力。治療有效量也指所述抗體或抗體部分的有益治療效果超出了其毒性或有害效果。″預(yù)防有效量″指為達(dá)到所需的預(yù)防效果，在劑量和所需的時間階段內(nèi)的總共的效果。典型地，由于在受試者中應(yīng)用的預(yù)防劑量在患病前或在所述疾病的早期階段應(yīng)用于受試者，所以預(yù)防有效量要比治療有效量低?？梢哉{(diào)整劑量方案以達(dá)到理想的所需應(yīng)答(例如，治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如可以單獨的大丸劑施用，也可以一段時間內(nèi)以分散的劑量施用，或者所述的劑量也可以依照治療狀態(tài)所指示的緊迫性成比例地減少或增加。這特別有助于以劑量單元的形式配置非腸道組合物以靈活施用并均勻分配劑量。此處所用的劑量單元形式指生理上不連續(xù)的單元適合于作為施用于受試哺乳動物的單位劑量；每一單元包含預(yù)定量的經(jīng)計算以產(chǎn)生與所需藥物載體有關(guān)的治療效果的活性化合物。本發(fā)明劑量單元形式的規(guī)格受限于并直接依賴于(a)所述活性化合物的獨有特征和所要達(dá)到的治療和預(yù)防效果，和(b)使所述活性化合物符合個體治療靈敏性在本領(lǐng)域中的固有限制。示范性地，本發(fā)明的抗體或抗體部分的治療有效量或預(yù)防有效量的非限定性的范圍是0.1-20mg/kg，更優(yōu)選1-10mg/kg。值得注意的是所述的劑量值可能依所述類型和所要減輕的疾病的嚴(yán)重性而有所不同。還應(yīng)當(dāng)了解的是，對于任何特定的受試者，都應(yīng)當(dāng)依照個體的需要調(diào)整特定的劑量方案，施用或監(jiān)控所述組合物施用的人員的專業(yè)性的調(diào)整和此處所述的劑量范圍都只是示例性的，其并不是為了限制或?qū)嶒炚埱蟊Ｗo(hù)的藥物組合物的范圍。本發(fā)明通過下述的實施例進(jìn)行詳細(xì)描述，但其不對本發(fā)明構(gòu)成任何形式的限制。所有引述的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容，包括參考文獻(xiàn)，已頒發(fā)的專利，和已出版的專利申請，在本申請中均全部清楚地引入作為參考。實施例1基于相同的鄰近拓?fù)鋮^(qū)域的雙特異性抗原設(shè)計在這一實施例中，確定了兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白，IL-1α和IL-1β間最大的鄰近的相同拓?fù)鋮^(qū)域，將其作為設(shè)計產(chǎn)生抗IL-1α和IL-1β雙特異性抗體的雙特異性抗原的基礎(chǔ)。用BLAST算法對兩蛋白進(jìn)行比較，使人們能夠估計在相似的結(jié)構(gòu)或功能區(qū)用一種殘基替代另一種殘基的可能性。通過這一試驗可以鑒定IL-1α和IL-1β間最大的鄰近的相同拓?fù)鋮^(qū)域，并可通過合理的相似性延伸擴(kuò)展這一區(qū)域以創(chuàng)建作為雙特異性抗原的線性肽。最為符合這一原則的肽具有下述的氨基酸序列NEAQNITDF(SEQIDNO1)*****標(biāo)注的星號(*)表示在兩蛋白中同一的殘基，其他殘基依照BLAST算法非常相似。例如，賴氨酸經(jīng)常替代同源蛋白中的精氨酸，但不能替代苯丙氨酸。SEQIDNO1中的肽是取自所述結(jié)構(gòu)中兩不同部分的雜合肽，它們的取向相反，因此這一表位另一種可能的表示法是dNdEdAdQNITDF(其中的前綴″d″表示所述的氨基酸殘基是D氨基酸殘基)。L氨基酸組成的所述肽和部分由D氨基酸殘基取代的所述肽均是由標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法合成的。然后將所述的肽與載體蛋白(例如，KLH或白蛋白)相偶聯(lián)，偶聯(lián)形成的肽用于通過體外或體內(nèi)方法篩選抗體。實施例2基于模擬共有折疊環(huán)的環(huán)狀肽的雙特異性抗原的設(shè)計在這一實施例中，構(gòu)建下述的環(huán)狀肽作為產(chǎn)生抗IL-1α和IL-1β雙特異性抗體的雙特異性抗原，所述的環(huán)狀肽在結(jié)構(gòu)上模擬兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白，IL-1α和IL-1β的共有折疊中的關(guān)鍵的環(huán)。所選擇的環(huán)表現(xiàn)為IL-1α的168-184位殘基，和IL-1β的160-176位殘基。所述的共有序列是Cyclo-MAFLRANQNNGKISVAL(PG)(SEQIDNO2)*cbcccccccc**c*b*所標(biāo)注的星號(*)表示IL-1α和1L-1β間同一的殘基，c表示共有殘基，即，類似于IL-1α和IL-1β中的殘基，而實際上在兩蛋白中的這一位置上均不存在的殘基，b表示此處沒有明顯的共有殘基，所以保留了IL-1β序列的特性。所述的線性肽是通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成方法合成的。為使該肽環(huán)化，添加了脯氨酸和甘氨酸殘基。所述的環(huán)化肽可以利用標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)條件，在N，N-二甲基甲酰胺(Img/ml)中高度稀釋而合成。典型的反應(yīng)是使用過量的偶聯(lián)試劑，例如苯并三唑-1-y1-含氧-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸鹽(PyBOP；2eq)和重碳酸鈉(10eq)在室溫下進(jìn)行的。然后將所述的肽與載體蛋白(例如，KLH或白蛋白)相偶聯(lián)，偶聯(lián)形成的肽用于通過體外或體內(nèi)方法篩選抗體。實施例3基于雜合肽的雙特異性抗原的設(shè)計在這一實施例中，構(gòu)建包括兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白，IL-1α和IL-1β的可替代或重疊序列雜合肽，用作產(chǎn)生抗IL-1α和IL-1β雙特異性抗體的雙特異性抗原。為創(chuàng)建所述的雜合肽，鑒定了IL-1α和IL-1β中的可替代和重疊氨基酸序列，并將其剪接成下述的肽TKGGQDITDFQILENQ(SEQIDNO3)bbbbbbbbbbaaaaaaaaaa上述的a和b表示哪一個蛋白是上述殘基的來源蛋白(a＝1L-1α；b＝IL-1β)。所述的ITDF(SEQIDNO4)在兩蛋白中是共同的，其包含在所述雜合肽中。而且，這一雜合肽集中于來自兩蛋白羧基端的序列，已知其也對兩蛋白中的中和抗體具有抗原性。所述雜合肽通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成方法制備。然后將所述的肽與載體蛋白(例如，KLH或白蛋白)相偶聯(lián)，偶聯(lián)形成的肽用于通過體外或體內(nèi)方法篩選抗體。實施例4生產(chǎn)針對IL-1α和IL-1β的雙特異性抗體NEAQNTTDF(SEQIDNO1)Cyclo-MAFLRANQNNGKISVAL(PG)(SEQIDNO2)TKGGQDITDFQILENQ(SEQIDNO3)SEQIDNO；1，2和3的肽與KLH相偶聯(lián)，分別用來免疫兔。