專利名稱：支化鏈親脂性分子衍生物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的支化鏈親脂性分子磷酸衍生物，涉及其藥物組合物，和其以可逆和選擇方式提高生物屏障的通透性和抑制腫瘤生長(zhǎng)的用途。
背景技術(shù)：
很多藥物和治療性物質(zhì)應(yīng)用的主要局限性是它們穿過生物屏障的能力不足。這提出一個(gè)嚴(yán)重的問題，尤其對(duì)于特定位置例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病和失調(diào)的治療。
血腦屏障(BBB)，由通過緊密接合而連接的特殊微血管內(nèi)皮細(xì)胞組成，正常情況下負(fù)責(zé)保持腦部?jī)?nèi)環(huán)境穩(wěn)定并且保護(hù)它不受循環(huán)系統(tǒng)中存在的毒物和降解產(chǎn)物的作用。但是，在一些病理學(xué)情形中，BBB的存在會(huì)干擾治療物質(zhì)運(yùn)輸?shù)侥X中，因此妨礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療，包括腫瘤，感染，膿腫和退化性疾病。
以類似方式，血腫瘤屏障(BTB)的存在干擾化學(xué)治療藥物送遞到腫瘤中，因此降低生物利用度并且在需要的情況下阻礙治療有效作用。治療物質(zhì)不足以接近病灶的問題在CNS腫瘤情況下特別嚴(yán)重，并且攜帶惡性腦部腫瘤的患者預(yù)后很不好。
為了在有限位點(diǎn)達(dá)到某些藥物臨床上有用的濃度，經(jīng)常要求以高全身劑量施用這些化合物。高全身劑量與不利的副作用及高水平毒性有關(guān)。
解決這個(gè)問題的一個(gè)策略涉及改變親水性藥物分子的生物物理特征，例如，通過將這些藥物與親脂性載體連接。因?yàn)樗幬锟邕^生物膜的通透性取決于它的親脂性，增強(qiáng)化合物的親脂性性質(zhì)理論上應(yīng)該提高它的生物利用度并且提高治療效果。Yatvin等人的美國(guó)專利5,827,819中公開了與目標(biāo)神經(jīng)病學(xué)活性化合物的這樣的極性脂質(zhì)連接物。
避免BBB不通透性的另一個(gè)方法是通過使用瞬間開放BBB并且有利于特定藥物或物質(zhì)進(jìn)入腦部的物質(zhì)。已經(jīng)證明象甘露糖醇這樣的物質(zhì)具有這種期望的作用并且已經(jīng)用于將化學(xué)治療藥物送遞給惡性腦腫瘤(Hiesinger等(1986)，Annals of Neurology，1950-59)。但是腦腫瘤治療中這種類型的高滲性BBB破壞的使用是有爭(zhēng)議的，因?yàn)槌怂幬锿ㄟ^BBB之外，也允許進(jìn)入其他分子，例如神經(jīng)毒素。這可以解釋與使用通透口方法治療相關(guān)的高發(fā)生率中風(fēng)，癲癇發(fā)作免疫反應(yīng)和眼毒性。
也公開過提高血腦屏障通透性的各種各樣的其他治療方法，包括使用緩激肽激動(dòng)劑(Alkermes的WO 91/16355)和一些其他的肽(Alkermes的WO 92/18529)；使用細(xì)菌細(xì)胞壁片段(RockefellerUniv.的WO 91/16064)或者使用抗百日咳桿菌絲狀血凝素或腦內(nèi)皮x-分子抗體(Rockefeller Univ.的WO 92/19269)。也有人報(bào)道過象油酸這樣的一些脂肪酸可逆地開放BBB(Sztriha和Betz(1991)，BrainRes.336257-262)。
公開過在施用診斷試劑(Oregon Health Sci.U.的美國(guó)專利5,059,415)或治療試劑(Oregon Health Sci.U.的WO 89/11299)之前可逆提高血腦屏障的通透性的方法是沒有用的。
本發(fā)明人以前在國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO 99/02120中公開過支化脂肪酸及其某些親脂性衍生物對(duì)于可逆性透過生物膜是有用的。但是，沒有人公開過包括磷酸酯部分的化合物。此外，沒有人公開過通過加入磷酸酯部分修飾支化脂肪酸有可能以特定的和有差別的方式調(diào)節(jié)生物學(xué)屏障的開放。
毫無(wú)疑問，目前開發(fā)的通透生物膜和屏障的組分產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。因此，還有這樣的沒有滿足的需要，即對(duì)將足量的治療物質(zhì)和診斷物質(zhì)送遞到限定位點(diǎn)提供有效而安全的方法。
人們提出很多種用于治療各種癌癥的組分，其中包括包含烴鏈和磷酸膽堿部分的化合物。Eibl的美國(guó)專利4,837,023和5,049,552公開了用于治療癌癥的組合物和方法。這些情況下活性物質(zhì)是已知的物質(zhì)十六烷基磷酸膽堿(HePC)。但是，根據(jù)這些專利的公開內(nèi)容，所有的試驗(yàn)的化合物中只有HePC具有實(shí)際上有用的抗腫瘤作用，而具有較短烷基的同系物不具有或具有太低的抗腫瘤作用，具有較長(zhǎng)烷基的同系物毒性大得多?，F(xiàn)有技術(shù)即沒有公開也沒有提示本發(fā)明主題的任何一種這樣的化合物。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了通式I的化合物 或者其藥學(xué)可接受鹽，其中R1和R2是相同或不同的，飽和的或不飽和的具有2-30個(gè)碳原子的脂族鏈；R3是A-[CH2]m-B-[CH2]n-C-[CH2]p-D，其中m，n和p各自獨(dú)立地是0或1-12的整數(shù)，并且A，B，C和D各自獨(dú)立地選自共價(jià)鍵，氨基，酰氨基，氧，硫，羰基，羧基，氧羰基，硫羰基，磷酸酯，氨基磷酸酯，一-，二-和三-氨基磷酸酯基團(tuán)，前提是沒有兩個(gè)氧原子直接彼此連接；Z1和Z2是相同或不同的，各自可以不存在或者獨(dú)立地選自a)氫，鈉，鋰，鉀，銨，一-，二-，三-和四-烷基銨，或者b)和磷酸基團(tuán)一起形成丙三醇，膽堿，乙醇胺，肌醇，絲氨酸，單糖或寡糖的磷酸酯。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通式I的化合物是α-支化脂肪酸分子，其中R1和R2分別是具有3和12-16個(gè)碳原子的烴鏈。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，通式I的化合物的R3包括一-或二-乙二醇部分。
根據(jù)本發(fā)明的一般優(yōu)選的化合物是磷酸4-十六烷基酯(3，12-PO4)，磷酸4-十八烷基酯(3，14-PO4)，磷酸4-二十烷基酯(3，16-PO4)，磷酸8-十五烷基酯(7，7-PO4)，磷酸4-十六酰氧基乙酯(3，12-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十六酰氧基)乙氧基乙酯(3，12-DEG-PO4)，磷酸4-十六烷基氧基乙酯(3，12-(醚)-MEG-PO4)，
磷酸2-(4′-十六烷基氧基)乙氧基乙酯(3，12-(醚)-DEG-PO4)，4-十六烷基磷酸膽堿(3，12-PC)，2-(4-十六酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，12-MEG-PC)，2-(4-十六酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，12-DEG-PC)，磷酸2-{2′-[10″-(十六烷基-4-氧基)癸-1-氧基]乙氧基}乙酯(3，12-O-C10-DEG-PO4)，2-{2′-[10″-(十六烷基-4-氧基)癸-1-氧基]乙氧基}乙基磷酸膽堿(3，12-O-C10-DEG-PC)，磷酸4-十八烷酰氧基乙酯(3，14-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十八烷酰氧基)乙氧基乙酯(3，14-DEG-PO4)，磷酸4-十八烷基氧基乙酯(3，14-(醚)-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十八烷基氧基)乙氧基乙酯(3，14-(醚)-DEG-PO4)，4-十八烷基磷酸膽堿(3，14-PC)，2-(4-十八烷酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，14-MEG-PC)，2-(4-十八烷酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，14-DEG-PC)，磷酸4-二十酰氧基乙酯(3，16-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-二十酰氧基)乙氧基乙酯(3，16-DEG-PO4)，磷酸4-二十烷基氧基乙酯(3，16-(醚)-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-二十烷基氧基)乙氧基乙酯(3，16-(醚)-DEG-PO4)，4-二十烷基磷酸膽堿(3，16-PC)，磷酸2-(4-二十酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，16-MEG-PC)，2-(4-二十酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，16-DEG-PC)，磷酸10-(4′-十六酰氧基)癸酯，磷酸10-(8′-十五酰氧基)癸酯，磷酸2-[2′-(2″-丙基二十酰氧基)-乙氧基]乙酯(3，18-DEG-PO4)，和2-(2′-丙基二十酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，18-DEG-PC)。
一般最優(yōu)選的化合物是磷酸2-(4′-十六酰氧基)乙氧基乙酯，一鈉鹽，磷酸2-(4′-十六酰氧基)乙氧基乙酯，二鈉鹽，磷酸2-(4′-十六烷基氧基)乙氧基乙酯，2-(4-十六酰氧基)乙基磷酸膽堿，和
2-(4-十六酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿。
本發(fā)明的化合物用于提高生物屏障的通透性。因此，另一方面，本發(fā)明提供了含有有效量的上述通式I的化合物，或者其藥學(xué)可接受鹽，和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
本發(fā)明的藥物組合物還可以另外含有藥學(xué)有效量的一種生物活性劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是一種治療劑。所述治療劑可以選自但不限于抗腫瘤劑，抗病毒劑，抗微生物劑，抗真菌劑，抗炎劑，神經(jīng)保護(hù)劑和生物活性肽和蛋白質(zhì)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步含有一種診斷劑。
所述藥物組合物用于促進(jìn)將生物活性分子，例如治療劑和診斷劑，施用到組織和器官中，特別是在生物屏障優(yōu)先保護(hù)的位點(diǎn)。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述藥物組合物用于增強(qiáng)通過血視網(wǎng)膜屏障(BRB)，血腦屏障(BBB)和血腫瘤屏障(BTB)的藥物遞送。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可以用于提高其他生物學(xué)屏障的通透性，例如，促進(jìn)通過皮膚，角膜，結(jié)膜，鼻，支氣管，頰，陰道，和胃腸道上皮吸收，和通過血睪丸屏障和血腎界面。
可以通過口服，腸胃外或局部給藥或者通過局部灌注，灌腸法或器官內(nèi)灌洗施用藥物組合物。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)給藥。
另一方面，本發(fā)明提供了提高生物學(xué)屏障的通透性的方法。這些方法包括使所述屏障暴露于有效量的通式I的化合物，或者其藥學(xué)可接受鹽，這樣允許或提高生物學(xué)屏障的通透性。
另一方面，本發(fā)明提供了將生物活性劑施用到特定位點(diǎn)或器官中的方法，包括在有效量的根據(jù)本發(fā)明的化合物的存在下使所述位點(diǎn)或器官暴露于所述生物活性劑，這樣允許或提高生物活性劑在特定位點(diǎn)或器官中的穿透和/或積聚。所述特定位點(diǎn)或器官可以選自但不限于脊髓，腦，眼，睪丸，腺體和腫瘤。
