專利名稱：具有抗血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物的制作方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種包含蜂花屬植物葉提取物的組合物，其具有對(duì)血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制活性。
詳細(xì)地，本發(fā)明涉及包含蜂花屬植物葉提取物作為活性成分的組合物，其可被用作藥品，食品或化妝品來(lái)治療或預(yù)防血管生成-和/或MMP-依賴性的疾病。
(b)相關(guān)技術(shù)的描述蜂花屬植物(蜜蜂花)，一種唇形科植物，作為常用名和俗名，也被稱為密里薩香草(lemon balm)，香蜂草(balm)或水腫植物(dropsy plant)。
蜜蜂花的主要成分是揮發(fā)性油(香葉醛，橙花醛，香茅，里哪醇，香葉醇，牻牛兒乙酸酯，香茅甲酯(methyl citronellate)，反式-β-羅勒烯，大根香葉烯(germacren)，丁子香酚)，咖啡酸衍生物，類(lèi)黃酮類(lèi)，三萜烯類(lèi)，兒茶酸類(lèi)和單寧類(lèi)。迷迭香酸，咖啡酸的一種衍生物，是蜂花屬植物葉提取物的最豐富的成分(約4.7％)，已知其具有抗炎的活性。
蜂花屬植物是可食用和藥用的。新鮮的葉子可加到色拉中和用于制作魚(yú)、家禽和豬肉調(diào)味料。干燥的或新鮮的全植物用來(lái)使飲料涼爽提神或溫?zé)崃钊朔潘傻牟枞~(relaxing tea)，其對(duì)發(fā)熱，感冒和頭痛是有效的。作為一種備選藥物，它適于鎮(zhèn)靜神經(jīng)，緩解痛經(jīng)、失眠、抑郁、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、肚子痛和嬰兒疝痛。它是抗菌藥，解痙藥，抗病毒藥，驅(qū)風(fēng)劑，發(fā)汗劑，助消化劑，通經(jīng)藥，退熱藥，鎮(zhèn)靜劑和補(bǔ)藥。近來(lái)，蜂花屬植物的葉提取物已包含于血液循環(huán)活化劑，其有助于外周血管的擴(kuò)張。新鮮的碾碎葉涂敷到傷口和昆蟲(chóng)叮咬處。蜂花屬植物的油通常加到皮膚制劑和香料中。精油通常在香料按摩中使用(Cohen RA，Kucera LS，Herrmann EC Jr.，Proc Soc Exp Biol Med 117，431-434，1964；Kucera LS，Cohen RA和Herrmann EC Jr，Ann.NYAcad Sci 130，474-82，1965)。
血管生成是產(chǎn)生新的微血管的過(guò)程。這是由于被活化的預(yù)先存在的內(nèi)皮細(xì)胞增殖產(chǎn)生的。血管再生被嚴(yán)格地調(diào)節(jié)，并且活化僅在胚胎發(fā)育、組織重新再造，傷口愈合和產(chǎn)生黃體的循環(huán)周期中發(fā)生(Folkman和Cotran，Relation of vascular proliferation to tumor growth，Int Rev Exp Pathol 16 207-248，1976)。
與身體中的其它類(lèi)型細(xì)胞相比，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)非常緩慢。然而，如果這些細(xì)胞的增殖被對(duì)血管生成的無(wú)效調(diào)節(jié)所誘導(dǎo)，則產(chǎn)生某些病理狀況(Timar，J Pathol Oncol Res 6，85-94，2001)。在很多疾病中涉及病理的血管生成。例如，心血管疾病如血管瘤，血管纖維瘤，血管畸形，動(dòng)脈粥樣硬化，粘連和edemic硬化；和眼科疾病如角膜植入后的血管再生，新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)，糖尿病性視網(wǎng)膜病，血管原性角膜疾病，黃斑變性，翼狀胬肉，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，和顆粒性結(jié)膜炎涉及血管生成。慢性炎癥疾病如關(guān)節(jié)炎；皮膚病如牛皮癬，毛細(xì)管擴(kuò)張，膿性肉芽腫，皮脂溢性皮炎和痤瘡也是血管生成依賴性的。
