專利名稱：核酸佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，廣泛涉及核酸免疫技術(shù)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及編碼佐劑的多核苷酸，和應(yīng)用這些多核苷酸的免疫策略。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域已描述為了抗表達(dá)產(chǎn)物的免疫目的，將DNA和mRNA注射入哺乳動(dòng)物組織中的技術(shù)。該技術(shù)，本文命名為“核酸免疫”，已顯示了誘導(dǎo)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。例如，已顯示用編碼包膜糖蛋白，gp160的DNA構(gòu)建體免疫小鼠的血清在免疫測(cè)定中與重組gp160反應(yīng)，并且，注射小鼠的淋巴細(xì)胞顯示了增殖以應(yīng)答重組gp120。Wang等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA904156-4160。類似地，用人生長(zhǎng)激素(hGH)基因免疫的小鼠證實(shí)了基于抗體的免疫應(yīng)答。Tang等(1992)Nature356152-154。肌肉注射由哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼流感核蛋白的DNA已顯示了誘導(dǎo)CD8+CTL應(yīng)答，其可保護(hù)小鼠免受后續(xù)病毒致死性攻擊。Ulmer等(1993)Science2591745-1749。注射位點(diǎn)的免疫組織化學(xué)研究揭示成髓細(xì)胞吸收DNA，并且病毒蛋白的胞質(zhì)生產(chǎn)可以顯示至少6個(gè)月。
發(fā)明概述本發(fā)明的主要目的是提供一種含有第一和第二核酸序列的多核苷酸佐劑組合物，其中第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亞基編碼區(qū)，第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亞基編碼區(qū)。每個(gè)截短的亞基編碼區(qū)具有5’缺失，并且編碼不具氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽。
第一和第二核酸序列可在相同或不同的核酸構(gòu)建體中存在。截短的亞基編碼區(qū)可獲自或來(lái)源于相同的細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素，并且在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素是霍亂毒素(CT)或大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。此外，至少一個(gè)截短的亞基編碼區(qū)可被基因修飾以除去由其編碼的亞基肽的毒性，例如，其中截短的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以破壞或失活亞基肽表達(dá)產(chǎn)物中的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是提供一種含有第一和第二核酸序列的多核苷酸佐劑組合物，其中第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的修飾的A亞基編碼區(qū)，第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的B亞基編碼區(qū)。所述修飾的A亞基編碼區(qū)和B亞基編碼區(qū)分別編碼成熟亞基肽，并且修飾的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以缺失由其編碼的C-末端KDEL或亞基肽的RDEL基序(motif)。
如上所述，第一和第二核酸序列可在相同或不同的核酸構(gòu)建體中存在。截短的亞基編碼區(qū)可獲自或來(lái)源于相同的細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素，并且在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素是霍亂毒素(CT)或大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。此外，至少一個(gè)截短的亞基編碼區(qū)可被基因修飾以除去由其編碼的亞基肽的毒性，例如，其中截短的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以破壞或失活亞基肽表達(dá)產(chǎn)物中的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
在本發(fā)明的某些方面，可以通過(guò)粒子形式提供上述組合物，例如，其中組合物是適合以粒子遞送設(shè)備遞送的粒子。在這方面，本組合物可包被至相同或不同的核心載體粒子上，從而適于使用粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)遞送。優(yōu)選核心載體粒子的平均直徑約為0.1-10μm，并且可以包含金屬，例如金。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供負(fù)載有(例如，含有)如本文所述的粒子組合物的粒子遞送設(shè)備。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是提供組合物在制造藥劑的應(yīng)用，所述組合物含有第一和第二核酸序列，其中每個(gè)序列包含ADP-核糖基化外毒素亞基的編碼區(qū)，所述藥劑用于提高脊椎動(dòng)物個(gè)體抗所述個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答。通過(guò)給所述個(gè)體施用目的抗原和組合物，因此，表達(dá)由第一和第二核酸序列編碼的毒素亞基，其量足以誘導(dǎo)對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。第一核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亞基編碼區(qū)，第二核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亞基編碼區(qū)，但條件是每個(gè)截短的亞基編碼區(qū)具有5’缺失，并且編碼不具氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽。
本發(fā)明相關(guān)的主要目是提供用于提高抗個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答的方法。該方法通常需要(a)給所述個(gè)體施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐劑組合物，其中第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亞基編碼區(qū)，第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亞基編碼區(qū)；和(c)給所述個(gè)體施用佐劑組合物，藉此通過(guò)引入到所述個(gè)體，表達(dá)第一和第二核酸序列，以提供足夠量的亞基肽來(lái)誘導(dǎo)提高的抗目的抗原的免疫應(yīng)答。截短亞基編碼區(qū)的原因在于每個(gè)亞基編碼區(qū)具有5’缺失，并且編碼不具氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽。
本發(fā)明還有一個(gè)主要目的是提供組合物在制造藥劑的應(yīng)用，所述組合物含有第一和第二核酸序列，其中每個(gè)序列包含細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素亞基的編碼區(qū)，所述藥劑用于提高脊椎動(dòng)物個(gè)體抗所述個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答。通過(guò)給所述個(gè)體施用目的抗原和組合物，因此，表達(dá)由第一和第二核酸序列編碼的毒素亞基，其量足以誘導(dǎo)提高的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。第一核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的修飾的A亞基編碼區(qū)，第二核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的B亞基編碼區(qū)，但條件是修飾的A亞基和B亞基編碼區(qū)分別編碼成熟亞基肽，并且進(jìn)一步條件是修飾的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以缺失由其編碼的亞基肽的C-末端KDEL或RDEL基序。
本發(fā)明相關(guān)的主要目是提供用于提高抗個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答的方法。該方法通常需要(a)給所述個(gè)體施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐劑組合物，其中第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的修飾的A亞基，第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的B亞基編碼區(qū)；和(c)給所述個(gè)體施用佐劑組合物，藉此通過(guò)引入到所述個(gè)體，表達(dá)第一和第二核酸序列，以提供足夠量的亞基肽來(lái)誘導(dǎo)提高的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。修飾亞基編碼區(qū)的原因在于它們分別編碼成熟亞基肽，但是已基因修飾A亞基編碼區(qū)以缺失由其編碼的亞基肽的C-末端KDEL或RDEL基序。
在本發(fā)明應(yīng)用和方法中，施用佐劑組合物需要用本發(fā)明多核苷酸佐劑組合物轉(zhuǎn)染個(gè)體細(xì)胞。含有本發(fā)明核酸分子的表達(dá)盒子和/或載體可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而且在允許個(gè)體中亞基肽表達(dá)的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)染。該方法可以進(jìn)一步需要給個(gè)體施用至少一個(gè)第二組合物的步驟。
在免疫期間可以在體內(nèi)或離體進(jìn)行轉(zhuǎn)染過(guò)程(例如，在進(jìn)行次級(jí)免疫步驟前獲得隨后被引入個(gè)體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。當(dāng)應(yīng)用體內(nèi)轉(zhuǎn)染時(shí)，可以通過(guò)肌肉或真皮內(nèi)注射質(zhì)粒DNA的方法給個(gè)體施用核酸分子，優(yōu)選地，利用粒子介導(dǎo)的遞送技術(shù)給個(gè)體施用?？梢砸匀魏芜m合的疫苗組合物形式，例如肽亞基組合物的形式，核酸疫苗組合物的形式，或整體或分裂的病毒流感疫苗組合物的形式提供疫苗組合物(含有目的抗原)。
在一些方法中，給個(gè)體的相同位點(diǎn)施用目的抗原和佐劑組合物。例如，可以同時(shí)施用佐劑組合物和目的抗原(例如，在單一疫苗組合物中提供)。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，以粒子形式施用佐劑和，可選地目的抗原，例如其中佐劑組合物包被在核心載體粒子上，而且用粒子介導(dǎo)的遞送技術(shù)遞送給個(gè)體。
在這些方法中，優(yōu)選本發(fā)明多核苷酸佐劑組合物的施用引起增加的抗共施用目的抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答。該提高的免疫應(yīng)答通常可以以增加的產(chǎn)生干擾素的CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞效價(jià)，增加的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性，和抗目的抗原的T輔助性1-類似免疫應(yīng)答(Th1)(以增加的通常與細(xì)胞免疫(例如，IgG2a)有關(guān)的亞類的抗原特異性抗體的效價(jià)，常常伴隨通常與體液免疫(例如，IgG1)有關(guān)的亞類的抗體效價(jià)的降低為特征)為特征，而不是T輔助性2-類似免疫應(yīng)答(Th2)。T輔助性2-類似免疫應(yīng)答(Th2)就像當(dāng)用細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素佐劑，如CT或LT免疫個(gè)體時(shí)通常產(chǎn)生的那樣。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)包括，但不限于本發(fā)明佐劑組合物提供顯著佐劑效果和因此提高免疫個(gè)體中共施用抗原免疫原性的能力，還包括有助于抗共施用抗原的Th1樣免疫應(yīng)答的能力，共施用抗原在疫苗產(chǎn)品中是有益的。
鑒于本文的公開(kāi)，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將容易想到本發(fā)明的這些和其它目的，方面，實(shí)施方式和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是質(zhì)粒pPJV2002的限制圖譜和功能圖譜，該質(zhì)粒含有霍亂毒素(CT)亞基A(CTA)肽截短的編碼序列，其中該質(zhì)粒進(jìn)一步含有人巨細(xì)胞病毒(hCMV)立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列，及允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌截短的CTA表達(dá)產(chǎn)物的人組織血纖蛋白溶酶原激活體信號(hào)肽的編碼序列。該圖進(jìn)一步包含pPJV2002質(zhì)粒的完整核酸序列(SEQ IDNO1)。
圖2是質(zhì)粒pPJV2003的限制圖譜和功能圖譜，該質(zhì)粒含有霍亂毒素(CT)亞基B(CTB)肽截短的編碼序列，其中該質(zhì)粒進(jìn)一步含有hCMV立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列，及允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌截短的CTB表達(dá)產(chǎn)物的人組織血纖蛋白溶酶原激活體信號(hào)肽的編碼序列。該圖進(jìn)一步包含pPJV2003質(zhì)粒的完整核酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3是質(zhì)粒pPJV2006的限制圖譜和功能圖譜，該質(zhì)粒含有CTA肽截短的編碼序列，其中進(jìn)一步修飾截短的CTA編碼序列以缺失其編碼的亞基肽中C-末端KDEL基序。質(zhì)粒進(jìn)一步含有hCMV立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列，及允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌截短的CTA表達(dá)產(chǎn)物的人組織血纖蛋白溶酶原激活體信號(hào)肽的編碼序列。該圖進(jìn)一步包含pPJV2006質(zhì)粒的完整核酸序列(SEQ ID NO3)。
圖4是質(zhì)粒pPJV2004的限制圖譜和功能圖譜，該質(zhì)粒含有大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)亞基A(LTA)肽截短的編碼序列，其中該質(zhì)粒進(jìn)一步含有hCMV立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列，及允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌截短的LTA表達(dá)產(chǎn)物的人組織血纖蛋白溶酶原激活體信號(hào)肽的編碼序列。該圖進(jìn)一步包含pPJV2004質(zhì)粒的完整核酸序列(SEQ ID NO4)。
圖5是質(zhì)粒pPJV2005的限制圖譜和功能圖譜，該質(zhì)粒含有LT亞基B(LTB)肽截短的編碼序列，其中該質(zhì)粒進(jìn)一步含有hCMV立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列，及允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌截短的LTB表達(dá)產(chǎn)物的人組織血纖蛋白溶酶原激活體信號(hào)肽的編碼序列。該圖進(jìn)一步包含pPJV2005質(zhì)粒的完整核酸序列(SEQ ID NO5)。
圖6是質(zhì)粒pPJV2007的限制圖譜和功能圖譜，該質(zhì)粒含有LTA肽截短的編碼序列，其中截短的LTA編碼區(qū)被進(jìn)一步修飾以缺失其編碼的亞基肽中C-末端RDEL基序。該質(zhì)粒進(jìn)一步含有hCMV立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列，及允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌截短的LTA表達(dá)產(chǎn)物的人組織血纖蛋白溶酶原激活體信號(hào)肽的編碼序列。該圖進(jìn)一步包含pPJV2007質(zhì)粒的完整核酸序列(SEQ ID NO6)。
圖7描述了實(shí)施例5中進(jìn)行的ELISA結(jié)果。矩形圖表示接受下述制劑的動(dòng)物中出現(xiàn)的抗gp120抗體的對(duì)數(shù)倒數(shù)效價(jià)，在圖中從左到右，含有空pWRG7504載體(“EmpVec”)的制劑#1；含有EmpVec(pWRG7054)和pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#2；含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的EmpVec(pWRG7054)的制劑#3；含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#4；含有與pPJV2006和pPJV2003佐劑載體(“CTA-KDEL/B”)聯(lián)合的pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)制劑#5；或無(wú)疫苗和/或佐劑組合物(首次用于試驗(yàn)的)。
圖8描述了實(shí)施例5中進(jìn)行的原位ELISA結(jié)果。矩形圖表示接受下述制劑的動(dòng)物脾細(xì)胞中g(shù)p120特異性IFN-γ產(chǎn)生的相對(duì)水平，圖中從左到右，含有空pWRG7504載體(“EmpVec”)的制劑#1；含有EmpVec(pWRG7054)和pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#2；含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的EmpVec(pWRG7054)的制劑#3；含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#4；或含有與pPJV2006和pPJV2003佐劑載體(“CTA-KDEL/B”)聯(lián)合的pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#5。