另一方面，本發(fā)明提供了治療腫瘤的方法，包括對(duì)需要的患者施用治療有效量的含有作為活性成分的根據(jù)本發(fā)明的通式I的化合物的藥物組合物。所述腫瘤可以選自但不限于，癌(例如乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌和膀胱癌)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤(例如星形細(xì)胞瘤)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，眼內(nèi)惡性腫瘤，淋巴瘤，白血病，肉瘤和黑素瘤。腫瘤可以是原發(fā)或繼發(fā)腫瘤。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或失調(diào)的方法，包括與治療劑聯(lián)合對(duì)需要的患者施用治療有效量的含有通式I的化合物，或者其藥學(xué)可接受鹽的藥物組合物。所述治療劑可以包含在含有通式I的化合物的相同藥物組合物中，或者在分開的組合物中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是腦腫瘤，治療劑是抗癌藥物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療的疾病是眼科疾病或紊亂，例如囊樣黃斑水腫(CME)，與年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)，眼內(nèi)感染，眼內(nèi)炎癥和眼內(nèi)惡性腫瘤。
另一方面，本發(fā)明提供了增加診斷劑在生物學(xué)屏障保護(hù)的器官中的積累的方法，包括與有效量的上面定義的通式I的化合物聯(lián)合對(duì)個(gè)體施用所述診斷劑，從而增加診斷劑在生物學(xué)屏障保護(hù)的器官中的積累。所述診斷劑可以包含在含有通式I的化合物的相同藥物組合物中，或者在分開的組合物中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物學(xué)屏障保護(hù)的所述器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1說(shuō)明3，n-型α-支化脂肪酸的各種鏈長(zhǎng)與這些化合物在Evans藍(lán)-白蛋白復(fù)合物外滲進(jìn)入大鼠腦部中的效能的相關(guān)性。
圖2A-C說(shuō)明單側(cè)施用下面的化合物之后攜帶雙側(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的大鼠腦切片中Evans藍(lán)的積累10μM 3，12-DEG-HPO4Na(圖2A)，40μM3，12-Na(圖2B)或甘露糖醇25％(圖2C)。
圖3A-C說(shuō)明單獨(dú)施用F-Na，或者與3，12-DEG-HPO4Na(圖3B)或賦形劑(圖3C)聯(lián)合施用熒光素鈉鹽(F-Na)之后30秒和10分鐘時(shí)記錄的大鼠眼后部的血管造影。
圖4A-B說(shuō)明根據(jù)實(shí)施例26的步驟，與3，12-DEG-HPO4Na(圖4A)或賦形劑(圖4B)聯(lián)合施用F-Na之后10分鐘時(shí)記錄的眼前部的F-Na積累。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及用于提高生物屏障通透性和用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的化合物，組合物和方法。
促進(jìn)將治療劑或診斷劑運(yùn)送到限定位點(diǎn)(例如腦，眼，睪丸等)的期望的物質(zhì)是能通透過限制性生物屏障的物質(zhì)。但是，優(yōu)選的通透作用一定要以差別方式實(shí)現(xiàn)而沒有產(chǎn)生不可接受程度的副作用。例如，在治療腦腫瘤情況下，使用在完整相鄰腦組織中以比BBB大得多的程度通透過BTB的物質(zhì)是有利的。在這種情況下，通透作用使得毒性藥物優(yōu)先在病理組織中積累，同時(shí)對(duì)周圍健康腦組織引起最小損傷或者沒有損傷。對(duì)于其他屏障有相似的考慮。例如，期望有這樣一種試劑，其能夠增強(qiáng)遞送藥物或其他有益分子以暫短而特異方式通過皮膚和腸屏障。
本發(fā)明涉及新的化合物并且基礎(chǔ)在于出人意料的發(fā)現(xiàn)，即這些化合物可以以可逆和選擇性方式提高生物屏障的通透性。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，所述新的化合物是如上定義的通式I的化合物或者其藥學(xué)可接受鹽。
在說(shuō)明書中，通式I的化合物總稱為″DP-BFAs″或者可互換地通稱為支化鏈親脂性分子的磷酸衍生物，縮寫是″P-BFA″。不帶有磷酸酯部分的支化鏈親脂性分子稱作″BFA″或″碳-BFA″。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，P-BFAs是通式結(jié)構(gòu)R1(R2)-CH-的α-支化親脂性分子的磷酸衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，P-BFAs是通式結(jié)構(gòu)R1(R2)-CH-[CH2]m-的支化親脂性分子的磷酸衍生物，其中m是1至12，因此稱作ω-支化親脂性分子，例如在位置β(m＝1)，γ(m＝2)等支化。
下文中，分別通過存在的它們的特定R1和R2，支化鏈親脂性分子側(cè)鏈和主鏈上的碳原子數(shù)，來(lái)稱謂特定的DP-BFAs。
其中R3是一乙二醇或二乙二醇的通式I的化合物分別稱作R1，R2-MEG-PO4和R1，R2-DEG-PO4。在某些情況下，具體指明連接支化鏈部分和相鄰化學(xué)基團(tuán)的鍵，例如，在3，12-O-C10-DEG-PO4，3，12-(醚)-DEG-PO4等。其中Z1是膽堿的通式I的化合物稱作R1，R2-PC。
根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，通過改變通式I的化合物的結(jié)構(gòu)中的各個(gè)部分來(lái)實(shí)現(xiàn)分子穩(wěn)定性和它們對(duì)生物屏障的通透作用的精密調(diào)節(jié)是可能的。例如，改變烷基R1和R2中的碳原子數(shù)目和飽和度會(huì)影響分子的總體疏水性，從而使得優(yōu)化其通過特定生物膜的能力。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選化合物是其中R1碳鏈長(zhǎng)度是2-14，并且R2和R3的碳原子總數(shù)是6-26的DP-BFA分子。目前更優(yōu)選的化合物是α-支化鏈化合物，其中R1是3個(gè)碳原子并且R2是12-16個(gè)碳原子。通式I優(yōu)選的化合物包括從磷酸酯基團(tuán)至支化的親脂性分子的支化點(diǎn)長(zhǎng)度最多是20個(gè)碳原子的脂族鏈。如上定義的通式I的R3部分中估計(jì)的碳原子數(shù)最適合通過DP-BFA分子的有效膜干擾，從而引起期望的通透作用。應(yīng)該注意到上述脂族鏈可以是連續(xù)的烴鏈，或者其中可以有一個(gè)或多個(gè)選自氧，硫，氮和磷原子的雜原子，這包括在R3的定義中。
在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通式I的分子的R3包括通過酯鍵連接支化鏈部分和至少一個(gè)二元醇部分的羰基。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，R3包括通過醚鍵連接支化鏈部分和至少一個(gè)二元醇部分的共價(jià)鍵。在生理?xiàng)l件下，醚鍵一般不易酶解，因此預(yù)期比酯鍵更穩(wěn)定。
可以影響DP-BFA化合物通過各種生物屏障的能力的另一個(gè)因素是分子中不同化學(xué)基團(tuán)的極性。這也可幫助不同通透作用的精密調(diào)節(jié)。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物是鹽的形式，是通式I的化合物的一價(jià)鹽或二價(jià)鹽。合適的鹽可以包括含一價(jià)或二價(jià)抗衡離子的任何藥學(xué)可接受鹽，可以選自但不限于，Na+，Li+，K+，NH4+，Ca++，Mg++，Mn++，一-，二-，三-和四-烷基銨。更優(yōu)選的化合物包括一價(jià)鹽。特別優(yōu)選的是鈉鹽形式的DP-BFA分子，是一-或二-鈉鹽。
通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法可以制備本發(fā)明的化合物。下面的實(shí)施例中詳細(xì)描述了一些這樣的方法。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的替代方法。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物體外破壞細(xì)胞緊密連接和體內(nèi)提高生物屏障的通透作用是有用的。此外，本發(fā)明以這樣的出人意料的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即一些磷酸支化鏈親脂性分子的衍生物對(duì)開放BBB和BTB屏障有不同的作用。因此，本發(fā)明的不同的P-BFA化合物可以用于產(chǎn)生生物屏障的通透作用而同時(shí)產(chǎn)生最小的毒性和副作用。
一些DP-BFA化合物就能差異通過生物屏障來(lái)說(shuō)對(duì)于不同大小的分子是有選擇性的。這一特征歸因于磷酸-BFA物質(zhì)更高的安全性水平。一些DP-BFAs作用時(shí)間不同，這可以證明是其中期望限定屏障瞬時(shí)選擇性通透的某些治療環(huán)境下另一個(gè)有益因素。
本發(fā)明的化合物和含有它們的藥物組合物可以使得或有利于遞送生物活性劑通過生物屏障。
術(shù)語(yǔ)″生物活性劑″意指包括能激發(fā)生物學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物系統(tǒng)具有作用或者作為指示工具的所有的天然存在的和合成的化合物。這些生物活性劑可以是治療或診斷劑。
治療劑可以包括但不限于，抗腫瘤劑，抗增生劑，抗炎劑，神經(jīng)病藥物，抗細(xì)菌劑，抗霉菌劑和抗病毒劑。這些化合物和本發(fā)明的化合物聯(lián)合特別用于治療限定部位的病理狀況，疾病和紊亂。例如，用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)和損害，包括腫瘤，感染，膿腫和退化性紊亂。
診斷劑可以包括但不限于，成像劑，造影劑和染料。診斷劑的例子包括放射性標(biāo)記物質(zhì)(例如锝-99m和氟-18為基礎(chǔ)的試劑)和造影劑例如釓為基礎(chǔ)的化合物。本發(fā)明的化合物可以用于，例如診斷和鑒定腦病變的方法。在這種情況下，本發(fā)明的化合物用于提高BBB通透性，可以和以可以被監(jiān)測(cè)的方式標(biāo)記的化學(xué)試劑一起導(dǎo)入(在相同的或分開的組合物中)。
要監(jiān)測(cè)的化學(xué)試劑可以是，例如，對(duì)腦細(xì)胞或結(jié)構(gòu)的一般指示劑，或者在某些腦區(qū)域或腦病變中特異性而排它性結(jié)合或者積累的試劑。然后可以對(duì)腦組織分析來(lái)確定標(biāo)記試劑的存在?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的掃描和成像方法進(jìn)行分析(例如磁性共振成像技術(shù)(MRI)，正電子發(fā)射X線斷層攝影術(shù)(PET)和計(jì)算機(jī)X線斷層攝影術(shù)(CT))。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，DP-BFA化合物可以用于增強(qiáng)藥物在腸中的吸收或透過皮膚吸收。腸和皮膚中的生物屏障阻止很多種物質(zhì)被動(dòng)擴(kuò)散通過胃腸或皮膚上皮，從而阻止某些有用的化學(xué)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物的有效吸收。通過和DP-BFA化合物聯(lián)合施用期望的有用的化學(xué)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和藥物可以克服這個(gè)障礙。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，很多種生物活性化合物適合與通式I的支化親脂性分子聯(lián)合，因此包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，作為用于根據(jù)本發(fā)明的治療或診斷的藥物組合物或方法的化合物。根據(jù)本發(fā)明，與期望的生物活性劑聯(lián)合施用P-BFA化合物。毫無(wú)疑問，所述期望的生物活性劑可以包括在相同的通式I的化合物的藥物組合物之中，或者可以在分開的組合物中施用。優(yōu)選地，兩種活性劑，即通式I的化合物和期望的生物活性劑，被同時(shí)施用，或者在短時(shí)間間隔之內(nèi)依次施用。在施用P-BFA化合物之前或者之后可以施用所述生物活性劑，前提是它在一個(gè)時(shí)間窗之內(nèi)，使得P-BFA對(duì)生物屏障的作用足以促進(jìn)相關(guān)的物質(zhì)通過進(jìn)入限定的部位。