用上述三種肽免疫的兔的抗血清表現(xiàn)出針對作為抗原的肽的良好免疫應(yīng)答。但是，只有用SEQIDNO3的肽免疫的兔的抗血清能與IL-1α蛋白和IL-β蛋白都結(jié)合。五只小鼠(BA119-BA123)用與KLH偶聯(lián)的SEQIDNO3的肽(FIA)加上弗氏不完全佐劑經(jīng)皮下免疫，每三周免疫一次共三次，然后用與KLH偶聯(lián)的SEQIDNO3的肽以靜脈內(nèi)方式進(jìn)行兩次加強(qiáng)。每次免疫后10天從每只小鼠取血，通過ELISA測定抗體滴度。小鼠BA119和BA123的脾細(xì)胞分別與IIA部分中所述的骨髓瘤細(xì)胞系P3X36Ag8.653相融合，通過有限稀釋在96-孔培養(yǎng)板中每孔接種一個上述融合細(xì)胞。首先以標(biāo)準(zhǔn)的ELISA測定所述的雜交瘤的IgG和IgM的產(chǎn)量，以鑒定抗體-產(chǎn)生克隆。總共分離了來自小鼠#BA123融合體的945個克隆。用ELISA檢測的355個克隆的上清液表現(xiàn)出對IL-1α，IL-1β，或IL-1α和IL-β的抗原結(jié)合活性。等價形式通過不多的試驗本領(lǐng)域的技術(shù)人員就可以認(rèn)識到或能夠明了，此處所述的特定實施方案還存在等價形式。這些等價形式也包含在下述權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.能與白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β特異結(jié)合的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分。2.如權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分，其以0.1s-1或更低的koff速率常數(shù)與白細(xì)胞介素-1α結(jié)合，或以1×10-5M或更低的IC50抑制白細(xì)胞介素-1α的活性，所述的速率常數(shù)是通過表面胞質(zhì)團(tuán)共振測定的。3.如權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分，其以0.1s-1或更低的koff速率常數(shù)與白細(xì)胞介素-1β結(jié)合，或以1×10-5M或更低的IC50抑制白細(xì)胞介素-1β的活性，所述的速率常數(shù)是通過表面胞質(zhì)團(tuán)共振測定的。4.一種獲得可特異地與白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β特異結(jié)合的雙特異性抗體的方法，該方法包括提供含白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β共有結(jié)構(gòu)特征的抗原；將所有抗體組分暴露于所述抗原；和從所有抗體組分中篩選可與白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β相結(jié)合的抗體，從而獲得所述的雙特異性抗體。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的抗原是基于白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β間鄰近的相同拓?fù)鋮^(qū)域設(shè)計的。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述的抗原包含氨基酸序列NEAQNITDF(SEQIDNO1)或dNdEdAdQNITDF。7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的抗原是基于在結(jié)構(gòu)上模擬白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β共有折疊中的環(huán)而設(shè)計的。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述的抗原是包含氨基酸序列Cyclo-MAFLRANQNNGKISVAL(PG)(SEQIDNO2)的環(huán)狀肽。9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的抗原是基于剪接白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β中的重疊部分創(chuàng)建的雜合分子而設(shè)計的。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述的抗原包含氨基酸序列TKGGQDITDFQILENQ(SEQIDNO3)。11.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的抗原包含氨基酸序列APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMGAYKSSKDDAKITVILGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS(SEQIDNO4)。12.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的抗體所有組分通過用所述抗原體內(nèi)免疫動物而暴露于所述抗原。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其進(jìn)一步包括由所述動物的淋巴細(xì)胞制備一系列雜交瘤，再篩選能分泌可與白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-1β特異結(jié)合的抗體的雜交瘤。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的動物選自小鼠，大鼠，兔和山羊。15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的動物是白細(xì)胞介素-1α，白細(xì)胞介素-β或白細(xì)胞介素-1α和白細(xì)胞介素-β缺陷的剔除小鼠。16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的動物是轉(zhuǎn)有人免疫球蛋白基因的小鼠，因此所述的小鼠在受到抗原刺激后產(chǎn)生人抗體。17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的動物是具有重度聯(lián)合免疫缺陷的小鼠(SCID)，所述的小鼠已用人外周血單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞或其前體重建。