圖9描述了實(shí)施例5中進(jìn)行的ELISPOT測(cè)定法的結(jié)果。矩形圖表示接受下述制劑的動(dòng)物中產(chǎn)生IFN-γ的脾細(xì)胞的相對(duì)水平，圖中從左到右，含有空pWRG7504載體(“EmpVec”)的制劑#1；含有EmpVec(pWRG7054)和pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#2；含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的EmpVec(pWRG7054)的制劑#3；含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#4；或含有與pPJV2006和pPJV2003佐劑載體(“CTA-KDEL/B”)聯(lián)合的pCIA-EnvT質(zhì)粒(“gp120”)的制劑#5。
圖10描述了實(shí)施例6中進(jìn)行的ELISA結(jié)果。在圖中，幾何平均吸光度值表示在血清樣品(以四個(gè)不同稀釋度)中出現(xiàn)的抗HBcAg抗體的效價(jià)，所述的血清樣品在加強(qiáng)免疫時(shí)(本研究的第6周)，接受下述制劑的動(dòng)物中采集的，或是含有HBcAg/HBsAg載體質(zhì)粒(pWRG7193)的制劑#1；或是含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的HBcAg/HBsAg載體質(zhì)粒(pWRG7193)的制劑#2。
圖11描述了實(shí)施例6中進(jìn)行的ELISA結(jié)果。在圖中，幾何平均吸光度值表示在血清樣品(以四個(gè)不同稀釋度)中出現(xiàn)的抗HBcAg抗體的效價(jià)，所述的血清樣品在加強(qiáng)免疫后2周(本研究的第8周)，從接受下列制劑的動(dòng)物中采集的，或是含有HBcAg/HBsAg載體質(zhì)粒(pWRG7193)的制劑#1；或是含有與pPJV2002和pPJV2003佐劑載體(“CTA/B”)聯(lián)合的HBcAg/HBsAg載體質(zhì)粒(pWRG7193)的制劑#2。
圖12描述了實(shí)施例7中進(jìn)行的ELISA結(jié)果。矩形圖表示接受下列制劑的每個(gè)免疫組的1og IgG1IgG2a比率，在圖中從左到右，含有與空載體質(zhì)粒對(duì)照(pWRG7054)聯(lián)合的pM2-FL質(zhì)粒(“M2”)的制劑#1；含有與pPJV2002和pPJV2003 CTA/B佐劑載體(“M2+CT”)聯(lián)合的pM2-FL質(zhì)粒的制劑#2；或含有與pPJV2004和pPJV2005 LTA/B佐劑載體(“M2+LT”)聯(lián)合的pM2-FL質(zhì)粒的制劑#2。
圖13A-13D描述了在實(shí)施例8的第一次研究中用于評(píng)估對(duì)肝炎B病毒表面和核心抗原免疫應(yīng)答的IFN-γ和IL4 ELISPOT測(cè)定法的結(jié)果。矩形圖表示各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中每1×105脾臟細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。
圖14描述了實(shí)施例9中進(jìn)行的HSV-2病毒攻擊研究的存活結(jié)果。
發(fā)明詳述詳述本發(fā)明前，可以理解本發(fā)明不限于本身的特定示例性分子或過(guò)程參數(shù)，因?yàn)楫?dāng)然，所述分子或過(guò)程參數(shù)可以變化。用在本文的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述本發(fā)明特定實(shí)施方式的目的，而不意味限制本發(fā)明，這也是可以理解的。此外，除非另外說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)踐將利用所有本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)的病毒學(xué)，微生物學(xué)，分子生物學(xué)，重組DNA技術(shù)和免疫學(xué)的常規(guī)方法。文獻(xiàn)中全面解釋了這些技術(shù)。參見(jiàn)，例如Sambrook，等，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；DNA CloningA Practical Approach，vol.I & II(D.Glover，ed.)OligonucleotideSynthesis(N.Gait，ed.，1984)；A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；和Fundamental Virology，第二版，vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.)。
因此無(wú)論上文和下文，本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都整體并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。
必需注意，除了內(nèi)容清楚規(guī)定外，在本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所用的單數(shù)形式“一種”或“一個(gè)”和“所述”或“該”等冠詞包括復(fù)數(shù)對(duì)象。
定義除了另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常的理解具有相同的含意。盡管與本文所述類似或等同的大量方法和材料可以用于本發(fā)明實(shí)踐中，但是本文描述了優(yōu)選的材料和方法。
在描述本發(fā)明中，將用到下面的術(shù)語(yǔ)，而且按如下所述定義這些術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“佐劑”意指能特異或非特異改變，提高，定向，重新定向，加強(qiáng)或起始抗原特異性免疫應(yīng)答的任何材料和組合物。因此，佐劑和抗原的共施用可以導(dǎo)致在施用抗原的個(gè)體中，達(dá)到期望免疫應(yīng)答必需的較低或較少劑量，或共施用在個(gè)體中可以引起定性和/或定量不同的免疫應(yīng)答。通過(guò)給動(dòng)物施用佐劑和疫苗組合物，同時(shí)單獨(dú)施用疫苗組合物，并且用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法，如放射免疫測(cè)定法，ELISAs，CTL測(cè)定法等等本領(lǐng)域已知測(cè)定法比較兩個(gè)組中的抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，可以測(cè)定佐劑的有效性。通常，在疫苗組合物中，盡管單一分子可以有佐劑和抗原兩種特性，但是佐劑是與抗原分離的單獨(dú)部分。
“佐劑組合物”意指任何含有佐劑的藥物組合物?？梢酝ㄟ^(guò)任何適合的藥物形式，例如作為液體，粉末，乳膏，洗液，乳劑，凝膠或類似形式遞送佐劑組合物，通過(guò)本發(fā)明方法遞送佐劑組合物。然而，優(yōu)選的佐劑組合物將是粒子形式。盡管沒(méi)有經(jīng)常明確說(shuō)明，但是傾向于與野生型或純化肽或化學(xué)佐劑具有類似生物活性的分子。
術(shù)語(yǔ)“肽”所用的是其最廣泛的意義，指兩個(gè)或多個(gè)亞基氨基酸、氨基酸類似物或其它肽聚模擬物(peptidomimetics)。可以通過(guò)肽鍵或通過(guò)其它鍵，例如酯，醚等連接亞基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指或天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光學(xué)異構(gòu)體，和氨基酸類似物和肽聚模擬物。如果肽鏈短，三個(gè)和多個(gè)氨基酸通常稱為“寡肽”。如果肽鏈長(zhǎng)，肽通常指“多肽”或“蛋白質(zhì)”。
“抗原”指任何試劑，通常是能誘導(dǎo)個(gè)體免疫應(yīng)答的大分子。術(shù)語(yǔ)可以用于指單獨(dú)大分子或抗原大分子的同質(zhì)或異質(zhì)群。如本文所用，“抗原”通常用于指含有一個(gè)或多個(gè)抗原表位的肽或碳水化合物分子。對(duì)于本發(fā)明目的而言，可以從任何適合來(lái)源獲得或得到抗原。而且，對(duì)于本發(fā)明目的而言，只要肽保持足夠的免疫原性，“抗原”包含有修飾的肽，如對(duì)天然序列的缺失，添加和置換(通常在天然存在時(shí)是保守的)。這些修飾可以是有意的，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變，或可以是偶然的，如通過(guò)產(chǎn)生抗原的宿主突變。
抗目的抗原的“免疫應(yīng)答”是個(gè)體中對(duì)該抗原的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的發(fā)展。對(duì)于本發(fā)明目的而言，“體液免疫應(yīng)答”指通過(guò)抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而“細(xì)胞免疫應(yīng)答”是通過(guò)T-淋巴細(xì)胞和/或其它白血細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
術(shù)語(yǔ)“核酸免疫”用在本文指引入宿主細(xì)胞編碼一個(gè)或多個(gè)選定抗原的核酸分子進(jìn)行一個(gè)抗原或許多抗原的體內(nèi)表達(dá)。術(shù)語(yǔ)也包含引入宿主細(xì)胞編碼一個(gè)或多個(gè)選定佐劑的核酸分子進(jìn)行一個(gè)佐劑或許多佐劑的體內(nèi)表達(dá)。如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)肌肉或真皮內(nèi)注射；經(jīng)皮的粒子遞送；吸入；局部地，或通過(guò)口、鼻內(nèi)或粘膜施用方式，可以直接引入核酸分子進(jìn)入受體個(gè)體?？蛇x的方案，在離體條件下，可以引入分子進(jìn)入從個(gè)體分離的細(xì)胞。在后一種情況下，再引入含有目的核酸分子的細(xì)胞進(jìn)入個(gè)體，因此可以增加抗核酸分子編碼抗原的免疫應(yīng)答，或因此核酸分子編碼的佐劑可以發(fā)揮其佐劑作用。
術(shù)語(yǔ)“核酸分子”和“多核苷酸”在本文是互換使用的，指任何長(zhǎng)度核苷酸(或脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可以有任何三維結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)行任何已知或未知的功能。多核苷酸非限制性的例子包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸，分支多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。
多核苷酸通常由四個(gè)核苷酸堿基腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥(niǎo)嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(當(dāng)多核苷酸是RNA時(shí)，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))的特異序列組成。因此，術(shù)語(yǔ)核酸序列是多核苷酸分子的字母表示。可以在有中央處理單元計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入該字母表示，并且用于生物信息學(xué)應(yīng)用，如功能基因組學(xué)和同源性檢索。
“載體”能轉(zhuǎn)移核酸序列到靶細(xì)胞(例如，病毒載體、非病毒載體、粒子載體和脂質(zhì)體)。通常，“載體構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”、和“基因轉(zhuǎn)移載體”指能引導(dǎo)目的基因表達(dá)的任何核酸構(gòu)建體，而且其能轉(zhuǎn)移基因到靶細(xì)胞。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)載體及病毒載體?！百|(zhì)?！笔侨旧w外遺傳成分形式的載體。
“編碼”選定佐劑和/或抗原的核酸序列是核酸分子，當(dāng)該核酸分子置于合適調(diào)節(jié)序列控制時(shí)，其在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄(DNA情況下)和翻譯(RNA情況下)成多肽。由5’-(氨基)末端的起始密碼子和3’-(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定編碼序列的范圍。對(duì)于本發(fā)明目的而言，該核酸序列可以包括，但不限于病毒的cDNA、原核或真核mRNA、病毒或原核DNA或RNA的基因組序列、甚至是合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可以位于編碼序列的3’端。
“啟動(dòng)子”是起始和調(diào)節(jié)編碼多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。啟動(dòng)子可以包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(其中分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo)可操作地與啟動(dòng)子連接的多核苷酸序列的表達(dá))，阻抑型啟動(dòng)子(其中分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等阻抑可操作地與啟動(dòng)子連接的多核苷酸序列的表達(dá))，及組成型啟動(dòng)子。傾向術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“控制元件”包括全長(zhǎng)啟動(dòng)子區(qū)域和這些區(qū)域的功能(例如，控制轉(zhuǎn)錄或翻譯)片段。
“可操作地連接”指元件的排列，其中裝配所述組分以進(jìn)行其通常的功能。因此，當(dāng)適合的酶存在時(shí)，可操作地與核酸序列連接的特定啟動(dòng)子能影響該序列的表達(dá)。只要啟動(dòng)子起到引導(dǎo)序列表達(dá)的功能，啟動(dòng)子不需要與序列鄰接。因此，例如，可以在啟動(dòng)子序列和核酸序列間存在間插的非翻譯但轉(zhuǎn)錄序列，仍然可以認(rèn)為啟動(dòng)子序列“可操作地連接”編碼序列。
“重組體”在本文用于描述基因組、cDNA、半合成或合成來(lái)源的核酸分子(多核苷酸)，利用其來(lái)源或操作，其與其天然相關(guān)的全部或部分多核苷酸無(wú)關(guān)，和/或與其天然所連接的多核苷酸以外的多核苷酸連接。當(dāng)單個(gè)重組核酸分子中含有的兩個(gè)核酸序列在天然存在時(shí)，通常相互不相關(guān)時(shí)，這兩個(gè)核酸序列相互是“異源的”。
“分離的多核苷酸”是來(lái)源于整個(gè)生物體的單獨(dú)和分離的核酸分子，在天然存在時(shí)，該分子是在整個(gè)生物體中發(fā)現(xiàn)的；或是缺少與其天然存在時(shí)，通常相關(guān)序列的全部或部分的核酸分子；或是天然存在的序列，但該序列有與其相關(guān)的異源序列(如下所定義)。如果序列和來(lái)源分子區(qū)域、其cDNA、其互補(bǔ)序列有相同或基本相同的堿基對(duì)序列，或如果如下所述其顯示了序列同一性，那么序列是“來(lái)源于或獲自”所述分子。
檢測(cè)核酸和氨基酸“序列同一性”或“序列同源性”的技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的。通常，該技術(shù)包括檢測(cè)基因的mRNA核苷酸序列和/或檢測(cè)由其編碼的氨基酸序列，和比較這些序列與第二核苷酸序列或氨基酸序列。通常，“同一性”分別指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸對(duì)應(yīng)。可以通過(guò)檢測(cè)它們的“同一性百分比”比較兩個(gè)或多個(gè)序列(多核苷酸或氨基酸)。無(wú)論核酸或氨基酸序列，兩個(gè)序列的同一性百分比是兩個(gè)比對(duì)序列間的精確匹配數(shù)除以較短序列的長(zhǎng)度，乘以100。Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics2482-489(1981)的局部同源性算法提供了用于核酸序列的適合的比對(duì)。通過(guò)用Dayhoff，(Atlas of Protein Sequences and Structure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3353-358，National Biomedical ResearchFoundation，華盛頓，美國(guó))開(kāi)發(fā)及Gribskov，(Nucl.Acids Res.14(6)6745-6763(1986))標(biāo)準(zhǔn)化的記分矩陣，該算法可以用于氨基酸序列。Genetics Computer Group(Madison，WI)在“BestFit”實(shí)用申請(qǐng)中提供了該算法檢測(cè)序列同一性百分比的示例性具體實(shí)施。在Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual，第8版(1995)(可從Genetics Computer Group，Madison，WI得到)中描述了這個(gè)方法的缺省參數(shù)。在本發(fā)明上下文確立同一性百分比的優(yōu)選方法是利用MPSRCH程序包，其版權(quán)由the University of Edinburgh所有，由JohnF.Collins和Shane S.Sturrok開(kāi)發(fā)，IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)發(fā)行。這套程序包可以利用Smith-Waterman算法，其中缺省參數(shù)用于記分表(例如，空位設(shè)置罰值12，空位擴(kuò)展罰值1和空位6)。“匹配”值產(chǎn)生的數(shù)據(jù)放映了“序列同一性”。用于估算序列間同一性或類似性百分比的其它適合程序通常是本領(lǐng)域已知的，例如，另一個(gè)具有缺省參數(shù)應(yīng)用的比對(duì)程序是BLAST。例如，利用下面缺省參數(shù)應(yīng)用BLASTN和BLASTP遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾＝無(wú)；鏈＝雙鏈；截?cái)嘀担?0；E值(expect)＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50個(gè)序列；分類＝HIGH SCORE；數(shù)據(jù)庫(kù)＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白質(zhì)+Spupdate+PIR。可以在下面網(wǎng)址中發(fā)現(xiàn)這些程序的詳細(xì)內(nèi)容http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
