專利名稱：GnRH－I和GnRH－II之間的區(qū)分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及GnRH同種型。
GnRH-I(在文獻(xiàn)中一般稱為GnRH)是一種來自下丘腦的長度為10個氨基酸的小型肽(十肽)。GnRH-I的氨基酸序列(SEQ ID NO1)可以由以下3字母代碼表示pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2或用相應(yīng)的單字母代碼表示，其中pE是焦谷氨酸，#是酰胺pEHWSYGLRPG#。
GnRH-I作用于腦垂體，使生物活性的促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)釋放入血增多，隨即刺激生長期雄性動物睪丸發(fā)育及雄性類固醇合成。在生長期雌性動物中，刺激卵巢發(fā)育，表現(xiàn)為卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育，雌性類固醇合成，及排卵。
已知GnRH-I如果與載體蛋白偶聯(lián)，可以用于免疫動物。這種免疫可以由于各種原因而進(jìn)行，所有這些免疫均與GnRH-I的自然功能相關(guān)聯(lián)。如所已知的，血液中LH和/或FSH的大幅度降低會抑制雄性類固醇或雄激素及雄性睪丸中精子的產(chǎn)生，及抑制雌性類固醇或孕激素的形成和雌性動物卵巢中卵泡成熟。血液中雄激素，孕激素和雌激素的數(shù)量降低至這種可與通過閹割去除睪丸或卵巢而獲得的水平相當(dāng)?shù)乃剑梢酝ㄟ^針對GnRH-I有效免疫動物而實現(xiàn)。在雄性動物中，在許多情況中，睪丸隨即出現(xiàn)發(fā)育緩慢或完全不發(fā)育，無雄激素(雄性類固醇激素)合成及無精子形成。在雌性動物中，卵巢的活性下降，無雌激素和孕激素(雌性類固醇激素)合成及卵泡成熟和排卵受抑制。
近來有報道靈長類動物腦中存在另一種形式的GnRH(GnRH-II)(Lescheid等，內(nèi)分泌學(xué)138(1997)5618-5629)，而且從人基因組文庫中克隆了這第二種GnRH分子的基因(GnRH-II，(SEQ ID NO2)(White等，PNAS USA95(1998)305-309)。哺乳動物GnRH-I(SEQID NO1)在腦組織外幾乎不表達(dá)。這方面有少數(shù)例外。GnRH I隨著月經(jīng)周期存在于婦女子宮內(nèi)膜中(Casan等，F(xiàn)ertil.Steril.1998，70，102-106)，而且在妊娠期人胎盤中表達(dá)(Kelly等，DNA細(xì)胞生物學(xué)1991，10，411-421)。GnRH mRNA在大鼠的卵巢，睪丸，胸腺，胎盤和下丘腦中發(fā)現(xiàn)(Oikawa等，內(nèi)分泌學(xué)1990，127，2350-2356)。GnRH的表達(dá)在豬的免疫組織(脾，胸腺和淋巴細(xì)胞)中檢測到(Weesner等，生命科學(xué)1997，61，1643-1649)。
GnRH-II在腦組織外的許多組織中表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在腎，骨髓和前列腺中的濃度尤其高。GnRH-II在除了腦組織之外的不同組織中的存在提示GnRH-II也許具有多重功能。另外，GnRH-II肽在遍及不同脊椎動物物種中的嚴(yán)格保守結(jié)構(gòu)提示這種神經(jīng)肽具有重要的生物活性。然而迄今為止，GnRH-II的功能實際上還未知。一些類型的分化的淋巴細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞，產(chǎn)生GnRH和類GnRH肽。在腎，骨髓和前列腺中存在很多后一類型的細(xì)胞，這也許對GnRH-II在這些組織中的高表達(dá)起作用。與GnRH-I相比，GnRH II似乎較少參與生殖。在性腺機能減退的小鼠即缺失GnRH-I基因的小鼠中，產(chǎn)生GnRH-II的細(xì)胞與在正常小鼠中的分布相同，但這不足以在這些小鼠中產(chǎn)生正常的生殖腺發(fā)育(Chen等，F(xiàn)EBS通訊435(1998)199-203)。然而，恒河猴月經(jīng)周期的黃體期示出在靜脈注射GnRH-II后血漿黃體生成素濃度明顯提高，但在中間卵泡期期間不能產(chǎn)生這種提高(Lescheid等，內(nèi)分泌學(xué)138(1997)5618-5629)。
本發(fā)明提供了適于激發(fā)抗各種形式促性腺激素釋放激素(GnRH)的免疫應(yīng)答的一種肽，所述激素也稱為促黃體生成素釋放激素(LHRH)。本發(fā)明還提供了基于這種肽的免疫原性組合物和疫苗，藥物，及其它醫(yī)學(xué)制劑。本發(fā)明還提供了這種疫苗或醫(yī)學(xué)制劑在哺乳動物抗GnRH免疫方法中的應(yīng)用，以影響所述哺乳動物的生殖或行為特性，本發(fā)明還提供了這種疫苗或醫(yī)學(xué)制劑在改良豬的肉質(zhì)的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了適于激發(fā)抗GnRH-I或GnRH-II的選擇性免疫應(yīng)答的一種肽。例外，本發(fā)明提供了抗GnRH-I和/或GnRH-II的抗體，包含這些抗體的組合物及所述肽在治療前列腺癌癥的藥物組合物或醫(yī)學(xué)制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了這樣的見解，即通過所提供的可以區(qū)分不同類型GnRH的肽序列，可以對不同類型GnRH的免疫應(yīng)答中的變化和不同加以更適當(dāng)?shù)暮陀行У睦?。更具體地，本發(fā)明提供了這樣的見解，即可以實現(xiàn)抗GnRH-I疫苗的效力和選擇性的改良?？笹nRH-I的免疫能有效中和GnRH-I，并引起促性腺激素水平降低及阻斷性腺類固醇合成。然而，關(guān)于抗GnRH-I產(chǎn)生的抗體對GnRH-II功能的任何生理學(xué)作用還完全未知。因為GnRH-II主要在腎中合成，與GnRH-II交叉反應(yīng)的抗GnRH-I產(chǎn)生的抗體可能影響腎功能。為排除GnRH-I免疫對腎功能的可能存在的副作用，需要將免疫閹割疫苗的抗原性應(yīng)答特異性針對GnRH-I并避免由于非性腺GnRH-II的中和而導(dǎo)致的可能存在的有害副作用。
如果只需要廢除物種通常與性行為伴隨的生殖能力，優(yōu)選特異性中和GnRH-I的免疫閹割疫苗。因此需要抗促性腺激素釋放激素的選擇性免疫，優(yōu)選抗GnRH-I的選擇性免疫。
在獸醫(yī)學(xué)中，100％有效的抗GnRH-I免疫可以用于使例如小家畜如雄性和雌性貓和狗絕育，或用于治療雄性狗和牛的進(jìn)攻性，其簡便地通過免疫代替手術(shù)如閹割或卵巢切除術(shù)而進(jìn)行?？笹nRH-I免疫的其它可能原因是防止雌性動物如狗，貓和牛發(fā)情，及增肥的用以屠宰的雄性動物躁動。
在人類衛(wèi)生保健中，抗GnRH-I和/或GnRH-II的免疫可以用于治療前列腺癌和乳腺癌，而且如果需要，可以用于治療一些垂體癌。在前列腺癌的情況中，更需要中和GnRH-I和GnRH-II，因為后一同種型也在前列腺組織中高度表達(dá)。
