專利名稱：使用20－h(huán)ete合成酶抑制劑治療腦血管疾病的制作方法
與相關申請的相互參照此申請要求美國臨時申請的權(quán)益，序列號60/245,638，2000年11月3日提出申請。
關于聯(lián)邦政府資助研究或發(fā)展的聲明此發(fā)明得到美國政府的支持，由以下組織資助NIH Grant Nos.H1-59996和HL-36279。美國擁有此發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術：
減少腦血流量會引起一系列從輕度頭痛到嚴重腦損傷和死亡的問題。有許多情況會導致腦血流量減少。例如出血性中風、腦損傷、阻塞性中風、腦血管痙攣和低血壓。
蛛網(wǎng)膜下出血(SAH)占所有中風的5-10％。每年每100,000人中就有2-20例，致死率為20-60％。Ingall，T等，Stroke 321054-1061(2000)；Stroke311843-1850(2000)]。SAH通常是在腦動脈瘤破裂或頭部創(chuàng)傷引起蛛網(wǎng)膜下出血和血塊形成后發(fā)生。出血后，由于腦脊液壓力上升減少了有效的滲透壓以及從血液釋放的血管活性物質(zhì)使腦血管張力提高，腦部血流量最初下降。SAH后損傷的最初階段與高致死率相聯(lián)系(30-50％)。隨后腦血管痙攣(CVS)延遲發(fā)作逐步顯示出來(大鼠2-3天，人5-7天)。與此延遲的CVS相關的致死率更高達70％。Weir，B.，J.Neurosurg.9375-390(1995)。對于由血液釋放的在SAH后最初階段減少腦血液流動的因素知之甚少。而關于什么介導延遲的CVS知道得更少。以前的研究表明，SAH后延遲的CVS與活化蛋白激酶C(PKC)，)減少K+通道活性和血管平滑肌(VSM)細胞去極化有關。腦VSM細胞的去極化增加了鈣的流入，鈣加強血管收縮藥對內(nèi)皮素(ET)、血栓烷、血清素和其它由凝血產(chǎn)生的血管抑制藥的反應并減少腦血管內(nèi)源形成的血管擴張藥如氧化氮(NO)的反應。對NO反應受損被假定是由于紅細胞溶血后NO結(jié)合到游離血紅蛋白上，Edwards，D.H.等，J.Neurosurg.76830-837(1992)，或由血紅蛋白氧化形成的超氧化物增加NO的降解。Misra，H.P.等，J.Biol.Chem 2476960-6962(1972)；Winterbourn CC等，Biochem.J.155493-502(1976)。有證據(jù)表明NO的第二信使之一的活性，可溶性鳥苷?；h(huán)化酶的活性在SAH后降低了。Faraci，F(xiàn).M.和Sobey，G.C.，Brain Res.821368-373(1999)；Sehba，F(xiàn).A.等，Stroke 301955-1961(1999)。
其它研究探索了血管收縮途徑在SAH后介導CVS中的正調(diào)節(jié)作用。ET水平在SAH后上升。在大鼠中SAH誘導后2小時觀察到腦血流量最初的下降受到ET合成的抑制劑和ET受體阻斷劑削弱。Clozel，M.和Watanabe，H.，Life Sci.52825-834(1993)。脂肪酸周轉(zhuǎn)率的提高和花生四烯酸(AA)的血管收縮代謝物形成的增加也在SAH后觀察到。Juvela S，J.Neurosurg.92390-400(2000)；Seifert，V.等，J.Neurosurg.8255-62(1995)。最近的研究表明，20-羥基花生四烯酸(20-HETE)是腦循環(huán)中產(chǎn)生的AA的一種代謝物。然而，20-HETE在SAH后的CVS的發(fā)病機理中的作用還不知道。20-HETE是由腦動脈中的VSM細胞表達的細胞色素P450(CYP)4A家族的酶產(chǎn)生。Hander，D.R.等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.266H2098-H2107(1994)；Gebremendin，D.等，Circ Res.8760-65，2000。形成20-HETE的CYP4A家族成員包括大鼠中的CYP4A1，2，3和8，小鼠中的CYP4A10，12和14及人中的CYP4A11。CYP4A家族的酶也參與20-HETE的產(chǎn)生。形成20-HETE的CYP4F家族成員包括大鼠中的CYP4F1，4，5和6及人中的CYP4F2和3。CYP4F2已顯示當與AA培育時產(chǎn)生20-HETE。Powell，P.K.等，J Pharmacol Exp Therap2851327-1336，1998.CYP4F3已顯示在產(chǎn)生20-HETE的多形核白細胞上表達。Bednar，M.M.等，Biochem Pharmacol 60447-455，2000；Rosolowsky，M.等，BiochemBiophys Acta 1300143-150，1996。
20-HETE是有強的腦動脈收縮劑(EC50＜10nM)。20-HETE活化PKC并通過抑制大導電率KCa通道去極化VSM細胞。20-HETE還通過腦脈管系統(tǒng)中的L-型Ca2+通道提高Ca2+流入，Harder，D.R.等，Am J Physiol Heart Circ Physiol.266H2098-H2107(1994)；Gebremedhin，D.等，J.Physiol(Lond)。507(Pt3)771-781(1998)，并在大鼠自動調(diào)控腦血流量的機制中起關鍵作用。Alonso-Galicia，M.等，Stroke302727-2734(1999)；Gebremedhin，D.等，Circ.Res.8760-65(2000)。血管收縮肽(如血管緊縮肽II和ET)刺激20-HETE的形成。Oyekan，A.等，Am J PhysiolRegulatory Integrative Comp Physiol.273R293-R300(1997)；Croft，K.D.等，Am.J.Physiol Renal Physiol.279F544-F551(2000)。血管擴張劑NO抑制20-HETE的形成。Alonso-Galicia，M.等，Stroke 302727-2734(1999)。活化的多形核白細胞(PMN)和腦動脈急切地產(chǎn)生20-HETE。Harder，D.R.等，J.Physiol Heart CircPhysiol.266H2098-H2107(1994)；Gebremedhin，D.等，J.Physiol(Lond)。507(Pt3)771-781(1998)；Alonso-Galicia，M.等，Stroke 302727-2734(1999)；Gebremedhin，D.等，Circ.Res.8760-65(2000)；Bednar，M.M.等，Biochem.Pharmacol.60447-455(2000)；Rosolowsky，M.等，Biochem Biophys Acta1300143-150，1996；Lange，A.