作為替代方案，在多核苷酸同源區(qū)形成穩(wěn)定雙螺旋的條件下，可以通過(guò)多核苷酸雜交檢測(cè)同源性，隨后用單鏈特異性核酸酶消化，及消化片段大小的檢測(cè)。用上述方法測(cè)定，當(dāng)序列與確定長(zhǎng)度的分子顯示至少約80-85％，優(yōu)選至少約90％，和最優(yōu)選地至少約95％-98％序列同一性時(shí)，兩個(gè)DNA或兩個(gè)多肽序列相互是“基本同源的”。如本文所用，基本同源也指顯示與特定DNA或多肽序列有完整同一性的序列?？梢栽赟outhern雜交實(shí)驗(yàn)，在例如嚴(yán)格條件下，鑒定基本同源性的DNA序列，所述條件由該特定系統(tǒng)所限定。例如，嚴(yán)格雜交條件可以包括50％甲酰胺，5x Denhardt’s溶液，5x SSC，0.1％SDS和100μg/ml變性鮭精DNA，并且沖洗條件可以包含在37℃，2x SSC，0.1％SDS，接著68℃，1xSSC，0.1％SDS。定義適合的雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)。參見(jiàn)，例如，Sambrook等，上文；DNA Cloning，上文；Nucleic Acid Hybridization，上文。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)皮的”遞送指皮內(nèi)(例如進(jìn)入真皮或表皮)，經(jīng)皮(例如經(jīng)皮膚的)和經(jīng)粘膜施用，即，通過(guò)試劑的遞送進(jìn)入或穿過(guò)皮膚或粘膜組織。參見(jiàn)，例如Transdermal Drug DeliveryDevelopmental Issues andResearch Initiatives，Hadgraft和Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications，Robinson和Lee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs，卷1-3，Kydonieus和Berner(eds.)，CRC出版社，(1987)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括利用如美國(guó)專利號(hào)5,630,796所述的粒子遞送裝置(例如，無(wú)針注射器)的試劑遞送，及如美國(guó)專利號(hào)5,865,796所述的粒子介導(dǎo)遞送裝置的遞送。
通過(guò)“核心載體”指為了給予確定的粒子大小和完成細(xì)胞膜穿透所需動(dòng)量的足夠高密度，載體上包被待處理核酸(例如，DNA、RNA)，因此用粒子介導(dǎo)技術(shù)可以(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,100,792)遞送待處理分子。核心載體通常包括鎢、金、鉑、鐵酸鹽、聚苯乙烯和乳膠。參見(jiàn)，例如Particle Bombardment Technology for Gene Transfer，(1994)Yang，N.ed.，Oxford University出版社，New York，NY 10-11頁(yè)。
通過(guò)“粒子遞送裝置”指不需要常規(guī)針的輔助經(jīng)皮遞送粒子組合物穿透皮膚。整個(gè)本文件討論本發(fā)明所用的粒子遞送裝置。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括下面任何一個(gè)感染或再感染的預(yù)防；癥狀的減少和消除；病原體的減少或完全消除。治療可以在預(yù)防(感染前)或治療(感染后)階段實(shí)現(xiàn)。
在本文可互換使用術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”和“受處理者”，指脊索(cordata)亞門(mén)的任何成員，包括，非限定于，人和任何其它靈長(zhǎng)目動(dòng)物，包括非人靈長(zhǎng)目如黑猩猩和其它猿及猴種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物如狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥(niǎo)類，包括家養(yǎng)、野生和獵鳥(niǎo)如雞、火雞和其它雞形目的鳥(niǎo)、鴨子、鵝等等。術(shù)語(yǔ)不表示特定的年齡。因此，意指包括成年和新出生的個(gè)體。因?yàn)樗羞@些脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)類似地起作用，所以本文所述方法意指在任何上述脊椎動(dòng)物物種中應(yīng)用。
概述詳述本發(fā)明前，可以理解本發(fā)明不限于特定的配方或過(guò)程參數(shù)，因?yàn)椋?dāng)然，所述配方或過(guò)程參數(shù)可以變化。用在本文的術(shù)語(yǔ)只是為了描述本發(fā)明特定實(shí)施方式的目的，而不意味限制本發(fā)明，這也是可以理解的。
本發(fā)明提供了含有核酸序列的新組合物，其中組合物中第一序列是獲自或來(lái)源于ADP-核糖基化細(xì)菌毒素的A亞基編碼序列，組合物中第二序列是獲得或來(lái)源于ADP-核糖基化細(xì)菌毒素的B亞基編碼序列。第一和第二序列在免疫方法中是有用的，其中為了在免疫個(gè)體中提供佐劑效果(抗共施用的目的抗原)，遞送它們給個(gè)體。ADP-核糖基化細(xì)菌毒素是相關(guān)細(xì)菌外毒素家族，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍亂毒素(CT)，大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定毒素(LT1和LT2)，假單胞菌(Pseudomona)內(nèi)毒素A，假單胞菌(Pseudomona)外毒素S，蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)胞外酶，球形芽孢桿菌毒素(B.sphaericus)，肉毒梭菌(C.botulinum)C2和C3毒素，泥渣梭菌(C.limosum)胞外酶，及產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)，C.spiriforma和艱難梭菌(C.difficile)的毒素，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)EDIN，和ADP-核糖基化細(xì)菌毒素突變體，如CRM197，非毒性白喉毒素突變體(參見(jiàn)，例如Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251175；和Constantino等(1992)Vaccine)。大多數(shù)ADP-核糖基化細(xì)菌毒素被組織為A:B多聚體，其中A亞基含有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，B亞基作為結(jié)合部分。用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選ADP-核糖基化細(xì)菌毒素包括霍亂毒素和大腸桿菌(E.coii)熱不穩(wěn)定毒素。
霍亂毒素(CT)和相關(guān)的大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)是其各自腸毒素細(xì)菌株系的分泌產(chǎn)物，其是有效的免疫原，并且當(dāng)系統(tǒng)、口服或粘膜施用時(shí)顯示了強(qiáng)毒性。當(dāng)通過(guò)肌肉或口服途徑施用CT和LT時(shí)，兩者提供抗原佐劑效果是已知的。低于毒性所需劑量時(shí)就已觀察到了這些佐劑效果。兩種毒素是極其類似的分子，在氨基酸水平上至少約70-80％是同源的。
CT和LT毒素是六聚體，由5個(gè)B亞基分子組成的環(huán)形環(huán)環(huán)繞單分子A亞基構(gòu)成。A亞基具有引起G蛋白修飾的ADP核糖基酶活性，所述修飾引起A亞基在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)在化后的cAMP和蛋白激酶A正調(diào)節(jié)?？梢酝ㄟ^(guò)外源蛋白酶切割A(yù)亞基產(chǎn)生由單二硫橋連接的A1和A2片段。CT的A亞基含有與蛋白質(zhì)跨越高爾基網(wǎng)進(jìn)入ER挽回有關(guān)的C-末端KDEL肽基序(對(duì)于LT的A亞基是RDEL)。對(duì)于內(nèi)在化后為毒性A片段遞送到正確細(xì)胞區(qū)室，及該細(xì)胞區(qū)室內(nèi)毒素的保留，這可能是重要的。A1亞基進(jìn)入細(xì)胞胞質(zhì)，并且通過(guò)催化G蛋白質(zhì)ADP-核糖基化觸發(fā)C1流出，其激活引起提高cAMP水平的腺苷酸環(huán)化酶。提高的cAMP引起蛋白激酶A磷酸化和打開(kāi)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白氯離子通道。
片段A2的主要作用是與B亞基相互作用。通過(guò)B亞基的5個(gè)考貝介導(dǎo)毒素內(nèi)在化，B亞基對(duì)GM1神經(jīng)節(jié)苷脂，普遍存在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的鞘糖脂具有結(jié)合活性。
A和B亞基對(duì)于佐劑活性的相對(duì)重要性是有爭(zhēng)議的。在本領(lǐng)域存在這樣的推測(cè)，即A亞基可以調(diào)節(jié)與B亞基相關(guān)的佐劑效果。一些研究證明A亞基的突變廢除了佐劑活性，而其它研究表明阻斷ADP-核糖基酶活性的A亞基突變對(duì)佐劑活性沒(méi)有影響。其它報(bào)告表明對(duì)于純化的B亞基或重組B亞基制劑，佐劑效果的變化水平?？赡蹵和B亞基有獨(dú)立產(chǎn)生佐劑活性的單獨(dú)功能。這些功能分別是ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和受體觸發(fā)活性。尤其是與B細(xì)胞上GM1受體結(jié)合的LT的B亞基引起多克隆活化，其在缺乏顯著增殖時(shí)出現(xiàn)，而且包括許多重要分子，如MCH II類、B7、CD40、ICAM-1和IL2-Rα的正調(diào)節(jié)。對(duì)于T細(xì)胞，向伴刀豆球蛋白A刺激的T細(xì)胞添加CT或LT全毒素或重組B亞基引起胸腺嘧啶加入的減少。還沒(méi)有報(bào)道這些分子對(duì)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的作用。在PBMC培養(yǎng)中，EtxB刺激高水平的TNF-α和IL-10而不是IL-12產(chǎn)生。這與利用CT和LT形式作為佐劑有關(guān)的主要Th2樣應(yīng)答的觀察結(jié)果一致。
因此本發(fā)明的意外特征是本發(fā)明多核苷酸佐劑組合物的施用優(yōu)先產(chǎn)生增強(qiáng)的抗共施用抗原的Th1樣免疫應(yīng)答，而不是應(yīng)用ADP-核糖基化外毒素佐劑化合物預(yù)期的Th2樣應(yīng)答。
ADP-核糖基化外毒素亞基的編碼序列在一個(gè)實(shí)施方式中，提供包含一個(gè)或多個(gè)重組核酸分子的組合物，所述一個(gè)或多個(gè)分子含有第一和第二核酸序列，其中(a)第一核酸序列是得自或來(lái)源于ADP-核糖基化外毒素截短的A亞基肽編碼區(qū)，和(b)第二核酸序列是得自或來(lái)源于ADP-核糖基化外毒素截短的B亞基肽編碼區(qū)。因?yàn)橐鸦蚋淖兞嗣總€(gè)所述編碼區(qū)以產(chǎn)生5’缺失，所以編碼區(qū)提供“截短的”亞基肽，因此編碼的亞基肽沒(méi)有氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽。
在另一實(shí)施方式中，提供包含一個(gè)或多個(gè)重組核酸分子的組合物，所述一個(gè)或多個(gè)分子含有第一和第二核酸序列，其中(a)第一核酸序列是得自或來(lái)源于ADP-核糖基化外毒素的修飾的、成熟A亞基肽編碼區(qū)，和(b)第二核酸序列是得自或來(lái)源于ADP-核糖基化外毒素的成熟B亞基肽編碼區(qū)。因?yàn)橐鸦蚋淖兞怂鼍幋a區(qū)以缺失在編碼亞基肽中正常發(fā)現(xiàn)的4個(gè)氨基酸殘基C-末端KDEL或RDEL基序，所以第一核酸序列含有提供“修飾的”A亞基肽的編碼區(qū)。
在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，提供包含一個(gè)或多個(gè)重組核酸分子的組合物，所述一個(gè)或多個(gè)分子含有第一和第二核酸序列，其中(a)第一核酸序列是得自或來(lái)源于ADP-核糖基化外毒素截短和修飾的A亞基肽編碼區(qū)，和(b)第二核酸序列是得自或來(lái)源于ADP-核糖基化外毒素的截短的B亞基肽編碼序列。
在特定優(yōu)選的實(shí)施方式中，ADP-核糖基化外毒素肽亞基編碼序列得自或來(lái)源于霍亂毒素(CT)。在其它特定優(yōu)選實(shí)施方式中，ADP-核糖基化外毒素肽亞基編碼序列得自或來(lái)源于大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)，例如LT1或LT2。
通常，各種腸毒素細(xì)菌種的基因組部分，特別是含有ADP-核糖基化外毒素編碼序列的基因組部分是已知的，其序列例如在互聯(lián)網(wǎng)是公眾可獲得的，例如在World Wide Web，和/或存儲(chǔ)在儲(chǔ)存庫(kù)如GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，在Locus VIBCTXABB(登記號(hào)D30053)可以發(fā)現(xiàn)CT亞基A和B基因完整序列的GenBank入口，而在Locus AB0116677(登記號(hào)AB011677)可以發(fā)現(xiàn)LT亞基A和B基因完整序列的GenBank入口。也可以在本發(fā)明組合物和方法中利用這些毒素序列的活性變異體或片斷。對(duì)于ADP-核糖基化外毒素的總的討論，參見(jiàn)例如Krueger等(1995)Clin.Microbiol.Rev.834-47。而且，在本發(fā)明的一些方面，可以進(jìn)一步基因修飾一個(gè)或兩個(gè)毒素亞基肽編碼區(qū)以除去其編碼的亞基肽的毒性。例如，破壞ADP-核糖基化活性、胰蛋白酶切割位點(diǎn)突變或破壞結(jié)合活性的基因改變的毒素突變體是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Burnette等(1994)“Recombinant microbial ADP-ribosylating toxins of Bordetellapertusis，Vibrio choleraE，and enterotoxigenic Escherichia colistructure，function and toxoid vaccine development，”在Bioprocess Technology，Burnette等eds.，185-203頁(yè)；Rappuoli等(1995)Int.Archiv.Allergy Immunol.108327-333；和Rappuoli等(1996)Ad.Exp.Med.Biol.39755-60。用已知技術(shù)，通常在適合的載體(例如質(zhì)粒骨架)中插入編碼選定毒素亞基的序列，如下面實(shí)施例所述。
可以用已知方法獲得和/或制備編碼目的ADP-核糖基化外毒素亞基肽的一個(gè)或多個(gè)序列。例如，用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)工具，可以得到基本上純的制劑。即，用重組方法，如通過(guò)從表達(dá)毒素亞基的細(xì)胞篩選cDNA文庫(kù)，或通過(guò)從已知包含該多核苷酸序列的載體得到毒素亞基編碼序列，可以獲得編碼上述毒素亞基的多核苷酸序列。各種細(xì)菌株系的毒素亞基編碼序列保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，而其它的毒素亞基編碼序列可從國(guó)家和國(guó)際健康組織如疾病控制中心(the Centers ofDisease Control)(Atlanta，GA)得到。參見(jiàn)，例如Sambrook等，上文，用于獲得和分離核酸分子的技術(shù)說(shuō)明。也可以合成，而不是克隆產(chǎn)生多核苷酸序列。
然而，分離特定核酸分子的另一個(gè)方便方法是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)Mullis等(1987)Methods Enzymol.155335-350。這個(gè)技術(shù)利用DNA聚合酶，通常是熱穩(wěn)定DNA聚合酶復(fù)制期望的DNA區(qū)域。通過(guò)特異序列的寡核苷酸識(shí)別將要復(fù)制的DNA區(qū)域，該寡核苷酸與期望DNA的相反末端和相反鏈互補(bǔ)以引發(fā)復(fù)制反應(yīng)。第一輪復(fù)制產(chǎn)物是用于隨后復(fù)制的模板本身，因此重復(fù)連續(xù)的復(fù)制循環(huán)引起了由所用引物對(duì)限定的DNA片斷的幾何擴(kuò)增。
一旦獲得目的ADP-核糖基化外毒素亞基的相關(guān)序列，用標(biāo)準(zhǔn)克隆或分子生物學(xué)技術(shù)可以將其連接在一起以提供一個(gè)或多個(gè)鄰接核酸分子。更具體地，獲得選定毒素亞基聯(lián)合的序列信息后，編碼序列可以互相聯(lián)合或與其它序列聯(lián)合以形成雜交序列，或分別處理編碼序列。在雜交序列中，亞基肽編碼序列相互間可以通過(guò)任何方式定位，而且以任何排序方式包含在單分子中，例如，作為單拷貝，作為在分子中隨機(jī)重復(fù)的多拷貝，或作為多串連重復(fù)包含在分子中，或另外的有序重復(fù)基序。
盡管可以用許多常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建該重組核酸分子，但是一個(gè)方便的方法需要利用穿梭或克隆載體中一個(gè)或多個(gè)單一限制性位點(diǎn)(或者插入在適合載體序列中插入一個(gè)或多個(gè)單一位點(diǎn))和標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)定向亞基肽編碼一個(gè)序列或多個(gè)序列到載體特定靶位點(diǎn)中。
作為替代方案，可以合成，而不是克隆產(chǎn)生雜交分子。設(shè)計(jì)具有期望特定氨基酸的合適密碼子的核苷酸序列。一般地，人們選擇表達(dá)序列的期望宿主的優(yōu)選密碼子。然后，可以從標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸裝配完整序列，并且裝配為完整編碼序列。參見(jiàn)，例如Edge(1981)Nature292756；Nambair等(1984)Science(1984)2231299；Jay等(1984)J.Biol.Chem.2596311。