抗GnRH-I疫苗的另一應(yīng)用是在畜牧業(yè)領(lǐng)域，特別是用于屠宰的增肥的豬。雄性性成熟豬(公豬)的肉具有典型的氣味，即所謂的公豬膻味或公豬氣味。在性成熟豬的睪丸中，形成許多C19-δ-16類固醇，其貯存于動物的脂肪組織中(Patterson，食品農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志19，31-38(1968)；Brooksen Pearson，動物科學(xué)雜志62，632-645(1986)；Claus，Zeitschrift.Tierzuchtg.Züchtungsbiol.93，38-47(1976)；Claus，Acta Endocrinol.(Copenh.)91，Suppl.225，432-433(1979))。這些類固醇主要與加熱所述肉類時形成討厭的類尿氣味相關(guān)(Fuchs，Swedish J.Agric.Res.1，233-237(1971)；Bonneau，Livest.Prod.Sci.9，687-705(1982))。由于這些討厭的氣味，雄性性成熟豬的肉一般不適于消費及不適合出口。由于大約10％的雄性屠宰豬在屠宰之前已經(jīng)性成熟，這使豬的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)潛在地遭受巨大損失。
為控制和防止這些損失，幾乎所有的雄性小豬當(dāng)它們還是幼年時就被閹割，所進(jìn)行的手術(shù)一般不進(jìn)行任何形式的麻醉。除了這種閹割對動物不利之外，閹割還引起感染，生長抑制，及最后的屠宰后的肉質(zhì)比完整的動物肉質(zhì)低劣，至少在完整的動物還未發(fā)出公豬膻味的時候(Walstra，Livest.Prod.Sci.1，187-96(1974))。
一種對動物友善的替代方法是通過抗GnRH-I免疫使豬垂體中GnRH-I濃度降低，即所謂的免疫閹割。GnRH-I水平的降低導(dǎo)致生物活性的FSH和LH濃度降低，隨即抑制生長動物的睪丸發(fā)育，并抑制睪丸類固醇合成，包括雄烯酮，睪酮和雌激素。這種方法防止屠宰時雄性豬的公豬膻味，并且不需要進(jìn)行手術(shù)閹割，因為雄烯酮水平降至低水平或檢測不到的水平(Oonk等，1995，家畜生產(chǎn)科學(xué)42，63-71)。
抗公豬膻味的可接受的疫苗的嚴(yán)格要求是在幾乎所有的豬中，睪丸的發(fā)育延遲到這樣的程度，即公豬膻味在屠宰時不發(fā)生，而且當(dāng)所述疫苗不降低動物睪丸發(fā)育時，其可以通過與成功免疫閹割的豬相比太大的睪丸而簡便地檢測。
在關(guān)于抗GnRH-I疫苗的抗生殖能力的現(xiàn)有文獻(xiàn)和先前的專利申請中，免疫的結(jié)果通常表現(xiàn)為是可變的。在大多數(shù)所述研究中，少量的免疫動物對所述免疫不應(yīng)答，或者需要大劑量疫苗，多次免疫或商業(yè)上不適當(dāng)?shù)淖魟┮援a(chǎn)生所需效力(Hoskinson等，1990，澳大利亞生物技術(shù)雜志4，166-170；Falvo等(1986)，動物科學(xué)雜志63986-994；Clarke等，1998，內(nèi)分泌學(xué)139，2007-2014；Adams T.E.和B.M.Adams，在飼養(yǎng)場進(jìn)行小公牛和公牛的抗促性腺激素釋放激素活性免疫，動物科學(xué)雜志1992，701691-1698；Brown等，綿羊在生命早期的抗GnRH-I免疫公羊的生殖功能和激素的作用，生殖和生育雜志(1994)101，15-21；Ferro等，使用與PPD綴合的促性腺激素釋放激素類似物的免疫閹割，食品和農(nóng)業(yè)免疫學(xué)1995，7，259-272；美國專利4,608,251；國際專利申請WO88/05308)。
一些研究提示一種抗GnRH-I的疫苗有100％的效力，但所述疫苗在大量動物體內(nèi)未進(jìn)行測試(Ladd等(1994)，基于抗促黃體生成素釋放激素的活性免疫的一種寵物抗生育疫苗的研制，生殖生物學(xué)51，10761083；J.G.Manns和S.R.Robbins(1997)，用基于GnRH疫苗的重組物防止公豬膻味，完整雄性豬中的公豬膻味，EAAP研究組學(xué)報“完整雄性豬肉的生產(chǎn)和利用”，EAAP出版物No.92，137-140)；其它研究報道的是所述疫苗對處理的動物的平均效力，因為單獨的數(shù)值不能示出免疫的和未處理的對照物中間的明顯差別(Bonneau等，動物科學(xué)雜志72，14-20(1994)；Hennesy等，1997，消除公豬膻味針對雄性豬的一種商業(yè)公豬膻味疫苗，Bonneau，M.，Lundstrm，K.和Malmfors，B.(編輯)，完整雄性豬中的公豬膻味，Wageningen Pers，Wageningen，EAAP出版物No.92.，141-145)。
制備這種疫苗的難處大概是耐受現(xiàn)象所致。自身物質(zhì)如激素不被識別為外源物，而是免疫系統(tǒng)耐受的。通常沒有抗自身物質(zhì)的抗體被激發(fā)。為使一種疫苗成功，其必須是足夠外源的。只有當(dāng)所述疫苗是足夠外源的以至于免疫系統(tǒng)不耐受時，才誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。然而，反之，所述抗體必須仍能識別所述激素，并因此所述疫苗不能是太“外源”的。
因為這些條件表現(xiàn)為是互斥的，直到最近也未確定這種物質(zhì)是否可以制備出。一種產(chǎn)生類GnRH肽疫苗的嘗試包括用右旋氨基酸置換GnRH-I十肽第6位的Gly(D-Tryp；Chaffaux等，Recueil deMedicine Vétérinaire161(2)，133-145，1985)。然而，已經(jīng)證實一種包含這種修飾的GnRH-I肽的疫苗制品的性能甚至比正常的GnRH-I十肽還低(歐洲專利申請464，124A)。
最近，我們已經(jīng)明確揭示在所有抗GnRH-I免疫的個體中，有可能激發(fā)一種有效的抗體應(yīng)答(Meloen等，疫苗12，741-746(1994))。在這些實驗中，將豬用與傳統(tǒng)類型的GnRH-I疫苗(GnRH-I偶聯(lián)于一種載體蛋白，在Freund′s佐劑中)不同的一種GnRH-I疫苗免疫兩次，所述疫苗稱為串聯(lián)GnRH-I疫苗(歐洲專利No0464124)。在這個出版物中，描述了一種肽，其特征在于包含串聯(lián)的至少2個GnRH-I序列(SEQ ID NO3)，通式如下