等，J.Biol.Chem.27227345-27352(1997)。然而，用20-HETE合成酶抑制劑治療動物是否會防止與SAH(出血性中風)或延遲CVS和腦局部缺血相關的腦血流量最初的下降。此外，現(xiàn)有的抑制20-HETE形成的藥物有嚴重的局限性，很大程度上限制它們作為治療劑的潛力。例如，盡管17-ODYA抑制20-HETE的合成，由于它同樣有效地阻斷EET形成，因此不是特異性抑制劑。Zou，A.P.等，J Pharmacol Exp Therap 268474-481，1994。EET是腦中形成的有效的血管舒張劑。阻斷EETs合成也許會抵消阻斷20-HETE形成所帶來的任何有益的效果。Alkayed，N.J.，等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 271H1541-H1546，1996；Gebremendhin，D.等，Am J Physiol Heart Circ Physiol 263H5 19-H525，1992。當全身給予時，17-十八炔酸(17-ODYA)也結(jié)合血漿蛋白且不穿過血腦屏障。DDMS是形成20-HETE的更特異性抑制劑。Alonso-Galicia，M.等，Hypertension29320-325，1997；Wang，M.H.等，J.Pharm Exp Therap 284966-973，1998。然而，當全身給予時，它太結(jié)合血漿蛋白以致于不能血腦屏障。
已在以前的研究中測試了腦心室內(nèi)注射DDMS對腦血流量的作用。DDMS對于基線腦血流量沒有作用。然而，它阻斷腦血流量的自調(diào)控，即隨著腦血流量上升收縮腦血管。Gebremendin，D.等，Circ Res.8760-65，2000。還已報導DDMS可防止由NO供體，DEA NONOate產(chǎn)生的腦血流量的上升。Alono-Galicia，M.等，Stroke302727-2734，1999。但是，沒有體內(nèi)信息表明，DDMS或17-ODYA是否對防止或逆轉(zhuǎn)與SAH相關或中風和其它腦血管疾病引起的腦血流量下降有有益的效果。
發(fā)明概述在一個實施例中，本發(fā)明是治療人或非人動物中的腦血管疾病的方法，通過有效減少人或非人動物中20-HETE合成酶活性以增加腦血流量或防止與許多疾病狀態(tài)相關的腦血流量下降。術語“腦血管疾病”指由腦血流量減少引發(fā)的狀況。
減少20-HETE合成酶活性可以通過使用20-HETE合成酶抑制劑達到。為了本發(fā)明的目的，20-HETE合成酶抑制劑可以是化學化合物或20-HETE合成酶的抗體。降低20-HETE合成酶活性也可通過降低20-HETE合成酶水平達到，如用阻斷編碼產(chǎn)生20-HETE的CYP4A或CYP4F酶的mRNA翻譯的反義寡核苷酸治療動物。
附圖簡述

圖1顯示了N-羥基-N’-(4-丁基-2-甲基苯)-甲脒(HET0016)的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示了HET0016和17-ODYA對SAH后的局部腦血流量(rCBF)的效果，HET0016和17-ODYA在SAH誘導前給予。*表示與對照有顯著區(qū)別。++表示與載體處理的組中的對應值有顯著區(qū)別。
圖3顯示了HET0016對大鼠腎微粒體中的20-HETE和EFT形成的效果。*表示與對照有顯著區(qū)別。20-HETE誤差很小，因此它們處于數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。
圖4描述了20-HETE在SAH前后和用17-ODYA或HET0016處理大鼠后在腦脊液中的濃度。*表示與對照有顯著區(qū)別。++表示與載體處理的組有顯著區(qū)別。
圖5顯示了HET0016在SAH后，當HET0016在SAH開始后30分鐘給予時對rCBF的效果。
圖6顯示了HET0016在大鼠中央腦動脈的短暫阻塞后對梗塞量的效果。
圖7比較了HET0016，1-氨基苯三唑(1-ABT)和咪康唑?qū)Υ笫竽I微粒體中的20-HETE和EET合成的效果。
圖8顯示了犬PMNs產(chǎn)生20-HETE的能力。
圖9顯示了HET0016對犬嗜中性粒細胞合成20-HETE的效果。
圖10顯示了SAH對犬CSF中20-HETE水平的效果。
圖11顯示了在HET0016存在(B組)和不存在(A組)情況下由CYP4F3催化20-HETE形成的層析圖以及HET0016對由CYP4A11、CYP4F2和CYP4F3(C組)催化20-HETE形成的效果。
發(fā)明的詳述總體上，本發(fā)明提供了通過顯著降低20-HETE合成酶活性以增加腦血流量或防止與許多疾病狀態(tài)相關的腦血流量下降來治療腦血管疾病的方法。術語“腦血管疾病”指由腦血流量下降引起的狀況。術語“20-HETE合成酶”包括CYP4A和CYP4F家族的酶。除了CYP4A11和CYP4F2，最近表明來自人的酶CYP4F3產(chǎn)生20-HETE。Chrismas P等，通過轉(zhuǎn)換底物特異性可變剪接測定CYP4F3的功能[L.Biol.Chem(2001)] 。術語“處理”或“治療”指防治疾病的發(fā)展，在疾病發(fā)作時減少嚴重性，在疾病發(fā)展后或顯示疾病消失癥狀后減少嚴重性。
20-HETE是血管收縮劑。在下面的實施例中，用20-HETE合成酶抑制劑處理動物顯示降低了動物中的20-HETE水平并增加了那些患腦血管疾病的動物中的腦血流量。20-HETE合成酶抑制劑對腦血管疾病的治療效果首先在出血性中風模式SAH中測試。在此模式中，誘導SAH引起20-HETE水平的增加。SAH或腦內(nèi)任何出血后的20-HETE水平的增加可能是由凝血反應中白細胞活化和刺激腦動脈壁中20-HETE產(chǎn)生引起的。20-HETE水平還由于在SAH后，阻塞性中風后腦局部缺血損傷或炎癥或腦部外傷后白細胞遷移至出血部位而增加。20-HETE合成酶抑制劑HET0016(圖1顯示其結(jié)構(gòu)；Miyata，N.等，HET0016是有效的、選擇性的20-HETE合成酶抑制劑，Br.J.Pharmacol.133325-329，2001；合成HET0016的方法在PCT申請PCT/JP00/07694，公布號WO01/32164中公開)和17-ODYA(購自Sigma ChemicalCorp.，St.Louis，MO)顯示有效地降低SAH后CSF中的20-HETE水平。用HET0016或17-ODYA預處理大鼠可防止SAH后腦血流量的下降。還發(fā)現(xiàn)HET0016逆轉(zhuǎn)SAH已開始后腦血流量的下降和提高的20-HETE水平的腦血流量和血管張力產(chǎn)生有害作用已很明顯。20-HETE合成酶抑制劑對腦血管疾病的有益效果通過使用阻塞性中風模式作了進一步測試。在此模式中，阻塞性中風由中央腦動脈暫時阻塞引起。用20-HETE合成酶抑制劑HET0016預處理大鼠顯示顯著地減少中央腦動脈阻塞后梗塞量。在此情況中，20-HETE的來源也許是滲透入局部缺血梗塞區(qū)域的嗜中性多形核白細胞(PMNs)。