一旦獲得或構(gòu)建相關(guān)的ADP-核糖基化外毒素肽編碼序列，可以在含有控制序列的一個(gè)或多個(gè)適合載體內(nèi)插入它們，該控制序列可操作地與插入的一個(gè)序列或多個(gè)序列連接，因此提供了允許毒素亞基肽在靶個(gè)體物種體內(nèi)表達(dá)的表達(dá)盒子。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的常用啟動(dòng)子包括SV40早期啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子如CMV立即早期啟動(dòng)子，小鼠乳腺腫瘤病毒LTR啟動(dòng)子，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(Ad MLP)，和其它適合有效的啟動(dòng)子系統(tǒng)。非病毒啟動(dòng)子，如鼠金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子也可以用于哺乳動(dòng)物表達(dá)。也可以利用誘導(dǎo)型、阻抑型或其它控制型啟動(dòng)子。通常，也將存在轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列，其位于每個(gè)翻譯終止子的3’。優(yōu)選地，也存在位于每個(gè)編碼序列5’的翻譯起始的最佳序列。轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號(hào)的例子包括來(lái)源于SV40的轉(zhuǎn)錄終止子/聚腺苷酸化信號(hào)，如Sambrook et al等，上文，及牛生長(zhǎng)激素終止子序列。表達(dá)盒子內(nèi)也可以設(shè)計(jì)含有剪接供體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。
此外，表達(dá)盒子中可以包含增強(qiáng)子元件以增加表達(dá)水平。適合的增強(qiáng)子例子包括SV40早期基因增強(qiáng)子(Dijkema等(1985)EMBO J.4761)，來(lái)源于魯斯氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA796777)，和來(lái)源于人或鼠CMV的元件(Boshart等(1985)Cell41521)，例如包含在CMV內(nèi)含子A序列中的元件。
在一些特定的實(shí)施方式中，可以進(jìn)一步包含輔助序列，該輔助序列提供了所連接的ADP-核糖基化外毒素亞基肽從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌。該分泌前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且包括，例如組織血纖維蛋白溶酶原激活物(tpa)前導(dǎo)信號(hào)序列。
在產(chǎn)生含有目的ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列的一個(gè)或多個(gè)適合的表達(dá)盒子(或核酸構(gòu)建體，如質(zhì)粒載體)后，在適合的轉(zhuǎn)染載體，如DNA質(zhì)粒載體或病毒載體中可以提供表達(dá)盒子用于隨后施用于個(gè)體。在這方面，本發(fā)明的多核苷酸組合物可以用做獨(dú)立的佐劑組合物，或與目的抗原共施用，例如作為多組分疫苗組合物的一部分。例如，在多組分疫苗組合物中，該核酸分子(含有目的ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列)可以與編碼一個(gè)或多個(gè)抗原的其它核酸分子，例如含有編碼流感HA或NA抗原序列的分子，或含有編碼HIV抗原序列的分子聯(lián)合，已知所述抗原對(duì)提供抗病原體的保護(hù)是重要的。作為替代方案，除了編碼毒素亞基的多核苷酸外，多組分疫苗組合物還可以包含常規(guī)整體病毒的抗原、分裂的病毒、多糖、或純化的亞基疫苗制劑，如本文下文所述。
抗原本文所述的組合物和方法在輔助免疫系統(tǒng)抗廣泛種類共施用抗原方面是有用的，所述抗原，例如得自或來(lái)源于患病細(xì)胞或組織、人或動(dòng)物病原體的抗原。對(duì)于本發(fā)明目的而言，佐劑或用于增強(qiáng)對(duì)特異抗原的免疫應(yīng)答，例如當(dāng)佐劑與疫苗組合物共施用時(shí)，免疫應(yīng)答比施用同樣量沒(méi)有佐劑的疫苗組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答更強(qiáng)；佐劑或用于定向抗共施用抗原的特定型或類的免疫應(yīng)答。本發(fā)明佐劑組合物“有效量”的共施用是增強(qiáng)對(duì)共施用抗原免疫學(xué)反應(yīng)的量，因此，例如，需要較低或較少劑量的抗原產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。
例如，當(dāng)本發(fā)明的編碼佐劑組合物的ADP-核糖基化外毒素亞基與目的抗原(例如，疫苗組合物)“共施用”時(shí)，本文所用術(shù)語(yǔ)“共施用”指佐劑組合物和抗原的同時(shí)或共同施用，例如，當(dāng)兩者出現(xiàn)在相同組合物中，或者在幾乎相同時(shí)間但不同位點(diǎn)以單獨(dú)組合物形式施用時(shí)，及佐劑組合物和抗原在不同時(shí)間以單獨(dú)組合物形式遞送，包括給不同位點(diǎn)遞送。例如，在相同或不同位點(diǎn)遞送抗原前或后可以遞送佐劑組合物。佐劑和抗原遞送的計(jì)時(shí)范圍可以從約幾分鐘間隔到幾小時(shí)間隔，到幾天間隔。
對(duì)于本發(fā)明目的而言，術(shù)語(yǔ)“病原體”以廣泛地意義應(yīng)用，指疾病和病情的特定成因因子，并且包括提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子原的任何因子。因此，病原體包括但不限于病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、癌細(xì)胞等等。通常，病原體產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)肽或碳水化合物抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。鑒定適合抗原，獲得和制備該分子，然后測(cè)定適合的劑量，測(cè)定適合的免疫原性及用該抗原治療的方法是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如Plotkin等(1994)Vaccines，第二版，W.B.Saunders，Philadelphia，PA。因此，可以用于接種脊椎動(dòng)物個(gè)體，特別是人和非人的哺乳動(dòng)物的抗原源的非限制性例子包括病毒、細(xì)菌、真菌和其它的病原生物體。
適合的病毒抗原包括但不限于從肝炎家族病毒，包括肝炎A病毒(HAV)，肝炎B病毒(HBV)，肝炎C病毒(HBC)，δ肝炎病毒(HDV)，肝炎E病毒(HEV)和肝炎G病毒(HGV)得到或來(lái)源的病毒抗原。參見(jiàn)，例如國(guó)際公布號(hào)WO 89/04669；WO 90/11089；和WO 90/14436。HCV基因組編碼多個(gè)病毒蛋白質(zhì)，包括E1和E2。參見(jiàn)，例如Houghton等(1991)Hepatology14381-388。將發(fā)現(xiàn)含有編碼這些蛋白質(zhì)序列的基因組片段及其抗原片段在本發(fā)明的應(yīng)用。類似地，HDV的δ-抗原的編碼序列是已知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,378,814)。
以類似的方式，本發(fā)明可以利用皰疹病毒家族廣泛種類的蛋白質(zhì)作為抗原，包括來(lái)源于皰疹單純病毒(HSV)類型1和類型2，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；水痘帶狀皰疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)，包括CMV gB和CMV gH的蛋白質(zhì)；和其它的人皰疹病毒，如HHV6和HHV7的抗原。(參見(jiàn)，例如.Chee等(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer-Verlag，125-169頁(yè)；McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美國(guó)專利號(hào)5,171,568；Baer等(1984)Nature310207-211；和Davison等(1986)J.Gen.Virol.671759-1816)。
已知和報(bào)道了人免疫缺陷病毒(HIV)抗原，如許多HIV-1和HIV-2分離物，包括HIV各種遺傳亞型成員的gp120分子(參見(jiàn)，例如Myers等，Los Alamos Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；和Modrow等(1987)J.Virol.61570-578)。將發(fā)現(xiàn)從任何這些分離物來(lái)源或獲得的含有抗原的基因組片段在本發(fā)明中的應(yīng)用。而且，將發(fā)現(xiàn)來(lái)源于或獲自各種HIV分離物中任何一種的其它免疫原蛋白質(zhì)在本文的應(yīng)用，所述免疫原蛋白質(zhì)包括含有一個(gè)或多個(gè)各種衣殼蛋白質(zhì)如gp160和gp41的片段，gag抗原如p24gag和p55gag，及來(lái)源于HIV的pol、env、tat、vif、rev、nef、vpr、vpu和LTR區(qū)域的蛋白質(zhì)。
也將發(fā)現(xiàn)來(lái)源于或獲自其它病毒的抗原在本文的應(yīng)用，如非限制性的，小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒等)；杯狀病毒科；披膜病毒科(例如風(fēng)疹病毒、登革熱病毒等)；黃病毒科；冠狀病毒科；呼腸孤病毒科(例如，輪狀病毒)；雙節(jié)段RNA病毒科；彈狀病毒科(例如，狂犬病病毒)；正粘病毒科(例如，甲、乙和丙型流感病毒等)；纖絲病毒科；副粘病毒科(例如，流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒等)；布尼亞病毒科；沙粒病毒科；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(例如，HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(作為HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等也是已知的))，包括但不限于來(lái)源于分離物HIVIIIb、HIVSF2、HIVLAV、HIVLAI、HIVMN；HIV-1CM235，HIV-1US4HIV-2，其中的其它種類的抗原；猿免疫缺陷病毒(SIV)；乳頭狀瘤病毒、蜱傳腦炎(the tick-bourne)病毒等等。關(guān)于這些和其它病毒的描述參見(jiàn)，例如Virology，第三版(W.K.Jokliked.1988)；Fundamental Virology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.1991)。
在一些上下文中，獲自或來(lái)源于病毒病原體的病毒抗原可以是優(yōu)選的，這些病毒病原體通常通過(guò)粘膜表面進(jìn)入身體，已知其引起或與人類疾病有關(guān)，所述病毒病原體例如，但不限于HIV(AIDS)、流感病毒(Flu)、單純皰疹病毒(生殖器感染、單純性皰疹、STDs)、輪狀病毒(腹瀉)、副流感病毒(呼吸感染)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(脊髓灰質(zhì)炎)、呼吸道合胞體病毒(呼吸感染)、麻疹和流行性腮腺炎病毒(麻疹、腮腺炎)、風(fēng)疹病毒(風(fēng)疹)和鼻病毒(普通感冒)。
可以從已知與疾病相關(guān)的成因因子獲得或衍生含有細(xì)菌和寄生抗原的基因組片段，包括但不限于，白喉(Diptheria)、百日咳、破傷風(fēng)、結(jié)核病、細(xì)菌或真菌肺炎、中耳炎、淋病(Gonnorhea)、霍亂、傷寒、腦膜炎、單核細(xì)胞增多癥、瘟疫、細(xì)菌性痢疾或沙門(mén)氏菌感染、軍團(tuán)病、萊姆病(Lyme Disease)、麻風(fēng)病、瘧疾、鉤蟲(chóng)病、盤(pán)尾絲蟲(chóng)病、血吸蟲(chóng)病、Trypamasomialsis，Lesmaniasis、賈第鞭毛蟲(chóng)病、阿米巴病(Amoebiasis)、絲蟲(chóng)病、包柔螺旋體病(Borelia)和旋毛蟲(chóng)病。而且進(jìn)一步抗原可以從非常規(guī)病毒，如庫(kù)魯病、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob病，CJD)、羊瘙癢病、可傳遞的水貂腦病和慢性消耗性疾病，或蛋白質(zhì)感染粒子如與瘋牛病有關(guān)的朊病毒的成因因子得到或來(lái)源。
特定的病原體可以包括結(jié)核分支桿菌、衣原體、淋病奈瑟氏球菌、志賀菌屬、沙門(mén)菌、霍亂弧菌、梅毒密螺旋體、假單胞菌、百日咳博德特氏菌、布魯氏菌、土拉熱弗朗西絲氏菌(Franciscella tulorensis)、幽門(mén)螺桿菌，問(wèn)號(hào)鉤端螺旋、嗜肺軍團(tuán)菌、鼠疫桿菌、鏈球菌(A和B型)、肺炎球菌、腦膜炎球菌、血友病流感(Hemophilus influenza)(B型)、鼠弓形體、Complylobacteriosis、粘膜炎莫拉菌、腹股溝肉芽腫和放線菌??；真菌病原體包括念珠菌病和曲霉??；寄生病原體包括絳蟲(chóng)屬、血吸蟲(chóng)、線蟲(chóng)、阿米巴病、賈第蟲(chóng)病、隱孢子蟲(chóng)屬、血吸蟲(chóng)屬、卡氏肺囊蟲(chóng)、毛滴蟲(chóng)病和旋毛蟲(chóng)病。因此，本發(fā)明也可以用于提供抗許多獸醫(yī)疾病的免疫應(yīng)答，如口蹄疫、冠狀病毒、多殺巴斯德菌、螺桿菌屬、尋常圓線蟲(chóng)、胸膜肺炎放線桿菌、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、肺炎克雷白菌、大腸桿菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和brochiseptica。
在一些實(shí)施方式中，目的抗原可以是過(guò)敏原?！斑^(guò)敏原”是能引起超敏感性狀態(tài)的抗原，或在已用過(guò)敏原致敏的個(gè)體中能激發(fā)立即超敏感性反應(yīng)。過(guò)敏原通常是具有過(guò)敏屬性的蛋白質(zhì)或與蛋白質(zhì)結(jié)合的化學(xué)試劑；然而，過(guò)敏原也包括從各種人造或天然來(lái)源，如植物材料、金屬、化妝品或去污劑中的組分、乳膠等等得到的有機(jī)或無(wú)機(jī)材料。用于本發(fā)明方法中的適合過(guò)敏原的分類包括，但不限于花粉、動(dòng)物毛屑、草、霉、塵埃、抗生素、螫刺昆蟲(chóng)毒液，和各種環(huán)境的(包括化學(xué)試劑和金屬)、藥物和食品過(guò)敏原。普通樹(shù)過(guò)敏原包括三葉楊、普通岑樹(shù)、樺樹(shù)、槭樹(shù)、橡樹(shù)、榆樹(shù)、山胡桃木和美洲山核桃樹(shù)的花粉；普通植物過(guò)敏原包括來(lái)自黑麥、豚草、英國(guó)車前草、酸模和藜的過(guò)敏原；植物接觸過(guò)敏原包括來(lái)自毒櫟、毒葛和蕁麻的過(guò)敏原；普通草過(guò)敏原包括來(lái)自貓尾草、約翰遜、百慕大、牛毛草和莓系屬的牧草過(guò)敏原；也可以從霉菌或真菌得到普通過(guò)敏原，例如鏈格孢屬、鐮刀菌屬、單孢枝霉菌屬、曲霉屬、小多胞菌屬、毛霉菌和嗜熱放線菌綱；青霉素和四環(huán)素是普通的抗生素過(guò)敏原；從房屋或有機(jī)塵埃(來(lái)源通常是真菌)中，從昆蟲(chóng)如房屋螨類(dermatphagoides pterosinyssis)，或是動(dòng)物來(lái)源的如羽毛，貓和狗的毛屑可以得到表皮過(guò)敏原；普通的食物過(guò)敏原包括牛奶和奶酪(奶制品)、蛋、小麥、堅(jiān)果(例如花生)、海產(chǎn)食品(例如貝類)、豌豆、豆和谷蛋白過(guò)敏原；普通的環(huán)境過(guò)敏原包括金屬(鎳和金)、化學(xué)試劑(甲醛、三硝基苯酚和松脂)、乳劑、橡膠、纖維(棉花或羊毛)、粗帆布、染發(fā)劑、化妝品、去污劑和香味過(guò)敏原；普通的藥物過(guò)敏原包括局部麻醉劑和水楊酸鹽過(guò)敏原；抗生素過(guò)敏原包括青霉素和磺胺類藥過(guò)敏原；和普通的昆蟲(chóng)過(guò)敏原包括蜜蜂、胡蜂和螞蟻毒液、及蟑螂萼器過(guò)敏原。特定特征的過(guò)敏原包括，但不限于Der pI過(guò)敏原(Hoyne等(1994)Immunology83190-195)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等(1996)J.Clin.Invest.981676-1683)，樺樹(shù)花粉過(guò)敏原Betv1(Bauer等(1997)Clin.Exp.Immunol.107536-541)和多抗原表位重組草過(guò)敏原rKBG8.3(Cao等(1997)Immunology9046-51)的主要和隱含的抗原表位?？少?gòu)買(mǎi)得到這些和其它適合的過(guò)敏原，和/或根據(jù)已知技術(shù)易制備作為提取物的這些和其它適合的過(guò)敏原。
在一些其它實(shí)施方式中，目的抗原可以是腫瘤特異性抗原。對(duì)于本發(fā)明目的而言，腫瘤特異性抗原包括，但不限于各種MAGEs(黑色素瘤相關(guān)抗原E)，包括MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3(HLA-A1肽)、MAGE 4等的任何一種；各種酪氨酸酶(HLA-A2肽)；突變的ras；突變的p53；和p97黑色素瘤抗原中任何一種；其它腫瘤特異性抗原包括與晚期癌癥相關(guān)Ras肽和p53肽、與宮頸癌相關(guān)的HPV 16/18和E6/E7抗原、與乳腺癌相關(guān)的MUC1-KLH抗原、與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的CEA(癌胚抗原)，與黑色素腫瘤相關(guān)的gp100或MART1抗原、及與前列腺癌相關(guān)的PSA抗原。p53基因序列是已知的(參見(jiàn)，例如，Harris等(1986)Mol.Cell.Biol.64650-4656)，并且存儲(chǔ)在GenBank中，登記號(hào)為M14694。因此，可以用本發(fā)明佐劑組合物進(jìn)行治療宮頸、乳腺、結(jié)腸直腸、前列腺、肺癌和黑色素瘤的免疫治療方法。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法獲得或產(chǎn)生本發(fā)明所用抗原。具體地，用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，可以直接從天然來(lái)源分離抗原。作為替代方案，可以用已知技術(shù)重組產(chǎn)生抗原。參見(jiàn)，例如Sambrook，F(xiàn)ritsch& Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，Vols.I，II和III，第二版(1989)；DNA Cloning，Vols.I和II(D.N.Glover ed.1985)。也可以根據(jù)所述的氨基酸序列，通過(guò)化學(xué)多聚體合成，如固相肽合成來(lái)合成本文所用抗原。這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。參見(jiàn)，對(duì)于固相肽合成技術(shù)，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhasePeptide Synthesis，第二版，Pierce Chemicai Co.，Rockford，IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，編者E.Gross和J.Meienhofer，Vol.2，Academic Press，New York，(1980)，3-254頁(yè)；和對(duì)于經(jīng)典溶液合成，M.Bodansky，Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Berlin(1984)及E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，上文，Vol.1。