下面的情況也是有可能的，即不是在施用P-BFA的同時(shí)附近施用期望的生物活性劑，而是所述期望的生物活性劑已經(jīng)存在于血液之中(或者是體內(nèi)自然產(chǎn)生或者作為緩慢釋放藥物而產(chǎn)生)。一些例子包括生物活性肽和蛋白質(zhì)，例如神經(jīng)遞質(zhì)，生長(zhǎng)因子，激素，抗體等。在這種情況下，要求發(fā)生目標(biāo)屏障的通透作用，同時(shí)存在足夠量的期望的生物活性劑來(lái)發(fā)揮其生物作用。
本發(fā)明的化合物在生物屏障的通透作用中的改進(jìn)的活性導(dǎo)致施用的藥物生物利用度提高，從而擴(kuò)大了這些藥物在對(duì)低劑量藥物沒有反應(yīng)的狀況中的治療用途。這在治療腦部和眼部限定部位的疾病和癥狀中特別適當(dāng)。
另外，本發(fā)明的化合物是有益的，它們能降低藥物的有用劑量，從而減少不期望的全身副作用。此外，因?yàn)楸景l(fā)明的分子能允許選擇性通過屏障，它們可以優(yōu)先增加特定位點(diǎn)(例如腫瘤)的藥物吸收而對(duì)相鄰細(xì)胞和組織則不這樣。
在對(duì)攜帶腫瘤的大鼠體內(nèi)檢查P-BFA的通透作用時(shí)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)一些試驗(yàn)化合物對(duì)腫瘤表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性作用，證實(shí)它們顯著抑制被治療的腫瘤的生長(zhǎng)的能力。因此確定了一些本發(fā)明的化合物可以用作抗癌劑。此外，當(dāng)體外對(duì)不同的正常的和腫瘤細(xì)胞測(cè)試它們的作用時(shí)，一些本發(fā)明的化合物具有經(jīng)證實(shí)的不同的細(xì)胞毒素活性。
根據(jù)本發(fā)明原理，不同的DP-BFA分子可以特異制備以適合特定目標(biāo)部位和特定指征。例如，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的分子在開放BBB和BTB屏障中以不同的方式作用。在這種情況下，某些DP-BFAs對(duì)BTB的通透作用比對(duì)BBB的作用程度更大。一些DP-BFA分子的作用的另一些有益特征是對(duì)于允許通過的化合物保持一定的區(qū)別水平。因此DP-BFAs以比碳-BFA或高滲劑例如甘露糖醇更具選擇性的方式影響屏障通透作用。作為結(jié)果，與本領(lǐng)域已知的其它通透劑相比，預(yù)期P-BFA化合物引起較小毒副作用。此外，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)它們的通透作用是可逆的，本發(fā)明的化合物也可以用于藥物的長(zhǎng)期給藥。
如說(shuō)明書和權(quán)利要求書中提到的，P-BFA的″有效量″指發(fā)揮根據(jù)本發(fā)明的期望的有益作用的本發(fā)明的化合物的量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，其是顯著提高相關(guān)屏障對(duì)感興趣的分子的通透性的P-BFA量。即，提高相關(guān)屏障的通透性以允許足夠量的感興趣的分子通過生物屏障這樣以發(fā)揮其治療或預(yù)防作用或者允許診斷程序的P-BFA量。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，它是作為抗癌劑的治療有效的P-BFA量。即，是抑制不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)的P-BFA的量。
在個(gè)體的基礎(chǔ)上并且至少部分在考慮到個(gè)體大小，具體的疾病，要治療的癥狀的嚴(yán)重程度等的基礎(chǔ)上確定有效量。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這些因素并且使用日常經(jīng)驗(yàn)容易確定有效量。
使用的劑量范圍和給藥方案取決于給藥途徑，接受者的年齡，性別，健康狀況和體重以及對(duì)特定DP-BFA的效能和施用的相關(guān)的有用的藥物或試劑。技術(shù)人員為了獲得期望的作用時(shí)間和程度能調(diào)節(jié)DP-BFA組合物和劑量。
藥物組合物可以是液體，氣溶膠或固體劑型，并且可以配制成任何合適的制劑，包括但不限于溶液，懸浮液，膠束，乳劑，微乳劑，氣溶膠，軟膏，凝膠，栓劑，膠囊，片劑，等，這些根據(jù)給藥途徑所要求。
本發(fā)明包括的合適的給藥途徑包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，吸入，鼻內(nèi)，局部，直腸或者其他已知途徑。在對(duì)CNS通透作用的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是通過動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)給藥。對(duì)于用作抗腫瘤藥物，本發(fā)明相關(guān)的藥物組合物優(yōu)選通過口服或靜脈內(nèi)或局部施用或者通過局部灌注，灌腸或器官內(nèi)灌洗。
現(xiàn)在通過下面的非限制性實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例I.化學(xué)實(shí)施例為了清楚起見，下面舉例說(shuō)明特定P-BFA分子及其鹽的合成方法。但是應(yīng)該明白相似方法也適用于其它的本發(fā)明的P-BFA分子的合成，包括但不限于，其中R1和/或R2是包括環(huán)烷基的脂族鏈的飽和的和不飽和的支化的鏈狀分子和化合物。也可以獲得P-BFA分子的各種藥學(xué)可接受鹽，包括但不限于鈉鹽，鉀鹽，銨鹽和烷基-銨鹽和與二價(jià)抗衡離子的鹽。
所有的合成的化合物都通過NMR，質(zhì)譜和元素分析加以鑒定。
實(shí)施例1磷酸烷基酯的合成制備通式RO-P(O)(OH)2的磷酸鹽。R代表R1(R2)-CH結(jié)構(gòu)的支化鏈烷基部分，其中R1指?jìng)?cè)烷基鏈中碳原子數(shù)目，R2指主烷基鏈中碳原子數(shù)目。
RO-P(O)(OH)2分子的合成是三階段程序。
第一階段，利用格林反應(yīng)從醛和烷基溴制備相應(yīng)的醇(R-OH)(Vogel′s，“有機(jī)化學(xué)實(shí)用手冊(cè)”(″Textbook of practical organicchemistry″)，Wiley，New York，pg.531，(1996))。
第二階段，從所述醇和氯化磷酸二苯酯制備磷酸二苯酯
第三階段，通過所述二苯酯的氫化作用獲得磷酸二氫烷基酯。
磷酸4-十六烷基二苯酯.
室溫下，振蕩下，向十六烷-4-醇(2.4克，0.01摩爾)的無(wú)水吡啶(5ml)溶液緩慢加入氯化磷酸二苯酯(4.0克，0.015摩爾)。將燒瓶用塞子塞住并且放置48小時(shí)；然后將內(nèi)含物倒到冰冷的1N鹽酸(100ml)中。分離重油狀物，用乙醚萃取。乙醚層用1N鹽酸(3次)，5％碳酸氫鈉(5次)，和水(5次)洗滌。干燥(MgSO4)之后，去除乙醚，并且用柱色譜法純化殘余物(石油醚(bp 30-60℃)∶乙醚，10∶1)。蒸發(fā)溶劑之后，獲得3.5g液體。產(chǎn)率74％。
磷酸4-十六烷基酯.(3，12-PO4)氫氣保護(hù)下振蕩氧化鉑(Adams催化劑)(0.32g)的冰醋酸(20ml)懸浮液，直到停止吸收。然后通過傾析，用2N鹽酸，水，并且最后用冰醋酸將Adams催化劑充分洗滌。將磷酸4-十六烷基二苯酯(3.2g)的冰醋酸(40ml)溶液加給所述催化劑，并且在氫氣下振蕩該溶液直到停止吸收。濾出催化劑并且用氯仿洗滌。真空下從濾液去除溶劑。殘余物用石油醚(bp 30-60℃)重結(jié)晶，并且在65℃下干燥。獲得2.01g終產(chǎn)物。產(chǎn)率92％。
磷酸4-十六烷基酯二鈉.(3，12-PO4Na2)磷酸4-十六烷基酯(1g，0.0031摩爾)溶解于乙醇(100ml)。加入NaOH(0.25g，0.0062mol)并且將混合物攪拌1小時(shí)后蒸發(fā)。加入乙醇(2×100ml)并且蒸發(fā)。加入乙醚(100ml)并且蒸發(fā)。殘余物用丙酮(30ml)重結(jié)晶，并且在65℃(15mm.Hg)下干燥。獲得0.9g終產(chǎn)物。產(chǎn)率79％。
1H-NMR(CD3OD)δ0.89(m，6H)，1.27(s，22H)，1.58(m，4H)，4.22(m，1H)。
MS(FAB)m/z 367.06(M+H)+。
磷酸4-十六烷基酯一鈉.(3，12-HPO4Na)磷酸4-十六烷基酯(3.13g，0.0097mol)溶解于乙醇(150ml)。加入NaOH(0.37g，0.0092mol)，并且將該混合物攪拌48小時(shí)之后蒸發(fā)。加入乙醇(2×150ml)并且蒸發(fā)。加入乙醚(2×100ml)并且蒸發(fā)。得到的固體用丙酮(100ml)研制并且在1mm.Hg氣壓下干燥過夜。獲得2.98g終產(chǎn)物。產(chǎn)率87％。
1H-NMR(CD3OD)δ0.87(m，6H)，1.25(s，22H)，1.51(m，4H)，4.12(m，1H)。
MS(FAB)m/z 345.11(M+H)+。
磷酸4-十八烷基酯二鈉.(3，14-PO4Na2)1H-NMR(CD3OD)δ0.89(m，6H)，1.27(s，26H)，1.58(m，4H)，4.17(m，1H)。
MS(FAB)m/z 395.20(M+H)+。
磷酸4-十八烷基酯一鈉.(3，14-HPO4Na)1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.28(s，26H)，1.56(m，4H)，4.14(m，1H)。
MS(FAB)m/z 373.29(M+H)+。
磷酸8-十五烷基酯二鈉.(7，7-PO4Na2)1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.30(s，20H)，1.60(m，4H)，4.12(m，1H)。
MS(FAB)m/z 352.93(M+H)+。
磷酸8-十五烷基酯一鈉.(7，7-HPO4Na)
1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.30(s，20H)，1.60(m，4H)，4.12(m，1H)。
MS(FAB)m/z 353.05(M+Na)+。
實(shí)施例2磷酸2-(2′-丙基十四酰氧基)乙酯的合成通過實(shí)施例1中如上所述相同的方法制備該化合物，使用醇C3H7-C(C12H25)H-C(O)-O-CH2-CH2-O-。從2-丙基戊酸的氯化酸酐和乙二醇獲得該醇(Vogel′s，″Textbook of practical organicchemistry″，Wiley，New York，pg.698，(1996))。
磷酸2-(2′-丙基十四酰氧基)乙酯二鈉.(3，12-MEG-PO4Na2)1H-NMR(CDCl3)δ0.87(m，6H)，1.24(s，22H)，1.54(m，4H)，2.33(m，1H)。
3.87(m，2H)，4.26(m，2H)。MS(FAB)m/z 439.19(M+H)+。
磷酸2-(2′-丙基十四酰氧基)乙酯一鈉.(3，12-MEG-HPO4Na)1H-NMR(CDCl3)δ0.87(t，6H)，1.24(s，20H)，1.42(m，2H)，1.56(m，2H)，2.34(m，1H).4.02(m，2H)，4.28(m，2H)。MS(FAB)m/z 417.19(M+H)+。
實(shí)施例3磷酸2-[2′-(2”-丙基十四酰氧基)-乙氧基]乙酯的合成通過實(shí)施例1中如上所述相同的方法制備該化合物，使用醇C3H7-C(C12H25)H-C(O)-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-。從2-丙基戊酸的氯化酸酐和二乙二醇獲得該醇(Vogel′s，″Textbook of practicalorganic chemistry″，Wiley，New York，pg.698，(1996))。
磷酸2-[2′-(2”-丙基十四酰氧基)-乙氧基]乙酯二鈉.(3，12-DEG-PO4Na2)1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.30(s，20H)，1.44(m，2H)，1.59(m，2H)2.39(m，1H)，3.72(m，4H)，4.09(m，2H)，4.24(m，2H)。MS(FAB)m/z 483.03(M+H)+。
磷酸2-[2′-(2”-丙基十四酰氧基)-乙氧基]乙酯一鈉.(3，12-DEG-HPO4Na)
1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.30(s，20H)，1.44(m，2H)，1.59(m，2H)2.39(m，1H)，3.72(m，4H)，4.09(m，2H)，4.24(m，2H)。MS(FAB)m/z 461.31(M+H)+。