20-HETE合成酶抑制劑可治療的腦血管疾病并不限于上述例子?；罨陌准毎湍X動脈急切地產(chǎn)生20-HETE。預計20-HETE合成酶抑制劑可用來治療由減少的腦血流量引起的狀況。除了出血性中風和阻塞性中風，這些狀況包括但不限于偏頭痛、CVS、感染病、由頭部外傷和大腦損傷引起的狀況，與血流量減少有關的慢性神經(jīng)病如阿爾茨海默爾病、癡呆、帕金森病和亨廷頓病，這些情況可提高腦灌注來減輕。
在以下所述的例子中，HET0016已顯示是高度特異的20-HETE合成酶抑制劑，當在抑制20-HETE合成酶濃度為80％或以上使用時，觀察到對EET或其它測試的CYP酶抑制很少。DDMS也顯示是相當特異的產(chǎn)生20-HETE酶的抑制劑。其它20-HETE合成酶抑制劑如17-ODYA，1-ABT(購自Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)和咪康唑(購自Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)特異性低很多，它們要么至少抑制EET合成和抑制20-HETE合成，要么它們在抑制20-HETE合成酶時也顯著抑制一些其它的CYP酶。任何20-HETE合成酶抑制劑可用來治療腦血管疾病。然而，較高特異性的抑制劑(如HET0016)可能更有利，因為它們可能副作用更少。
如以下的例子所示，HET0016在大鼠腎微粒體和犬PMN中依賴劑量地抑制20-HETE形成，且HET0016抑制大鼠20-HETE合成酶的IC50在10nM和約25nM之間。HET0016在人腎微粒體中依賴劑量地抑制20-HETE合成，IC50為8.9nM。當用重組CYP4A11、4F2和4F3同工型測試時，HET0016依賴劑量地抑制20-HETE合成，IC50在50nM到100nM之間。HET0016測試中抑制20-HETE合成酶的最低劑量為1.5nM，在此濃度大鼠20-HETE合成酶被抑制約20％。通常，預期HET0016血漿濃度從約1nM到約1000nM可有效治療腦血管疾病。術語“約”在說明書和權(quán)利要求書中與劑量相聯(lián)使用意味劑量也從此變化小，保持劑量的一般功能。當HET0016以10mg/kg體重劑量靜脈時注射，HET0016血漿水平1小時后為2.8μM。預期靜脈注射量為約0.003mg/kg體重到約10mg/kg體重可使HET0016血漿濃度范圍從約1.0nM到約2.8nM，因此可有效治療腦血管疾病。
除了靜脈注射，HET0016也可口服和皮下給予。當HET0016口服或皮下給予時需要達到血漿水平為約1nM到約1000nM的劑量可容易地使用以下靜脈注入HET0016例子中測量血漿HET0016水平的同樣方法決定。此外，在出血性中風情況中，HET0016也可直接注入出血部位治療腦血管疾病。例如，在SAH中，HET0016可通過大池或硬膜下放置的套管直接注入CSF來治療CVS。直接將HET0016注入CSF也許是頭部損傷后給藥的優(yōu)先途徑，因為分流經(jīng)常位于顱以排出CSF減少上升的腦脊液壓力。當HET0016直接注入出血部位時，有效地治療腦血管疾病所需的劑量可同樣使用下面用于17-ODYA的方法決定。CSF量對人約10ml，對大鼠約0.3ml。因此，治療腦血管疾病人需要的HET0016是大鼠的約30倍。
抑制20-HETE形成的IC50對于17-ODYA是1μM，對于DDMS是3μM。Zou AP等，J Pharmacol Exp Therap 268474-481，1994；Alonso-Galicia，M.等，Hypertension 29320-325，1997。由于17-ODYA和DDMS不能穿過血腦屏障，這些藥物必須直接引入CSF。注射1.5nmol17-ODYA到大鼠的大池完全阻斷SAH后的腦血流量下降。假定CSF量在大鼠中為0.3ml，1.5nmol17-ODYA注射入CSF會產(chǎn)生CSF中終濃度為10μM的17-ODYA。
當除HET0016，17-ODYA和DDMS外的20-HETE合成酶抑制劑用于治療腦血管疾病時，多種給藥途徑后達到有效抑制濃度所需的IC50和劑量可用上面描述的用于HET0016的方法決定。
除了上述的20-HETE合成酶抑制劑，抗20-HETE合成酶的單克隆或多克隆抗體為了本發(fā)明的目的也可用作酶抑制劑。通常，當注入動物體內(nèi)時，顯示抗體可阻斷靶蛋白的功能。Dahly，A.J.，F(xiàn)ASEB J.14A133，2000；Dahly，A.J.，J.Am.Soc.Nephrology 11332A，2000。因此，抗20-HETE合成酶的抗體可用于治療本發(fā)明說明的腦血管疾病。例如，約0.01mg到約100mg，優(yōu)選約0.1mg到約10mg，最優(yōu)選約0.2mg到約1.0mg人源化的CYP4A或CYP4F抗體可通過肌肉內(nèi)注射阻斷與由腦血管過度產(chǎn)生20-HETE相關的CVS.這些抗體在人體內(nèi)的半衰期可長達2-3周。抗體也可直接注入CSF阻斷與CSF(SAH)或與腦局部炎癥(感染，局部缺血)有關狀況中的血液元素相關的20-HETE產(chǎn)生。CYP4A和CYP4F家族中所有已知成員的DNA和蛋白氨基酸序列已公布，本領域熟練技術人員可采用。本領域熟練技術人員知道如何制備酶的單克隆或多克隆抗體。例如，已制備抗CYP4A1和CYP4A10的抗體且這些抗體顯示抑制CYP4A1和CYP4A10的酶活性。Amet，Y.等，Biochem Pharmacol.54(8)947-952，1997；Amet，Y.等，Biochem Pharmacol.53(6)765-771，1997；Amet，Y.等，Alcohol Clin.Exp.Res.22(2)445-462，1998.一些抗20-HETE合成酶抗體在市場上可以買到。例如，抗CYP4A1可從Gentest Corp(Woburn，Massachusetts)購買。
迄今為止，我們描述了使用酶抑制劑降低20-HETE合成酶活性的方法。另一種降低20-HETE合成酶活性的方法是減少酶水平。許多策略可用來達到這個目的。例如，可增加酶r降解率或抑制酶的合成。酶的合成可在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平抑制。
阻斷蛋白(如酶)的合成的一個普通方法是使用含有至少與部分阻斷翻譯r蛋白r mRNA序列互補序列的反義寡核苷酸(DNA或RNA)。CYP4A和CYP4F家族中所有已知成員的cDNA序列已公布，本領域熟練技術人員可采用。本領域熟練技術人員知道如何制備和使用反義寡核苷酸阻斷這些酶的合成。例如，反義方法用來有效地減少CYP4A在大鼠體內(nèi)腎血管中的表達，降低血壓和血管張力。Wang，M.H.等，Am J Physiol 276LF246-F253，1999；Wang，M.H.等，Am J Physiol 280R255-R261，2001.