如果期望，可以用重組方法，例如通過(guò)從表達(dá)基因的細(xì)胞篩選cDNA和基因組文庫(kù)，或通過(guò)從已知包含該多核苷酸序列的載體中取得基因，獲得編碼上述抗原的多核苷酸序列。而且，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如苯酚提取和cDNA或基因組DNA PCR，可以直接從含有該多核苷酸序列的細(xì)胞和組織中分離期望的基因。參見(jiàn)，例如Sambrook等，上文，用于獲得和分離DNA技術(shù)的描述。也可以合成，而不是克隆產(chǎn)生多核苷酸序列。
在這些組合物中，其中將通過(guò)編碼目的抗原的核酸序列的方式提供抗原成分，選定抗原的編碼序列可以與一個(gè)或兩個(gè)ADP-核糖基化外毒素亞基肽的編碼序列連接以提供帶有所有三個(gè)編碼序列的單一構(gòu)建體，可以與毒素亞基的僅一個(gè)編碼序列連接以提供，例如兩個(gè)質(zhì)粒組合物，或提供在來(lái)自于帶有毒素亞基編碼序列的單一構(gòu)建體或多構(gòu)建體的分離構(gòu)建體中。在上述情況的每一種中，抗原可以可操作地被連接，并且在相同或不同控制元件，例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。在這些構(gòu)建體中，其中單一控制元件用于引導(dǎo)兩個(gè)或多個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，可以利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)促進(jìn)多序列的轉(zhuǎn)錄。
多核苷酸的施用可以通過(guò)任何合適的方法施用本文所述的多核苷酸(含有選定ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列的核酸分子)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如下文所述，通過(guò)包被含有目的ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列(并且，在一些實(shí)施方式中，是在相同或不同構(gòu)建體中的目的抗原的編碼序列)的一個(gè)或多個(gè)適合構(gòu)建體(例如，一個(gè)或多個(gè)DNA質(zhì)粒構(gòu)建體)到核心載體粒子上，然后給個(gè)體或細(xì)胞施用包被的粒子。然而，也可以用病毒載體或用非病毒系統(tǒng)，例如裸核酸遞送，遞送本發(fā)明多核苷酸。
病毒載體大量基于病毒的系統(tǒng)已用于基因遞送。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒是已知的，并且通常利用具有整合缺陷原病毒(輔助病毒)的包裝系，該缺陷原病毒(輔助病毒)表達(dá)所有的病毒基因，但是由于包裝信號(hào)，已知為pis序列的缺失，不能包裝其自身基因組。因此，細(xì)胞系產(chǎn)生了空病毒外殼。可以由包裝系得到生產(chǎn)系，生產(chǎn)系中除了輔助病毒外，還含有病毒載體，該病毒載體含有在病毒復(fù)制和包裝中所需的順式(in cis)序列，即已知的長(zhǎng)末端重復(fù)(LTRs)。目的多核苷酸分子可以插入載體中，在逆轉(zhuǎn)錄病毒輔助病毒合成的病毒外殼中包裝。然后可以分離重組病毒，及遞送給個(gè)體重組病毒。(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,219,740)。代表性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括但不限于，載體例如，如美國(guó)專利號(hào)5,219,740所述LHL，N2，LNSAL，LSHL和LHL2載體，本文整體并入這篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)，及這些載體的衍生物，如本文所述的修飾的N2載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知技術(shù)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,219,740；Mann等(1983)Cell33153-159。
已研究開(kāi)發(fā)了用于基因遞送的基于腺病毒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)適合遞送本文所述的核酸分子。人腺病毒是通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的雙鏈DNA病毒。這些病毒特別適于基因轉(zhuǎn)移，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀咨L(zhǎng)和操作，而且它們顯示了在體內(nèi)和體外廣泛的宿主范圍。例如，腺病毒能感染造血的、淋巴樣和骨髓來(lái)源的人細(xì)胞。而且，腺病毒感染靜止和復(fù)制的靶細(xì)胞。不同于整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒持續(xù)存在于染色體外，因此使與插入誘變有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)最小化。病毒容易高效價(jià)產(chǎn)生，而且是穩(wěn)定的，因此可以純化和貯藏。即使是在有能力復(fù)制的形式中，腺病毒僅僅引起低水平的發(fā)病率，并且與人惡性瘤無(wú)關(guān)。因此，已開(kāi)發(fā)研究出利用這些優(yōu)點(diǎn)的腺病毒載體。腺病毒載體的描述和它們的應(yīng)用參見(jiàn)，例如Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等(1994)Human GeneTherapy5717-729；Seth等(1994)J.Virol.68933-940；Barr等(1994)Gene Therapy151-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6616-629；Rich等(1993)Human Gene Therapy4461-476。
腺相關(guān)病毒載體(AAV)也可用于施用本文所述的多核苷酸。在這方面，AAV載體可以來(lái)源于任何AAV血清型，包括但不限于AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-4，AAV-5，AAV-7等。AAV載體可以有一個(gè)或多個(gè)整體或部分缺失的AAV野生型基因，優(yōu)選rep和/或cap基因，但保留一個(gè)或多個(gè)功能的側(cè)翼末端反向重復(fù)(ITR)序列。通常認(rèn)為功能ITR序列對(duì)AAV病毒粒子的拯救、復(fù)制和包裝是必需的。因此，AAV載體包含至少在病毒復(fù)制和包裝中所需的那些順式(in cis)序列(例如，功能ITR)。只要ITR序列提供功能拯救、復(fù)制和包裝，其不必是野生的核苷酸序列，而且可以通過(guò)核苷酸的插入，缺失和置換改變。
用已知技術(shù)構(gòu)建AAV表達(dá)載體，其至少提供了在指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄時(shí)可操作地連接的組分，控制元件包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、目的DNA和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。選擇在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用的控制元件。由此產(chǎn)生的含有可操作地連接組分的構(gòu)建體與功能AAV ITR序列連接(5’和3’)?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知技術(shù)設(shè)計(jì)適合的AAV構(gòu)建體。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,173,414和5,139,941；國(guó)際公布號(hào)WO 92/01070(1992年1月23日公開(kāi))和WO93/03769(1993年3月4日公開(kāi))；Lebkowski等(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等(1990)Vaccines 90(Cold SpringHarbor Laboratory出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion inBiotechnology3533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics inMicrobiol.and Immunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)Human GeneTherapy5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy1165-169；和Zhou等(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
常規(guī)藥物制劑可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員易得的所有標(biāo)準(zhǔn)制藥劑型化學(xué)和方法學(xué)完成包含本發(fā)明多核苷酸分子，有或無(wú)抗原組合物添加的制劑劑型。例如，含有一個(gè)或多個(gè)適合載體的組合物可以與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體聯(lián)合以提供液體制劑。
可以在賦形劑或載體中存在輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等等。這些賦形劑、載體和輔助物質(zhì)是普通的藥學(xué)試劑，其本身在接受組合物的個(gè)體中不會(huì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且可以予以施用，而無(wú)過(guò)度的毒性。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于液體，如水、鹽水、聚乙烯二醇、透明質(zhì)酸、甘油和乙醇。藥學(xué)上可接受的鹽也可以包含在其中，例如礦酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；和有機(jī)酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。盡管不是必需，但也優(yōu)選制劑含有起穩(wěn)定劑作用的，特別是對(duì)如果將要包含在疫苗組合物中的肽、蛋白質(zhì)或其它類似抗原分子起穩(wěn)定劑作用的藥學(xué)上可接受的賦形劑。作為適合載體對(duì)肽也起穩(wěn)定劑作用的例子非限制性包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等的藥學(xué)梯度。其它適合載體再一次非限制性包括淀粉、纖維素、磷酸鈉或磷酸鈣、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量的聚乙二醇(PEGs)，及其聯(lián)合。在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)可得到藥學(xué)可接受賦形劑、載體和輔助物質(zhì)的詳細(xì)討論，本文并入其為參考文獻(xiàn)。
組合物中也可以包含一些核酸攝取和/或表達(dá)的促進(jìn)因子(“轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑”)，例如，促進(jìn)因子如丁呱卡因(bupivacaine)、心臟毒素和蔗糖，和轉(zhuǎn)染促進(jìn)載體如常規(guī)用于遞送核酸分子的脂質(zhì)體或脂質(zhì)制劑。陰離子和中性脂質(zhì)體是廣泛可得到的，用于遞送核酸分子是熟知的(參見(jiàn)，例如LiposomesA Practical Approach，(1990)RPC New Ed.，IRL Press)。陽(yáng)離子脂質(zhì)制劑也是熟知的用于核酸分子遞送的載體。適合的脂質(zhì)制劑包括可購(gòu)得的商品名為L(zhǎng)ipofectinTM的DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨)，和DOTAP(1，2-二油酰氧-3-(三甲銨)丙烷)，參見(jiàn)，例如Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7416；Malone等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081；美國(guó)專利號(hào)5,283,185和5,527,928，和國(guó)際公布號(hào)WO 90/11092，WO 91/15501和WO 95/26356。這些陽(yáng)離子脂質(zhì)可以優(yōu)選與中性脂質(zhì)，例如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)聯(lián)合使用?？梢蕴砑拥缴鲜鲋|(zhì)或脂質(zhì)體中的進(jìn)一步的轉(zhuǎn)染促進(jìn)組合物包括精胺衍生物(參見(jiàn)，例如國(guó)際公布號(hào)WO 93/18759)和細(xì)胞膜通透化合物如GALA、短桿菌肽S和陽(yáng)離子膽汁鹽(參見(jiàn)，例如國(guó)際公布號(hào)WO 93/19768)。
作為替代方案，本發(fā)明核酸分子可被包被、吸附或連接粒子載體。適合的粒子載體包括來(lái)源于聚甲基甲基丙烯酸酯多聚體的粒子載體，和來(lái)源于聚丙交酯和聚(丙交酯-co-聚乙交酯)的PLG微粒，參見(jiàn)，例如Jeffery等(1993)Pharm.Res.10362-368。也可以利用其它的粒子系統(tǒng)和多聚體，例如，多聚體如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸、精胺、亞精胺及這些分子的共軛物。
因此，所形成的組合物通常將包含一個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子(例如，質(zhì)粒載體)，該多核苷酸分子含有選定ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列，其量足以輔助抗共施用抗原的免疫學(xué)反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定適合的有效量。該量將在通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的相對(duì)寬范圍內(nèi)。例如，用0.1μg這樣少量的DNA可以獲得適合的佐劑效果，而在其它施用中，可以使用達(dá)0.2mg的DNA。通常期望含有目的ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列的多核苷酸的有效劑量范圍將在約1μg到1000μg內(nèi)，但是，發(fā)現(xiàn)這個(gè)劑量以上和以下也是有效的。因此，組合物可以包含從約0.1％到約99.9％的多核苷酸分子。
常規(guī)藥物制劑的施用可以通過(guò)在整個(gè)療程中連續(xù)或間斷的一個(gè)劑量完成上述藥物制劑的施用，即，一旦適合地制備了本發(fā)明的組合物，可以用各種已知的途徑和技術(shù)給個(gè)體體內(nèi)施用它。例如，液體制劑可以作為可注射的溶液、懸浮液或乳液提供，用常規(guī)注射針和注射器，通過(guò)不經(jīng)腸道的、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)注射，或液體噴射注射系統(tǒng)施用。也可以給皮膚或粘膜組織局部施用液體制劑，或提供為適于呼吸器官或肺施用的極細(xì)分割的噴霧。其它施用方式包括口服施用、栓劑和主動(dòng)或被動(dòng)經(jīng)皮遞送技術(shù)。
作為替代方案，可以離體施用組合物，例如轉(zhuǎn)化細(xì)胞遞送和重新植入受體是已知的(例如，葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、電穿孔和直接微注射入核)。然而，通過(guò)常規(guī)注射針和注射器用于含有粒子組合物的液體組合物和液體懸浮液的遞送是最經(jīng)常的遞送。測(cè)定最有效施用方法和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，而且將隨著遞送載體、治療組合物、靶細(xì)胞和被治療的個(gè)體而變化。由主治醫(yī)師選的劑量水平和方式可以進(jìn)行單一或多次施用。應(yīng)該理解單多核苷酸載體構(gòu)建體可以帶有一個(gè)以上亞基編碼區(qū)和/或抗原編碼區(qū)?？蛇x的方案，如本文所述，也可以遞送給個(gè)體表達(dá)來(lái)源于任何病原體的一個(gè)或多個(gè)毒素亞基肽和/或抗原的每個(gè)單獨(dú)載體(例如，病毒載體、質(zhì)?；蚱淙魏温?lián)合)。
而且，也希望本發(fā)明方法遞送的多核苷酸可以與其它適合的組合物和治療聯(lián)合。例如，為了進(jìn)一步增強(qiáng)個(gè)體的免疫應(yīng)答，本文所述的組合物和方法可以與輔助物質(zhì)(例如，其它佐劑)，如藥理學(xué)因子、細(xì)胞因子或類似物的遞送聯(lián)合。可以在本文所述多核苷酸分子施用同時(shí)，前或后施用輔助物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)或其它大分子。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，核酸分子組合物也可以給個(gè)體直接施用，或可選方法，離體遞送給來(lái)自個(gè)體的細(xì)胞。
包被的粒子在一個(gè)實(shí)施方式中，用載體粒子遞送含有選定ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列的多核苷酸構(gòu)建體，和其它輔助成分(如一個(gè)或多個(gè)抗原編碼序列)。用于施用該核酸制劑的粒子介導(dǎo)的遞送方法是本領(lǐng)域已知的。因此，一旦制備和適合地純化出上述質(zhì)粒載體構(gòu)建體，其就可以用各種已知技術(shù)包被到載體粒子(例如，核心載體)上。載體粒子選自在粒子大小范圍內(nèi)有適合密度的材料，該粒子大小通常用來(lái)自于適合的粒子遞送裝置的細(xì)胞內(nèi)遞送。當(dāng)然，最佳載體粒子大小將取決于靶細(xì)胞的直徑。
對(duì)于本發(fā)明的目的，可以用鎢、金、鉑和銥核心載體粒子。優(yōu)選鎢和金粒子。容易得到平均直徑大小為0.5到2.0μm的鎢粒子。盡管該粒子對(duì)粒子遞送方法有用的最佳密度，而且允許DNA高效包被，但是鎢對(duì)一些細(xì)胞型有潛在的毒性。因此，也將發(fā)現(xiàn)金粒子和微晶體金(例如，金粉A1570，可購(gòu)自Engelhard Corp.，East Newark，NJ)在本發(fā)明中的應(yīng)用。金粒子具有一致的大小(1-3μm大小的粒子可購(gòu)自Alpha Chemicals或包括0.95μm大小的粒子可購(gòu)自Degussa，South Plainfield，NJ)和減少的毒性。