特別地，血管生成對(duì)于癌癥的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)是必需的(D’Amato RJ和Adamis AP，Ophthalmol 102，1261-1262，1995；Arbiser JL，J Am Acad Derm34，486-497，1996；O’Brien K.D.等.Circulation 93，672-682，1996；HanahanD和Folkman J，Cell 86，353-364，1996)。新血管不僅對(duì)快速生長(zhǎng)的癌細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)素和氧氣，而且提供進(jìn)入血流導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的通路(Polverini P.J.，Critical Reviews in Oral Biology，6，230-247，1995)。目前，大量的化學(xué)療法和免疫療法用于治療癌癥，但由于缺乏抗轉(zhuǎn)移作用，治療的效率是有限的，并且沒(méi)有療法可以成功地延長(zhǎng)癌癥患者的生命。
關(guān)節(jié)炎，一種眾所周知的炎性疾病，是作為一種自身免疫性疾病發(fā)病的。然而，在滑液腔中血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)被炎性細(xì)胞因子活化，其最終破壞軟骨的清晰度(Kocb AE，Polverini PJ和Lcibovich SJ，Arth Rheum29，471-479，1986；Stupack DG，Storgard CM和Cheresh DA，Braz J Med BiolRcs 32，578-581，1999；Koch AE，Arthritis Rheum 41，951-962，1998)。
由于各種眼病，全世界有很多人喪失了視力。由于毛細(xì)管血細(xì)胞滲透到玻璃體液中，很多患者失明(Jeffrey MI和Takayuki A，J Clin Invest103，1231-1236，1999)。
牛皮癬是由于皮膚細(xì)胞的極度活性增殖引起的?？焖偕L(zhǎng)的細(xì)胞需要充足的血液供應(yīng)，并且在牛皮癬中血管生成被異常地誘導(dǎo)(Folkman J.，JInvest Dermatol 59，40-48，1972)。
如上所述，血管生成與很多疾病的引發(fā)和進(jìn)展緊密相關(guān)。因此，血管生成的抑制劑可以是治療那些疾病的良好的備選物。為了防止和/或治療那些疾病，在開(kāi)發(fā)血管生成抑制劑方面已做了很多努力。
由于組成即使單一腫瘤血管的個(gè)體細(xì)胞廣泛變化，用各種類(lèi)型的抗血管生成的治療可提高癌癥治療的功效。對(duì)于最佳的抗血管生成治療，制備幾種血管生成抑制劑的混合物是理想的。
誘導(dǎo)血管生成的一個(gè)主要事件是在微血管形成前胞外基質(zhì)的斷裂?；|(zhì)降解的最重要的酶是基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)酶(MMP)，一個(gè)超過(guò)20種酶的家族。MMP是內(nèi)肽酶，其降解或蛋白酶解(proteolyze)胞外基質(zhì)的成分例如膠原質(zhì)，蛋白聚糖，和明膠，并被分為四組膠原酶，明膠酶，溶基質(zhì)素，和膜-型MMP。MMP家族中的許多酶具有底物特異性。當(dāng)需要胞外基質(zhì)的重新再造時(shí)，在各種生理環(huán)境下誘導(dǎo)MMP的表達(dá)。(Curry TEJr，Osteen KG，Biol Repord 64，1285-1296，2001；Damjanovske S，Amano T，Li Q，Ueda S，Shi YB，Ishizuya-Oka A，Ann NYAcad Sci 926，180-191，2000；Ravanti L，Kahari VM，Int JMol Med 6，391-407 2000)在很多生理狀態(tài)下觀察到增加的MMP表達(dá)或活化，例如動(dòng)脈粥樣硬化，阿爾茨海默氏病，皮膚老化，皺紋，關(guān)節(jié)炎，角膜潰瘍，蛋白尿，腹部主動(dòng)脈瘤，消退的軟骨損傷，有髓神經(jīng)損傷，肝纖維化，nephrogromerula病，胚膜破裂，炎性腸疾病，齦炎/牙周炎，老年性黃斑變性，視網(wǎng)膜病，斯耶格倫綜合癥，近視，角膜植入的排斥，血管生成和癌轉(zhuǎn)移(Woessner Jr.，Annals NY Acad Sci，732，11-21，1994；Warner等.，Am J Pathol，158，2139-44，2001；Stetler-Stevenson，Surg Oncol Clin N Am，10，383-92，2001)。