本發(fā)明反義方法的例子是使用20-25mer反義寡核苷酸直接針對CYP4A1(大鼠)，CYP4A2(大鼠)，CYP4A11(人)，CYP4F2(人)或CYP4F3(人)的5’末端與3’端和5’端最后三個堿基對上硫代磷酸衍生物信息從提高半衰期和寡核苷酸的穩(wěn)定性。用5’轉(zhuǎn)錄起始位點延伸2-5堿基對的序列設計一些寡核苷酸是有用的策略。CYP4A1合適的反義序列其中包括，用于DNA的5’-cagtgcagagacgctcatggt-3’(SEQ ID NO1)和用于RNA的5’-cagugcagagacgcucauggu-3’(SEQ ID NO2)。CYP4A2合適的反義序列其中包括，用于DNA的5’-gctaaatacagagaaacccatggt-3’(SEQ IDNO3)和用于RNA的5’-gcuaaauacagagaaacccauggu-3’(SEQ ID NO4)。
本發(fā)明說明的用于治療腦血管疾病的反義寡核苷酸可靜脈注入患病動物。寡核苷酸也可注入CSF。也可使用反義寡核苷酸的載體。合適載體的例子是陽離子脂質(zhì)體。例如，寡核苷酸可與陽離子脂質(zhì)體混合，陽離子脂質(zhì)體是在1ml氯仿中1-α二油酰磷酯酰乙醇胺和二甲基二十八烷基溴化銨以5∶2的比例混合制備的。溶劑會揮發(fā)，脂質(zhì)在10ml鹽水中用超波處理重懸浮。懸浮在陽離子脂質(zhì)體中的寡核苷酸應該穿過血腦屏障。但是，如果它不穿過，可直接注入CSF。
本發(fā)明使用的反義寡核苷酸的劑量可從約0.1μg/kg體重到約100μg/kg體重，約1μg/kg體重到約10μg/kg體重，或約3μg/kg體重到約5μg/kg體重。以上范圍以外的劑量但阻斷靶酶合成也可用于本發(fā)明。
另一種使用反義寡核苷酸的方法是將其轉(zhuǎn)入載體使載體可產(chǎn)生阻斷編碼產(chǎn)生20-HETE的CYP4A或CYP4F的mRNA翻譯的反義cRNA。
實施例1治療SAH后血流量急劇下降材料和方法動物。實驗在雄性Sprague-Dawley大鼠(9周齡)上進行，大鼠購自HarlanSprague-Dawley，Inc.(Indianapolis，IN)。大鼠住在由美國實驗動物養(yǎng)護資格認可協(xié)會(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)批準的威斯康星醫(yī)學院的動物飼養(yǎng)設施。涉及動物的所有方案得到威斯康星醫(yī)學院委員會批準。
手術準備。大鼠用氯胺酮(Ketaject20mg/kg i.m.)和硫布塔巴比妥鈉(Inactin50mg/kgi.p.)麻醉。在氣管中放置套管，且大鼠使用一小通風設備(SAR-830，CWE，Inc.，Ardmore，PA)和含30％O2的N2的混合物人工通風。將導管插入股靜脈以輸注藥物，大鼠以3ml/min的速度接受0.9％NaCl溶液靜脈輸注以補充液體損失。股動脈插入導管以測量平均動脈壓(MAP)和動脈血氣。根據(jù)二氧化碳分析器(Capstar-100IITC，Inc.，Woodland Hills，CA)讀數(shù)調(diào)節(jié)每分鐘通風將二氧化碳的終末潮的分壓控制在38mmHg。在實驗開始和結(jié)束收集血液樣品并用血氣分析儀(ABL300，Radiometer，Copenhagen，Denmark)分析驗證二氧化碳的終末潮的分壓讀數(shù)。麻醉由使用額外需要量的硫布塔巴比妥(8mg/kg靜脈內(nèi))維持。直腸體內(nèi)溫度維持在37±1℃。
誘導SAH和測量腦血流量。使用SAH模式的后顱骨-頸途徑的修飾將0.3ml自體動脈血注入大池誘導SAH。Delgado TJ等，Stroke 16595-602(1985)；SolomonRA等，Stroke 1658-64(1985)。大鼠頭部置于立體定向頭部固定器，在中線平整地分離上覆頸肌使寰枕膜露出。枕骨和寰椎可看見。使用立體顯微鏡將附有30計量針的PE-10穿透寰枕膜插入大池。然后，0.3ml新得到的未肝素化動脈血以35μl/min的速度用注射器泵注入大池。這產(chǎn)生了大量在所有大鼠尸體解剖中證實的SAH。小腦延髓接合處后上方和基動脈及韋利斯氏環(huán)血管周圍發(fā)現(xiàn)有血液。
使用激光多普勒流量計通過薄顱窗連續(xù)測量腦血流量(CBF)。右壁皮層上3×5mm面積的骨用手持鉆孔機打薄至顱骨只有一薄的半透明層(薄顱窗)。PF103激光多普勒流量(LDF)探測器置于顱窗上，用PF3激光多普勒流量計(Perimed，Stockholm，Sweden)監(jiān)控CBF。
測試SAH前給予HET0016和17-ODYA對rCBF效果的實驗方案。手術后和30分鐘平衡期，靜脈/載體給予或HET0016(10mg/kg)，在30分鐘對照期中測量CBF。其它動物采用微操縱器和30計量針直接注入大池接受17-ODYA(1.5nmol)或50μl體積的載體。CBF在SAH開始前記錄最后5分鐘的對照期作為對照值。從股動脈收集血液樣品(0.3ml)，注入大池10分鐘。在血液注射完成后在10，20，30，60，90，120分鐘時隔2分鐘記錄CBF一次。CBF數(shù)據(jù)以對照百分比變化表示。
測試在SAH建立后給予HET0016對rCBF效果的實驗方案。0.3ml血液注入大鼠大池誘導SAH。30分鐘后，靜脈注射或HET0016(1mg/kg)CBF在注入血液前最后5分鐘的平均值作為對照值，在SAH誘導后10，30，40，70，100和160分鐘時隔2分鐘記錄CBF一次。CBF數(shù)據(jù)以對照百分比變化表示。
測量CSF中的20-HETE。在每個實驗結(jié)束時，用1ml注射器和30計量針從大池收集CSF。也可從其它沒有接受血液注入大池的假手術大鼠收集CSF。用最近描述的新熒光HPLC分析測量CSF中的20-HETE濃度。Maier KG等，Am.J.Physiol HeartCirc.Physiol.279H863-H871(2000)。簡單地說，50ng國際標準20-羥基二十碳-6(Z)、15(Z)-二烯酸(WIT-002)加入CSF樣品(50μl)。樣品用1ml乙酸乙酯提取，提取物在氬下干燥，脂質(zhì)部分在Sep-Pak VacTM柱(cat.no.WAT054955，WatersCorporation，Milford，MA)上純化。脂質(zhì)部分用含36.4mM 2-(2，3-萘二甲酰亞氨基乙基三氟甲磺酸鹽)-的20μl乙腈標記。加入N，N-二異丙基乙胺(10μl)催化反應。樣品在室溫反應30分鐘。用Sep-Pak VacTM柱去除多余的染料，樣品在氬下干燥并在100μl甲醇中重懸浮，使用4.6×250mm對稱C18柱(WatersCorporation，Milford，MA)和熒光探測器(型號L-7480，Hitachi，Naperville，IL)的反相HPLC分析。通過比較20-HETE和內(nèi)部標準的峰值區(qū)域確定樣品中20-HETE的量。