Z1-Glx-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-Z2，其中氨基酸是以3個字母代碼表示的，Trp1和Trp2是色氨酸(Trp)或甲?；彼?N(吲哚)-甲酰-色氨酸)，n是一個至少為1的數(shù)字，X是氨基酸Gly和Gln之間的一個直接鍵或是一個間隔基團，Z1-Glx是pGlu(焦谷氨酸)或附著一個包含一或多個額外氨基酸的尾部的Gln，Gly-Z2是Gly-NH2或附著一個包含一或多個額外氨基酸的尾部的Gly。在這個通式中，X可以是甘氨酸和谷氨酰胺之間的直接鍵，即這些氨基酸是直接相互連接的，沒有中間環(huán)節(jié)(通過正常肽鍵連接)。本發(fā)明串聯(lián)的GnRH-I疫苗還包含其中GnRH-I序列通過間隔基團相互連接而構(gòu)成的肽。間隔基團的性質(zhì)可以是非常不同的，可以是一或多個氨基酸至較短或較長的烴鏈及其它化合物基團或分子。在上述通式中，Z1-Glx優(yōu)選代表pGlu(焦谷氨酸)，但也可以代表附著一個包含一或多個額外氨基酸的尾部的Gln，例如用于將所述肽偶聯(lián)于一種載體蛋白。在上述通式中，Gly-Z2代表例如Gly-NH2，或附著一個包含一或多個額外氨基酸的尾部的Gly，例如用于將所述肽偶聯(lián)于一種載體蛋白。優(yōu)選地，Gly-Z2代表Gly-Cys-NH2，加入的C末端半胱氨酸是為了所述肽與一種載體蛋白的可能偶聯(lián)。
從WO96/40755中得知適用于GnRH-I分子變體的串聯(lián)二聚體原理產(chǎn)生一種疫苗，其在一些溫和的佐劑如Specol和雙油乳狀液(double oil emulsion)中是高效的，而且在低劑量也是有效的。在這種情況中，GnRH-I分子的變體通過用右旋(D-)氨基酸D-Lys取代所述十肽第6位的Gly而形成，隨后將所得肽二聚體化并偶聯(lián)于一種常用的載體化合物卵清蛋白。因此，盡管使用D-氨基酸取代原始序列第6位Gly的疫苗和具有D-氨基酸的GnRH-I十肽與原始GnRH-I序列相比免疫原性降低(Chaffaux等，Recueil de Medicine Vétérinaire161(2)，133-145，1985)，但用于串聯(lián)二聚體GnRH-I疫苗的這種D-氨基酸取代能產(chǎn)生更免疫原性的GnRH-I疫苗制品。然而，免疫方法需要重復(fù)劑量的疫苗以完全有效。需要額外的激發(fā)劑量以達(dá)到哺乳動物100％有效抗GnRH-I免疫是已知肽的缺點。我們還發(fā)現(xiàn)在一些情況中使用(D-Lys6)GnRH I串聯(lián)二聚體(即有或無D-Lys6置換的GnRH I串聯(lián)二聚體)，產(chǎn)生非常低的當(dāng)仍可測定數(shù)量的睪酮，其是不希望的而且是(D-Lys6)GnRH I串聯(lián)二聚體的一個缺點。
本發(fā)明提供了肽序列及提供了串聯(lián)D-Lys6GnRH-I的替代形式，當(dāng)用于疫苗中時其產(chǎn)生一種有效用于免疫閹割的疫苗。
本發(fā)明的一方面是確定串聯(lián)GnRH-I序列中氨基酸可以變化的程度，同時所得取代的串聯(lián)GnRH-I仍能產(chǎn)生對GnRH-I的免疫原性應(yīng)答，足以進(jìn)行免疫閹割。因此，本發(fā)明提供了一種可誘導(dǎo)抗GnRH-I抗體產(chǎn)生的肽序列的產(chǎn)生方法，所述抗體在數(shù)量和活性方面均有足夠的競爭性。本發(fā)明不限于這些具體串聯(lián)肽，應(yīng)意識到相似的區(qū)分性應(yīng)答可以用單一的十肽變體激發(fā)，或者甚至用這樣的GnRH序列激發(fā)，所述GnRH序列已經(jīng)截短或已經(jīng)缺失特定的氨基酸或以任何其它形式修飾或衍生化，如通過添加非天然發(fā)生的氨基酸或D-氨基酸，尤其通過導(dǎo)致與GnRH-I或GnRH-II相似之處減少但其免疫原性提高的那些修飾方法進(jìn)行。
本發(fā)明的另一方面是提供了一種肽序列，其選擇性誘導(dǎo)抗GnRH-I抗體產(chǎn)生，同時極少或不誘導(dǎo)針對GnRH-I的應(yīng)答。一個優(yōu)選的實施方案是一種肽序列，其不僅選擇性誘導(dǎo)抗GnRH-I抗體產(chǎn)生，而且在免疫閹割中也是有效的，同時對GnRH-II的免疫應(yīng)答降低或無應(yīng)答。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在串聯(lián)的GnRH-I肽序列中，可以置換各種氨基酸，導(dǎo)致與自身激素的相似之處減少同時保留甚至提高所述肽激發(fā)GnRH-I結(jié)合抗體的能力。同樣，GnRH-I肽序列中的一些氨基酸置換產(chǎn)生對GnRH-I的選擇性免疫應(yīng)答及對GnRH-II的免疫應(yīng)答降低或無應(yīng)答。
在本發(fā)明的一個方面中，提供了一些修飾的串聯(lián)GnRH-I肽序列用于疫苗中，其不僅能降低雄性動物睪丸生長，也能實質(zhì)上降低睪酮水平至通過常規(guī)方法不能檢測的水平。
例外，從這些肽序列中制備的疫苗表現(xiàn)一種活性，即在大多數(shù)情況中不需要第二次加強免疫，就能與使用常規(guī)D-Lys6串聯(lián)GnRH-I一樣，達(dá)到基本上100％活性。本發(fā)明術(shù)語100％活性是指在一次免疫后睪酮水平通過常規(guī)技術(shù)基本上檢測不到。
本發(fā)明最顯著的一個特點是通過這些GnRH疫苗產(chǎn)生的抗體可以區(qū)分GnRH-I和GnRH-II。因此本發(fā)明的肽表現(xiàn)為提高的或得以保留的抗GnRH-I活性，同時發(fā)現(xiàn)對GnRH-II的免疫應(yīng)答降低或無應(yīng)答。這可以產(chǎn)生具有相反作用的肽，即它們表現(xiàn)為抗GnRH-II活性提高或得以保留，同時抗GnRH-I的免疫應(yīng)答降低或無應(yīng)答。這種GnRH-II特異性應(yīng)答可以用于幫助抑制不需要或極少需要妊娠的哺乳動物中的胚胎植入。例外，通過使用這種GnRH-II特異性應(yīng)答，F(xiàn)SH水平可以負(fù)調(diào)節(jié)，使整體生育力降低。
本發(fā)明一方面涉及一種肽，其包含一種修飾的串聯(lián)GnRH-I十肽序列，從而用所述肽以適當(dāng)劑量免疫可使睪酮水平基本上檢測不到。
本發(fā)明還涉及一種肽，其包含至少兩個偶聯(lián)的GnRH-I十肽序列，任選地通過間隔序列偶聯(lián)，其可產(chǎn)生可以有效區(qū)分GnRH-I和GnRH-II的免疫原性應(yīng)答。
本發(fā)明的肽與激素足夠相似，但同時對免疫系統(tǒng)而言是更“外源”的，而且誘導(dǎo)抗所述激素的抗體產(chǎn)生的能力提高。
本發(fā)明的一個特點是各個串聯(lián)單位可以是二聚體化的，以進(jìn)一步增強其免疫原性而不喪失將所述肽或肽組合物偶聯(lián)于一個載體化合物蛋白的可能性。
可以使用與WO96/40755所述相似的二聚體化和將串聯(lián)序列偶聯(lián)于載體的方法。本發(fā)明中也可以使用只含有GnRH-I或II肽序列一部分的肽，例如九肽和十一肽。
用于本發(fā)明肽中的接頭可以選自本申請中所述的接頭或如SMCC接頭或本領(lǐng)域已知的其它接頭。
接頭用于偶聯(lián)兩或多個二聚體化的肽序列。用于置換串聯(lián)肽序列中的氨基酸的氨基酸優(yōu)選是相對簡單的氨基酸，如丙氨酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述不同的氨基酸是丙氨酸。其它氨基酸也可以用于置換串聯(lián)十肽序列中的氨基酸。優(yōu)選地，只進(jìn)行保守氨基酸置換。保守氨基酸置換是氨基酸取代中大氨基酸由大氨基酸置換，芳香族氨基酸由芳香族氨基酸置換等。這些觀點是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在本發(fā)明肽中間可以放置間隔基。這樣可以形成多聚體。適當(dāng)?shù)拈g隔基是本領(lǐng)域熟知的。