18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的動物是小鼠接受了致死劑量的全身輻射處理，接下來用重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID)的骨髓細(xì)胞進(jìn)行輻射保護(hù)，再移植功能性的人淋巴細(xì)胞或其前體。19.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過用所述抗原篩選重組抗體文庫，使所述的抗體所有組分在體外暴露于所述抗原。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫表達(dá)在噬菌體的表面。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫表達(dá)在細(xì)菌細(xì)胞表面。23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫作為RNA-蛋白融合體表達(dá)。24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫是scFv文庫或Fab文庫。25.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過用所述的抗原在體內(nèi)免疫動物，使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原，接下來用所述抗原在體外篩選由所述動物淋巴細(xì)胞制備的重組抗體文庫。26.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過用所述的抗原在體內(nèi)免疫動物，使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原，接下來體外親和成熟由所述動物淋巴細(xì)胞制備的重組抗體文庫。27.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過用所述的抗原在體內(nèi)免疫動物，使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原，接下來篩選分泌可與所述抗原結(jié)合的抗體的單細(xì)胞，回收所述單細(xì)胞cDNA的重-和輕鏈可變區(qū)域。28.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的雙特異性抗體是完全的人抗體。29.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的雙特異性抗體是嵌合抗體。30.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的雙特異性抗體是CDR移植的抗體。31.可由權(quán)利要求4的方法獲得的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分，其可特異地與IL-1α和IL-1β結(jié)合。32.一種獲得可與兩個不同但結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子特異結(jié)合的雙特異性抗體的方法，該方法包括提供包含兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子共有結(jié)構(gòu)特征的抗原；將所有抗體組分暴露于所述抗原；和從所有抗體組分中篩選可與兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子特異結(jié)合的抗體，從而獲得所述的雙特異性抗體。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的抗原是基于兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子間鄰近的相同拓?fù)鋮^(qū)域而設(shè)計的。34如權(quán)利要求33所述的方法，其中，所述的兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子是蛋白，所述的抗原包含兩蛋白間鄰近的相同拓?fù)鋮^(qū)域氨基酸序列的肽。35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的抗原是基于在結(jié)構(gòu)上模擬兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子共有折疊中的環(huán)而設(shè)計的。36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子是蛋白，所述的抗原是結(jié)構(gòu)上模擬兩個不同蛋白的共有折疊中的環(huán)的環(huán)狀肽。37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的抗原基于剪接兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子中的重疊部分創(chuàng)建的雜合分子而設(shè)計的。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子是蛋白，所述的抗原是由剪接兩蛋白的重疊氨基酸序列而制備的雜合肽。39.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的抗原是兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子之一。40.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，利用所述抗原在體內(nèi)免疫動物從而使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其進(jìn)一步包括由所述動物的淋巴細(xì)胞制備一系列雜交瘤，再篩選能分泌可與兩個不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子特異結(jié)合的抗體的雜交瘤。42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的動物選自小鼠，大鼠，兔和山羊。43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的動物是所述抗原內(nèi)源形式缺陷的剔除小鼠。44.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的動物是轉(zhuǎn)化了人免疫球蛋白基因的小鼠，因此所述的小鼠在受到抗原刺激后產(chǎn)生人抗體。45.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的動物是具有重度聯(lián)合免疫缺陷的小鼠，所述的小鼠已經(jīng)人外周血單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或其前體進(jìn)行重建。46.