HET0016作為20-HETE形成的選擇性抑制劑的特征。這些試驗檢測了不同濃度的HET0016對腎微粒體中AA代謝的效果，腎微粒體富含使AA代謝為20-HETE和EET的CYP酶。大鼠腎皮層在10mmol/L含250mmol/L蔗糖，1mmol/LEDTA和10mmol/L氯化鎂的磷酸鉀緩沖液(PH7.7)中攪勻。微粒體用前面描述的差速離心法制備。Ma，Y-H等，Am J Physiol Regulatory Integrative Camp Physiol.267R579-R589(1994)。通過在37℃用[14C]-AA(0.1μ Ci/ml，42μmol/L，Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)在1ml前描述的0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(PH7.4)和1mmol/L NADPH中培養(yǎng)腎皮層微粒體(0.5mg蛋白)30分鐘分析CYP4A酶活性。Ma，Y-H等，Am J Physiol Regulatory Integrative Camp Physiol.267R579-R589(1994)。反應用0.1mol/L蟻酸酸化成PH3.5終止并用乙酸乙酯提取。用25cm×2mmi.d.(Supelco Inc.，Bellefonte，PA)C18-反相HPLC柱和范圍從乙腈∶水∶乙酸(50/50/0.1)到乙腈∶乙酸(100/0.1)的40分鐘線性洗脫梯度分離代謝物。放射性產(chǎn)物用放射性的流動探測器(型號120，Radiomatic Instrment Co.，Tampa.FL)監(jiān)控。
測量HETE0016在血漿和大腦中的水平。大鼠靜脈內(nèi)注入含HETE0016(10mg/kg)的10％卵磷脂。平衡1小時后，大鼠用戊巴比妥麻醉，血液樣品從頸靜脈收集。然后大鼠被處死并摘除大腦，稱重，在3體積0.9％NaCl溶液中用Physcotron勻漿器(Nition-Ikakikai，Chiba，Japan)攪勻。HETE0016在100μl等分血漿或腦勻漿液的濃度由LC/MS選擇性離子監(jiān)控確定。樣品用1ml乙腈混合、離心，20μl清澈上清液注入LC/MS。樣品在200×4.6mm Capcellpak UG 120 ODS柱(Shieseido Corp.，Tokyo，Japan)上分離并用乙腈∶水(72/28)洗脫。峰值用Sciex API 3000質(zhì)譜儀(Perkin Elmer Sciex，Ontario，Canada)監(jiān)控，質(zhì)譜儀轉(zhuǎn)向檢測對每個分析物特異的產(chǎn)物轉(zhuǎn)換前體。
藥物和化學品。所有的化學品都是HPLC級。熒光探針(2-(2，3-萘二甲酰亞氨基)-乙基三氟甲磺酸鹽)購自Molecular Probes(Eugene，OR)。17-ODYA購自Sigma(StLouis，MO)。HETE0016和WIT-002由Taisho PharmaceuticalCo.Ltd.(Saitama，Japan)合成。
統(tǒng)計法。數(shù)據(jù)以平均值±平均標準誤(SEM)表示。組內(nèi)和組之間平均值顯著的差異由雙向ANOVA重復測量再用鄧肯多范圍測試來檢測。AP值小于0.05被認為是顯著的。
結(jié)果在SAH前給予HET0016和17-DOYA對rCBF的效果。兩種化學性和機械性不同的20-HETE形成的抑制劑在SAH誘導后對rCBF變化的效果在圖2中列出。大鼠用HET0016(10mg/kg靜脈內(nèi)，SAH前30分鐘，n＝9)、17-DOYA(1.5nmol鞘內(nèi)，n＝7)或載體(n＝15)預處理。接受HET0016(卵磷脂)或17-DOYA(1∶1,000乙醇在鹽水中)的載體的大鼠反應沒有顯著差異。因此，來自這兩組的數(shù)據(jù)組合并一起列在圖2中。在載體處理的大鼠中，注入300μl血液到大池引起rCBF迅速下降。SAH誘導10分鐘后它平均下降30％，并在實驗中保持比水平2小時。用20-HETE和EET、17-ODYA形成的不可逆抑制劑或新的20-HETE、HET0016形成的選擇性抑制劑預處理大鼠，顯著地減少rCBF的下降。在用HET0016處理的大鼠誘導SAH后和用17-DOYA處理的大鼠誘導SAH后90分鐘內(nèi)，兩種藥物都在10分鐘顯著減少rCBF最初下降約40％，rCBF在60分鐘內(nèi)恢復的值與對照沒有明顯不同。
生理學參數(shù)。比較這些實驗中MAP和終末潮的pCO2數(shù)據(jù)表明，在大鼠接受載體，HET0016或17-DOYA的實驗中任何時候的endtidal pCO2沒有顯著差異。MAP在這三組實驗中往往下降，但用載體17-DOYA或HET0016處理的大鼠血壓在實驗中任何時候都沒有差異。
HET0016對HET0016合成的效果。大鼠腎微粒體用于這些實驗，因為它們都表達在腦動脈中形成20-HETE有關的CYP4A酶和產(chǎn)生EET的CYP2C和CYP2J家族的酶。HET0016對大鼠腎微粒體AA代謝的效果在圖3中列出。四種分析以平均值±SEM表示。數(shù)據(jù)以對照產(chǎn)生平均96±3.9pmoles/min每毫克蛋白的百分比表示。HET0016依賴劑量地以濃度10-1000nmol/L抑制20-HETE合成。HET0016對腎微粒體產(chǎn)生EET甚至在濃度高達1000nmol/L時也沒有顯著效果。
測量血漿和大腦中HET0016水平。在靜脈內(nèi)注入10mg/kgHET0016后1小時，HET0016水平在血漿中平均為570±90ng/ml(n＝3，2.8μmol/L)，在大腦中為1488±104ng/g(n＝3，7.2μmol/L)。
測量CSF中20-HETE水平。假手術對照大鼠的CSF和大鼠給予載體，17-DOYA和HET0016兩小時后20-HETE的濃度值在圖4中列出。括號內(nèi)的數(shù)字表明研究動物的數(shù)目。接受載體的大鼠SAH后CSF中的20-HETE濃度與沒有接受血液注入的對照大鼠測量水平比較增加10倍。在SAH誘導前接受17-DOYA或HET0016的大鼠CSF中的20-HETE濃度較低。接受17-DOYA的大鼠CSF中的20-HETE水平下降比用HET0016處理大鼠中觀察到的大。
在誘導SAH后給予HET0016逆轉(zhuǎn)腦血流量下降的能力注射0.3ml血液到大鼠大池誘導SAH。如圖5所示，注入的血液暫時使腦血流量減少60％，之后腦血流量持續(xù)減少30％。SAH誘導30分鐘后用HET0016處理大鼠(1mg/kg體重，i.v.)使腦血流量70分鐘后回到對照值。相反，載體處理的大鼠腦血流量在整個實驗階段的160分鐘仍低。圖5中顯示的數(shù)據(jù)表明，HET0016是治療和逆轉(zhuǎn)SAH后腦血流量下降和隨之腦損傷的有效治療劑。
實施例2HET0016對暫時MCA阻塞大鼠的梗塞量的效果方法成年雄性Wistar大鼠(200-250g)用含2％氟烷的02麻醉。仔細解剖右外頸動脈(ECA)。將包硅的縫合線(180mm長)從ECA內(nèi)腔插入右內(nèi)頸動脈(ICA)以閉合右中央腦動脈(MCA)源頭。體溫用加熱墊維持在37℃。手術后，麻醉停止，局部出血的動物在四肢上部表現(xiàn)出嚴重的輕偏癱。MCA阻塞1小時后，拆線使缺血區(qū)域重灌注。大鼠在重灌注后立即給予載體(30％羥丙基β-環(huán)糊精)或HET0016(0.01，0.1和1mg/kg靜脈內(nèi))。