用類似方法制備另外的化合物。例如，通過使用醇C3H7-C(C18H37)H-C(O)-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-制備磷酸2-[2′-(2”-丙基二十酰氧基)-乙氧基]乙酯化合物。從2-丙基花生酸的氯化酸酐和乙二醇獲得該醇。
磷酸2-[2′-(2”-丙基二十酰氧基)-乙氧基]乙酯一鈉.(3，18-DEG-HPO4Na)1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.30(s，34H)，1.44(m，2H)，1.59(m，2H)2.39(m，1H).3.72(m，4H)，4.09(m，2H)，4.24(m，2H)。
MS(FAB)m/z 544.31(M+H)+。
實(shí)施例4磷酸2-{2′-[10″-(十六烷基-4-氧)癸-1-氧基]乙氧基}乙酯一鈉鹽(3，12-O-C10-DEG-HPO4Na)的合成通過實(shí)施例1中如上所述相同的方法制備該化合物，使用醇C3H7-C(C12H25)H-O-(CH2)10-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-OH-。用兩步方法獲得該醇首先，使甲苯磺酸4-十六烷基酯(Vogel′s，″Textbook ofpractical organic chemistry″，Wiley，New York，pg.698，(1996))與1，10-癸二酸一鈉反應(yīng)產(chǎn)生10-(十六烷基-4-氧基)癸醇。第二步，通過使(第一步產(chǎn)生的)甲苯磺酸10-(十六烷基-4-氧基)癸酯與2-(2-羥基乙基氧基)乙酸鈉反應(yīng)制備醇2′-[10″-(十六烷基-4-氧基)癸基-乙基氧基乙醇。
1H-NMR(CD3OD)δ0.90(m，6H)，1.30(s，38H)，1.44(m，2H)，1.59(m，2H)3.15(m，1H).3.37(m，4H)，3,45-3,62(6H)，3,95(m，2H)。
MS(FAB)m/z 565.45(M+H)+。
實(shí)施例5磷酸2-(4-十六烷氧基)乙氧基乙酯的合成通過實(shí)施例1中如上所述相同的方法制備該化合物，使用醇C3H7-C(C12H25)H-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-。從2-(2-羥基乙氧基)乙酸鈉和甲苯磺酸10-(十六烷基-4-氧基)癸酯獲得該醇(Vogel′s，″Textbook of practical organic chemistry″，Wiley，New York，pg.698，(1996))。
4-十六烷磺酰氯將4-十六醇(12.29g 0.051mol)和對(duì)甲苯磺酰氯(12g 0.063mol)溶解于吡啶(100ml)，并且在室溫下攪拌過夜。加入二氯甲烷(400ml)。然后將二氯甲烷溶液用水，H2SO4(3％)，水，NaHCO3(3％)和水充分洗滌，用無(wú)水硫酸鎂(10g)干燥。蒸發(fā)溶劑之后，得到20g 4-十六烷磺酰氯粗產(chǎn)物。
2(4-十六烷氧基)乙氧基乙磺酰氯60℃下將鈉小塊(3.5g 0.15mol)加給二(乙二醇)(140ml 1.5mol)。相同溫度下向得到的溶液加入甲苯磺酸4-十六烷酯(粗產(chǎn)物20g)的THF(300ml)溶液。溶液在回流下攪拌6小時(shí)。室溫下向混合物加入水(100ml)。用乙酸乙酯(300ml)萃取混合物。蒸發(fā)溶劑之后，殘余物通過柱色譜法純化(石油醚(bp 30-60℃)∶乙醚，1∶1)。得到4g 2(4-十六烷氧基)乙氧基乙磺酰氯。從4-十六醇開始的產(chǎn)率是24％。
磷酸2(4-十六烷氧基)乙氧基乙酯二鈉(3，12-醚-DEG-PO4Na2)1H-NMR(CD3OD)δ0.9(m，6H)，1.28(s，22H)，1.43(m，4H)，3.30(m，1H)，3.60(m，4H)，3.69(m，2H)，4.07(m，2H)。MS(FAB)m/z 455.45(M+H)+。
實(shí)施例62-(2′-丙基十四酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿如下制備式C3H7-C(C12H25)H-C(O)-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-PO-(O)-O-CH2CH2N+(CH3)3的磷酸膽堿2-(2′-丙基十四酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，12-DEG-PC)向冷卻的(0℃)2-(2′-丙基十四酰氧基)乙氧基乙醇(15.8g，0.044mol)和三乙胺(10ml，0.075mol)的無(wú)水乙醚(250ml)溶液加入2-氯-2-氧-1，3，2-二氧雜phospholane(7ml，0.075mol)的200ml無(wú)水乙醚溶液。將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。濾出沉淀的晶體(C2H5)3N·HCl，并且真空去除溶劑。殘余物溶解于500ml三甲胺的無(wú)水乙腈溶液(0.27M)中，并且轉(zhuǎn)移至耐壓瓶。耐壓瓶在60-65℃的油浴中保持48小時(shí)。然后將耐壓瓶冷卻并且打開。去除溶劑，殘余物通過柱色譜法純化(CHCl3∶CH3OH∶H2O，1∶9∶1)。65℃下將蒸發(fā)溶劑之后獲得的油狀物凍干72小時(shí)。得到17.4g淺黃色蠟狀物。產(chǎn)率75％。
1H-NMR(CD3OD)δ0.9(t，6H)，1.29(s，22H)，1.46(m，2H)，1.59(m，2H)，2.38(m，1H)，3.25(S，9H)，3.69(m，6H)，3.99(m，2H)，4.29(m，4H)。MS(FAB)m/z 524.6(M+H)+。
通過類似于上述的方法合成下面的化合物。
2-(2′-丙基二十酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，18-DEG-PC)1H-NMR(CD3OD)δ0.9(t，6H)，1.29(s，34H)，1.46(m，2H)，1.59(m，2H)，2.38(m，1H)，3.25(S，9H)，3.69(m，6H)，3.99(m，2H)，4.29(m，4H).MS(FAB)m/z 608.6(M+H)+。
2-{2′-10″-(十六烷基-4-氧基)癸-1-氧基]乙氧基}乙基磷酸膽堿(3，12-O-C10-DEG-PC)1H-NMR(CD3OD)δ0.9(t，6H)，1.29(s，34H)，1.46(m，2H)，1.59(m，2H)，2.38(m，1H)，3.25(S，9H)，3.69(m，6H)，3.99(m，2H)，4.29(m，4H)。MS(FAB)m/z 608.6(M+H)+。
實(shí)施例72-(2′-丙基十四酰氧基)乙基磷酸膽堿的合成通過上述實(shí)施例6中相同的方法制備式C3H7-C(C12H25)H-C(O)-O-CH2-CH2-O-PO(O)-O-CH2CH2N+(CH3)3的磷酸膽堿，除了使用相應(yīng)的醇，即2-(2′-丙基十四酰氧基)乙醇代替2-(2′-丙基十四酰氧基)乙氧基乙醇。
2-(2′-丙基十四酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，12-MEG-PC)1H-NMR(CD3OD)δ0.9(t，6H)，1.29(s，22H)，1.46(m，2H)，1.59(m，2H)，2.39(m，1H)，3.24(S，9H)，3.66(m，2H)，4.07(m，2H)，4.28(m，4H)。MS(FAB)m/z 480.7(M+H)+。
實(shí)施例8烷基磷酸膽堿的合成通過上述實(shí)施例6中相同的方法制備式RO-PO-(O)-O-CH2CH2N+(CH3)3的磷酸膽堿化合物，除了在起始步驟中使用R-OH作為醇。R代表R1-C(R2)H-型支化鏈烷基。
4-十六烷基磷酸膽堿(3，12-PC)1H-NMR(CD3OD)δ0.91(t，6H)，1.28(s，22H)，1.57(m，4H)，3.21(S，9H)，3.62(m，2H)，4.25(m，3H)。MS(FAB)m/z 408.68(M+H)+。
4-十八烷基磷酸膽堿(3，14-PC)1H-NMR(CD3OD)δ0.9(t，6H)，1.28(s，26H)，1.57(m，4H)，3.21(S，9H)，3.61(m，2H)，4.23(m，3H)。MS(FAB)m/z 436.91(M+H)+。
8-十五烷基磷酸膽堿(7，7-PC)1H-NMR(CD3OD)δ0.92(t，6H)，1.32(s，20H)，1.59(m，4H)，3.23(S，9H)，3.63(m，2H)，4.26(m，3H)。MS(FAB)m/z 394.35(M+H)+。
實(shí)施例9ω-支化P-BFA的合成使用相關(guān)的ω-醇通過上述實(shí)施例1和6中相同的方法制備ω-支化P-BFA化合物。
ω-支化P-BFA的制備是六階段合成，起始試劑是1-溴-ω-醇和c和n-烷基-m-烷基酮。第一階段是根據(jù)Kocienski(″ProtectingGroup″；Georg.Thieme Verlag Stuttgart.N-Y.pg.83-84(1994))所述方法用二氫吡喃(DHP)保護(hù)1-溴-ω-醇的羥基。
第一階段I IITHP表示四氫吡喃醚。
第二階段和第三階段是如下叔醇的標(biāo)準(zhǔn)格利雅合成(Vogel′s，″Textbook of practical organic chemistry″，Wiley，New York，pgs.475，538，(1996))。
第二階段III第三階段IVR，R′-代表烷基。
第四階段是根據(jù)Carey和Tremper.(JACS，v.91，p.2967，(1969))所述方法通過離子氫化反應(yīng)對(duì)化合物(IV)的叔羥基的還原作用。
第四階段V第五階段是從得到的ω-支化醇(V)裂解保護(hù)基團(tuán)(″ProtectingGroup″；Georg.Thieme Verlag Stuttgart.N-Y.pg.83-84(1994))。
最后階段，第六階段，是將ω-支化醇氧化成相應(yīng)的ω-支化BFA。這根據(jù)Manger和Lee(Tetraehedron letters，v.22，N.18，p.1655，(1981))描述的方法進(jìn)行。
第六階段II.生理化學(xué)性質(zhì)實(shí)施例10DP-BFAs的體外親脂性測(cè)定通過比較這些化合物在有機(jī)溶液和水溶液中的溶解度估計(jì)支化脂肪酸的各種衍生物的親脂性值。使用辛醇和生理鹽水分別作為有機(jī)溶液和水溶液。通過搖瓶技術(shù)測(cè)定分配系數(shù)(Pc)值，即辛醇/鹽水分布。表1給出了結(jié)果，即以mg/ml表示的在辛醇和水中的溶解度和計(jì)算的LogPc。
表1辛醇-鹽水分配系數(shù)(Pc)
*支化脂肪酸和它們的PO4衍生物的鈉鹽。
實(shí)施例11結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性在該項(xiàng)研究中，評(píng)價(jià)支化鏈分子的生理化學(xué)性質(zhì)和它們的生物學(xué)作用之間的相關(guān)性。研究的目的在于找出支化鏈分子的鏈長(zhǎng)和它們?cè)诖笫竽XEvans藍(lán)(EB)外滲中的效能之間是否存在相關(guān)性(參見對(duì)于測(cè)定EC50值中使用的方法的實(shí)施例18)。使用3，n-型各種支化脂肪酸，其中一個(gè)支化鏈?zhǔn)?個(gè)碳原子，并且第二個(gè)烴鏈，n，是7-16個(gè)碳原子。圖1中圖示給出結(jié)果。
如圖1所示，發(fā)現(xiàn)BFAs 3，12，3，14和3，16在BBB的透化作用中是有活性的。在使用的實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)化合物中最有效的化合物是BFA-3，12。
III.生物學(xué)實(shí)施例III-a)體外研究實(shí)施例12體外毒性比較研究為了確定它們的毒性，在培養(yǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)AA8細(xì)胞系中篩選各種DP-BFA分子。從劑量反應(yīng)曲線計(jì)算引起細(xì)胞群50％死亡的濃度，即LC50值，將磷酸-BFAs的LC50值與相應(yīng)的支化脂肪酸的相比較(＝碳-BFAs)。
方法乳酸脫氫酶(LDH)釋放被用作細(xì)胞膜完整性分析，這樣，用于毒性估計(jì)。細(xì)胞(2×105/ml)接種在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基的96孔板上。兩天之后，以從500至1微克/毫升遞減的濃度向平板加入試驗(yàn)DP-BFA化合物或?qū)φ栈衔锸耐樗帷?小時(shí)之后收集細(xì)胞。在收集之前45分鐘，為了證明指示細(xì)胞死亡的完全溶解和最大乳酸脫氫酶釋放，向前6個(gè)孔加入16.5微升溶胞溶液。其它對(duì)照物包括兩個(gè)空白孔和5個(gè)含有沒有加入藥物的細(xì)胞的孔。離心之后(1500rpm，5分鐘)，使用45微升LDH測(cè)試混合物(Tox-7試劑盒，Sigma)將75微升上清液轉(zhuǎn)移給新的平板。室溫10-20分鐘之后，使用Elisa Reader 490nm測(cè)定吸光率。