圖2在用G6k-GnRH串聯(lián)二聚體肽免疫后，對于各個動物(每個柱代表一個動物)血清，由GnRH-I(圖2A)和GnRH-II(圖2B)置換的碘化GnRH-I的百分率，丙氨酸置換在每一簇柱下標(biāo)示。將在加強免疫后(10wpv)3周獲得的抗血清稀釋為1∶100至1∶10000。將GnRH-I和GnRH-II以250pmol/ml濃度加入進(jìn)行置換。
圖2A水平軸用于免疫的肽；垂直軸由GnRH-I置換的碘化GnRH-I的百分率。
圖2B水平軸用于免疫的肽；垂直軸由GnRH-II置換的碘化GnRH-I的百分率。
圖3在用G6k-GnRH-串聯(lián)二聚體肽免疫后，對于各個動物(每個柱代表一個動物)血清，碘化的GnRH-I由GnRH-I(圖3A)和GnRH-II(圖3B)置換的百分率，丙氨酸置換在每簇柱下方標(biāo)示。在加強免疫(7wpv)時獲得抗血清，并稀釋為1∶100至1∶10000。以250pmol/ml濃度加入GnRH-I和GnRH-II以進(jìn)行置換。H2A和W3A血清數(shù)據(jù)未包括，因為抗體效價太低以至于不能測定置換。
圖3A水平軸用于免疫的肽；垂直軸碘化的GnRH-I由GnRH-I置換的百分率。
圖3B水平軸用于免疫的肽；垂直軸碘化的GnRH-I由GnRH-II置換的百分率。
圖4用綴合于卵清蛋白的GnRH-串聯(lián)二聚體肽(62μg)免疫的幾組豬的免疫閹割效力，用Specol作為佐劑。起始的肽是GnRH串聯(lián)(Cys-OH)二聚體(縮寫為Cys-OH)。在這一肽中，所有丙氨酸掃描肽均用于免疫。免疫閹割效力劃分為1-4級(1＝免疫閹割不發(fā)生，2＝少數(shù)豬被免疫閹割，3＝大多數(shù)豬被免疫閹割，4＝所有的豬被免疫閹割)。
圖5在用GnRH-串聯(lián)二聚體肽免疫后，對于各個動物(每個柱代表一個動物)血清，碘化的GnRH-I由GnRH-I(圖5A)和GnRH-II(圖5B)置換的百分率，丙氨酸置換在每簇柱下方標(biāo)示。將在加強免疫(10wpv)3周后獲得的抗血清稀釋為1∶100至1∶10000。以250pmol/ml濃度加入GnRH-I和GnRH-II以進(jìn)行置換。
圖5A水平軸用于免疫的肽；垂直軸碘化的GnRH-I由GnRH-I置換的百分率。
圖5B水平軸用于免疫的肽；垂直軸碘化的GnRH-I由GnRH-II置換的百分率。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一個特征是本發(fā)明的肽具有SEQ ID NO4所示通式，或以下單字母代碼所示通式pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#在這個通式中，Q代表Gln并可以位于X之前，其中X代表一個間隔基。這些氨基酸中有一些已經(jīng)用其它氨基酸置換。在這個通式中，取代位置用黑體字表示并下劃線。大寫字母代表左旋氨基酸，小寫字母代表右旋氨基酸，例如KL-Lys；kD-Lys。隨后當(dāng)偶聯(lián)于載體時確定其免疫原性應(yīng)答，所述載體一般是卵清蛋白，但也可以使用其它載體如KLH，BSA。
應(yīng)該理解，GnRH-II肽序列(SEQ ID NO2)決定了哪個氨基酸可以以這樣的方式被取代，即在GnRH-I和GnRH-II兩個序列之間仍可能存在基于免疫應(yīng)答的有效區(qū)分。
為確定通過本發(fā)明GnRH疫苗產(chǎn)生的抗體是否可以區(qū)分GnRH-I和GnRH-II，進(jìn)行GnRH抗體結(jié)合分析以確定抗GnRH-I-串聯(lián)二聚體肽或其丙氨酸取代類似物的抗體與GnRH-II是否結(jié)合。將血清稀釋液與GnRH-I，GnRH-II，對照肽或不用肽預(yù)先溫育。接著將碘化的GnRH-I加入，以競爭預(yù)先溫育的肽與抗體的結(jié)合。
在加強免疫之前及之后收集血清，因為在加強免疫后抗體的特異性可能提高。
當(dāng)本發(fā)明肽與卵清蛋白綴合(OVA-綴合物)使用并與對照相比較時，均示出在幼豬的免疫閹割中有效。與已知G6k-GnRH串聯(lián)二聚體OVA綴合物相比較(見表1)，示出本發(fā)明肽呈現(xiàn)可比的或相似的效力，即使其與“自身”激素GnRH的相似之處已經(jīng)降低。本發(fā)明的肽提供的免疫原性應(yīng)答可以有效區(qū)分GnRH-I和GnRH-II。這些肽導(dǎo)致睪丸小及睪酮水平低。更具體地，表現(xiàn)為低睪丸重量和低睪酮水平的肽是R8A，G10A和S4A?；贕nRH-I和GnRH-II之間的免疫學(xué)選擇性，優(yōu)選的肽是S4A和pE1A。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述肽選自pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#(SEQ ID NO5)，pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#(SEQ ID NO6)和pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#(SEQ ID NO7)。更優(yōu)選地選自pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#(SEQ ID NO6)和pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#(SEQ ID NO7)。
在本發(fā)明的肽中，串聯(lián)單位的二聚體化可以例如通過羧基末端或通過氨基末端發(fā)生。兩個串聯(lián)單位可例如通過二硫鍵或硫醚鍵二聚體化。為二聚體化所述串聯(lián)序列，可以使用第21位的Cys，或者Cys可以在第1位的谷氨酸之前合成。在現(xiàn)有技術(shù)中也可以發(fā)現(xiàn)二聚體化或多聚體化GnRH-串聯(lián)單位的其它方法。如果第21位的Cys參與二聚體化并因此不可用于偶聯(lián)，可以使用可以偶聯(lián)串聯(lián)序列的另一氨基酸。如果二聚體化或多聚體化導(dǎo)致可以偶聯(lián)載體化合物的可及位點喪失，這足以將置換氨基酸限于具有適當(dāng)側(cè)鏈的氨基酸。這種置換氨基酸例如是L-Kys或D-Lys，L-Glu或D-Glu或其它含有側(cè)鏈可以偶聯(lián)載體化合物的氨基酸。對L-和D-取代均已經(jīng)測試并發(fā)現(xiàn)具有相同作用。
更具體地，本發(fā)明的這種優(yōu)選的肽例如是D-Lys6-串聯(lián)-GnRH二聚體(SEQ ID NO8)，其具有下式1 21#EHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC|#EHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC22 42在本發(fā)明的一個實施方案的這一實施例中，可以用另一個氨基酸置換串聯(lián)二聚體的一個氨基酸。
本發(fā)明還包括其它的肽或肽序列或偶聯(lián)的肽序列，其中存在含有氨基酸取代的單體的，二聚體的或多聚體的GnRH串聯(lián)單位。