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的動物是小鼠接受了致死劑量的全身輻射處理，接下來用重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID)的骨髓細(xì)胞進(jìn)行輻射保護(hù)，再移植功能性的人淋巴細(xì)胞。47.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，用所述抗原在體外篩選重組抗體文庫，從而使所述的抗體所有組分暴露于該抗原。48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫表達(dá)于噬菌體表面。49.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫表達(dá)于酵母細(xì)胞表面。50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫表達(dá)于細(xì)菌細(xì)胞表面。51.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫作為RNA-蛋白融合體表達(dá)。52.如權(quán)利要求47所述的方法，其中，所述的重組抗體文庫是scFv文庫或Fab文庫。53.如權(quán)利要求32所述的方法，通過用所述的抗原在體內(nèi)免疫動物，使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原，接下來用所述抗原在體外篩選由所述動物淋巴細(xì)胞制備的重組抗體文庫。54.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，通過用所述的抗原在體內(nèi)免疫動物，使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原，接下來體外親和成熟由所述動物淋巴細(xì)胞制備的重組抗體文庫。55.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，通過用所述的抗原在體內(nèi)免疫動物，使所述的抗體所有組分暴露于所述抗原，接下來篩選分泌可與所述抗原結(jié)合的抗體的單細(xì)胞，回收所述單細(xì)胞的重-和輕鏈可變區(qū)域cDNA。56.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的雙特異性抗體完全的人抗體。57.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的雙特異性抗體是嵌合抗體。58.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述的雙特異性抗體是CDR移植的抗體。59.一種由權(quán)利要求32的方法獲得的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分。60.一種在生物樣品或組織中檢測IL-α或IL-β的方法，該方法包括使懷疑含有IL-α或IL-β的生物樣品或組織與如權(quán)利要求1所述的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分相接觸，并檢測生物樣品或組織中的IL-1α或IL-1β。61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，IL-α或IL-β的檢測用于診斷目的。62.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述的生物樣品是體外樣品。63.如權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述的組織位于受試者體內(nèi)，所述的方法包含所述組織的體內(nèi)成象。64.一種抑制IL-1α或IL-1β活性的方法，該方法包括使IL-1α或IL-1β與權(quán)利要求1的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分相接觸，從而使IL-1α或IL-1β活性受到抑制。65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，IL-α或IL-β活性在體外受到抑制。66.一種治療與IL-1-相關(guān)的機(jī)能紊亂的方法，該方法包括對患有IL-1-相關(guān)疾病的受試者施用權(quán)利要求1的雙特異性抗體，或其抗原結(jié)合部分，從而使患有IL-1-相關(guān)的機(jī)能紊亂的患者受到治療。67.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述的IL-1-相關(guān)的機(jī)能紊亂是炎癥性的機(jī)能紊亂。68.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述的IL-1-相關(guān)的機(jī)能紊亂是自身免疫性的機(jī)能紊亂。69.如權(quán)利要求66所述的方法，其中，所述的IL-1-相關(guān)的機(jī)能紊亂選自類風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎，克羅恩氏病，多發(fā)性硬化，胰島素依賴性的糖尿病，糖尿癥和牛皮癬。70.一種制備抗體或其抗原結(jié)合部分文庫的方法，該方法包括下述步驟a)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A；b)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B；c)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C；d)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D；和e)將重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D相結(jié)合，以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X和/或?qū)⒅亟M重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B相結(jié)合以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y。71.如權(quán)利要求70所述的制備抗體或其抗原結(jié)合部分文庫的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟將所述的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X與抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y結(jié)合以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Z。72.如權(quán)利要求70所述的方法制備的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X。