表2總結(jié)了與不同的DP-BFAs溫育1小時(shí)之后得到的毒性數(shù)據(jù)。各個(gè)實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行三次。
表2BFAs和它們的磷酸衍生物對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的毒性檢測(cè)的化合物L(fēng)C50(μM)7，7-Na 657，7-PO4Na23203，12-Na1653，12-PO4Na23203，12-DEG-PO4Na2320一般情況下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)碳-BFA更敏感，對(duì)試驗(yàn)的磷酸-BFA衍生物較不敏感。估計(jì)溫育1小時(shí)之后對(duì)碳-BFA的亞毒性劑量在30-100μM之間。在相同的條件下，估計(jì)對(duì)試驗(yàn)磷酸-BFA衍生物的亞毒性劑量是160μM至640μM以上。
結(jié)論一般情況下，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的碳-BFAs分子相比磷酸-BFAs毒性小大約2-5倍。
實(shí)施例13DP-BFA對(duì)上皮細(xì)胞連接的作用使用人腺癌細(xì)胞系(A431)研究各種BFA衍生物對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞連接的作用。這些細(xì)胞具有腸細(xì)胞的極化結(jié)構(gòu)特征。
在該項(xiàng)研究中，監(jiān)測(cè)了與緊密連接復(fù)合體相關(guān)的蛋白質(zhì)ZO2的亞細(xì)胞分布的定量變化(Anderson等(1993)，Current Opinion in CellBiology 5772-778)。
在存在或不存在亞毒性劑量的DP-BFA下，在蓋玻片上在含血清的DMEM中培養(yǎng)的A431細(xì)胞被溫育1小時(shí)。用3％低聚甲醛和0.5％Triton-X-100的混合物固定細(xì)胞并且滲透2分鐘，然后單獨(dú)用3％低聚甲醛進(jìn)一步固定20分鐘。固定的細(xì)胞被清洗，并且在室溫下與兔多克隆抗體ZO2(Zymed Laboratories，Inc.USA)在室溫下溫育45分鐘，用PBS沖洗三次，并且與熒光標(biāo)記的二抗溫育45分鐘。在顯微鏡檢查之前染色的蓋玻片安裝在Elvanol(Mowiol 4-88，Hoechst，法蘭克福，德國(guó))中。監(jiān)測(cè)免疫熒光標(biāo)記的ZO2蛋白質(zhì)的分布。
使用與抑制磷酸酪氨酸磷酸酶從而破壞細(xì)胞連接的過釩酸鹽溫育了1小時(shí)的A431細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。
ZO2的熒光成像表明DP-BFA對(duì)破壞A431細(xì)胞的緊密聯(lián)接有明確的作用。
實(shí)施例14DP-BFA對(duì)上皮細(xì)胞單層的通透性的作用該項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)DP-BFA化合物在改變上皮細(xì)胞單層的通透性的動(dòng)力學(xué)和總的作用，它作為生物屏障特別是腸屏障的體外模型系統(tǒng)。
為了測(cè)定DP-BFA生物屏障透過性的作用，采用兩種方法。一種方法是使放射性標(biāo)記的化合物運(yùn)送通過上皮細(xì)胞單層。第二種方法是監(jiān)測(cè)電阻變化，作為指示細(xì)胞層通透性水平的量度。
在膜過濾器(0.4微米，1cm2)上培養(yǎng)上皮細(xì)胞。在供者和受者室兩個(gè)隔室之間放置帶有上皮細(xì)胞單層的膜。對(duì)頂端(供者)側(cè)加給預(yù)定無(wú)毒濃度的試驗(yàn)P-BFA化合物，和14C-蔗糖放射性示蹤劑(1 Ci，溶于0.5ml緩沖液)。在實(shí)驗(yàn)期間以10分鐘間隔從基底外側(cè)(受者)收集每份0.5ml的樣品，收集90分鐘。在70rpm搖動(dòng)的同時(shí)在含有1％FCS的組織培養(yǎng)基中進(jìn)行溫育。在每一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)將頂室和膜轉(zhuǎn)移到新的接受者室。為了在頂室中保持示蹤劑濃度不變和兩個(gè)室中液體體積不變而進(jìn)行。使用Trilux microbeta計(jì)數(shù)器(Wallac，F(xiàn)inland)估計(jì)收集的樣品中放射性示蹤劑的濃度。計(jì)算示蹤劑運(yùn)送速率并且表示為通透性系數(shù)。
在溫育開始和結(jié)束時(shí)通過使用millicell-ERC(Millipore)測(cè)定反式-上皮電阻(TEER)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中使用的上皮單層的完整性。
使用和上述相同的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行一套平行的實(shí)驗(yàn)，但是沒有加入放射性示蹤劑。每10分鐘監(jiān)測(cè)一次反式-上皮電阻(TEER)，監(jiān)測(cè)90分鐘。
結(jié)論i)P-BFAs顯著加強(qiáng)蔗糖通過通過上皮細(xì)胞單層，和ii)降低單層的TEER，這兩個(gè)事實(shí)支持這樣的結(jié)論，即P-BFA化合物透過生物屏障。
實(shí)施例15各種DP-BFAs對(duì)正常的和惡性的細(xì)胞類型的細(xì)胞毒活性在包括正常的和惡性的細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物中體外測(cè)定支化鏈脂肪酸(DP-BFAs)的各種磷酸衍生物的細(xì)胞毒活性。使用下面的細(xì)胞系原代成纖維細(xì)胞(人)正常骨髓(BM)細(xì)胞(小鼠)原代支氣管上皮細(xì)胞(人，來(lái)自Clonetics，cat.no.CC-2541)Caco-2-結(jié)腸癌細(xì)胞系(人，ATTC，HTB-37)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(大鼠，ATCC，CRL-2199)神經(jīng)2a-成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系(小鼠，ATCC，CCL-131)SKBR-3-乳腺癌細(xì)胞系(人，ATTC，HTB-30)HL60-骨髓白血病細(xì)胞系(人，ATCC，CCL-240)U937-骨髓白血病細(xì)胞系(人)在37℃下在微量滴定板中含有2mM L-谷氨酰胺，100單位/毫升青霉素，100微克/毫升鏈霉素和10％FCS的MEM中接種細(xì)胞。如所指明的在不存在(對(duì)照組)或存在各種DP-BFAs的條件下在線性生長(zhǎng)期溫育培養(yǎng)的細(xì)胞。試驗(yàn)的DP-BFA的最終濃度范圍是1.5-200微摩爾。溫育期結(jié)束時(shí)，即對(duì)于骨髓細(xì)胞是5天，對(duì)于所有的其它細(xì)胞系是3天，通過利用比色MTT分析法估計(jì)加入的P-BFA對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒素作用。MTT分析法(Mosmann(1983)J.Immunol Methods 6555-63)測(cè)定線粒體還原酶活性并且用于定量測(cè)定細(xì)胞存活率。與對(duì)照組相比較引起細(xì)胞存活率降低50％的藥物濃度定義為EC50。從對(duì)不同的分析的細(xì)胞系建立的劑量反應(yīng)曲線計(jì)算試驗(yàn)DP-BFA化合物的EC50值。表3總結(jié)了結(jié)果。各個(gè)EC50值是來(lái)自1-5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的EC50值的平均值。
從表3的結(jié)果可以看出，各種DP-BFAs分子對(duì)不同細(xì)胞的細(xì)胞毒素作用活性程度不同。試驗(yàn)化合物中，對(duì)于惡性細(xì)胞的最有效的細(xì)胞毒性劑是3，12-DEG-PO4，3，12-(醚)-DEG-PO4，3，12-MEG-PC，3，12-DEG-PC，3，18-DEG-PC和3，14-PC。這些化合物中的兩個(gè)，3，12-DEG-PO4和3，12-(醚)-DEG-PO4，發(fā)現(xiàn)對(duì)正常上皮細(xì)胞具有最低的細(xì)胞毒活性。另一種化合物，3，12-DEG-PC，發(fā)現(xiàn)對(duì)正常的成纖維細(xì)胞和正常的骨髓細(xì)胞具有最低的細(xì)胞毒活性。
表3DP-BFAs對(duì)各種細(xì)胞系的毒性
結(jié)論磷酸-BFA化合物 具有經(jīng)證實(shí)的細(xì)胞-類型特異性細(xì)胞毒作用。當(dāng)對(duì)惡性細(xì)胞系試驗(yàn)時(shí)，證明這些化合物中的幾個(gè)是最有效的細(xì)胞毒物質(zhì)，而對(duì)來(lái)自不同的組織的正常細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)，具有低得多的毒性。這些數(shù)據(jù)提示這些化合物可能是有效的具有低細(xì)胞毒性副作用的抗癌物質(zhì)。
實(shí)施例163，12-DEG-PC誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中caspase-3的激活和DNA片段化為了進(jìn)一步弄清各種DP-BFAs表現(xiàn)細(xì)胞毒作用的可能的機(jī)理，研究了用于細(xì)胞凋亡，caspase-3活性和DNA片段化的兩個(gè)確定的標(biāo)記(Lincz(1998)Immunol.Cell Biol.761-19)。
在37℃下含有2mM L-谷氨酰胺，100單位/毫升青霉素，100微克/毫升鏈霉素和10％FCS的MEM中接種Neuro2a成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(ATCC，CCL-131)。24小時(shí)之后，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入3，12-DEG-PC達(dá)25μM，50μM或100μM終濃度。只有賦形劑存在下培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。
對(duì)與藥物分別溫育6和24小時(shí)之后獲得的細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行caspase-3活性和DNA片段化分析。使用熒光團(tuán)底物Ac-DEVD-AMC(Pharmingen，Becton Dickinson，cat.no.66081U)并且根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明測(cè)定caspase-3活性。使用Cell Death Detection Elisa plus試劑盒(Roche，cat.no.1774 425)并且根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明定量測(cè)定DNA-片段化作用。
表4總結(jié)了結(jié)果。測(cè)得的caspase活性表示為標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白質(zhì)含量的對(duì)照平板中活性的百分比。DNA-片段化表示為λ＝405nm的OD值，并且是重復(fù)進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)物溶胞產(chǎn)物讀數(shù)的平均值。
表4用3，12-DEG-PC處理過的Neuro2a細(xì)胞中細(xì)胞凋亡標(biāo)記
從表4中的結(jié)果可以看出，Neuro2a細(xì)胞與化合物3，12-DEG-PC溫育，引起caspase-3活性提高大約5倍，并且DNA片段化顯著增加。當(dāng)對(duì)來(lái)自結(jié)腸癌的另一種惡性細(xì)胞系，caco-2，測(cè)試這種化合物時(shí)，獲得相似結(jié)果。
結(jié)論某些惡性細(xì)胞中細(xì)胞凋亡可能是BFAs的磷酸膽堿衍生物發(fā)揮細(xì)胞毒作用的可能機(jī)理。