本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含一種免疫原性形式的肽。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，有產(chǎn)生自身并不是免疫原性的物質(zhì)的免疫原性形式的不同方法。一種可能是將本發(fā)明的肽偶聯(lián)于一種適當(dāng)?shù)妮d體蛋白。一種適當(dāng)?shù)妮d體蛋白是卵清蛋白，KLH或BSA。在串聯(lián)肽中，在C末端的一個半胱氨酸可以適當(dāng)用于化學(xué)偶聯(lián)。在串聯(lián)二聚體肽中，偶聯(lián)也可以使用普通的或修飾的側(cè)鏈(D-)賴氨酸、(D-)谷氨酰胺或任何其它修飾的氨基酸置換所述肽序列中的氨基酸而進(jìn)行。適當(dāng)?shù)呐悸?lián)方法和載體蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
根據(jù)本發(fā)明，有一種優(yōu)選的組合物，特征在于其包含一種蛋白質(zhì)如卵清蛋白與一種肽或肽組合物的免疫原性綴合物。
本發(fā)明的組合物可以以疫苗形式使用。為此可以生產(chǎn)適于施用形式的組合物。通過施用本發(fā)明的疫苗，產(chǎn)生抗GnRH的一種免疫原性應(yīng)答，優(yōu)選抗GnRH-I的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明因此還提供了一種免疫哺乳動物抗GnRH-I的方法，通過用本發(fā)明的疫苗免疫所述哺乳動物而進(jìn)行。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種用本發(fā)明疫苗選擇性免疫哺乳動物抗GnRH-I的方法。
當(dāng)然，本發(fā)明的疫苗制品可以與至少一種免疫佐劑組合。適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┦潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明優(yōu)選的佐劑是Specol或一種雙油乳狀液，但也可以使用不引起或只有輕微副作用的其它佐劑。本發(fā)明可以用于免疫選自各種脊椎動物尤其是哺乳動物的個體而抗GnRH-I的方法中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述疫苗可以單次劑量施用，其與必須施用兩次的已知疫苗具有相同作用?？笹nRH-I免疫，優(yōu)選選擇性免疫，可例如用于使小家畜如雄性和雌性貓和狗絕育，或用于處理雄性狗和牛的進(jìn)攻性。本發(fā)明的抗GnRH-I免疫還防止雌性動物如狗，貓和牛發(fā)情，及防止或處理需要增肥以屠宰的雄性動物躁動。在人類衛(wèi)生保健中，抗GnRH免疫，優(yōu)選選擇性抗GnRH-I或GnRH-II免疫，可以用于治療前列腺癌和乳腺癌，而且如果需要，可以治療一些垂體癌。
本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案是改良豬的肉質(zhì)的一種方法，其中將豬用本發(fā)明的這種疫苗制品免疫。本發(fā)明通過以下實驗部分得以例證。
I.豬的免疫閹割材料和方法材料乙腈(ACN)是HPLC-S梯度級，N-甲基吡咯烷酮(NMP)，二異丙基乙胺(DIEA)，二甲基甲酰胺(DMF)，三氟乙酸(TFA)和哌啶是肽合成級并均得自Biosolve(Valkenswaard，NL)。N-羥基苯并三唑(HOBt)和2-(1H-苯并三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲(tetramethyluronium)六氟磷酸鹽(HBTU)均得自Richelieu生物技術(shù)公司(Hamon，加拿大)。苯并三唑-1-基-氧(oxy)-三(tris)-吡咯烷-六氟磷酸鏻(PyBOP)得自Novabiochem(Laufelfingen，瑞士)。苯甲硫醚(TA)，乙二硫醇(ethanedithiol)(EDT)，二甲亞砜(DMSO)，戊烷和二甲基氨基嘧啶(DMAP)是預(yù)分析級并得自Merck(Darmstad，德國)。二乙醚在使用之前通過活化的堿性氧化鋁柱純化。氨基酸衍生物和樹脂得自Bachem Feinchemicalien AG(Bubendorf，瑞士)。多重肽合成(MPS)設(shè)定Hamilton Microlab 2200程序?qū)⑾礈烊軇┖驮噭┘尤胍慌?0個帶有濾膜的4ml柱中，所述柱中含有30mmol樹脂以進(jìn)行肽合成。將柱在每個步驟之后通過真空排水。偶聯(lián)循環(huán)基于Fmoc化學(xué)，使用雙偶聯(lián)步驟1.NMP洗滌(1ml)2.30％(v/v)哌啶/NMP(3分鐘，0.5ml)3.30％(v/v)哌啶/NMP(17分鐘，0.5ml)4.NMP洗滌(5×1ml)5.雙偶聯(lián)(2×30分鐘)6.NMP洗滌(2×1ml)偶聯(lián)步驟將NMP中的Fmoc-氨基酸(0.4M，0.25ml)，DMF中的HBTU/HOBt(0.45M，0.22ml)，和NMP中的DIEA(2M，0.2ml)移至反應(yīng)試管中，反應(yīng)30-50分鐘。將反應(yīng)混合物排水并重復(fù)一次偶聯(lián)步驟。
在最后的氨基酸偶聯(lián)后，將Fmoc基團用30％哌啶/NMP裂解，洗滌所述肽，使用NMP/乙酐/DIEA 10/1/0.2?；?0分鐘，再次洗滌，并干燥。將所述肽在一種混合物中脫保護并裂解2小時，所述混合物是1.5ml的TFA/苯酚/TA/水/EDT 10/0.75/0.5/0.5/0.25(試劑K)。將所述裂解混合物過濾，將樹脂用0.5mlTFA洗滌，并將所述肽通過加入13ml戊烷/二乙醚1/1而沉淀。離心后，將沉淀物用戊烷/二乙醚再次提取。將沉淀干燥，溶解于ACN/水1/1中并凍干。根據(jù)分子量，這個步驟產(chǎn)生25-70mg的肽。
合成的肽序列以單字母代碼示于表1。
表1以單字母代碼表示的合成的肽的氨基酸序列肽 氨基酸序列G6k-GnRH串聯(lián) pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#(SEQ ID NO9)pE1A-G6k-GnRH串聯(lián)*AHWSYkLRPGAHWSYkLRPGC#(SEQ ID NO10)S4A-G6k-GnRH串聯(lián) pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#(SEQ ID NO5)Y5A-G6k-GnRH串聯(lián) pEHWSAkLRPGQHWSAkLRPGC#(SEQ ID NO11)L7A-G6k-GnRH串聯(lián) pEHWSYkARPGQHWSYkARPGC#(SEQ ID NO12)R8A-G6k-GnRH串聯(lián) pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#(SEQ ID NO6)P9A-G6k-GnRH串聯(lián) pEHWSYkLRAGQHWSYkLRAGC#(SEQ ID NO13)G10A-G6k-GnRH串聯(lián) pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#(SEQ ID NO7)pE＝焦谷氨酸；*＝乙?；?；#＝酰胺；k＝d-賴氨酸；G6k＝天然GnRH序列第6位的Gly由d-賴氨酸取代。