例如，溶基質(zhì)素是已知斷裂軟骨的主要酶(Murphy，G.等，Biochem J，248，265-268，1987)。膠原酶，明膠酶和溶基質(zhì)素導(dǎo)致很多視網(wǎng)膜病中胞外基質(zhì)的降解(Bruns，F(xiàn).R.等，Invest Opthalmol and Visual Sci，32，1569-1575，1989)。膠原酶和溶基質(zhì)素是在發(fā)炎齒齦的成纖維細(xì)胞中被鑒定的，酶的活性依賴于炎癥的程度(Beeley，N.R.A.等，見(jiàn)上文；Overall，C.M.等，J Periodontal Res，22，81-88，1987)。
近來(lái)的報(bào)道也表明，MMP-1活性在阿爾茨海默氏病中被高度誘導(dǎo)，在疾病的病理生理過(guò)程中涉及MMP-2和MMP-3。(Leake A，Morris CM，&Whateley，J Neurosci Lett 291，201-3，2000；Yoshiyama Y，Asahina M，&Hattori T，Acta Neuropathol(berl)，99，91-5，2000)MMP也參與日光UV輻射誘導(dǎo)的皮膚損傷，影響導(dǎo)致過(guò)早老化的皮膚顏色和彈性。癥狀其中包括似革的肌理，皺紋，斑狀的色素沉著，松弛和菜色。因此，MMP抑制劑可包含在抗光老化的化妝品中或抗皺紋劑中(Hase T，Shinata K，Murase T，Tokimitsu I，Hattori M，Takimoto R，Tsuboi R和Ogawa H，Br J Dermatol 142，267-273，2000；Fisher GJ，Talwar HS，Lin J，Voorhees JJ，Photochem Photobiol 69，154-157，1999)。
由于MMP和血管生成抑制劑可用于治療許多疾病，期待開(kāi)發(fā)血管生成抑制劑作為新的藥物。理想的抑制劑應(yīng)不具有毒性或副作用，具有良好的患者順應(yīng)性，因?yàn)橐种苿┬枰L(zhǎng)時(shí)間的給藥。
因此，本發(fā)明提供了一種抗血管生成組合物，其包含作為活性成分的蜂花屬植物葉提取物，還包含或不含其它活性成分。
更具體地，本發(fā)明提供了一種用于藥物或飲食的抗血管生成組合物。
因此，本發(fā)明的組合物可用于治療或預(yù)防衍生自血管生成的疾病。
另外，本發(fā)明提供了一種抑制MMP的組合物，其包含作為活性成分的蜂花屬植物葉提取物，還包含或不含其它活性成分。
更具體地，本發(fā)明提供了一種用于藥物，飲食或化妝品的抑制MMP的組合物。
因此，本發(fā)明的組合物可用于治療或預(yù)防衍生自MMP的疾病。
圖2是顯示用25μg/ml的蜂花屬植物葉提取物處理的HUVEC圖片。
圖3是顯示在小鼠Matrigel模型中，蜂花屬植物葉提取物對(duì)血管生成的作用的圖。
圖4是顯示在小鼠Matrigel模型中，口服給藥蜂花屬植物葉提取物對(duì)血管生成的抑制的圖表。
圖5是顯示在絨膜尿囊膜試驗(yàn)中，蜂花屬植物葉提取物的抗血管生成作用的圖片(a對(duì)照，b處理)。
圖6是顯示蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP-1活性的抑制的圖。
圖7是顯示蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP-2活性的抑制的圖。
圖8是顯示蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP-9活性的抑制的圖。
本發(fā)明的詳述在下文中，將詳細(xì)解釋本發(fā)明。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的蜂花屬植物葉提取物不僅在管形成試驗(yàn)中，而且在CAM試驗(yàn)和小鼠Matrigel模型中抑制血管生成。當(dāng)口服給藥蜂花屬植物葉提取物時(shí)，它還抑制血管生成。
管道形成試驗(yàn)是一種體外試驗(yàn)方法，其與體內(nèi)功效緊密相關(guān)，該試驗(yàn)研究對(duì)形成微脈管網(wǎng)絡(luò)的人內(nèi)皮細(xì)胞的移行和分化的影響。盡管CAM試驗(yàn)是利用受精卵的體內(nèi)試驗(yàn)，但在小鼠Matrigel模型中，可定量測(cè)量血管生成。
另外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)蜂花屬葉提取物抑制MMP，一類(lèi)血管生成和癌癥轉(zhuǎn)移的必需酶家族。當(dāng)用MMP-1，MMP-2和MMP-9來(lái)研究蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP的作用時(shí)，它強(qiáng)烈地抑制所有這三種酶的活性。然而，蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP的抑制作用不局限于這三種酶。