73.如權(quán)利要求70所述的方法制備的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y。74.如權(quán)利要求71所述的方法制備的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Z。75一種制備雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，該方法包括下述步驟a)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A；b)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B；c)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C；d)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D；和e)將重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D相結(jié)合，以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X和/或?qū)⒅亟M重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B相結(jié)合以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y；和f)從抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X和/或抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y中篩選可與所述的第一和第二抗原相結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分。76.由權(quán)利要求75的方法制備的雙特異性抗體。77.一種制備雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，該方法包括下述步驟a)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A；b)由暴露于第一抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B；c)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C；d)由暴露于第二抗原的所有抗體組分獲得重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D；和e)將重組重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫A與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫D相結(jié)合，以獲得抗體文庫X和/或?qū)⒅亟M重鏈或其抗原結(jié)合部分文庫C與重組輕鏈或其抗原結(jié)合部分文庫B相結(jié)合以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y；和f)將所述的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫X與抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Y結(jié)合以獲得抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Z；g)從抗體或其抗原結(jié)合部分文庫Z中篩選可與所述的第一和第二抗原相結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合部分。78.由權(quán)利要求77所述的方法制備的雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分。79.如權(quán)利要求70，75或77所述的方法，其中，所述的第一和第二抗原分別選自蛋白，多肽和肽，條件是所述的第一和第二抗原不相同。80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述的蛋白，多肽和肽是分泌蛋白或表面受體。81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，所述的分泌蛋白選自IFN，TNF，IL，IP-10，PF4，GRO，9E3，EMAP-II，CSF，F(xiàn)GF，和PDGF。82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中所述的第一抗原是IL-1α，所述的第二抗原是IL-1β。83.編碼如權(quán)利要求72，73或74所述的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫中每一成員的核苷酸序列。84.編碼如權(quán)利要求76或78所述的雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分的核苷酸序列。85.包含編碼如權(quán)利要求72，73或74所述的抗體或其抗原結(jié)合部分文庫中每一成員的核苷酸序列的載體。86.包含編碼如權(quán)利要求76或78所述的雙特異性抗體或其抗原結(jié)合部分的核苷酸序列的載體。87.用如權(quán)利要求85所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。88.用權(quán)利要求86所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明提供了對兩個不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原具有雙特異性的抗體。所述的抗體可以是，例如，完全的人抗體，重組抗體，或單克隆抗體。優(yōu)選的抗體具有對IL－1α和IL－1β的雙特異性并能在體外和體內(nèi)中和IL－1α和IL－1β的活性。本發(fā)明的抗體可以是全長抗體或其抗原－結(jié)合部分。另外，本發(fā)明還提供了制備和使用本發(fā)明的抗體的方法。本發(fā)明的抗體，或抗體部分可用于檢測兩個不同的但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的抗原(例如，IL－1α和IL－1β)和用以抑制所述抗原的活性(例如，在患有IL－1α和/或IL－1β的活性起有害作用的疾病的人受試者中。文檔編號A61P25/00GK1451043SQ01814818公開日2003年10月22日申請日期2001年6月28日優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日發(fā)明者A·科林森,T·哈于爾,G·阿夫格里諾斯,R·迪克松,Z·凱馬克卡蘭申請人:艾博特公司