分析HPLC為對肽進(jìn)行分析，我們使用LC-MS(電噴射)系統(tǒng)，其包括兩個Waters泵，型號510，一個Waters梯度控制器，型號680，一個WatersWISP712自動注射器，和一個Waters 991光電二級管陣列檢測儀。質(zhì)譜儀是Micromass Quattro II sq，其在陽離子模式中使用。將產(chǎn)物在含0.05％TFA的10％ACN/水至含0.05％TFA的70％ACN/水的線性梯度中，在Waters Delta Pak C18-100A(3.9×150mm，5mm)柱上以1ml/分鐘，在215nm分析30分鐘。根據(jù)峰面積，所有產(chǎn)物純度為40-70％。
二聚體化通過將所述產(chǎn)物溶解于20％ DMSO水溶液中將粗產(chǎn)物二聚體化。用1％NH4HCO3將pH調(diào)節(jié)為5-6，保持清澈的溶液。用1％乙酸校正pH。在室溫攪拌至少5小時后，將產(chǎn)物貯存于-20℃直至進(jìn)行純化。
制備HPLC肽純化使用Waters Prep 4000液相層析儀進(jìn)行，所述層析儀裝備有Waters RCM模塊，具有兩個PrepPa柱和一個保護柱(40×210mm或25×210mm)，其中充填有δ-Pak C18-100A(15mm)材料。一般而言，純化是使用與分析HPLC中相同的洗脫劑進(jìn)行，但梯度速度為0.5％ACN/min，流速為40或100ml/分鐘。用配有制備池的Waters 486分光光度計在215-230nm對肽進(jìn)行檢測。將所述肽凍干并測定其純度為至少90％。
綴合物制備為通過N-乙基-N＝-(3′-二甲基氨基丙基)鹽酸碳二亞胺(″EDC″)與雞卵清蛋白(″OVA″)綴合，將等重量的肽和載體蛋白分別溶解于milliQ水中，并將這兩種溶液充分混合。接著，基于重量，將10倍過量的EDC溶解于milliQ水中。隨后，將此溶液在持續(xù)攪拌下緩慢加入到肽/OVA溶液中，最終溶液pH為5。在至少6小時緩慢搖動后，將產(chǎn)物用300倍過量的milli Q水透析(MW cut-off 10,000)兩天。一天將水更新兩次。載荷是從所述綴合物和載體蛋白的對比氨基酸分析中計算的。在Pico-Tag工作站中使用6N HCl在150℃水解1小時，并用異硫氰酸苯酯衍生化后，使用Waters Pico-Tag系統(tǒng)進(jìn)行氨基酸分析。
根據(jù)氨基酸分析，所述綴合物含有0.3-0.5mg肽/mg載體蛋白，P9A-G6k-GnRH-串聯(lián)二聚體綴合物除外，其只含有0.16mg肽/mg卵清蛋白。
G6k-GnRH-串聯(lián)二聚體OVA綴合物以G6k-TD縮寫表示。具有丙氨酸取代的綴合物通過天然GnRH序列中被置換的氨基酸、其位置和代表丙氨酸置換的A而縮寫表示。例如pE1A-G6k-GnRH-串聯(lián)二聚體OVA綴合物是pE1A。
乳狀液制備將由在輕礦物油中的兩種去污劑組成的Specol(Special Oil Phase，ID-DLO，Lelystad，荷蘭)用作油相(Bokhout等，1981)。油包水(WIO)乳狀液是使用具有攪拌棒的Ultra Tunax(Janke和Kunkel，Staufen，德國)制備的。將油相Specol(5份v/v)置于25ml玻璃試管中，并將由在milli Q水中的綴合物組成的水相(4份v/v)緩慢加入，同時攪拌所述乳狀液。在加入水相后，將乳狀液以相同的轉(zhuǎn)速(15000rpm)攪拌半分鐘。將乳狀液在4℃貯存過夜以檢測穩(wěn)定性，并在第二天施用于動物。
動物在此實驗中使用的是雄性小豬，大約10周齡。將雜種小豬圈在半圍欄中，并隨意給予飼料和水。
免疫接種將所述小豬隨機進(jìn)行處理，每次處理6或7只小豬。將所有動物均用含有二聚體化的串聯(lián)GnRH綴合物(即62ug肽)的2ml所述乳狀液注射，或用無抗原的乳狀液注射。在開始實驗當(dāng)天(0天)和7周后(7wpv)，在頸部進(jìn)行肌內(nèi)注射。在初次免疫后13周(13wpv)后，將所有動物屠宰。
測量和血液取樣將動物在0天及7和13wpv稱重。睪丸大小通過用游標(biāo)卡尺在0天，及7，10和13周后測定睪丸長度而確定。睪丸大小以兩側(cè)睪丸的平均值記錄。
在測定睪丸大小的同一天通過刺破頸靜脈取血樣，并在開始免疫后第4周也取血樣。將血樣在4℃保持過夜，第2天通過離心(1500g，15分鐘)獲得血清。將血清樣品在-20℃貯存直至進(jìn)行分析。
屠宰后評價在屠宰后取出睪丸，除去附睪并稱重。睪丸的重量以兩側(cè)睪丸平均值記錄。
肽抗體用ELISA測定用于免疫的肽抗體。將肽使用戊二醛(GDA)包被在微效價平板孔中。通過與在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH5)中的0.2％GDA在室溫溫育4小時，將GDA包被于所述孔的表面。將平板用0.1M磷酸鹽緩沖液(pH8)漂洗3次，每次10分鐘。將100ml磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH8)中的1μg肽通過在37℃溫育3小時包被于每個孔。將平板貯存在-20℃直至使用。將解凍的平板用每升水含有8.2g NaCl，1.15g Na2HPO4.2H2O，0.20g NaH2PO4.2H2O和5ml10％Tween 80水溶液的milli-Q水漂洗3次，每次10分鐘。
使抗肽血清的系列血清稀釋液與包被的肽在25℃反應(yīng)1小時。在洗滌3次、每次10分鐘后，將作為二級抗體的偶聯(lián)于辣根過氧化物酶(Dako，Glastrup，Denmark)的山羊抗豬IgG導(dǎo)入1小時，并將ABTS(Boehringer，德國曼海姆)((250ml(2g/100ml)，在加入20mlH2O2(3％溶液)的10ml底物緩沖液中)用作底物。在405nm測定吸光度。
GnRH抗體GnRH抗體通過Meloen等(疫苗12，741-746(1994))所述方法測定。使所述豬抗血清的系列稀釋液結(jié)合125I-GnRH。效價以給定的血清稀釋液結(jié)合125I-GnRH的百分率表示。
睪酮血清中睪酮水平使用購自DPC實驗室(Los Angeles，CA)的Coat-a-Count試劑盒確定。
結(jié)果睪丸大小和睪丸重量在第一次免疫7周后，通過測定睪丸大小已經(jīng)可以觀測到免疫閹割作用。3種處理方法(R8A，G10A和G6k-TD)示出在加強免疫時平均睪丸大小幾乎沒有增加(＜10mm)。這些處理是成功的，睪丸重量在屠宰時為70g或更少。在低睪丸重量方面有效的其它處理是pE1A和S4A，而在Y5A，L7A和P9A組中，分別有2，1和1只動物對免疫無應(yīng)答(表2)。免疫閹割的動物的個體睪丸重量不超過70g，因此免疫閹割的動物和未免疫閹割的動物之間產(chǎn)生明顯不同。