因此清楚地，本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物以藥物或飲食應(yīng)用，用作治療或預(yù)防依賴血管生成的疾病的抗血管生成劑。
因此同樣是清楚地，本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物以藥物、飲食或化妝品應(yīng)用，用作MMP-抑制劑來(lái)治療或預(yù)防MMP-相關(guān)的疾病。
在本發(fā)明中使用的蜂花屬植物葉提取物可商購(gòu)或用常規(guī)方法制備。也可使用商購(gòu)的蜂花屬植物葉提取物。常規(guī)提取方法的實(shí)例如下。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，向1kg的干蜂花屬植物葉中加入10-20L的含水醇(例如，甲醇，乙醇，丁醇等)或丙酮。在60-80℃的溫度下，提取該混合物30分鐘-2小時(shí)?？捎闷渌軇?氯仿，乙酸乙酯，酮等)重復(fù)該提取過(guò)程2-3次。濃縮獲得的提取物以獲得蜂花屬植物葉提取物。
如上所述，本發(fā)明的蜂花屬植物葉提取物具有對(duì)血管生成和MMP活性的抑制作用。盡管MMP是導(dǎo)致血管生成的酶，但蜂花屬植物葉提取物的抗血管生成活性不局限于MMP抑制活性。即，盡管MMP是誘導(dǎo)血管生成的一個(gè)因素，但蜂花屬植物葉提取物可抑制血管生成的其它因素。而且，蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP的抑制活性不局限于抑制血管生成。
本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的其它血管生成抑制劑的成分，例如噻氯匹定，葡糖胺(2-氨基-2-脫氧-D-guco吡喃糖)，七葉樹(shù)屬植物提取物和銀杏提取物，來(lái)治療和/或預(yù)防血管生成-和MMP-依賴性的疾病。我們先前已報(bào)道了商購(gòu)的藥物組合物抑制血管生成，所述商購(gòu)藥物組合物如七葉樹(shù)屬植物提取物(KR10-2001-66246)，葡糖胺和它的鹽(KR-10-2001-18675)，銀杏提取物(KR10-2000-45265)和噻氯匹定(KR10-2000-43589)。
這些商購(gòu)藥物可與本發(fā)明的蜂花屬植物葉提取物共處理，以發(fā)揮組合物的作用。
具體地，用銀杏提取物或噻氯匹定聯(lián)合處理的蜂花屬植物葉提取物可用作轉(zhuǎn)移抑制劑。
本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的其它抗癌，抗炎和抗老化試劑的成分，如洋甘草(Glycyrrhiza glabra)，中國(guó)肉桂，槐(Sophora japonica)，關(guān)蒼術(shù)，茅蒼術(shù)(Atracylodes lancea)，茵陳蒿，桑(Morus alba)，蕺菜(Houttuynia cordata)，忍冬，旋復(fù)花(Inulajaponica)，歐亞旋復(fù)花，Paeonia albiflora，山芍藥(Paeonia japonica)，草芍藥(Paeonia obovata)，姜科(Curcuma domestica)，姜黃(Curcuma longa)，三白草，黑果越桔，懸鉤子屬植物，黃香草木犀(Melilotus officinalis)，Agelicagigantis，鼠尾草，白花丹參，闊葉土麥冬(Liriope Platyphylla)，姜，Ulmuscavidiana，大果榆(Ulmus macrocarpa)，山茶和葡萄。上述組合物可加到用于抗血管生成目的的藥物，準(zhǔn)藥物，食品或飲料中。
上述成分的抗血管生成活性也被如先前提及的HUVEC的管道形成所證實(shí)。與非處理的對(duì)照HUVEC相比，50μg/ml的每種組合物對(duì)管道形成的抑制是30-100％。例如百分比抑制分別是中國(guó)肉桂100％，關(guān)蒼術(shù)51.7％，茵陳蒿53％，桑53％，黑果越桔40％，蕺菜30％，和山芍藥(Paeoniajaponica)38％。
包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的稀釋劑，所述稀釋劑包括葡萄糖，麥芽糖糊精，鹽水，緩沖的鹽水，水，甘油，和乙醇，但不限制稀釋劑。適當(dāng)?shù)南♂寗┝杏赗emington’s Pharmaceutical Science的書(shū)面正文中(Mack Publishing co，Easton PA)。