III-b)體內(nèi)研究實(shí)施例17用于測(cè)定DP-BFA對(duì)BBB通透性的作用的體內(nèi)模型系統(tǒng)通過監(jiān)測(cè)以下兩種標(biāo)記在腦中的積累在大鼠模型系統(tǒng)研究DP-BFA對(duì)BBB的通透作用a)Evans藍(lán)染料(EB)，其體內(nèi)快速結(jié)合白蛋白(MW 70kD)，并且是細(xì)胞旁運(yùn)輸?shù)闹笜?biāo)；和b)熒光素鈉鹽(F-Na)，MW 376D，其通過細(xì)胞間隙被運(yùn)輸，并且使得能夠監(jiān)測(cè)跨細(xì)胞運(yùn)輸。隨著BBB破壞，Evans藍(lán)-白蛋白復(fù)合體在腦的細(xì)胞間間隙中不可逆地積累?？梢园麅?nèi)運(yùn)輸小得多的示蹤劑熒光素，占據(jù)腦中細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)間隙。
通過暫短接觸DP-BFA來(lái)誘導(dǎo)Sprague-Dawley大鼠中血腦屏障通透作用。用Rampun-Imalgen麻醉動(dòng)物，并且通過外側(cè)頸動(dòng)脈逆行對(duì)腦施用DP-BFA試驗(yàn)化合物(Smith，Q.R.，研究方法(Methods ofstudy)，于血腦屏障的生理學(xué)和藥學(xué)(Physiology andPharmacology of the Blood-Brain Barrier)，Bradbury M.B.編著，Spinger-Verlag Berlin-Heidelberg-NY；199224-52)。連接翼動(dòng)脈-腭動(dòng)脈，以避免輸入的溶液流向外頭部血管系統(tǒng)。使用Harvard器針頭泵，經(jīng)30秒或半小時(shí)輸入DP-BFA溶液。血液流經(jīng)頸總動(dòng)脈，只是在輸入時(shí)有所間斷。
從在水或乙醇中的貯備溶液通過用等滲甘露糖醇(5％)的氨基三丁醇緩沖液(Sigma)或PBS(pH 7.4)溶液稀釋200-1000倍，來(lái)制備所有的試驗(yàn)DP-BFA分子。在施用試驗(yàn)DP-BFA之后立即，或者如果研究作用的可逆性的話，在施用試驗(yàn)DP-BFA之后特定時(shí)間間隔之后，靜脈內(nèi)注射標(biāo)記，Evans藍(lán)(EB，25mg/ml)和熒光素(F-Na，12.5mg/ml)1毫升溶液。完成8分鐘F-Na(12.5mg/ml至100微升/分鐘)靜脈內(nèi)輸入。頸動(dòng)脈內(nèi)″閃光″之后用鹽水(60ml)清洗腦10分鐘。腦同側(cè)和對(duì)側(cè)大腦半球和腫瘤，在合適的情況下，分別用50％三氯乙酸(TCA)勻化。在合適的情況下，分光熒光法測(cè)定皮層和腫瘤中標(biāo)記物濃度(Uyama，O.等，(1988)J.Cereb.Blood Flow Metab 8，282-284Abraham等，(1996)神經(jīng)科學(xué)快報(bào)(Neurosci.Lett.)208，85-88)。以每克腦組織標(biāo)記物的微克數(shù)計(jì)算標(biāo)記物含有。使用標(biāo)準(zhǔn)誤和Student′s統(tǒng)計(jì)學(xué)意義檢驗(yàn)。
實(shí)施例18各種鏈長(zhǎng)的支化鏈脂肪酸對(duì)BBB通透性的作用在該項(xiàng)研究的第一階段，對(duì)不同鏈長(zhǎng)的BFA分子篩選它們?cè)谕高^血腦屏障(BBB)中的作用。
對(duì)體重250-320g的雄性Sprague-Dawley大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。下面是上面實(shí)施例17中描述的方法。
通過兩個(gè)參數(shù)評(píng)價(jià)試驗(yàn)化合物對(duì)開放BBB的作用a)效力-就Evans Blue白蛋白積累(微克EB/克腦組織)估計(jì)BBB開放程度；和b)效能-以EC50和最小有效濃度(MEC)值測(cè)定。EC50是產(chǎn)生EvansBlue外滲最大作用的50％的試驗(yàn)化合物的濃度。MEC定義為使得積累量是對(duì)照動(dòng)物中積累的Evans blue量的三倍的濃度，在我們這個(gè)情況下，總計(jì)是3微克EB/克腦組織。EC50和MEC值越低，試驗(yàn)化合物的效能越高。
表5給出了不同的DP-BFAs對(duì)BBB通透性作用的評(píng)價(jià)結(jié)果。
表5支化鏈脂肪酸對(duì)BBB通透性的作用
從表5的結(jié)果可以看出，根據(jù)DP-BFA鏈長(zhǎng)，Evans Blue外滲程度有相當(dāng)大的變化。具有最短鏈長(zhǎng)的那些分子在該模型系統(tǒng)中幾乎完全無(wú)效。具有最高效力的分子是BFAs 3，12-Na和3，16-Na，各自誘導(dǎo)大于30微克EB/克腦組織的積累。在使用的實(shí)驗(yàn)體系中，3，12-Na是最有效的通透劑，在試驗(yàn)化合物中具有最低的EC50和MEC值。
結(jié)論在使用的實(shí)驗(yàn)體系條件下，發(fā)現(xiàn)BFA 3/12-Na就效能和效力兩方面來(lái)說(shuō)是最有效的通透增強(qiáng)物質(zhì)。因此，更詳細(xì)地研究了以BFA-3，12為基礎(chǔ)的DP-BFA衍生物。
實(shí)施例19不同的DP-BFAs對(duì)BBB通透性的作用如上文實(shí)施例17中所述，在大鼠腦模型系統(tǒng)試驗(yàn)各種DP-BFAs對(duì)BBB通透性的作用。效力，也就是BBB開放水平表示為腦髓中積累的Evans藍(lán)的量(微克EB/克腦組織)。通過它們的計(jì)算的EC50和最小有效濃度(MEC)值來(lái)估計(jì)試驗(yàn)分子的效能。
表6不同的DP-BFAs對(duì)BBB通透性的作用(大鼠腦中)
從表6可以看出，各種DP-BFAs分子促進(jìn)與Evans藍(lán)示蹤劑結(jié)合的白蛋白穿過BBB。試驗(yàn)化合物的效能和效力不同。
在這種實(shí)驗(yàn)條件下，最有效的3，12-BFA的衍生物是3，12-DEG-PO4Na2，具有20μM的ED50值和3.3μM的最小有效濃度(MEC)。在提高BBB通透性方面最有效的化合物是3，12-(醚)-DEG-PO4Na2，3，12-PO4Na2和3，12-DEG-PO4Na2。用ED50濃度的3，12-(醚)-DEG-PO4Na2，3，12-PO4Na2和3，12-DEG-PO4Na2處理之后大鼠腦中Evans藍(lán)染料的積累水平分別是26，20和18微克EB/克腦組織。
實(shí)施例20DP-BFA對(duì)Evans藍(lán)結(jié)合的白蛋白和熒光素運(yùn)送通過過BBB的作用在正常大鼠腦模型系統(tǒng)中檢查各種DP-BFAs對(duì)BBB對(duì)不同大小的分子的通透性的作用。
運(yùn)送的兩個(gè)標(biāo)記物如下a)與白蛋白結(jié)合的Evans藍(lán)(MW 70kD)作為細(xì)胞旁運(yùn)送的指標(biāo)；和b)熒光素鈉鹽(MW 376D)代表小分子。
根據(jù)上文實(shí)施例17描述的方法經(jīng)30秒對(duì)頸外動(dòng)脈輸入Evans藍(lán)染料(EB)和熒光素鈉鹽(F-Na)。以它們的EC50濃度使用試驗(yàn)化合物。用賦形劑溶液處理對(duì)照動(dòng)物。
Evans藍(lán)外滲作用表示為每克腦組織積累的EB總量百分比。熒光素運(yùn)送到腦中，這取決于該分子的血清濃度，表示為血清中F-Na水平百分比。
計(jì)算腦中積累的F-Na與EB的比例，并且在表7中給出結(jié)果。
表7不同的DP-BFAs對(duì)BBB對(duì)EB-白蛋白和對(duì)熒光素的通透性的作用
*-各比例的平均值從表7可以看出，正常BBB(＝對(duì)照)比EB-白蛋白復(fù)合體對(duì)熒光素的通透性高大約10倍。高滲滲透劑，甘露糖醇，將BBB對(duì)EB的通透性提高至比F-Na(F-Na/EB之比等于4)更大的程度。類似地，試驗(yàn)支化脂肪酸3，14-Na和3，12-Na分別表現(xiàn)出F-Na/EB之比是4.7和4.9。
BFA的不同的磷酸衍生物以不同的方式影響對(duì)兩種標(biāo)記物的BBB通透性。發(fā)現(xiàn)3，12-PO4將BBB對(duì)EB-白蛋白復(fù)合體的通透性提高大約1.5倍，大于對(duì)熒光素通透性的提高。另一方面，發(fā)現(xiàn)3，12-DEG-PO4以更加生理學(xué)的方式提高BBB的通透性，即將F-Na運(yùn)送提高到和EB外滲相同的程度。接觸3，12-DEG-PO4的大鼠大腦中F-Na/EB之比是9左右。
結(jié)論不同的DP-BFA化合物以不同方式影響B(tài)BB通透性。一些DP-BFAs，例如3，12-(醚)-DEG-PO4Na2和3，12-PO4(F-Na/EB之比分別是1.1和5.9)誘導(dǎo)BBB選擇性開放，與具有低分子量的分子相比，有利于大分子運(yùn)送。相反，其它分子，例如3，12-DEG-PO4，同樣提高小分子例如F-Na和較大分子例如EB-白蛋白的運(yùn)輸。
實(shí)施例21DP-BFA對(duì)BBB開放的作用的延續(xù)時(shí)間施用DP-BFA之后在不同的時(shí)間點(diǎn)檢查DP-BFA對(duì)大鼠腦組織中Evans Blue和熒光素外滲的作用。
根據(jù)上文實(shí)施例17描述的方法經(jīng)30秒對(duì)Sprague Dawley大鼠的頸外動(dòng)脈輸入各種DP-BFA化合物。以它們的EC50濃度施用試驗(yàn)化合物。施用DP-BFA之后10，30，60，120和240分鐘測(cè)定腦組織中EvansBlue和熒光素的外滲作用。使用每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2-3只動(dòng)物的平均值計(jì)算大鼠腦組織中Evans Blue(微克/克)和熒光素(血清的％)含量。
上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中獲得的結(jié)果證明DP-BFA對(duì)BBB通透性的作用是可逆的。此外，提出DP-BFA的BBB開放作用有相對(duì)短的壽命。大多數(shù)DP-BFA-3，12的試驗(yàn)衍生物保持BBB通透性短于1小時(shí)，具有30分鐘左右的D1/2。D1/2定義為使用EC50濃度的試驗(yàn)化合物至少50％開放BBB的持續(xù)時(shí)間。兩種化合物，3，12-PC和3，12-MEG-PC，兩者都包括磷酸膽堿部分，被證明D1/2比其它試驗(yàn)3，12-BFA衍生物長(zhǎng)4倍，即D1/2是120分鐘左右。
結(jié)論證明DP-BFA以可逆方式影響大鼠腦組織中BBB開放。不同DP-BFA具有不同的通透作用持續(xù)時(shí)間。
實(shí)施例22毒理學(xué)和安全性研究對(duì)DP-BFA分子評(píng)價(jià)安全性和毒性。根據(jù)上文實(shí)施例17中所述方法對(duì)大鼠動(dòng)脈內(nèi)(i.a.)施用遞增劑量的試驗(yàn)化合物。24小時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物成活率來(lái)評(píng)價(jià)致死濃度(LC)。LC定義為引起死亡的最小濃度。
表8不同的DP-BFAs安全性數(shù)據(jù)比較(大鼠)
*鈉鹽安全系數(shù)定義為致死劑量(LC)和最小有效濃度(MEC)之間的比例，其中MEC相應(yīng)于激發(fā)三倍于只用賦形劑處理的對(duì)照動(dòng)物積累的Evans藍(lán)的量的試驗(yàn)化合物的計(jì)算濃度，即總共積累3微克EB。LC/MEC之比越高，安全系數(shù)越高。
結(jié)論加入磷酸基團(tuán)將安全系數(shù)提高2-3倍而不顯著妨礙效能。
實(shí)施例23用于測(cè)定DP-BFA對(duì)BTB通透作用的作用的體內(nèi)模型(攜帶腫瘤的大鼠)為了研究DP-BFA化合物調(diào)制血腫瘤屏障(BTB)的能力，使用攜帶C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤大鼠模型系統(tǒng)。
根據(jù)Bartus等(Exp Neurol(1996)；1421428)所述方法用C6神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤接種Sprague Dawley(SD)大鼠。在固定在立體定位設(shè)備中的大鼠的額頭皮骨上鉆一個(gè)小鉆孔。使用Hamilton注射器，對(duì)額皮層接種10微升或5微升的含有2.5×105C6神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤的培養(yǎng)基。坐標(biāo)是囟后1mm，2.5mm寬，并且3mm深。針頭在這里停留5分鐘。取出針頭之后，縫合頭皮纏上繃帶。接種之后6-8天檢查大鼠，此時(shí)腫瘤長(zhǎng)到足夠大小(20-60mg)。