為了測量梗塞量，大鼠在MCA暫時阻塞后重灌注后24小時殺死。大腦用生理鹽水穿心沖洗，從頭骨摘除，切成2-mm冠狀切片。切片在37℃20％氯化三苯基四唑氮(TTC)中浸30分鐘。
所有數(shù)值以平均值±SEM表示。對于統(tǒng)計分析，使用Dunnet多范圍測試。
結(jié)果靜脈注入0.1和1mg/kg劑量HET0016顯著減少MCA阻塞大鼠的梗塞量(圖6)。載體組、0.1mg/kg HET0016組和1mg/kgHET0016組的梗塞量為23.3±4.1％(n＝17)，10.7±2.6％(n-10，p＜0.05)和9.7±2.1％(n＝17，p＜0.05)。
實施例320-HETE合成酶抑制劑的20-HETE/EET選擇性方法所有步驟在4℃進行。從20只雄性SHR大鼠(6周齡)收集腎皮層。它們在裂解緩沖液(20mM HEPES，PH7.4，1mM EDTA，100μM對-(咪苯基)甲磺酰氟和250mM蔗糖)充分攪勻。上清液進一步以16000×g離心30分鐘。收集可溶部分并以200000×g離心30分鐘。所得沉淀懸浮在50mM MOPS緩沖液中。
微粒體在50mM MOPS緩沖液中，用[3H]-AA(1μCi/ml)在有或無HET0016、1-ABT或咪康唑情況下培養(yǎng)。β-NADPH(1mM)加入反應混合物并在37℃再培養(yǎng)1.5小時。通過加入蟻酸和乙腈至終濃度分別為1％和50％終止反應?；旌衔锏确旨尤隑io-SilC18HL90-5S柱(150×4.6mm)再用20-HETE以0.7ml/min流速和溶劑A(100％乙腈)及B(0.1％乙酸)梯度洗脫，梯度如下0-10分鐘，48％A到64.8％A；10-25分鐘，64.8％A到75％A；25-26分鐘，75％A。
結(jié)果如圖7所示，HET0016(MW＝206)依賴劑量地有效抑制20-HETE形成。此實驗中IC50平均4ng/ml，對應于20nM每摩爾濃度。但是，HET0016在大鼠腎微粒體中即使以研究的最高濃度(1000ng/ml或5μM)也不抑制EET形成。1-ABT(MW＝134)是依賴劑量地減少EET和20-HETE形成的非選擇抑制。1-ABT的IC50約20μg/ml或150μM。咪康唑(MW＝479)是EET形成的選擇性抑制劑，IC50約為0.5μg/ml或1μM。只有在非常高的濃度(10-20μg/ml，21-42μM)咪康唑才抑制20-HETE形成。這些結(jié)果提示在這些CYP450抑制劑中，HET0016是在大鼠腎微粒體中20-HETE選擇性CYP450抑制劑。它比其它化合物有效1000倍。
實施例420-HETE在犬嗜中性粒細胞中的生成活性方法進行實驗以確定犬血液中與20-HETE形成有關的細胞類型。實驗使用4只雄性小獵兔犬。犬用戊巴比妥鈉(30mg/kg，靜脈)麻醉。靜脈血樣品抽出并立即與作為抗凝血劑的1∶9體積檸檬酸三鈉(3.8％)混合。嗜中性粒細胞用珀可梯度技術制成98％純度。用20計量針從大池中抽出CSF。本實驗僅采用無血的清晰CSF樣品。CSF用混合氣體(95％O2，5％CO2)氧化30分鐘。嗜中性粒細胞懸浮在氧化的CSF中，細胞數(shù)目調(diào)整到2×106，6.3×106和2×107。全血(20μl)、紅細胞(20μl)或嗜中性白粒細胞在含1mM NADPH和[3H]-AA的氧化CSF(180μl)中37℃培養(yǎng)2小時。反應通過加入蟻酸終止。100％乙腈(200μl)加入反應緩沖液調(diào)節(jié)終濃度至50％以進行HPLC分離。AA的代謝物在Bio-SilC18HL90-5S柱(150×4.6mm)上以0.7ml/min流速使用梯度洗脫26分鐘分離，洗脫梯度范圍從乙腈∶水∶乙酸(48/52/0.1)到乙腈∶水∶乙酸(75/25/0.1)。形成的標記產(chǎn)物用放射性流動探測器(raytest GmbH，Straubenhardt，Germany)監(jiān)控。
結(jié)果本實驗結(jié)果表明犬血液中的嗜中性粒細胞產(chǎn)生20-HETE(圖8)。我們使用大鼠嗜中性粒細胞獲得了類似的數(shù)據(jù)。
實施例5HET0016對于犬嗜中性粒細胞中20-HETE生成活性的效果方法我們下一步檢測了不同濃度HET0016抑制犬嗜中性粒細胞形成20-HETE的能力。犬嗜中性粒細胞(2×107終濃度)在犬CSF中有1mM NADPH和[3H]-AA，有或無不同濃度HET0016(10-11，10-10，10-9，10-8，10-7和10-6M)情況下37℃培養(yǎng)2小時。反應通過加入蟻酸終止。乙腈加入反應緩沖液調(diào)節(jié)終濃度至50％以進行HPLC分離。AA的代謝物在Bio-SilC18HL90-5S柱(150×4.6mm)上以0.7ml/min流速使用梯度洗脫26分鐘分離，洗脫梯度范圍從乙腈∶水∶乙酸(48/52/0.1)到乙腈∶水∶乙酸(75/25/0.1)。標記代謝物用放射性流動探測器ramona 93(raytestGmbH，Straubenhardt，Germany)監(jiān)控。
結(jié)果HET0016(10-11-10-6M)依賴濃度地抑制犬嗜中性粒細胞形成20-HETE(圖9)。HET0016的IC50平均為10.2±1.3nM(n＝4)。
實施例6具有SAH犬中CSF的20-HETE水平的測量方法此研究使用雄性小獵犬。使用雙出血犬模型因為它能可靠再現(xiàn)慢性血管痙攣。
在第1天，在麻醉狀況下進行手術。通過20計量針插入大池誘導SAH，2到6mlCSF被去除。新鮮自體動脈血(5到10ml)注入大池。然后拎住尾部向SAH上將犬傾斜20分鐘以助于通過重力調(diào)整基動脈周圍的血液。隨后，喚醒動物并返回單獨的籠中。在第3天，麻醉犬，抽出0.5ml到4mlCSF，5.5到9ml新鮮自體動脈血注入大池，如第1天所述。然后動物回到它們的籠中。在第7天，CSF樣品(0.5ml到2ml)通過同樣的操作抽出。CSF中的20-HETE水平通過HPLC技術測量，HPLC技術如Maier，K.G.等，Am.J，Physiol Heart Circ.Physiol.279H863-H871(2000)所述。
結(jié)果CSF的20-HETE水平在對照期中為20.2±4.7ng/ml(n＝5)。我們發(fā)現(xiàn)注入血到大池增加了具有SAH的犬CSF中20-HETE水平(圖10)。CSF中的20-HETE水平在第3天和第7天為81.6±29.6ng/ml(n＝5)和148.1±36.6ng/ml(n＝5)(圖10)。