可以任何形式制備包含蜂花屬植物葉提取物的制劑。該制劑可被制成可注射的制劑(純?nèi)芤?，混懸液或乳濁?，和優(yōu)選口服劑型(片劑，膠囊，軟膠囊，含水內(nèi)服藥，丸劑，顆粒)和局部制劑(油膏，帖片，噴霧劑，溶液等)。
本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物可通過(guò)各種途徑給藥。給藥的途徑包括口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下內(nèi)，肌肉，動(dòng)脈內(nèi)，透皮，直腸，鼻，眼睛和局部施用。
可按照疾病和給藥途徑不同地施用本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物?？梢岳斫饣钚猿煞值牧坑筛鞣N因素所決定。這些因素包括患者癥狀的嚴(yán)重程度，其它共同施用的藥物(如化學(xué)治療劑)，年齡，性別，個(gè)體患者的體重，食品，劑量給藥時(shí)間，給藥的選擇途徑，和組合物的比率。
蜂花屬植物葉提取物的日劑量?jī)?yōu)選5mg-2g，最優(yōu)選10-1000mg。通常，可以每天單一劑量或2-3分開(kāi)劑量的形式給藥0.1-200mg/kg蜂花屬植物葉提取物。
包含本發(fā)明蜂花屬植物葉提取物的化妝品組合物可用于治療光老化或皺紋。
下述實(shí)施例是意圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明。然而，所說(shuō)明的這些實(shí)施例僅是為了更好地理解本發(fā)明，而不是限制它的范圍。<實(shí)施例1>
蜂花屬植物葉提取物購(gòu)自Emil Flachsmann AG，用于下述實(shí)施例。<試驗(yàn)1>蜂花屬植物葉提取物對(duì)HUVEC的管道形成的影響在體外，用人內(nèi)皮細(xì)胞研究蜂花屬植物葉提取物對(duì)血管生成的影響。
為進(jìn)行管道形成試驗(yàn)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分離自剖腹產(chǎn)術(shù)后新鮮獲得的臍帶。培養(yǎng)細(xì)胞，并通過(guò)用抗因子VIII抗體染色的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。用25μg/ml的實(shí)施例1的上述蜂花屬植物葉提取物(EmilFlachsmann AG)處理與Matrigel(BD Bioscience，Bedford，MA，美國(guó))一同生長(zhǎng)的HUVEC，并在37℃進(jìn)一步孵育8-16小時(shí)。作為對(duì)照，不用蜂花屬植物葉提取物重復(fù)該程序。


圖1表示當(dāng)它們?cè)贛atrigel上生長(zhǎng)時(shí)，作為血管再生過(guò)程，形成管狀網(wǎng)絡(luò)。然而，如圖2所示，在Matrigel上HUVEC的微脈管網(wǎng)絡(luò)被蜂花屬植物葉提取物斷開(kāi)。
圖2是用25μg/ml的蜂花屬植物葉提取物處理的，在Matrigel上生長(zhǎng)的HUVEC，其表示微脈管網(wǎng)絡(luò)被斷開(kāi)。
用圖象分析程序Image-Pro Plus(Media Cybemetics，美國(guó))確定管道的面積，并歸納于表1。與未處理的對(duì)照相比，用蜂花屬植物葉提取物處理后管道形成被抑制約66％。
(表1)
<試驗(yàn)2>血管生成的動(dòng)物試驗(yàn)(小鼠Matrigel模型)
在小鼠Matrigel模型中定量研究蜂花屬植物葉提取物的抗血管生成活性。
將0.4ml與每個(gè)50ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和50單位/ml肝素混合的Matrigel通過(guò)皮下注射植入6-8周齡的C57BL/6雌性小鼠。3-5天后，從每只小鼠的離體皮膚去除Matrigel，用Drabkin試劑盒(Sigma Chemical Co.，St.Louise，MI，美國(guó)，目錄號(hào)525)，一種測(cè)定血液中總血色素的試劑，測(cè)量Matrigel中血色素(Hb)的水平。
用含實(shí)施例1的蜂花屬植物葉提取物(0.5mg)的Matrigel進(jìn)行相同的試驗(yàn)，并將處理組的血色素含量與對(duì)照組的血色素含量相比較。如圖3和表2所示，與對(duì)照組相比，處理組的血色素含量明顯降低。因此，血管生成被抑制約99％。
(表2)