F-Na造影術(shù)和解剖之后將腫瘤稱重。對(duì)大鼠腦組織部分進(jìn)行組織學(xué)檢查并且監(jiān)測(cè)同側(cè)腫瘤組織，腫瘤周組織和對(duì)側(cè)組織的Evans藍(lán)和熒光素?cái)z入。
對(duì)對(duì)照的攜帶腫瘤的大鼠(沒有用本發(fā)明的化合物處理過)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果(沒有給出)證明血腫瘤屏障(BTB)對(duì)EB和熒光素的通透性分別比對(duì)于完整BBB觀察到的高大約2倍和4倍。
實(shí)施例24不同BFAs分子對(duì)BBB和BTB開放的作用(對(duì)攜帶腫瘤的大鼠的研究)使用上面實(shí)施例23描述的C6神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤大鼠雙側(cè)腫瘤模型系統(tǒng)來(lái)對(duì)DP-BFA的各種衍生物篩選與它們對(duì)血腫瘤屏障(BTB)的作用相比較的它們通過血腦屏障(BBB)的能力。根據(jù)實(shí)施例23描述的實(shí)驗(yàn)方法，除了進(jìn)一步用DP-BFA處理攜帶腫瘤的大鼠。如實(shí)施例17所述經(jīng)30秒對(duì)頸外動(dòng)脈單側(cè)輸入它們EC50值左右濃度的試驗(yàn)化合物。只用賦形劑處理的動(dòng)物用作對(duì)照組。通過測(cè)定白蛋白結(jié)合的Evans藍(lán)染料在腫瘤(T)與非腫瘤(NT)組織中的積累來(lái)定量測(cè)定通透作用。
表9總結(jié)了計(jì)算的效力值和特異性指數(shù)。特異性指數(shù)定義為腫瘤中積累的EB水平與非腫瘤腦組織中積累的EB水平之間的比例(T/NT)。
表9各種DP-BFAs對(duì)BBB和BTB開放之比較
*攜帶腫瘤大鼠的EC50值從表9可以看出，大多數(shù)試驗(yàn)化合物表現(xiàn)出在腫瘤和非腫瘤腦組織中EB積累水平相似，即T/NT之比是大約1至2。使用甘露糖醇(25％)，腫瘤中EB積累水平大約是非腫瘤腦組織中EB積累水平的兩倍。在使用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，化合物，3，12-DEG-PO4，表現(xiàn)出開放腫瘤血液屏障(BTB)的高特異性，因?yàn)槟[瘤中EB積累比非腫瘤組織中EB水平高22倍(T/NT之比＝22)。
結(jié)論3，12-DEG-PO4對(duì)開放C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤中BTB最具有特異性作用。該化合物通透過C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血腫瘤屏障(BTB)程度比通過正常血腦屏障(BBB)的大。因此DP-BFA衍生物可以用作能特異性且選擇性開放BTB的物質(zhì)。
實(shí)施例25對(duì)攜帶SD腫瘤大鼠單側(cè)施用DP-BFA對(duì)頸外動(dòng)脈單側(cè)輸入10μM 3，12-DEG-HPO4Na(圖2A)，40μM3，12-Na BFA(圖2B)或25％甘露糖醇(圖2C)之后檢查Evans藍(lán)和熒光素通透進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤。在如實(shí)施例23所述接種C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞之后9-12天對(duì)大鼠腦輸入相關(guān)化合物。
從圖2A可以清楚地看出對(duì)雙側(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤大鼠施用3，12-DEG-PO4之后Evans藍(lán)染色只是在同側(cè)半球腫瘤組織中。另一方面，DP-BFA的碳相應(yīng)物，即BFA 3，12，和高滲物質(zhì)，甘露糖醇，同樣透過腫瘤和非腫瘤腦組織。
實(shí)施例26DP-BFA對(duì)血視網(wǎng)膜屏障(BRB)通透性的作用通過監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記物，熒光素鈉鹽(F-Na)，從鞏膜血管的滲出來(lái)研究DP-BFA對(duì)大鼠血視網(wǎng)膜屏障(BRB)的通透作用。
用以0.1毫升/100克體重注射的氯胺酮(100mg/ml)和甲苯噻嗪(2％)溶液麻醉體重250-350克的Sprague-Dawley(SD)大鼠。對(duì)麻醉的動(dòng)物頸靜脈注射0.25ml F-Na(12.5mg/ml)。用與c-固定于用于眼科手術(shù)的INAMI L-0960顯微鏡連接的3-CCD色照相機(jī)(teliCS5850)記錄視網(wǎng)膜血管。顯微鏡裝備有光源和用于F-Na檢測(cè)的合適的濾光器。10分鐘后從視網(wǎng)膜清除F-Na。此時(shí)，30秒動(dòng)脈內(nèi)注射1.5ml的3，12-DEG-HPO4Na(12.5微克/毫升)，伴隨第二次靜脈內(nèi)注射F-Na。在施用藥物之后t＝0和0.25，0.5，1，2，4，8和10分鐘對(duì)血管照像。對(duì)第二組對(duì)照大鼠重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)，其中動(dòng)脈內(nèi)注射1.5ml賦形劑(Tab-甘露糖醇5％)代替3，12-DEG-HPO4Na。
通過在動(dòng)物眼后部在視網(wǎng)膜水平監(jiān)測(cè)F-Na在血管中的分布，證明單獨(dú)施用F-Na之后10分鐘，所有的熒光染料完全從視網(wǎng)膜血管周圍的范圍消失。但是，與動(dòng)脈內(nèi)注射3，12-DEG-HPO4Na聯(lián)合靜脈內(nèi)注射F-Na，導(dǎo)致血管周圍在視網(wǎng)膜水平積累F-Na。在3，12-DEG-HPO4Na存在下F-Na從血管滲出，是血視網(wǎng)膜屏障通透作用的指征。在對(duì)照動(dòng)物中，其中只施用賦形劑代替DP-BFA藥物，結(jié)果類似于單獨(dú)注射F-Na的那些動(dòng)物，即給藥之后10分鐘，血管中或其周圍在視網(wǎng)膜水平上檢測(cè)不到熒光。圖3A-C中給出的結(jié)果代表眼部血管造影術(shù)，即在單獨(dú)施用F-Na(圖3A)，或聯(lián)合施用3，12-DEG-HPO4Na(圖3B)或賦形劑(圖3C)之后30秒和10分鐘記錄的視網(wǎng)膜水平照取的眼部血液供應(yīng)照片。
根據(jù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，施用F-Na之后10分鐘，與只注射F-Na和賦形劑(圖4A-B)的對(duì)照動(dòng)物的玻璃體相比，對(duì)用3，12-DEG-HPO4Na處理的動(dòng)物的玻璃體可以檢測(cè)到更大量的F-Na。玻璃體中熒光信號(hào)的積累是由于BRB通透作用和視網(wǎng)膜水平的F-Na從血管的滲出。
結(jié)論3，12-DEG-HPO4Na使得能夠進(jìn)行血視網(wǎng)膜屏障的通透作用，并且導(dǎo)致視網(wǎng)膜和玻璃體中F-Na積累。
實(shí)施例27DP-BFA的抗腫瘤活性在上文實(shí)施例17中描述的體內(nèi)模型系統(tǒng)中研究各種P-BFAs的抗腫瘤作用。以預(yù)先測(cè)定的BBB和BTB對(duì)Evans藍(lán)和熒光素外滲的通透作用有效的濃度動(dòng)脈內(nèi)施用試驗(yàn)P-BFAs。和實(shí)施例23一樣的接種腫瘤的實(shí)驗(yàn)方法如下。
接種C6神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞之后第3-4天，對(duì)大鼠外頸動(dòng)脈插入套管，并且如實(shí)施例17所述經(jīng)30秒輸入試驗(yàn)P-BFAs，除了在該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中不給與標(biāo)記物。處理過的大鼠維持到第7-9天，然后殺死。獲得冠狀切片，用曙紅-蘇木紫染色，組織學(xué)檢查確定腫瘤體積。只用賦形劑處理的動(dòng)物用作對(duì)照。使用標(biāo)準(zhǔn)誤和Student′s統(tǒng)計(jì)學(xué)意義檢驗(yàn)。表10總結(jié)了結(jié)果。
從表10的結(jié)果可以看出，P-BFA化合物體內(nèi)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制細(xì)胞作用。在使用的實(shí)驗(yàn)條件下，3，12-DEG-PO4化合物表現(xiàn)出最突出的抗腫瘤作用。其它化合物，例如3，12-MEG-PC，也證明有顯著的抗腫瘤活性，但是程度較低。
結(jié)論對(duì)攜帶C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的大鼠動(dòng)脈內(nèi)施用P-BFAs表現(xiàn)出對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒作用。
表10各種P-BFAs對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抗腫瘤作用
SE-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤，*-統(tǒng)計(jì)學(xué)差異實(shí)施例28DP-BFA的抗腫瘤作用通過對(duì)攜帶C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤的大鼠模型系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤體積和外觀來(lái)評(píng)價(jià)DP-BFA的抗腫瘤作用。如下用5微升PBS中2.5×105個(gè)C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種Sprague Dawley(SD)大鼠。以放平頭顱方式將大鼠固定在立體定位頭部支架上。骨膜反射作用之后，按以下坐標(biāo)用1mm鉆頭進(jìn)行鉆孔前囟-1.0，左側(cè)中線外側(cè)3.50mm，深3.50mm。使用10微升Hamilton針管以3.50mm深度用手注射細(xì)胞懸浮液。以3ml/min的速度對(duì)頸外動(dòng)脈輸入范圍是5-20μM的3，12-二-乙二醇磷酸酯(3，12-DEG-PO4；鈉鹽)或賦形劑(等滲緩沖液，pH＝7.4)的單一劑量30秒接種后72小時(shí)處理攜帶腫瘤的大鼠。扎緊翼-腭動(dòng)脈，在輸液的同時(shí)夾緊頸總動(dòng)脈。
C6腫瘤細(xì)胞接種之后5天，用0.1毫升/100克體重的氯胺酮/甲苯噻嗪(1∶1)麻醉大鼠，灌注鹽水并且用4％甲醛溶液固定。取出腦組織并且在蔗糖溶液中低溫保護(hù)48小時(shí)。然后在冠狀切片中切碎腦組織，用蘇木紫-曙紅染色并且進(jìn)行病理檢查。
與沒有處理的動(dòng)物相比較，對(duì)處理過的動(dòng)物觀察到腫瘤體積的顯著減小。賦形劑處理的動(dòng)物腫瘤體積是8.1±2.2mm3(N＝7)，用3，12-DEG-PO4處理的動(dòng)物是1.6±0.2mm3(N＝12)。另外，腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境和性質(zhì)不同。賦形劑處理的攜帶腫瘤的大鼠表現(xiàn)出皮層、白質(zhì)和腦膜中顯著的局部的細(xì)胞膨脹。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出不規(guī)則的和高度的不可滲透性，并且表現(xiàn)出侵入血管周淋巴管間隙的較大傾向。相反，用DP-BFA處理，僅僅在細(xì)胞接種后第3天給予一次，就顯著改變了腫瘤生長(zhǎng)特征。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤通過血管周間隙侵入被減少，并且觀察到具有確定邊界的實(shí)體腫瘤。在接種區(qū)和室管膜下發(fā)現(xiàn)對(duì)腦膜的有限侵入。