實施例7抑制人20-HETE合成酶方法反應混合物含HBSS(Hanks平衡的鹽溶液，目錄號14175，Gibco)，5μCi/ml3H-AA(Amersham Pharmacia Biotech)，1mM NADPH和人腎微粒體(Human CellCulture Center，Laurel，MD)(0.02-0.4mg蛋白)，在37℃培養(yǎng)2小時。在抑制研究中，HET0016、17-ODYA或1-ABT直接加入反應混合物。所有反應通過用1％蟻酸酸化終止。加入等體積乙腈，最后50％乙腈混合物進行HPLC分析。等分反應混合物上Bio-Sil C18HL90-5S柱(150×4.6mm，Bio-Rad)，反應產(chǎn)物用溶劑A(100％乙腈)及B(0.1％乙酸)的混合物線性梯度分離，梯度如下(i)0-10分鐘，溶劑A48％到64.8％；(ii)10-20分鐘，溶劑A64.8％到75溶劑；(iii)25-26分鐘，溶劑A75％；(iv)26-31分鐘，溶劑A100％。3H標記產(chǎn)物用放射性探測器檢測(raytest，ramina93)。在我們體系中20-HETE保留時間約16分鐘(HPLC，Gilson System，805(測壓組件)，811C(動態(tài)混合器)，401C(稀釋器)，305(泵)，306(泵)，231XL(樣品注射器)，831(溫度調(diào)控器)503(除氣器))。IC50定義為使20-HETE的峰值區(qū)域減少到對照的50％的抑制劑的濃度。
結(jié)果HET0016(10-11-10-6M)，17-0DYA(10-9-10-4M)和1-ABT(10-9-10-4M)依賴濃度地抑制與AA培養(yǎng)的人腎微粒體的20-HETE形成。HET0016，17-ODYA和1-ABT的IC50分別為8.9±2.7nM(n＝6)，1.8±0.8μM(n＝6)和38.5±14.9μM(n＝5)。
實施例8HET0016對所有CYP同工型，與人中20-HETE形成有關的CYP4A11，CYP4F2和CYP4F3的效果方法從Gentest Corp(Woburn，Massachuseets)購買的30皮摩爾重組CYP4A11、CYP4F2或CYP4F3酶與[14C]-AA(0.1Ci，1.9M)在1ml含1mM NADPH的0.1M磷酸鉀緩沖液(PH7.4)中37℃培養(yǎng)30分鐘。通過蟻酸酸化至PH3.5終止反應并用乙酸乙酯提取。代謝物由反相HPLC分離，產(chǎn)物用放射流動探測器監(jiān)控。
結(jié)果用CYP4F3得到的代表性層析圖在圖11中列出，A組(對照)和B組(1μMHET0016)。通過使用CYP4A11或CYP4F2酶得到類似結(jié)果。所有三種同工型與AA培養(yǎng)時產(chǎn)生20-HETE。CYP4F3同工型活性最大，接著是CYP4F2和CYP4A11。HET0016依賴濃度地抑制所有三種同工型形成20-HETE(圖11，C組)。CYP4A11的IC50為42nM，CYP4F3和CYP4F2的IC50平均分別為100nM和125nM。
實施例9HET0016、17-ODYA和1-ABT對參與藥物代謝的主要人肝CYP酶CYP2D6，2C9和3A4的活性的效果。
方法測試HET0016、17-ODYA和1-ABT抑制參與藥物代謝的普通人肝臟細胞色素P450酶(CYP2D6，2C9和3A4)的催化活性的能力。由15個人的肝臟制備的微粒體購自Nippon Nosanko。酶/底物包括緩沖液、人肝臟微粒體和以下底物(CYP2C914C-甲苯丁唑酰胺(4-甲基羥基化)，CYP2D6鹽酸丁呋洛爾(1’-羥基化)，CYP3A414C-睪丸素和CYP2C1914C-(S)-美芬妥英(4’-羥基化))。上述混合物在有或無1-ABT(100μM)、17-ODYA(10μM)或不同的HET0016濃度(1，10，100μM)情況下培養(yǎng)。培養(yǎng)后，形成氧化底物(代謝物)的速度用TLC或HPLC確定。CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4和CYP2C19的陽性對照為磺胺非那唑，奎尼定，酮康唑和反苯環(huán)丙胺。
HET0016對COX活性的效果。HET0016對COX活性的效果用COX抑制劑篩選分析試劑盒(Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI)檢測。簡單地說，來自公羊精囊PGHI合酶的純化酶與100μM AA在1.0ml培養(yǎng)緩沖液(0.1M Tris-HCl，PH8，5mMEDTA，2mM苯酚和1μM高鐵血紅素)，中在有或無HET0016(10-10-10-4M)和吲哚美辛(10-10-10-4M)情況下培養(yǎng)。反應混合物在AA加入前和之后2分鐘37℃培養(yǎng)2分鐘。所有樣品用雙份。PGE2量在Tris緩沖液稀釋100-400倍后用ELA確定。
結(jié)果表1顯示了HET0016、17-ODYA和1-ABT對人CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性的抑制效果。相應的陽性對照抑制CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的代謝約90％，CYP2C19活性65％。濃度為100μM的1-ABT抑制這些CYP同工型活性40-80％。濃度為10μM的17-ODYA可顯著抑制CYP4A活性，比1-ABT更有選擇性，僅降低CYP2C9和CYP3A4活性20-30％。類似地，濃度為1μM HET0016，比抑制20-HETE形成所需濃度高100倍，僅降低CYP2C9和CYP3A4活性27％。較高濃度10μM和100μM的HET0016更顯著地減少CYP同工型的活性。然而，10μM和100μM分別超過HET0016抑制20-HETE形成所需的有效濃度1000和10000倍。
我們也通過測量PGH1合酶-催化的AA轉(zhuǎn)化為PGE2檢測HET0016對COX活性的效果。HET0016(10-6M)抑制COX活性20％，而吲哚美辛(10-6M)抑制COX活性95％。
表1HET0016、17-ODYA和1-ABT對人肝微粒體催化CYP特異活性的效果
陽性對照 2C9磺胺非那唑，2C19反苯環(huán)丙胺2D6奎尼定，3A4酮康唑人肝微粒體從15個供體中收集微粒體。
序列表<110>R.J.羅曼D，R，哈德宮田 典幸佐藤 正和龜雄 一也奧山 繁<120>使用20-HETE合成酶抑制劑治療腦血管疾病<130>650053.91533<140>PCT/US01/27605<141>2001-09-06<150>60/245,638<151>2000-11-03<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>1cagtgcagag acgctcatgg t21<210>2<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2
cagugcagag acgcucaugg u21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3gctaaataca gagaaaccca tggt 24<210>4<211>24<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4gcuaaauaca gagaaaccca uggu 2權(quán)利要求