為了測(cè)試口服給藥蜂花屬植物葉提取物對(duì)血管生成的活性，進(jìn)行下述試驗(yàn)。
將0.4ml含50ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和50單位/ml肝素的Matrigel通過(guò)皮下注射植入，并且每只鼠每天兩次口服給藥0.6mg蜂花屬植物葉提取物，給藥4天。在第5天，去除Matrigel，并確定Matrigel中的血色素量。
如圖4和表3所示，蜂花屬植物葉提取物處理的組顯示在Matrigel更低水平的血色素，約為對(duì)照組的71％。因此，當(dāng)口服給藥時(shí)，蜂花屬植物葉提取物也顯示抗血管生成活性。
(表3)
<試驗(yàn)3>用絨膜尿囊膜試驗(yàn)(CAM試驗(yàn))進(jìn)行血管生成分析將受精的雞蛋放置在37℃濕潤(rùn)的孵育箱中。孵育3天后，用26-規(guī)格針頭的注射器從雞蛋中抽出2-3ml的白蛋白，并用透明帶密封雞蛋。在雞蛋的末端打一個(gè)小孔的窗戶。兩天后，將溶解在15μl鹽水中的50μg蜂花屬植物葉提取物的等分試樣施用到滅菌的Thermanox圓盤(pán)(MilesScientific)上，并空氣干燥。通過(guò)窗戶將圓盤(pán)施用到絨膜尿囊膜表面，并用透明膠帶封口。在濕潤(rùn)的孵育箱中37℃將雞胚繼續(xù)孵育三天。用26-規(guī)格的針向胚絨膜尿囊中注入適當(dāng)體積的類(lèi)脂乳劑，使絨膜尿囊膜的血管網(wǎng)絡(luò)在白色的類(lèi)脂背景下顯現(xiàn)出來(lái)。作為對(duì)照，用15μl的生理鹽水代替蜂花屬植物葉提取物施用到圓盤(pán)上，接著重復(fù)上述相同的程序。觀察得到的血管，并與處理的雞蛋相比較。
在對(duì)照組(n＝20)，在90％的胚胎中，毛細(xì)血管的形成不受影響(圖5a)，而在用蜂花屬植物葉提取物處理的圓盤(pán)(圖片中較亮的部分)中，血管形成的抑制是明顯的，在所用處理雞蛋中觀察絨膜尿囊的血管形成的抑制(n＝15，100％，圖5b)。<試驗(yàn)4>蜂花屬植物葉提取物與銀杏提取物聯(lián)合處理對(duì)血管生成抑制的影響小鼠在Matrigel模型中研究蜂花屬植物葉提取物與其它組合物共處理對(duì)血管生成抑制的影響。
將0.4ml含50ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和50單位/ml肝素的Matrigel通過(guò)皮下注射植入，并且每天兩次口服給藥1.0mg蜂花屬植物葉提取物和0.5mg銀杏提取物，給藥4天。
在另一組中，對(duì)小鼠給藥較低劑量的蜂花屬植物葉提取物和銀杏提取物的合并組合物，所述劑量為先前合并組合物(0.2mg的蜂花屬植物和0.1mg的銀杏)劑量的1/5。
確定Matrigel中血色素的量，并將結(jié)果與未處理對(duì)照組相比較。如同表4中所歸納的，處理組Matrigel中總的血色素水平的平均值約為對(duì)照組的10-18％。合并處理的血管生成的百分比抑制為82-90％，其比單獨(dú)的蜂花屬植物葉提取物的百分比抑制高。
(表4)
<試驗(yàn)5>蜂花屬植物葉提取物與其它組合物聯(lián)合處理對(duì)癌癥轉(zhuǎn)移的抑制將B16BL6細(xì)胞(5×104)通過(guò)尾靜脈注入6-7周齡的C57BL/6雄性小鼠。其后，通過(guò)口服給藥對(duì)小鼠每天給藥0.2ml水或藥物組合物，給藥3周。注射3周后，處死小鼠，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)肺表面腫瘤克隆的數(shù)目。處理組小鼠肺中黑素瘤克隆的平均數(shù)小于對(duì)照小鼠的平均數(shù)。單一藥物處理組中，轉(zhuǎn)移的百分比抑制是37-38％，而在聯(lián)合處理組中，轉(zhuǎn)移的百分比抑制降至50-54％(表5)。
即，蜂花屬植物葉提取物與其它血管生成抑制劑的聯(lián)合處理比單獨(dú)的蜂花屬植物葉更有效。
(表5)
<實(shí)施例2>(1)MMP制劑利用桿狀病毒系統(tǒng)，從昆蟲(chóng)細(xì)胞(Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞)克隆并制備MMP-1，MMP-2和MMP-9。