用于在金或鎢粒子上包被或沉淀DNA或RNA的許多方法是已知的，而且已描述了這些方法。大多數(shù)這樣的方法通?；旌项A(yù)先測(cè)定量的金或鎢與質(zhì)粒DNA、CaCl2和亞精胺。在包被過(guò)程期間持續(xù)渦旋由此得到的溶液以確保反應(yīng)混合物的均勻性。核酸沉淀后，包被的粒子可以轉(zhuǎn)移到適合的膜上，使用前允許干燥，包被在樣品組件或盒子表面，或裝載到遞送盒子中以用于適合粒子遞送裝置。
肽抗原也可以包被在相同或相似的核心載體粒子上。例如，通過(guò)以經(jīng)驗(yàn)確定比率簡(jiǎn)單混合兩組分，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的硫酸銨沉淀或其它溶劑沉淀方法，或通過(guò)肽與載體粒子的化學(xué)偶合，肽可以與載體粒子連接。以前描述過(guò)L-半胱氨酸殘基與金的偶合(Brown等，ChemicalSociety Reviews9271-311(1980))。其它的方法將包括，例如，在純乙醇、水、或醇/水混合物中溶解肽，該溶液加到一定量的載體粒子中，然后在空氣或氮?dú)饬髦懈稍锘旌衔铮瑫r(shí)渦旋。可替代的方案，通過(guò)真空離心，抗原可以干燥于載體粒子上。一旦包被的粒子被干燥，其就可以在適合的溶劑(例如乙酸乙酯或丙酮)中重懸浮、粉碎(例如，通過(guò)超聲)以提供基本均勻的懸浮液。然后用抗原包被的核心載體粒子可以與帶有ADP-核糖基化外毒素亞基肽構(gòu)建體的核心載體粒子結(jié)合，并且在單粒子注射步驟中施用，或與毒素亞基組合物分開(kāi)施用。
包被粒子的施用在包被的核心載體粒子形成后，用粒子介導(dǎo)遞送技術(shù)，遞送給個(gè)體單獨(dú)或與，如抗原制劑聯(lián)合的本發(fā)明核酸制劑包被的核心載體粒子。
適合于粒子介導(dǎo)遞送技術(shù)的各種粒子遞送裝置是本領(lǐng)域已知的，而且它們都適于用在本發(fā)明的實(shí)踐中。目前的裝置設(shè)計(jì)利用爆發(fā)的、電或氣發(fā)射以驅(qū)使包被的核心載體粒子朝向靶細(xì)胞。包被的粒子本身可釋放地與可移動(dòng)的載片連接，或可移去地與氣流通過(guò)的表面連接，從表面抬高粒子，朝向靶細(xì)胞加速它們。在美國(guó)專利號(hào)5,204,253中描述了氣發(fā)射裝置的例子。在美國(guó)專利號(hào)4,945,050中描述了爆發(fā)型裝置。在美國(guó)專利號(hào)5,120,657中描述了電發(fā)射型粒子加速裝置的一個(gè)例子。在美國(guó)專利號(hào)5,149,655中描述了適于本文的另一個(gè)電發(fā)射裝置。本文，整體并入所有這些專利的公開(kāi)為參考文獻(xiàn)。
以與劑量劑型一致的方式及將有效引起期望佐劑效果/免疫應(yīng)答的量給待治療個(gè)體施用包被的粒子。所遞送組合物的量，在核酸分子的情況下，通常是每劑量0.001到1000μg，更通常是0.01到10.0μg的核酸分子，而且在在肽或蛋白質(zhì)分子的情況下是1μg到5μg，更通常是1到50μg肽，取決于待治療個(gè)體。根據(jù)免疫個(gè)體的年齡和總體情況，選擇的特定核苷酸序列或肽，及其它因素，必需的精確的量將變化。依據(jù)閱讀本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定適合的有效量。
粒子組合物作為替代方案，帶有選定ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列的多核苷酸，和一個(gè)或多個(gè)選定抗原部分可以形成粒子組合物。更具體地，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的所有標(biāo)準(zhǔn)制藥劑型化學(xué)和方法學(xué)制備包含一個(gè)或多個(gè)多核苷酸分子的粒子制劑。例如，一個(gè)或多個(gè)載體構(gòu)建體和/或抗原成分可以與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)可接受賦形劑或載體混合以提供疫苗組合物。輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可以在賦形劑或載體中存在。這些賦形劑、載體和輔助物質(zhì)是普通的藥學(xué)試劑，其本身在接受組合物的個(gè)體中不會(huì)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且可以予以施用，而無(wú)過(guò)度的毒性。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括但不限于液體，如水、鹽水、聚乙烯二醇、透明質(zhì)酸、甘油和乙醇。藥學(xué)上可接受的鹽也可以包含在其中，例如礦酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；和有機(jī)酸鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。盡管不是必需，但也優(yōu)選核酸組合物含有起穩(wěn)定劑作用的，特別是對(duì)肽、蛋白質(zhì)或其它類似抗原或輔助物質(zhì)起穩(wěn)定劑作用的藥學(xué)上可接受的載體。適合載體對(duì)肽也起穩(wěn)定劑作用的例子非限制性包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等的藥學(xué)梯度。其它適合載體再一次非限制性包括淀粉、纖維素、磷酸鈉或磷酸鈣、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量的聚乙二醇(PEGs)、及其聯(lián)合。在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)可得到藥學(xué)可接受賦形劑、載體和其它輔助物質(zhì)的詳細(xì)討論，本文并入其為參考文獻(xiàn)。
所形成的組合物將包含編碼毒素亞基肽的多核苷酸，其含量足以提供抗共施用抗原的期望佐劑效果，如上所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易測(cè)定適合有效的含量。該含量將在相對(duì)寬的范圍內(nèi)，通常在約0.001μg到25mg或更多的目的核酸構(gòu)建體范圍內(nèi)，而且可以通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定特定合適的含量。組合物可以含有約0.1％到約99.9％的核酸分子。如果組合物中包含抗原成分，或方法用于提供粒子抗原組合物，那么抗原如上所述抗原將以適合的含量存在。然后用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如通過(guò)簡(jiǎn)單蒸發(fā)(空氣干燥)、真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥(凍干法)、噴霧-冷凍干燥、噴霧包被、沉淀、超臨界液體粒子形成等制備組合物成為粒子。如果期望，得到的粒子可以用在共有國(guó)際公布號(hào)WO 97/48485中所述技術(shù)濃縮。
單獨(dú)的單位劑量或多劑量容器，其中在使用前可以包裝粒子，可以包括裝有適合量粒子的密封容器，所述粒子含有適合核酸構(gòu)建體和/或選定抗原(例如，提供多成分疫苗組合物)。粒子組合物可以作為無(wú)菌制劑包裝，因此可以設(shè)計(jì)密封容器以保持制劑在本發(fā)明方法中使用前是無(wú)菌的。如果期望，可以改造容器以適于在粒子遞送裝置中直接應(yīng)用。這樣的容器可以為膠囊、箔袋、小袋、盒子等形式。本文描述了適合的粒子遞送裝置(例如，無(wú)針注射器)。
進(jìn)一步，可以標(biāo)記裝有粒子的容器以識(shí)別組合物和提供相關(guān)的劑量信息。此外，可以用政府機(jī)構(gòu)，例如食品和藥品管理機(jī)構(gòu)規(guī)定形式的公示標(biāo)記容器，其中公示表明聯(lián)邦法律機(jī)構(gòu)許可包含在其中的人用佐劑、抗原(或疫苗組合物)的制造、使用或銷售。
然后可以用經(jīng)皮遞送技術(shù)施用粒子組合物。優(yōu)選地，通過(guò)粉末注射方法，例如，通過(guò)如在共有國(guó)際公布號(hào)WO 94/24263，WO 96/04947，WO96/12513，和WO 96/20022所述無(wú)針注射器系統(tǒng)遞送粒子組合物，在本文并入所有這些文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)。通常使用具有近似大小的粒子，通常范圍是0.1到250μm，優(yōu)選范圍是約10-70μm的粒子進(jìn)行該無(wú)針注射器系統(tǒng)的粒子遞送。也可以從粒子遞送裝置遞送大于約250μm的粒子，作為粒子大小的上限點(diǎn)將引起皮膚細(xì)胞的不適當(dāng)?shù)膿p壞。遞送粒子穿透靶表面的實(shí)際距離取決于粒子大小(例如，假設(shè)接近球形粒子幾何學(xué)的標(biāo)稱粒子直徑)、粒子密度、粒子撞擊表面的起始速率、和靶細(xì)胞組織的密度和運(yùn)動(dòng)學(xué)的粘性。在這方面，用于無(wú)針注射的最佳粒子密度通常范圍在約0.1到25g/cm3之間，優(yōu)選在約0.9到1.5g/cm3之間，注射速率通常在約100和3,000m/sec之間的范圍，或更大。用合適的氣壓，可以通過(guò)噴嘴以接近驅(qū)動(dòng)氣體流動(dòng)超聲速度的速率加速有10-70μm平均直徑的粒子。
通過(guò)上述粒子遞送裝置，可以遞送含有本文所述粉末分子治療有效量的組合物給任何適合的靶組織。例如，可以遞送組合物給肌肉、皮膚、腦、肺、肝、脾臟、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨骼軟骨、胰腺、腎、膽囊、胃、腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、腺和結(jié)締組織。對(duì)于核酸分子，優(yōu)選遞送給分子表達(dá)的末端分化細(xì)胞；然而，也可以遞送分子給非分化或部分分化的細(xì)胞，如血液干細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞。
如果期望，可以提供預(yù)先加載狀況的這些無(wú)針注射器系統(tǒng)，其含有適合劑量的粒子，該粒子含有目的ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列?？梢栽诿芊獾娜萜髦邪b加載的注射器，可以如上所述進(jìn)一步標(biāo)記。
因此，本方法可以用于獲得大小范圍為約10μm到250μm，優(yōu)選約10μm到約150μm，最優(yōu)選約20μm到60μm的核酸粒子；而且粒子密度范圍約從0.1到約25g/cm3，約0.5g/cm3到約3.0g/cm3或更大的體積密度。
類似地，可以獲得大小范圍為約0.1μm到250μm，優(yōu)選約0.1μm到約150μm，最優(yōu)選約20μm到60μm；粒子密度范圍約從0.1g/cm3到約25g/cm3，優(yōu)選約0.5到約3.0g/cm3，最優(yōu)選約0.8g/cm3到約1.5g/cm3體積密度的選定抗原粒子。
增強(qiáng)免疫應(yīng)答在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于增強(qiáng)抗目的共施用抗原免疫應(yīng)答的方法。本質(zhì)上，該方法需要(a)給個(gè)體施用目的抗原，(b)提供本發(fā)明佐劑組合物，其中所述組合物包含一個(gè)或多個(gè)含有選定ADP-核糖基化外毒素亞基肽編碼序列的核酸分子，和(c)給個(gè)體共施用佐劑組合物，因此毒素亞基肽從它們各自編碼序列表達(dá)，其量足以誘導(dǎo)增強(qiáng)的抗共施用抗原免疫應(yīng)答。如上文所詳述，編碼序列可操作地與相同或不同調(diào)節(jié)序列連接以提供一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒子。然后在適合載體，例如質(zhì)粒載體構(gòu)建體或病毒載體中提供這些表達(dá)盒子。
在一方面，該方法需要用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)基因遞送技術(shù)給個(gè)體施用多核苷酸組合物。參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,399,346，5,580,859，5,589,466。通常，多核苷酸疫苗組合物與藥學(xué)可接受賦形劑或載體混合以提供液體制劑(如上文所述)，然后作為可注射溶液、懸浮液或乳劑用于利用常規(guī)注射針和注射器，或液體噴射注射系統(tǒng)通過(guò)不經(jīng)腸道的、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)注射施用。優(yōu)選給個(gè)體的皮膚或粘膜組織施用組合物，也可以給皮膚或粘膜組織局部施用液體制劑，或提供為適于呼吸器官或肺施用的極細(xì)分割的噴霧。其它施用方式包括口服施用、栓劑和主動(dòng)或被動(dòng)經(jīng)皮遞送技術(shù)。作為替代方案，多核苷酸組合物可以離體遞送給來(lái)自個(gè)體的細(xì)胞，隨后細(xì)胞重新植入個(gè)體。一旦引入個(gè)體，就表達(dá)核酸序列以在原位提供ADP-核糖基化外毒素亞基肽，其量足以增強(qiáng)接種個(gè)體抗共施用抗原的免疫應(yīng)答。這個(gè)增強(qiáng)的免疫應(yīng)答以提高的體液(抗體)應(yīng)答，提高的細(xì)胞(CTL)應(yīng)答為特征，或以提高的抗共施用抗原的體液和細(xì)胞應(yīng)答為特征。
在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，增強(qiáng)的免疫應(yīng)答是以增加的抗共施用抗原的Th1樣(細(xì)胞的)免疫應(yīng)答，而不是Th2樣應(yīng)答為特征。在這方面，可以通過(guò)下面的一個(gè)或多個(gè)證明增加的Th1樣免疫應(yīng)答是符合要求的增加的產(chǎn)生干擾素γ的CD4+輔助細(xì)胞T淋巴細(xì)胞和/或CD8+CTLs效價(jià)；增加的抗原特異性CTL活性；增加的通常與細(xì)胞免疫有關(guān)(例如，IgG2a)亞類抗原特異性抗體效價(jià)。
優(yōu)選以粒子形式遞送本發(fā)明多核苷酸佐劑組合物。例如，用上文詳細(xì)描述的粒子遞送裝置可以施用組合物。在一些實(shí)施方式中，用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可以在核心載體粒子上包被多核苷酸組合物并利用粒子介導(dǎo)方法遞送。載體粒子選自在粒子大小范圍內(nèi)適合密度的材料，該粒子大小通常用來(lái)自于粒子遞送裝置的細(xì)胞內(nèi)遞送。當(dāng)然，最佳載體粒子大小將取決于靶細(xì)胞的直徑。
可選地，通過(guò)給個(gè)體共施用額外或輔助成分，可以修改這些方法。例如可以施用次級(jí)疫苗組合物，其中次級(jí)組合物可以包含核酸疫苗，或次級(jí)疫苗組合物可以包含常規(guī)疫苗，如整體病毒、分裂病毒或亞基疫苗。次級(jí)疫苗組合物可以與多核苷酸ADP-核糖基外毒素亞基肽組合物混合以形成單獨(dú)組合物，或次級(jí)疫苗組合物可以或共同、順序地給相同或不同位點(diǎn)單獨(dú)施用，或通過(guò)一段明顯的時(shí)間分開(kāi)次級(jí)疫苗組合物，如施用最初組合物后一些天的加強(qiáng)步驟中施用。
如上述，可以用常規(guī)注射器或用粒子介導(dǎo)遞送系統(tǒng)，通過(guò)注射施用次級(jí)疫苗組合物和/或其它輔助成分，也是如上所述。通常是皮下、表皮、皮內(nèi)、粘膜內(nèi)(例如，鼻、直腸和/或陰道)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、口或肌肉內(nèi)施用。其它施用方式包括局部、口和肺施用、栓劑和經(jīng)皮應(yīng)用。劑量治療可以是單劑量程序表或多劑量程序表。
實(shí)施例下面是實(shí)施本方面特定實(shí)施方式的實(shí)施例。提供實(shí)施例僅是為了示例目的，并不意味著以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
盡管已努力確保所用數(shù)字(例如，量、溫度等)的精確性，但是一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差當(dāng)然應(yīng)該是允許的。
實(shí)施例1編碼CT的A和B亞基表達(dá)載體的研究用霍亂弧菌基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)模板以產(chǎn)生含有霍亂毒素(CT)A和B亞基編碼序列的DNA片段。為了產(chǎn)生A亞基編碼片段(CTA)的PCR，用下面兩個(gè)寡脫氧核糖核苷酸引物引物15’-GGA GCT AGC AAT GAT GAT AAG TTA TAT CGG-3’(SEQID NO7)；和引物25’-CCT GGA TCC TCA TAA TTC ATC CTT AAT TCT-3’(SEQID NO8)。
為了有利于插入表達(dá)載體，引物1和2的5’-末端含有附加序列(CTA編碼序列同源區(qū)以外)，該序列分別包含NheI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物1和2以引起起始于核苷酸位置164，終止于核苷酸位置886的A亞基編碼序列PCR片段(GenBank登記號(hào)#D30053)的產(chǎn)生。這個(gè)區(qū)域包含成熟亞基A肽完整編碼序列，但不包含在前體亞基A肽氨基末端發(fā)現(xiàn)的編碼細(xì)菌信號(hào)肽的序列。
為了產(chǎn)生B亞基編碼片段(CTB)的PCR，用下面兩個(gè)寡脫氧核糖核苷酸引物引物35’-GGA GCT AGC ACA CCT CAA AAT ATT ACT GAT-3’(SEQID NO9)；和引物45’-CCT GGA TCC TTA ATT TGC CAT ACT AAT TGC-3’(SEQID NO10)。
為了有利于插入表達(dá)載體，引物3和4的5’-末端含有附加序列(CTB編碼序列同源區(qū)域以外)，該序列分別包含NheI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物3和4以引起起始于核苷酸位置946，終止于核苷酸位置1257的B亞基編碼序列PCR片段(GenBank登記號(hào)#D30053)的產(chǎn)生。這個(gè)區(qū)域包含成熟亞基B肽完整編碼序列，但不包含在前體亞基B肽氨基末端發(fā)現(xiàn)的編碼細(xì)菌信號(hào)肽的序列。
除了上述兩個(gè)PCR反應(yīng)外，進(jìn)行第三個(gè)PCR反應(yīng)以產(chǎn)生修飾形式的CT亞基A編碼序列，其中除去了其C-末端四個(gè)氨基酸KDEL基序。這個(gè)反應(yīng)包括應(yīng)用引物1(SEQ ID NO7)和下面引物引物55’-CCT GGA TCC TCA AAT TCT ATT ATG TGT ATC-3’(SEQID NO11)。
用Pfu Turbo DNA聚合酶(購(gòu)自Strategene，La Jolla，CA)和生產(chǎn)商提供的PCR反應(yīng)緩沖液進(jìn)行所有PCR反應(yīng)。PCR條件如下95℃，2分鐘；30個(gè)循環(huán)(95℃，1分鐘；55℃，2分鐘15秒；72℃，1分鐘。)，72℃，5分鐘，和4℃放置。