1.一種治療人或非人動物腦血管疾病的方法，其特征在于，該方法包括步驟減少動物中20-HETE合成酶活性來足以增加或防止動物腦血流量下降。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中腦血管疾病選自阻塞性中風、出血性中風、偏頭痛、腦血管痙攣、感染、由頭部外傷引起的疾病和大腦損傷和與血流量下降有關的慢性神經(jīng)病。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，其中與血流量減少有關的慢性神經(jīng)病選自阿爾茨海默爾病、癡呆、帕金森病和亨廷頓病。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中通過將20-HETE合成酶抑制劑注入動物降低20-HETE合成酶活性。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑選自HET0016、17-ODYA、二溴十二碳烯基甲硫酰亞胺、1-氨基苯三唑和咪康唑。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑是20-HETE合成酶抗體。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑是HET0016。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，其中HET0016劑量足夠以致HET0016的血液濃度在約1nM和約1000nM之間。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，其中HET0016劑量足夠以致HET0016的血液濃度在約2nM和約25nM之間。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，其中HET0016靜脈給予。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，其中HET0016的劑量在約0.003mg/kg體重和約10mg/kg體重之間。
12.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑是CYP4A抑制劑。
13.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑是CYP4F抑制劑。
14.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑口服給予。
15.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑靜脈給予。
16.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑皮下給予。
17.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中20-HETE合成酶抑制劑通過硬膜下或腦心室內(nèi)注射鞘內(nèi)注入CSF。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中腦血管疾病是蛛網(wǎng)膜下出血后腦血管痙攣。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，其中通過將HET0016給予動物來降低20-HETE合成酶活性。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，其中HET0016靜脈給予。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，其中HET0016的劑量在約0.003mg/kg體重和約10mg/kg體重之間。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，其中通過在動物中注入17-ODYA降低20-HETE合成酶活性。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，其中17-ODYA注入腦脊液。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，其中17-ODYA6的劑量足夠在腦脊液中產(chǎn)生約1μM和約10μM之間的終濃度。
25.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，其中通過對動物給予DDMS來降低20-HETE合成酶活性。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，其中DDMS的劑量足夠在腦脊液中產(chǎn)生約10μM的終濃度。
27.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中通過減少20-HETE合成酶水平降低20-HETE合成酶活性。
28.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中通過對動物給予反義寡核苷酸來降低20-HETE合成酶活性。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸是DNA。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，其中DNA核苷酸序列與SEQ IDNO1相同。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，其中DNA核苷酸序列與SEQ IDNO3相同。
32.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸是RNA。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，其中RNA核苷酸序列與SEQ IDNO2相同。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，其中RNA核苷酸序列與SEQ IDNO4相同。
35.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸靜脈給予。
34.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，其中寡核苷酸注入動物的腦脊液。
全文摘要
公開了治療人體或非人的動物的腦血管疾病的方法。此方法包括抑制20－HETE合成酶活性足以增加或防止人或非人的動物腦血流量的減少。這可以通過用酶CYP4A或CYP4F家族的抑制劑，如HET0016、17－ODYA(17－十八炔酸)、DDMS(二溴十二碳烯基甲硫酰亞胺)、1－ABT(1－氨基苯三唑)和咪康唑，或用20－HETE合成酶抗體或用直接直接針對CYP4A1、CYP4A2、CYP4A11、CYP4F2或CYP4F3 5’末端的反義寡核苷酸治療動物而實現(xiàn)。
文檔編號A61P31/04GK1655775SQ01818397
公開日2005年8月17日 申請日期2001年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者R·J·羅曼, D·R·哈德, 宮田典幸, 佐藤正和, 龜雄一也, 奧山繁 申請人:Mcw研究基金會股份有限公司, 大正制藥株式會社