表2根據(jù)睪丸重量(g)評價的不同處理的效力處理個體睪丸重量(g) 睪丸重量(g)應(yīng)答者數(shù)目/總數(shù)(中值(范圍))G6k-TD 10，10，10，12，16，7011(10-70) 6/6pE1A16，18，33，36，53，55，6536(16-65) 7/7S4A 10，14，15，36，40，43，6936(10-69) 7/7Y5A 15，19，34，44，69，210，235 44(15-235) 5/7L7A 12，13，15，20，24，29，195 20(12-195) 6/7R8A 10，10，12，15，17，19，1915(10-19) 7/7P9A 8，9，20，23，31，57，300 23(8-300) 6/7G10A11，13，14，14，15，30，3914(11-39) 7/7對照150，173，204，206，236 204(150-236) 0/5抗體應(yīng)答抗用于免疫的肽的平均抗體效價示于表3。用H2A和P9A處理的豬的平均抗體效價比其它處理的肽抗體效價低。
各個動物的抗不同肽的抗體效價為在2-4之間。在未免疫閹割的處理動物中，示出最低的抗肽效價。用H2A和W3A處理的動物未免疫閹割，但存在明顯的抗肽效價。
在H2A和W3A組中，在1/2000血清稀釋液中GnRH抗體結(jié)合百分率檢測不到或較低。然而，在1/200血清稀釋液中，在H2A組的所有動物血清和W3A組的3只動物血清中可檢測到抗體。
具有低平均GnRH抗體效價的動物未被免疫閹割。高抗體效價總是產(chǎn)生成功閹割的動物。具有中等抗體效價的動物睪丸重量在15-300g之間。
每次處理的平均GnRH抗體效價示出與每次處理的睪丸重量(中值)的明顯關(guān)聯(lián)(表3)。
睪酮所有成功處理的動物的睪酮水平均較低，而且在第二次免疫后降低。然而，多數(shù)(n＝31)動物在早如初次免疫后4周就顯示出閹割作用，這通過睪酮水平檢測不到而示出。這些動物的睪丸重量在8-36g。
大多數(shù)動物因此在施用單次劑量后就被有效免疫。
盡管所有免疫閹割的動物在屠宰時睪酮水平較低，但睪丸重量在65和70g的兩只動物分別具有3.80和1.18pmol/ml的明顯血清睪酮水平。
導(dǎo)致低睪丸重量和檢測不到的睪酮水平的肽被認(rèn)為是對豬進(jìn)行免疫閹割的最有效肽。這些肽是S4A，R8A和G10A。
未免疫閹割的豬在屠宰時睪酮水平為0.46-48.91pmol/ml。
表3不同處理對平均睪丸重量、肽抗體效價、GnRH抗體結(jié)合百分率和血清中LH和睪酮水平的作用處理 睪丸重量 10wpv時的GnRH結(jié)合 13wpv時睪酮(pmol/ml)(中值(范圍)) 抗肽效價 (平均)(中值(范圍))G6k-TD11(10-70) 3.32 17.2 n.d.(n.d.-1.18)pE1A 36(16-65) 3.24 15.7 n.d.(n.d.-3.80)S4A 36(10-69) 3.19 16.9 n.d.(n.d.)Y5A 44(15-235) 2.92 11.3 n.d.(n.d.-9.44)L7A 20(12-195) 3.52 17.6 n.d.(n.d.-48.91)R8A 15(10-19) 3.34 17.7 n.d.(n.d.)P9A 23(8-300) 2.62 15.68 n.d.(n.d.-11.57)G10A 14(11-39) 3.19 17.6 n.d.(n.d.)wpv＝免疫后周數(shù)，n.d.＝檢測不到II.L-氨基酸對D-氨基酸的置換在串聯(lián)二聚體中第6，16，27和37位的D-賴氨酸(k)由L-賴氨酸(K)置換，并對所得肽進(jìn)行測試(表4)。G6k-GnRH-串聯(lián)pEHWSYkLRPGQHWSYkLRPGC#(SEQ ID NO9)G6K-GnRH-串聯(lián)pEHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC#(SEQ ID NO14)表4處理 睪丸重量(g) 應(yīng)答者數(shù)10wpv時的GnRH結(jié)合 13wpv時的睪酮中值(范圍) 目/總數(shù) 抗肽效價 (平均)(pmol/ml)(中值和范圍)G6k-TD 11(10-70) 6/6 3.32 17.2 n.d.(n.d.-1.18)G6K-TD 21(9-175) 5/6 2.70 15.6 n.d.(n.d.-5.26)對照 204(150-236)0/5 n.d. n.d. 2.05(0.65-9.35)n.d.檢測不到L-賴氨酸對D-賴氨酸的置換不改變疫苗抗原的效力。
III.GnRH-I和GnRH-II之間的區(qū)分進(jìn)行GnRH抗體結(jié)合競爭放射性免疫分析，以確定抗G6k-GnRH-串聯(lián)(SEQ ID NO9)二聚體肽或其丙氨酸置換類似物產(chǎn)生的抗體是否結(jié)合GnRH-II。將血清稀釋液與GnRH-I，GnRH-II，對照肽，或無肽預(yù)先溫育。接著將碘化的GnRH-I加入以與預(yù)先溫育的肽競爭結(jié)合抗體。
在加強免疫之前和之后收集血清，因為抗體的特異性在加強免疫后會提高，這歸因于抗體的成熟。
材料和方法將在7wpv和10wpv(加強免疫后3周)收集的血清樣品在含0.4％BSA的PBS(稀釋緩沖液)中稀釋1/100-1/10000。將50微升血清稀釋液置于微孔平板中，并加入25微升肽溶液(每孔含0，0.25，2.5或25pmol在稀釋緩沖液中的肽)。將此混合物在4℃溫育24小時。第二天，加入25微升碘化的GnRH(大約13000cpm)，過夜貯存(4℃)后用活性炭從結(jié)合肽中分離未結(jié)合的肽。離心后，分離上清，計數(shù)并計算與抗體結(jié)合的碘化的GnRH的百分率。
結(jié)果證實了在7wpv獲得的除H2A和W3A之外所有處理的血清的碘化的GnRH-I的抗體結(jié)合。與GnRH-I的競爭導(dǎo)致碘化的GnRH-I的結(jié)合明顯降低(見

圖1)，而碘化的GnRH-I由GnRH-II的置換是高度可變的。正如所預(yù)期的，無一抗血清結(jié)合對照肽。
針對10wpv血清在幾乎所有處理的血清中，碘化的GnRH-I由GnRH-I置換的百分率在80％以上(圖2A)。GnRH-II對碘化的GnRH-I的抗體結(jié)合的競爭導(dǎo)致碘化的GnRH-I在幾乎所有R8A，P9A，G10A和G6k-TD處理血清中全部或部分置換，及在半數(shù)Y5A和L7A處理的血清中置換(圖2B)。然而，pE1A，H2A，W3A和S4A組的所有動物的抗體完全喪失與GnRH-II的結(jié)合，并因此特異于GnRH-I。
對加強前(7wpv)血清的置換研究結(jié)果與10wpv血清不同。同樣，所有處理的血清(除了H2A和W3A之外，歸因于低抗體效價)均識別GnRH-I，這通過碘化的GnRH-I由GnRH-I的置換而確定(圖3A)。然而，與10wpv血清相反(圖2)，所有處理包括pE1A和S4A處理的大多數(shù)血清識別GnRH-II(圖3B)。因此，pE1A和S4A的7wpv血清不是特異于GnRH I，但針對于GnRH-I而非GnRH-II的特異性在加強免疫3周后(10wpv)充分建立。
用加強前血清獲得的抗體結(jié)合結(jié)果與10wpv血清結(jié)果不同。對pE1A和S4A處理的抗血清已經(jīng)測試其識別GnRH-I或GnRH-II的能力(圖3)。針對這兩種肽，來自7只動物中的6只動物的10wpv血清不結(jié)合GnRH-II。在加強免疫之前獲得的pE1A血清中，7只動物有4只示出結(jié)合GnRH-II。兩個血清不識別GnRH-II及一個血清示出不結(jié)合碘化的GnRH。S4A加強前血清結(jié)果與10wpv血清相反。S4A組所有動物的加強前血清均識別GnRH-II，而對碘化的GnRH的結(jié)合能力的抑制對于GnRH-I和GnRH-II是相似的。