PCR反應(yīng)完成后，用NheI和BamHI酶消化新合成片段以產(chǎn)生粘性末端，在NheI和BamHI切割的pWRG7054表達(dá)載體中插入每個(gè)片段，產(chǎn)生下面的克隆pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006，它們分別編碼CTA、CTB和修飾的CTA(減去KDEL)。親本克隆載體pWRG7054含有人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子和相關(guān)內(nèi)含子A序列。此外，在pWRG7054中包含人組織血纖蛋白溶酶原激活物信號(hào)肽的編碼序列以允許從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌任何蛋白質(zhì)，其編碼序列插入適合可讀框的NheI位點(diǎn)。(參見(jiàn)，例如，Chapman等(1991)Nuc.Acids Res.193979-3986，和Burke等(1986)J.Biol.Chem.26112574-12578)。
在圖1，2，和3中分別描述了質(zhì)粒pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006的限制圖譜和全序列。
實(shí)施例2編碼大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素A和B亞基表達(dá)載體的研究用大腸桿菌株系EO78H11(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，#35401)基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板以產(chǎn)生含有熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)A和B亞基編碼序列的DNA片段。為了產(chǎn)生A亞基編碼片段的PCR，用下面兩個(gè)寡脫氧核糖核苷酸引物引物65’-GGA GCT AGC AAT GGC GAC AAA TTA TAC CGT-3’(SEQID NO12)；和引物75’-CCT GGA TCC TCA TAA TTC ATC CCG AAT TCT-3’(SEQID NO13)。
為了有利于插入表達(dá)載體，引物6和7的5’-末端含有額外序列(LTA編碼序列同源區(qū)域以外)，該序列分別包含NheI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物6和7以引起起始于核苷酸位置145，終止于核苷酸位置867的A亞基編碼序列PCR片段(GenBank登記號(hào)#AB011677)的產(chǎn)生。這個(gè)區(qū)域包含成熟亞基A肽完整編碼序列，但不包含在前體亞基A肽氨基末端發(fā)現(xiàn)的編碼細(xì)菌信號(hào)肽的序列。
為了產(chǎn)生B亞基編碼片段(CTB)的PCR，用下面兩個(gè)寡脫氧核糖核苷酸引物引物85’-GGA GCT AGC GCT CCC CAG TCT ATT ACA GAA-3’(SEQID NO14)；和引物95’-CCT GGA TCC CTA GTT TTC CAT ACT GAT TGC-3’(SEQID NO15)。
為了有利于插入表達(dá)載體，引物8和9的5’-末端含有額外序列(LTB編碼序列同源區(qū)域以外)，該序列分別包含NheI和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物8和9以引起起始于核苷酸位置927，終止于核苷酸位置1238的B亞基編碼序列PCR片段的產(chǎn)生，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)這個(gè)片段(登記號(hào)#AB011677)。這個(gè)區(qū)域包含成熟亞基B肽完整編碼序列，但不包含在前體亞基B肽氨基末端發(fā)現(xiàn)的編碼細(xì)菌信號(hào)肽的序列。
除了上述兩個(gè)PCR反應(yīng)外，進(jìn)行第三個(gè)PCR反應(yīng)以產(chǎn)生修飾形式的LT亞基A編碼序列，其中除去了其C-末端四個(gè)氨基酸RDEL基序。這個(gè)反應(yīng)包括應(yīng)用引物6(SEQ ID NO12)和下面引物
引物105’-CCT GGA TCC TCA AAT TCT GTT ATA TAT GTC-3’(SEQID NO16)。
用Pfu Turbo DNA聚合酶(購(gòu)自Strategene，La Jolla，CA)和生產(chǎn)商提供的PCR反應(yīng)緩沖液進(jìn)行所有PCR反應(yīng)。PCR條件如下95℃，2分鐘；30個(gè)循環(huán)(95℃，1分鐘；55℃，2分鐘15秒；72℃，1分鐘。)，72℃，5分鐘，和4℃放置。
PCR反應(yīng)完成后，用NheI和BamHI酶消化新合成片段以產(chǎn)生粘性末端，在NheI和BamHI切割的pWRG7054表達(dá)載體中插入每個(gè)片段，產(chǎn)生克隆pPJV2004，pPJV2005和pPJV2007，它們分別編碼LTA、LTB和修飾的LTA(減去RDEL)。
在圖4、5和6中分別顯示了質(zhì)粒pPJV2004、pPJV2005和pPJV2007的限制圖譜和全序列。
實(shí)施例3對(duì)利用編碼CTA和/或CTB質(zhì)粒載體DNA疫苗的抗原特異性抗體應(yīng)答的增加利用編碼甲型流感病毒M2蛋白質(zhì)的DNA疫苗載體檢測(cè)pPJV2002，pPJV2003和pPJV2006佐劑載體在上下文粒子介導(dǎo)的DNA接種中的佐劑效果。通過(guò)在顯微可見(jiàn)金粒子上沉淀有/無(wú)各種pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006佐劑載體混合的M2 DNA疫苗載體，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJect Vaccines，Inc.Madison，WI)加速包被的金粒子進(jìn)入小鼠表皮，進(jìn)行粒子介導(dǎo)的DNA接種。
更具體地，用流感病毒株系A(chǔ)/Kagoshima/10/95(H3N2)的RNA片段#7(其編碼M2蛋白質(zhì))作為設(shè)計(jì)PCR引物的模型以有利于A/Sydney/5/97(H3N2)成熟M2編碼序列的克隆。因?yàn)锳/Sydney的RNA片段#7序列還沒(méi)有確定，所以用A/Kagoshima序列設(shè)計(jì)引物。預(yù)測(cè)M2序列中高度保守以有利于應(yīng)用從不同病毒株系設(shè)計(jì)的引物。
因?yàn)镸2是從剪接RNA翻譯的，所以認(rèn)為剪除了片段7 RNA編碼區(qū)的核苷酸位置27到714是必要的。因此，產(chǎn)生和設(shè)計(jì)一套PCR引物以產(chǎn)生完整M2編碼序列，但是確保從由此得到的M2編碼序列克隆中完全除去內(nèi)含子序列。用于產(chǎn)生全長(zhǎng)M2編碼序列克隆的PCR引物如下引物115’-CCC AAG CTT CCA CCA TGA GCC TTC TAA CCG AGG TCGAAA CAC CTA TCA GAA ACG AAT GGG AGT GC-3’(SEQ ID NO17)；和引物125’-CCC GGA TCC TTA CTC CAG CTC TAT GCT G-3’(SEQID NO18)。
引物11(SEQ ID NO17)5’-末端含有附加序列，其包含HindIII的識(shí)別位點(diǎn)和有助于mRNA翻譯起始的Kozak共有序列。引物12(SEQ IDNO18)5’-末端也含有附加序列，其包含BamHI的識(shí)別位點(diǎn)。
從在含胚雞蛋中生長(zhǎng)的A/Sydney/5/97(H3N2)樣品分離病毒RNA。所用的病毒RNA分離方法標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用從Stratagene(La Jolla，CA)得到的RT-PCR試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)中使用該病毒的RNA。通過(guò)加5.9μl無(wú)RNA酶的水到反應(yīng)試管中完成RT反應(yīng)的步驟。向試管加入試劑盒中的1.0μl 10XMMLV-RT緩沖液和1.0μl dNTP混合物。還加入1μl A/Sydney/5/97 RNA和0.6μl(0.6μg)引物11(SEQ ID NO17)。加熱反應(yīng)到65℃，5分鐘以變性RNA，隨后加入0.5μl試劑盒中的反轉(zhuǎn)錄酶。在37℃，溫育反應(yīng)15分鐘以完成反轉(zhuǎn)錄步驟。
通過(guò)向新反應(yīng)試管中添加下面成分完成PCR反應(yīng)步驟40μl水；試劑盒中的5μl 10X超級(jí)(ultra)HF緩沖液；試劑盒中的1.0μl dNTP混合物；1.0μl引物11(SEQ ID NO17)(1.0μg)；1.0μl引物12(SEQID NO18)(1.0μg)；1μl上述反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)混合物；和試劑盒中的1μlTurbo PFU聚合酶。用下面的溫育方案進(jìn)行PCR反應(yīng)95℃，1分鐘；接著30個(gè)循環(huán)(95℃，30秒；46℃，30秒；68℃，3分鐘)，隨后68℃，10分鐘。在2％瓊脂糖凝膠上電泳PCR產(chǎn)物，顯示了約300bp預(yù)期大小的單DNA帶。
從凝膠上分離約300bp帶，用HindIII和BamHI消化以產(chǎn)生必需的粘性末端用于插入pWRG7077疫苗表達(dá)載體(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)。用HindIII部分消化，用BamHI進(jìn)行完全消化pWRG7077 DNA以利于M2編碼插入的插入。要求載體部分HindIII消化是因?yàn)樵谠撡|(zhì)粒卡那霉素抗性標(biāo)記中存在第二個(gè)HindIII位點(diǎn)。由此得到的M2 DNA疫苗載體稱為為pM2-FL。pM2-FL載體含有人巨細(xì)胞病毒(hCMV)的立即早期啟動(dòng)子及其相關(guān)的內(nèi)含子A序列以驅(qū)動(dòng)M2編碼序列的轉(zhuǎn)錄。該載體也包含牛生長(zhǎng)激素基因的聚腺苷酸化序列。
然后在2微米金粒子上沉淀pM2-FL質(zhì)粒為單一載體，或加佐劑載體樣品成為混合載體(即，M2質(zhì)粒載與pPJV2002、pPJV2003，和/或pPJV2006佐劑載體混合)。具體地，在含有400μl 50mM亞精胺小離心管中，質(zhì)粒DNA(單一M2載體或添加有一個(gè)或多個(gè)佐劑載體的M2載體)與2微米金粒子(Degussa，Lot 65-0)混合。DNA和金的比率在2.5微克DNA/每毫克金到4.0微克DNA/每毫克金之間變化，而且一批含有26mg金。當(dāng)旋轉(zhuǎn)混合器上的離心管不斷攪拌期間，通過(guò)加1/10體積10％CaCl2，DNA在金粒子上沉淀。用純乙醇洗DNA-金復(fù)合物3次，然后將其注射到管式旋轉(zhuǎn)器包被機(jī)器(tube turner coating machine)(PowderJect Vaccines，Inc.，Madison WI)的TEFZEL管(McMaster-Carr)中，其用金/DNA復(fù)合物包被管內(nèi)部。美國(guó)專利號(hào)5,733,600描述了這種管式旋轉(zhuǎn)器機(jī)器(tubeturner machine)。也參見(jiàn)PCT專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US95/00780和美國(guó)專利號(hào)5,780,100；5,865,796和5,584,807。完成包被過(guò)程后，將離心管切成適于裝載到粒子遞送裝置的0.5英寸“筒”。
產(chǎn)生下面DNA-金制劑用于小鼠DNA疫苗佐劑試驗(yàn)。
制劑#1單獨(dú)的pM2-FL DNA載體，2.5微克DNA/每毫克金，0.5毫克金/每筒；制劑#2在一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金)上沉淀的pM2-FL DNA載體，在第二批金(1.75微克每種DNA佐劑載體/每毫克金)上其沉淀的pPJV2002和pPJV2003 DNA載體，相等地混合兩批金，0.5毫克金/每筒；制劑#3在一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2002和pPJV2003各1微克/每毫克金)上共沉淀所有pM2-FL DNA載體、pPJV2002和pPJV2003 DNA載體，0.5毫克金/每筒；
制劑#4在單獨(dú)一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2006和pPJV2003各1微克/每毫克金)上共沉淀所有pM2-FL DNA載體、pPJV2006和pPJV2003 DNA載體，0.5毫克金/每筒；制劑#5在單獨(dú)一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2002 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀pM2-FL DNA載體和pPJV2002，0.5毫克金/每筒；和制劑#6在單獨(dú)一批金(2微克pM2-FL DNA/每毫克金，pPJV2003 DNA\1微克/每毫克金)上共沉淀pM2-FL DNA載體和pPJV2003，0.5毫克金/每筒。
然后，給如下6組鼠施用這些DNA疫苗。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含7只動(dòng)物，每只動(dòng)物接受單獨(dú)制劑的兩次免疫，兩次免疫間有4周休息期。每次免疫由給腹部表皮一前一后兩次遞送組成(每次遞送一個(gè)筒)。用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJect Vaccines Inc.，Madi son，WI)，在400p.s.i.氦壓力，。初次免疫后4周(剛好在加強(qiáng)免疫前)和二次或加強(qiáng)免疫后2周收集血清樣品。
用ELISA測(cè)定法測(cè)定每個(gè)血清樣品的M2特異性抗體應(yīng)答，其中用由下面序列組成的M2合成肽預(yù)先包被96孔板SLLTEVETPIRNEWECR(SEQ IDNO19)。用M2肽包被ELISA板，4℃過(guò)夜，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中肽濃度1μg/ml。第二天，用5％PBS中脫脂奶粉，室溫封閉板1小時(shí)。然后用沖洗緩沖液(10mMTris緩沖鹽溶液，0.1％Brij-35)洗板三次。然后向孔中加稀釋的血清樣品，在室溫下，溫育板2小時(shí)。然后用沖洗緩沖液洗板三次。加入100μl的第二抗體，室溫下，溫育板1小時(shí)。第二抗體由羊抗-鼠IgG(H+L)生物素標(biāo)記的抗體(Southern Biotechnology)組成，其在1％BSA/PBS/0.1％Tween-20中以1∶8000比率稀釋。然后洗板三次，加入在PBS/0.1％Tween-20中以1∶8000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白素-辣根過(guò)氧化物酶共軛物(Southern Biotechnology)，室溫下，溫育板1小時(shí)。另外洗3次后，加入100μl TMB底物(Bio Rad，Hercules，CA)，室溫下，進(jìn)行顯色30分鐘。通過(guò)加入1N H2SO4終止顯色，在450nm讀板。通過(guò)鑒定血清最高稀釋度檢測(cè)終點(diǎn)稀釋效價(jià)，該最高稀釋度仍舊產(chǎn)生吸光度值，其是用非免疫對(duì)照樣品獲得的背景吸光度值的兩倍。
在下表1中所示是每組中個(gè)體動(dòng)物的終點(diǎn)抗體效價(jià)和每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的幾何平均效價(jià)。
表1


*(已死亡)如所觀察，與僅用M2載體(制劑#1)免疫的對(duì)照動(dòng)物比較，用含有一個(gè)或多個(gè)CT編碼佐劑載體(制劑#2-6)免疫的所有實(shí)驗(yàn)組在加強(qiáng)免疫后都顯示了增加的幾何平均效價(jià)。
實(shí)施例4用編碼CT-A和CT-B亞基肽佐劑質(zhì)粒載體，對(duì)編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg)DNA疫苗的抗原特異性細(xì)胞應(yīng)答的增加如下構(gòu)建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)載體質(zhì)粒。為了產(chǎn)生HbsAg編碼序列，用NcoI切割pAM6構(gòu)建體(得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心“ATCC”得到)，用綠豆核酸酶處理以除去X-抗原起始密碼子。然后用BamHI切割由此產(chǎn)生的DNA，用T4 DNA聚合酶處理成平末端DNA，產(chǎn)生HBsAg表達(dá)盒子。HBsAg表達(dá)盒子以1.2kB片段存在。用HindIII和BglII切割含有全長(zhǎng)人CMV(Towne株系)立即早期啟動(dòng)子(帶有增強(qiáng)子)的質(zhì)粒構(gòu)建體pPJV7077(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)，然后用T4 DNA聚合酶和小牛堿性磷酸酶處理以產(chǎn)生平端DNA，HBsAg表達(dá)盒子連接到質(zhì)粒中產(chǎn)生pWRG7 128構(gòu)建體。
在上面實(shí)施例3所述過(guò)程后，在金粒子上沉淀pWRG7128質(zhì)粒，再一次用2微克DNA/每毫克金?；旌媳磉_(dá)CTA和CTB亞基基因(分別是pPJV2002和pPJV2003)的佐劑質(zhì)粒載體在一起，在金粒子上沉淀，每個(gè)質(zhì)粒以1微克DNA/每毫克金存在，這樣總量也是2微克DNA/每毫克金。以1∶1混合用pWRG7128包被的金粒子和用pPJV2002及pPJV2003包被的金粒子，然后裝載到如上提到的TEFZEL管中。對(duì)于免疫，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置，用上述實(shí)施例3相同的遞送條件遞送表示1μg DNA(0.5μg pWRG7128質(zhì)粒和pPJV2002及pPJV2003質(zhì)粒各0.25μg)的0.5英寸長(zhǎng)的管進(jìn)入Balb/c小鼠表皮。對(duì)于對(duì)照，用僅由pWRG7128包被的金粒子(每次遞送1微克DNA/0.5毫克金)免疫小鼠。在第4周，免疫和加強(qiáng)免疫小鼠(每個(gè)實(shí)驗(yàn)組4只)，然后，在后加強(qiáng)免疫2周時(shí)處死小鼠。通過(guò)ELISA的血清抗體水平評(píng)估免疫應(yīng)答。此外，用ELISPOT測(cè)定法定量CD8-特異的IFN-γ分泌來(lái)檢測(cè)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