將MMP-2cDNA(GENEBANK No.XM_048244)克隆到pBlueBac4.5轉(zhuǎn)移載體(Invitrogen，Cat no.V1995-20)上，然后用Bac-N-Blue轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen，目錄號(hào)K855-01)轉(zhuǎn)染到Sf21細(xì)胞中。用含10％胎牛血清的TNM-FH(Sigma，St.Louis，MO，美國(guó))培養(yǎng)基在27℃下孵育Sf21細(xì)胞，然后收獲細(xì)胞并以107細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮。室溫下，用含克隆基因的病毒孵育細(xì)胞混懸液1小時(shí)。被感染的Sf21細(xì)胞生長(zhǎng)72小時(shí)，并回收培養(yǎng)基。從回收的培養(yǎng)基中用明膠-瓊脂糖親和柱純化MMP-2。
如前所述，從相應(yīng)的基因制備MMP-1(GENEBANK NO.XM 040735)和MMP-9(GENEBANK NO.XM 009491)。用SP-瓊脂糖純化MMP-1，用明膠-瓊脂糖親和層析純化MMP-9。(2)MMP活性的抑制為了研究蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP的抑制，用分光熒光測(cè)定法(Perkin-Elmer LS50B)分析MMP酶活性。
分析前，用1mM的APMA活化后，純化的MMP-1，MMP-2和MMP-9可被使用。
MMP-1和MMP-9的底物是2，4-二硝基苯基-脯氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-色氨酸-丙氨酸-精氨酸(序列號(hào)1)，Mca-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-Dap(Dnp)-丙氨酸-精氨酸-NH2(序列號(hào)2BACHEM，目錄號(hào)M-1895)用作MMP-2的底物。
作為對(duì)照，在2ml試管中，在2ml反應(yīng)緩沖液(50mM Tricine(pH7.5)，10mM CaCl2，200mM NaCl)中混合10nM MMP-1和1μM底物(序列號(hào)1)。在280nm激發(fā)波長(zhǎng)和360nm發(fā)射波長(zhǎng)下，用分光熒光計(jì)在室溫下，每2分鐘測(cè)量熒光強(qiáng)度，測(cè)量20分鐘。
將溶解在水和10nM MMP-1中的蜂花屬植物葉提取物(25μg/ml)加到含底物的反應(yīng)緩沖液中，并以相同的方式測(cè)量熒光強(qiáng)度。
同樣分析MMP-2或MMP-9的活性，并如前所述測(cè)量熒光強(qiáng)度。
圖6，7和8是MMP-1，MMP-2和MMP-9活性的圖。如圖6所示，蜂花屬植物葉提取物抑制57％的MMP-1活性。蜂花屬植物葉提取物對(duì)MMP-2和MMP-9的抑制分別為71％(圖7)和73％(圖8)。
如前所述，本發(fā)明的蜂花屬植物葉提取物抑制血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶活性?；诖?，蜂花屬植物葉提取物可用作一種新的治療或預(yù)防血管生成-和/或MMP-依賴性疾病的組合物。
序列表<110>血管實(shí)驗(yàn)室公司<120>具有抗血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物<130>01PP101<150>KR 2000-75488<151>2000-12-12<150>KR 2001-8470<151>2001-02-20<150>KR 2001-77392<151>2001-12-07<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>第1位脯氨酸是2，4-二硝基苯基脯氨酸<400>1Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg1 5<210>2<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>第1位脯氨酸是(7-甲氧基香豆素-4-基)乙?；彼幔?位亮氨酸是N-3-(2，4-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙?；涟彼幔?位精氨酸被胺化。<400>2Pro Leu Gly Leu Ala Arg1 權(quán)利要求