IV.用GnRH-串聯(lián)二聚體綴合物對豬的免疫閹割與實施例I所述的丙氨酸掃描相似，合成GnRH-串聯(lián)肽的丙氨酸置換肽(表5)。如前所述將肽二聚體化，純化并綴合于OVA。
表5肽的氨基酸序列肽 氨基酸序列GnRH串聯(lián) pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC#pE1A-GnRH串聯(lián)*A---------A----------#H2A-GnRH串聯(lián)-A---------A---------#W3A-GnRH串聯(lián)--A---------A--------#S4A-GnRH串聯(lián)---A---------A-------#Y5A-GnRH串聯(lián)----A---------A------#G6A-GnRH串聯(lián)-----A---------A-----#L7A-GnRH串聯(lián)------A---------A----#R8A-GnRH串聯(lián)-------A---------A---#P9A-GnRH串聯(lián)--------A---------A--#G10A-GnRH串聯(lián) ---------A---------A-#pE＝焦谷氨酸；*＝乙?；?；#＝酰胺；-＝在此位的氨基酸與GnRH串聯(lián)相同位置的氨基酸相同。
將每組4或5只豬用相當(dāng)于62μg肽的綴合物在Specol佐劑中進(jìn)行免疫。
所述綴合物的免疫閹割效力示于圖4。
針對用于免疫的所述肽的抗體效價在pE1A，H2A和R8A處理的豬中較低，而W3A，S4A，Y5A和G10A組抗肽抗體效價較高?？笹nRH-I抗體效價與所述抗肽抗體效價一致，但用W3A處理的豬的抗體效價除外在這些動物中測得高抗肽抗體，然而發(fā)現(xiàn)碘化的GnRH-I的抗體結(jié)合能力較低。
V.GnRH-串聯(lián)二聚體抗血清的GnRH-I和GnRH-II之間的區(qū)分在放射免疫分析中，在用具有丙氨酸置換的GnRH-串聯(lián)二聚體肽處理的所有動物的100wpv血清(稀釋1/100-1/10000)中均觀測到碘化的GnRH-I的抗體結(jié)合。用GnRH-I的競爭導(dǎo)致碘化的GnRH-I的結(jié)合明顯降低。在幾乎所有處理的血清中，碘化的GnRH-I由GnRH-I置換的百分率在80％以上(圖5A)。
碘化的GnRH-I由GnRH-II的置換在不同組中明顯不同。在Y5A，L7A，R8A，P9A和TD處理的幾乎所有血清中導(dǎo)致碘化的GnRH-I的全部或部分置換(圖5B)，而其余處理的大多數(shù)血清碘化的GnRH-I只部分由GnRH-II置換，或者甚至根本不置換。
權(quán)利要求
1.一種包含修飾的GnRH十肽序列的肽，其可產(chǎn)生區(qū)分不同類型GnRH、優(yōu)選區(qū)分GnRH-I和GnRH-II的免疫原性應(yīng)答。
2.一種包含修飾的GnRH十肽序列的肽，其使睪酮水平在用所述肽以適當(dāng)劑量免疫后基本上檢測不到。
3.權(quán)利要求1或2的肽，其包含至少兩個偶聯(lián)的GnRH十肽序列，任選地通過一間隔基偶聯(lián)，其中至少一個氨基酸由一不同的氨基酸置換。
4.權(quán)利要求1，2或3的肽，其中所述不同的氨基酸是丙氨酸。
5.權(quán)利要求1-4任一項的肽，其中所述肽選自pEHWAYkLRPGQHWAYkLRPGC#，pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#，和pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#，優(yōu)選地選自pEHWSYkLAPGQHWSYkLAPGC#和pEHWSYkLRPAQHWSYkLRPAC#。
6.權(quán)利要求1-5任一項的肽，其是一種串聯(lián)肽。
7.權(quán)利要求1-6任一項的肽，其是二聚體化或多聚體化的。
8.權(quán)利要求7的肽，其與一種載體化合物綴合，其中所述載體化合物是一種蛋白質(zhì)。
9.權(quán)利要求7或8的肽，其中所述載體化合物是一種蛋白質(zhì)。
10.包含權(quán)利要求1-9任一項的肽的疫苗。
11.權(quán)利要求10的疫苗，還包含一種佐劑。
12.權(quán)利要求11的疫苗，其中所述佐劑是一種油包水乳狀液或一種雙油乳狀液的油相。
13.一種用權(quán)利要求10-12任一項的疫苗免疫哺乳動物抗GnRH的方法。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述疫苗是抗GnRH-I免疫的一種選擇性疫苗。
15.權(quán)利要求13或14的免疫哺乳動物的方法，其中所述疫苗以單次劑量施用。
16.權(quán)利要求10-12的疫苗，其具有以單次劑量施用即基本免疫閹割豬的足夠活性。
17.一種影響哺乳動物的一或多種生殖或行為特征的方法，特征在于所述哺乳動物根據(jù)權(quán)利要求13-15的方法免疫。
18.一種抗GnRH、優(yōu)選抗GnRH-I免疫哺乳動物的方法，包括用權(quán)利要求16的疫苗免疫所述動物。
19.一種免疫閹割豬的方法，特征在于所述豬根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法免疫。
20.抗GnRH抗體，其通過用包括用權(quán)利要求1-9任一項的肽激發(fā)免疫應(yīng)答這一步驟的一種方法獲得。
21.抗GnRH-II的疫苗，其包含權(quán)利要求1-9任一項的肽。
22.治療前列腺癌的組合物，其包含權(quán)利要求1-9任一項的肽。
23.權(quán)利要求1-9任一項的肽在制備藥物組合物中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求1-9任一項的肽在制備治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
25.治療前列腺癌的方法，包括施用適當(dāng)劑量的組合物，所述組合物包含激發(fā)至少一種抗GnRH-II免疫原性應(yīng)答的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含修飾的GnRH十肽序列的肽，在用所述肽以適當(dāng)劑量免疫后，睪酮水平基本上不能檢測得到，和/或產(chǎn)生可以有效區(qū)分GnRH－I和GnRH－Ⅱ的免疫原性應(yīng)答。本發(fā)明還涉及對豬進(jìn)行免疫閹割的方法。
文檔編號A61K38/00GK1455781SQ01815531
公開日2003年11月12日 申請日期2001年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月12日
發(fā)明者羅伯特·漢斯·梅洛恩, 亨德里克·貝倫迪納·奧科, 茹沃特·安妮·圖科斯特拉 申請人:Id－萊利斯塔德動物保健及動物育種研究所公司