結(jié)論3，12-DEG-PO4表現(xiàn)出作為抑制腫瘤侵入和腫瘤生長(zhǎng)速度的有效抗腫瘤作用。因此，DP-BFA化合物可以用于抑制腫瘤的擴(kuò)散和侵入。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明公開的原理適用很多實(shí)施方案和變化或修飾，這些都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)施例不是限制性的，下面的權(quán)利要求書確定本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.通式I的化合物 或者其藥學(xué)可接受鹽，其中R1和R2是相同或不同的，飽和的或不飽和的具有2-30個(gè)碳原子的脂族鏈；R3是A-[CH2]m-B-[CH2]n-C-[CH2]p-D，其中m，n和p各自獨(dú)立地是0或1-12的整數(shù)，并且A，B，C和D各自獨(dú)立地選自共價(jià)鍵，氨基，酰氨基，氧，硫，羰基，羧基，氧羰基，硫羰基，磷酸酯，氨基磷酸酯，一-，二-和三-氨基磷酸酯基團(tuán)，前提是沒有兩個(gè)氧原子直接彼此連接；Z1和Z2是相同或不同的，各自可以不存在或者獨(dú)立地選自a)氫，鈉，鋰，鉀，銨，一-，二-，三-和四-烷基銨，或者b)和磷酸基團(tuán)一起形成丙三醇，膽堿，乙醇胺，肌醇，絲氨酸，單糖或寡糖的磷酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1的長(zhǎng)度是3個(gè)碳原子，R2的長(zhǎng)度是12-16個(gè)碳原子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1是丙基，R2是十二烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R3包括一-乙二醇或二-乙二醇部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2和R3中碳原子總數(shù)是6-26。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2和R3中碳原子總數(shù)是16-22。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Z1是膽堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中Z1是鈉，Z2選自氫和鈉。
9.選自下組的根據(jù)權(quán)利要求1的化合物磷酸4-十六烷基酯(3，12-PO4)，磷酸4-十八烷基酯(3，14-PO4)，磷酸4-二十烷基酯(3，16-PO4)，磷酸8-十五烷基酯(7，7-PO4)，磷酸4-十六酰氧基乙酯(3，12-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十六酰氧基)乙氧基乙酯(3，12-DEG-PO4)，磷酸4-十六烷基氧基乙酯(3，12-(醚)-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十六烷基氧基)乙氧基乙酯(3，12-(醚)-DEG-PO4)，4-十六烷基磷酸膽堿(3，12-PC)，2-(4-十六酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，12-MEG-PC)，2-(4-十六酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，12-DEG-PC)，磷酸2-{2′-[10″-(十六烷基-4-氧基)癸-1-氧基]乙氧基}乙酯(3，12-O-C10-DEG-PO4)，2-{2′-[10″-(十六烷基-4-氧基)癸-1-氧基]乙氧基]乙基磷酸膽堿(3，12-O-C10-DEG-PC)，磷酸4-十八烷酰氧基乙酯(3，14-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十八烷酰氧基)乙氧基乙酯(3，14-DEG-PO4)，磷酸4-十八烷基氧基乙酯(3，14-(醚)-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-十八烷基氧基)乙氧基乙酯(3，14-(醚)-DEG-PO4)，4-十八烷基磷酸膽堿(3，14-PC)，2-(4-十八烷酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，14-MEG-PC)，2-(4-十八烷酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，14-DEG-PC)，磷酸4-二十酰氧基乙酯(3，16-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-二十酰氧基)乙氧基乙酯(3，16-DEG-PO4)，磷酸4-二十烷基氧基乙酯(3，16-(醚)-MEG-PO4)，磷酸2-(4′-二十烷基氧基)乙氧基乙酯(3，16-(醚)-DEG-PO4)，4-二十烷基磷酸膽堿(3，16-PC)，磷酸2-(4-二十酰氧基)乙基磷酸膽堿(3，16-MEG-PC)，2-(4-二十酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，16-DEG-PC)，磷酸10-(4′-十六酰氧基)癸酯，磷酸10-(8′-十五酰氧基)癸酯，磷酸2-[2′-(2″-丙基二十酰氧基)-乙氧基]乙酯(3，18-DEG-PO4)，和2-(2′-丙基二十酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿(3，18-DEG-PC)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是磷酸2-(4′-十六酰氧基)乙氧基乙酯一鈉鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是磷酸2-(4′-十六酰氧基)乙氧基乙酯二鈉鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是磷酸2-(4′-十六烷基氧基)乙氧基乙酯。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是2-(4-十六酰氧基)乙基磷酸膽堿。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是2-(4-十六酰氧基)乙氧基乙基磷酸膽堿。
15.含有藥學(xué)可接受載體和通式I的化合物或其藥學(xué)可接受鹽的藥物組合物， 其中R1和R2是相同或不同的，飽和的或不飽和的具有2-30個(gè)碳原子的脂族鏈；R3是A-[CH2]m-B-[CH2]n-C-[CH2]p-D，其中m，n和p各自獨(dú)立地是0或1-12的整數(shù)，并且A，B，C和D各自獨(dú)立地選自共價(jià)鍵，氨基，酰氨基，氧，硫，羰基，羧基，氧羰基，硫羰基，磷酸酯，氨基磷酸酯，一-，二-和三-氨基磷酸酯基團(tuán)，前提是沒有兩個(gè)氧原子直接彼此連接；Z1和Z2是相同或不同的，各自可以不存在或者獨(dú)立地選自a)氫，鈉，鋰，鉀，銨，一-，二-，三-和四-烷基銨，或者b)和磷酸基團(tuán)一起形成丙三醇，膽堿，乙醇胺，肌醇，絲氨酸，單糖或寡糖的磷酸酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，其中通式I的化合物和權(quán)利要求2-14中任一項(xiàng)定義的一樣。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的藥物組合物，進(jìn)一步包含一種生物活性劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述生物活性劑是治療劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述生物活性劑是抗癌藥物。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述生物活性劑是診斷劑。
21.權(quán)利要求1-14的任一項(xiàng)的化合物制備藥物的用途。
22.一種提高生物屏障通透性的方法，包括將所述屏障暴露給有效量的權(quán)利要求1-14的任一項(xiàng)中定義的通式I的化合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述生物屏障選自皮膚，角膜，結(jié)膜，鼻，支氣管，頰，陰道，和胃腸上皮，血視網(wǎng)膜屏障，血腦屏障，血睪丸屏障，血腫瘤屏障和血腎界面。
24.一種將生物活性劑施用給特定位點(diǎn)或器官的方法，包括使所述位點(diǎn)或器官在有效量的權(quán)利要求15的藥物組合物存在下暴露于所述生物活性劑，從而允許或提高所述生物活性劑在所述特定位點(diǎn)或器官中的穿透和/或積累。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述特定位點(diǎn)或器官是脊髓，腦，眼，睪丸，腺體或腫瘤。
26.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或紊亂的方法，包括與一種治療劑聯(lián)合對(duì)需要的患者施用有效量的權(quán)利要求15的藥物組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述治療劑選自抗腫瘤劑，抗病毒劑，抗微生物劑，抗真菌劑，抗炎劑，神經(jīng)保護(hù)劑和生物活性肽或蛋白質(zhì)。
28.一種治療腫瘤的方法，包括對(duì)需要的患者施用有效量的權(quán)利要求15的藥物組合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，進(jìn)一步包括對(duì)需要的患者施用有效量的抗癌藥物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述抗癌藥物在分開的藥物組合物中給藥。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述腫瘤是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述腫瘤是在腦內(nèi)。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述腫瘤選自癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤，淋巴瘤，白血病，肉瘤和黑素瘤。
34.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述腫瘤是原發(fā)或繼發(fā)腫瘤。
35.一種治療眼科疾病或紊亂的方法，包括對(duì)需要的患者施用有效量的權(quán)利要求15的藥物組合物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包括對(duì)需要的患者施用有效量的額外的生物活性劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述眼科疾病或紊亂選自囊樣黃斑水腫(CME)，與年齡相關(guān)的黃斑變性(ARMD)，眼內(nèi)感染，眼內(nèi)炎癥和眼內(nèi)惡性腫瘤。
38.根據(jù)權(quán)利要求24-37任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物組合物通過口服，腸胃外或局部施用而給藥或者通過局部灌注，灌腸法或器官內(nèi)灌洗而給藥。
39.根據(jù)權(quán)利要求24-37任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物組合物通過動(dòng)脈內(nèi)給藥。
40.根據(jù)權(quán)利要求24-37任一項(xiàng)的方法，其中所述藥物組合物通過鞘內(nèi)給藥。
41.一種提高由生物屏障保護(hù)的器官中診斷劑積累的方法，包括與有效量的權(quán)利要求15的藥物組合物聯(lián)合對(duì)個(gè)體施用所述診斷劑，從而提高由生物屏障保護(hù)的器官中診斷劑的積累。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的方法，其中由所述生物屏障保護(hù)的器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于透過生物屏障和用于抑制腫瘤生長(zhǎng)的支化鏈親脂性分子的新的磷酸衍生物。本發(fā)明進(jìn)一步公開了含有所述分子的藥物組合物和它們的用途。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1633440SQ01816806
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2001年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月3日
發(fā)明者A·科扎克, M·溫尼科瓦, M·珀雅克, E·貝特-延奈, D·雷滋尼斯基-科亨, A·森德里克欣 申請(qǐng)人:迪一藥品有限公司