1.一種用于抑制血管生成的含有蜂花屬植物葉提取物的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種選自下述物質(zhì)的成分銀杏提取物，噻氯匹定，葡糖胺和七葉樹(shù)屬植物提取物，洋甘草，中國(guó)肉桂，槐，關(guān)蒼術(shù)，茅蒼術(shù)，茵陳蒿，桑，蕺菜，忍冬，旋復(fù)花，歐亞旋復(fù)花，Paeonia albiflora，山芍藥，草芍藥，姜科，姜黃，三白草，黑果越桔，懸鉤子屬植物，黃香草木犀，Agelica gigantis，鼠尾草，白花丹參，闊葉土麥冬，姜，Ulmus cavidiana，大果榆，山茶和葡萄。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述組合物是用于抑制血管生成的藥物組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述組合物是用于抑制血管生成的食品組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述組合物是用于預(yù)防和/或治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，糖尿病性視網(wǎng)膜病，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，新生血管性青光眼，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑，黃斑變性，翼狀胬肉，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，牛皮癬，毛細(xì)管擴(kuò)張，膿性肉芽腫，皮脂溢性皮炎和痤瘡和關(guān)節(jié)炎。
6.一種用于抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中所述組合物另外包含至少一種選自下述物質(zhì)的成分銀杏提取物，噻氯匹定，葡糖胺和七葉樹(shù)屬植物提取物，洋甘草，中國(guó)肉桂，槐，關(guān)蒼術(shù)，茅蒼術(shù)，茵陳蒿，桑，蕺菜，忍冬，旋復(fù)花，歐亞旋復(fù)花，Paeonia albiflora，山芍藥，草芍藥，姜科，姜黃，三白草，黑果越桔，懸鉤子屬植物，黃香草木犀，Agelica gigantis，鼠尾草，白花丹參，闊葉土麥冬，姜，Ulmus cavidiana，大果榆，山茶和葡萄。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的藥物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的食品組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性的化妝品組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求6或7的組合物，其中所述組合物用于治療至少一種選自下述之一的疾病癌癥轉(zhuǎn)移，動(dòng)脈粥樣硬化，再狹窄，MMP依賴性骨病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥，阿爾茨海默氏病，皮膚老化，角膜潰瘍，粘連，骨疾病，蛋白尿，腹部主動(dòng)脈瘤，消退的軟骨損傷，有髓神經(jīng)損傷，肝纖維化，nephrogromerula病，胚膜破裂，炎性腸疾病，齦炎/牙周炎，老年性黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病，增生性玻璃體視網(wǎng)膜病，未完全發(fā)育的視網(wǎng)膜病，眼睛炎癥，圓錐形角膜，斯耶格倫綜合癥，近視，眼腫瘤，角膜植入的排斥，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)炎或膿毒性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含蜂花屬植物葉提取物的組合物，其抑制血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶活性。本發(fā)明的蜂花屬植物葉提取物抑制血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，因此，它可用于治療或預(yù)防與血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)的疾病。本發(fā)明的包含蜂花屬植物葉提取物的組合物也可包含多于一種的其它抗血管生成，抗癌，抗炎和抗老化成分的成分。這種包含蜂花屬植物葉提取物的具體組合物可用于藥物，飲食和/或化妝品用途。
文檔編號(hào)A61K36/16GK1477967SQ01819488
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月12日
發(fā)明者金敏英, 樸秉泳, 文昶喜, 樸殷圭, 金京美 申請(qǐng)人:血管實(shí)驗(yàn)室公司, 金敏英