用ELISA測(cè)定法檢測(cè)每只鼠血清樣品HBsAg特異的抗體。對(duì)于ELISA，用純化HBsAg(BioDesign)，以每孔0.1μg，在PBS(磷酸緩沖鹽，BioWhittaker)中包被Falcon Pro Bind微量滴定板，4℃過(guò)夜。室溫下(RT)，用5％奶粉/PBS封閉板1小時(shí)，然后用沖洗緩沖液(10mM Tris緩沖鹽溶液，0.1％Brij-35)，洗3次，向板中加入在稀釋緩沖液(2％奶粉/PBS/0.05％Tween 20)中稀釋的血清樣品，在室溫(RT)溫育2小時(shí)。洗板3次，向板中加入在稀釋緩沖液中以1∶8000稀釋的生物素?；难蚩故罂贵w(Southern Biotechnology)，室溫溫育1小時(shí)。溫育后，洗板3次，之后，加入PBS中1∶8000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白素-辣根過(guò)氧化物酶共軛物(Southern Biotechnology)，在室溫下，進(jìn)一步溫育板1小時(shí)。另外洗3次后，洗板3次，然后加入TMB底物溶液(BioRad)，30分鐘后，用1N H2SO4停止反應(yīng)。在450nm讀光密度，通過(guò)樣品和已知效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)比較計(jì)算終點(diǎn)效價(jià)。
對(duì)于細(xì)胞免疫測(cè)定法，在與已知Balb/C小鼠中CD8抗原表位對(duì)應(yīng)的肽存在情況下，體外培養(yǎng)免疫動(dòng)物脾臟脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。在DMSO(10mg/ml)中溶解肽，在培養(yǎng)中稀釋到10ug/ml。肽序列是IPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO20)。
對(duì)于IFN-γELISPOT測(cè)定法，用50μl的15μg/ml抗-IFN-γ抗血清(Pharmingen)在無(wú)菌0.1M碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中包被微孔多篩選膜過(guò)濾板，4℃過(guò)夜。用無(wú)菌PBS洗板6次，然后用含有10％胎牛血清(FBS)的組織培養(yǎng)基在室溫下封閉1-2小時(shí)。除去培養(yǎng)基，按照每孔1×106細(xì)胞總數(shù)，向孔中分配脾臟細(xì)胞。對(duì)于少于1×106免疫動(dòng)物細(xì)胞的孔，加入首次用于實(shí)驗(yàn)的(naive)動(dòng)物細(xì)胞達(dá)到1×106總數(shù)。在上述肽存在情況下，細(xì)胞在組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱中溫育過(guò)夜。然后用PBS洗板2次，用蒸餾水洗1次。隨后用PBS洗3次。向板中(PBS中1μg/ml溶液50μl)加入生物素?；目笽FN-γ單克隆抗體(Pharmingen)，室溫溫育2小時(shí)。用PBS洗板6次，之后，加入50μl鏈霉抗生物素蛋白素堿性磷酸酶共軛物(PBS中1∶1000，Pharmingen)，室溫，溫育2小時(shí)。用PBS洗板6次，加入堿性磷酸酶顯色底物(BioRad)，進(jìn)行這個(gè)反應(yīng)直到暗斑出現(xiàn)。通過(guò)用水洗3次終止反應(yīng)?？諝飧稍锇?，在顯微鏡下計(jì)數(shù)斑。
對(duì)于IFN-γELISA測(cè)定法，在肽存在的情況下，在圓底96孔組織培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞。取上清液的樣品用于IFN-γ水平測(cè)定。用100μl0.5ug/ml抗小鼠IFN-γ抗體(Pharmingen)在碳酸氫鹽緩沖液中，pH 9.6包被高結(jié)合的板(Costar)。用含有10％FBS的組織培養(yǎng)基，室溫下封閉板1小時(shí)，然后用TBS沖洗緩沖液洗3次。在組織培養(yǎng)基中稀釋獲自培養(yǎng)細(xì)胞的上清液樣品，加載到板上，室溫溫育2小時(shí)。用沖洗緩沖液洗板3次，向板中加第二抗體(PBS中0.5μg/ml生物素酰化的大鼠抗-小鼠INF-γ，Pharmingen)，室溫溫育1小時(shí)。洗板3次，加入鏈霉抗生物素蛋白素-辣根過(guò)氧化物酶共軛物(PBS中12000，SouthernBiotechnology)室溫1小時(shí)。洗板3次，加入TMB底物溶液(BioRad)，用1N H2SO4終止反應(yīng)。在450nm讀光密度。
在下表2中報(bào)告了ELISA結(jié)果。
表2

如所觀察到的，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用pWRG7128免疫的對(duì)照小鼠的抗體水平比用pWRG7128和CT佐劑載體(pPJV2002和pPJV2003)免疫小鼠的抗體水平高。對(duì)照動(dòng)物平均終點(diǎn)效價(jià)是55,000，而用佐劑制劑免疫動(dòng)物的平均效價(jià)是23,000。然而，接受佐劑制劑的組實(shí)際接受了作為對(duì)照pWRG7128量的1/2，這解釋了抗體效價(jià)降低的原因。
在兩組小鼠中測(cè)定的細(xì)胞免疫應(yīng)答表明了通過(guò)CT佐劑載體，細(xì)胞應(yīng)答顯著增強(qiáng)。更具體地，在下面表3中描述了CD8特異性IFN-γELISA測(cè)定法的結(jié)果。
表3

在該IFN-γELISA測(cè)定中，每孔的細(xì)胞數(shù)表示從平板每孔的免疫動(dòng)物恢復(fù)的細(xì)胞數(shù)。每孔總細(xì)胞數(shù)是常數(shù)(例如，1×106)，而且用首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物細(xì)胞補(bǔ)充。數(shù)值是在450nm測(cè)定的OD讀數(shù)。發(fā)現(xiàn)用CT佐劑制劑處理的小鼠細(xì)胞在ELISA中有較高OD值，表明這些細(xì)胞分泌較大量的IFN-γ以對(duì)抗原應(yīng)答。在IFN-γELISA中，首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠沒(méi)有產(chǎn)生可測(cè)量的OD值。
下表4描述了CD8特異性IFN-γELISPOT測(cè)定法的結(jié)果。
表4

在該IFN-γELISPOT測(cè)定中，數(shù)字是重復(fù)孔的平均值，與每1×106細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)對(duì)應(yīng)。在該ELISPOT測(cè)定中，首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠細(xì)胞沒(méi)有產(chǎn)生任何斑點(diǎn)。此外，在用CT佐劑制劑處理的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了較大量的ELISPOTs，表明比單獨(dú)接受抗原(pWRG7128)的動(dòng)物優(yōu)越的應(yīng)答。
上述數(shù)據(jù)表明本發(fā)明新的佐劑組合物具有增強(qiáng)對(duì)共施用抗原細(xì)胞免疫應(yīng)答的有效能力，在這種情況下，從DNA疫苗表達(dá)HbsAg。
實(shí)施例5用gp120抗原載體和CTA/CTB佐劑載體同時(shí)遞送，對(duì)HIV-1gp120抗原體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的增加如下文構(gòu)建編碼HIV-1 gp120的質(zhì)粒載體。用Bluescript(Stratagene，La Jolla，CA)質(zhì)粒骨架、人巨細(xì)胞病毒(hCMV)立即早期啟動(dòng)子(Fuller等(1994)Aids Res.Hum Retroviruses101433)和SV40病毒晚期聚腺苷酸化位點(diǎn)開(kāi)始構(gòu)建載體。HCMV啟動(dòng)子包含在619個(gè)堿基對(duì)(bp)AccII片段內(nèi)，從立即早期轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向上游延伸522個(gè)堿基對(duì)，向下游延伸96個(gè)堿基對(duì)。SV40病毒晚期聚腺苷酸化序列包含在來(lái)自于pSV2dhfr(以前得自Bethesda Research Laboratories，catalogue#5369 SS)約800個(gè)堿基對(duì)的BamHI-BglII內(nèi)。最初，構(gòu)建編碼HIV-1gp160，稱為“pC-Env”的質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有來(lái)自于LAV-1BRU(ATCC登記號(hào)53069，GenBank登記號(hào)K02013)的2565堿基對(duì)的KpnI-XhoI片段，其在編碼成熟gp160氨基末端氨基酸位置#4的序列開(kāi)始。緊鄰下游放置env編碼序列片段，并在框架中與皰疹單純病毒糖蛋白D(gD)信號(hào)肽的160bp合成片段融合，沒(méi)有成熟gD氨基末端氨基酸，如先前所述(Fuller等(1994)Aids Res.Hum Retroviruses101433)。
如下文，然后構(gòu)建編碼HIV-1 gp120，這里稱為“pCIA-Env/T”的質(zhì)粒。pCIA-Env/T質(zhì)粒編碼HIV-1 gp160截短的形式，除了在核苷酸位置8188的HindIII位點(diǎn)截短env編碼序列外，其與pC-Env構(gòu)建體相同。這就產(chǎn)生了截短gp160翻譯產(chǎn)物，具有位于gp120/gp41加工位點(diǎn)下游128個(gè)氨基酸殘基的截短點(diǎn)。
如下文，構(gòu)建編碼HIV-1 rev，這里稱為“pC-rev”的第二個(gè)質(zhì)粒載體。該載體含有LAV-1BRU原病毒(核苷酸位置678-1085、5821-6379和8188-8944)的三個(gè)不連續(xù)區(qū)，直接置于如上所述hCMV啟動(dòng)子和SV40病毒晚期聚腺苷酸化序列間。這三個(gè)不連續(xù)區(qū)分別含有主要5’剪接供體，rev基因的第一內(nèi)含子，和rev基因的第二內(nèi)含子。
稱為“pWRG7054”的第三個(gè)質(zhì)粒載體構(gòu)建體在研究中用做空載體對(duì)照。pWRG7054構(gòu)建體含有SIV nef編碼區(qū)，hCMV立即早期啟動(dòng)子和內(nèi)含子A區(qū)，TPA前導(dǎo)序列和牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列。在下文實(shí)施例6中描述了pWRG7054質(zhì)粒的構(gòu)建。
產(chǎn)生下面DNA-金制劑用于小鼠DNA疫苗佐劑試驗(yàn)。
制劑#1空載體對(duì)照(pWRG7054，無(wú)gp120插入)，2.5微克DNA/每毫克金，0.5毫克金/每筒；制劑#2在單獨(dú)一批金(pWRG7054 DNA和pCIA-EnvT DNA各1.25微克/每毫克金，0.12微克pC-rev/每毫克金)上共沉淀所有空載體對(duì)照(pWRG7054)、gp120(pCIA-EnvT)DNA載體，和rev(pC-rev)DNA載體(允許HIV-1 gp120分子表達(dá))，0.5毫克金/每筒；制劑#3在單獨(dú)一批金(1.25微克pWRG7054/每毫克金、pPJV2002和pPJV2003 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀所有空載體對(duì)照(pWRG7054)、CTA(pPJV2002)和CTB(pPJV2003)DNA載體，0.5毫克金/每筒；
制劑#4在單獨(dú)一批金(1.25微克pCIA-EnvT DNA/每毫克金、0.125微克pC-rev DNA/每毫克金、pPJV2002和pPJV2003 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀所有g(shù)p120(pCIA-EnvT)DNA載體、HIV-1 rev(pC-rev)DNA載體、CTA(pPJV2002)和CTB(pPJV2003)DNA載體，0.5毫克金/每筒；和制劑#5在單獨(dú)一批金gp120(1.25微克pCIA-EnvT DNA/每毫克金、0.125微克pC-rev DNA/每毫克金，pPJV2006和pPJV2003 DNA各1微克/每毫克金)上共沉淀所有(pCIA-EnvT)DNA載體、HIV-1 rev(pC-rev)DNA載體、CTA-KDEL(pPJV2006)和CTB(pPJV2003)DNA載體，0.5毫克金/每筒。
在上文實(shí)施例3所述過(guò)程后，在金粒子上沉淀pWRG7054、pCIA-EnvT、pC-rev、pPJV2002、pPJV2003和pPJV2006質(zhì)粒載體，也用2微克DNA/每毫克金。再一次用上文實(shí)施例3所述的過(guò)程，裝載包被的金粒子到TEFZEL管中。對(duì)于免疫，用粒子遞送裝置，在上述實(shí)施例3所述相同的遞送條件(400p.s.i.氦)下，用兩個(gè)0.5英寸長(zhǎng)的管遞送總載重1.0mg的金進(jìn)入5-6周齡雌性Balb/c小鼠表皮。
5個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每種DNA疫苗制劑各是一個(gè)試驗(yàn)組)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組由4只動(dòng)物組成，每個(gè)動(dòng)物用它們各自制劑進(jìn)行初次和加強(qiáng)免疫，時(shí)間在第0和5周。用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJect Vaccines Inc.，Madi son，WI)，每次免疫由兩次一前一后給腹部表皮的遞送構(gòu)成(每次遞送一個(gè)筒)。
用ELISA測(cè)定法，在第5周和6.5周(分別是初次免疫后和加強(qiáng)免疫后)收集的樣品檢測(cè)對(duì)HIV gp120抗原的血清抗體應(yīng)答。對(duì)于ELISA，在50μl-PBS中，用0.3μg/孔的重組HIV gp120(Intracel)包被Costar高結(jié)合EIA板，4℃過(guò)夜溫育。洗板3次，室溫下，用2％PBS中BSA封閉2小鼠。向包被板中加入系列血清稀釋液，37℃溫育1小時(shí)。板后，板與共軛結(jié)合羊抗-鼠IgG(H+L)(BioRad)的1∶1500稀釋度的堿性磷酸酶溫育，隨后用對(duì)硝基苯磷酸(PNPP)顯色，在405nm讀OD值。
在圖7中描述了ELISA結(jié)果，如所觀察到的，接受佐劑載體(含有pPJV2002和pPJV2003載體的制劑#4，或含有pPJV2006和pPJV2003載體的制劑#5)與gp120載體聯(lián)合的組與接受gp120載體，而無(wú)佐劑的組(制劑#2，pCIA-EnvT)比較，gp120特異性免疫應(yīng)答約增加20倍。
收集加強(qiáng)免疫后血清樣品后，處死動(dòng)物，收集每只鼠的脾臟。通過(guò)碾碎脾臟分離脾細(xì)胞，將細(xì)胞通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾器，用ACK裂解緩沖液(BioWhittaker)裂解紅血細(xì)胞。用RPMI-5％FCS洗脾細(xì)胞3次，在添加抗生素、丙酮酸鈉和非必需氨基酸的RPMI-10％FCS中重懸浮到1×107細(xì)胞/ml的濃度。
用原位ELISA測(cè)定脾細(xì)胞分泌的抗原特異IFN-γ的量。在50μl0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)中，用10μg/ml抗-小鼠IFN-γ捕獲單克隆抗體(mAb)(Pharmingen，San Diego，CA)包被Costar高結(jié)合板。4℃，溫育過(guò)夜后，用PBS-0.05％Tween-20洗孔5次，用200μl完全R10培養(yǎng)基，室溫封閉2小時(shí)。向每孔加入1×106脾細(xì)胞，在僅有培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)，或有1μg/ml HIV gp120肽的培養(yǎng)基中刺激，該肽有下面的序列RIQRGPGRAFVITGK(SEQ ID NO21)。在5％CO2中，在37℃溫育24小時(shí)后，用去離子(DI)水洗板2次以裂解細(xì)胞，然后用PBS-0.05％Tween 20洗3次，室溫下與每孔50μl的1μg/ml生物素?；?小鼠IFN-γ檢測(cè)mAb(Pharmingen)溫育1小時(shí)。然后洗板5次，與每孔50μl的1∶8000稀釋度的鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶液(Southern Biotechnology)溫育1小時(shí)。再一次洗板5次，通過(guò)加TMB底物(BioRad，Hercules，CA)，室溫進(jìn)行30分鐘完成比色計(jì)顯色。通過(guò)加1N硫酸終止反應(yīng)。用光學(xué)板讀數(shù)器讀取450nm的吸光度。
在圖8中描述了該研究的結(jié)果。該圖表示在接受上述制劑(制劑#1-5)的5個(gè)不同疫苗實(shí)驗(yàn)組中，抗原特異性IFN-γ生產(chǎn)的相對(duì)水平。重要地，接受gp120載體(pCIA-EnvT)與CT佐劑載體(即含有pPJV2002和pPJV2003載體的制劑#4，含有pPJV2006和pPJV2003載體的制劑#5)聯(lián)合的兩個(gè)免疫組顯示了比接受gp120，而無(wú)佐劑的組(含有空載體對(duì)照和pCIA-EnvT的制劑#2)顯著高的IFN-γ生產(chǎn)水平(分別是P＜0.000001和P＝0.0068)。這些數(shù)據(jù)證明在動(dòng)物模型中該CT載體佐劑聯(lián)合具有顯著增加對(duì)HIV抗原的抗原特異性細(xì)胞免疫的能力。
除了IFN-γ生產(chǎn)水平增加外，如用ELISPOT方法所測(cè)定，分泌IFN-γ的HIV-gp120肽-特異性脾細(xì)胞也顯著增加。用IFN-γ捕獲抗體包被用于T輔助細(xì)胞IFN-γ原位ELISA的硝酸纖維素板(微孔)，如上所述，沖洗，封閉。以1×106細(xì)胞/孔的加載細(xì)胞數(shù)向預(yù)包被孔中加入脾細(xì)胞，在僅有培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)或含有1μg/ml肽的培養(yǎng)基中刺激，該肽含有免疫優(yōu)勢(shì)HIV-gp120 CTL抗原表位，和具有下面的序列RGPGRAFVTI(SEQID NO22)。在5％CO2中，在37℃，溫育板24小時(shí)，用去離子水洗2次，用PBS洗3次，在室溫下，與每孔50μl的1μg/ml生物素?；?小鼠IFN-γ檢測(cè)mAb(Pharmingen)溫育1小時(shí)。然后洗板5次，與每孔50μl的1∶1000稀釋度的鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(ALP)溶液(Mabtech)溫育1小時(shí)。再一次洗板5次，通過(guò)添加ALP膜底物(BioRad，Hercules，CA)，直到斑點(diǎn)形成(室溫，2-30分鐘)完成比色計(jì)顯色。通過(guò)用去離子水洗終止反應(yīng)，空氣干燥板，過(guò)夜。在40X顯微鏡下斑點(diǎn)。僅僅計(jì)數(shù)有模糊邊界的大斑點(diǎn)計(jì)數(shù)為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)。
在圖9中描述了ELISPOT測(cè)定的結(jié)果，該圖表示在5個(gè)不同疫苗實(shí)驗(yàn)組(分別接受制劑#1-5)中產(chǎn)生IFN-γ脾臟細(xì)胞的相對(duì)水平。重要地，接受gp120載體(pCIA-EnvT)與CT佐劑載體(即含有pPJV2002和pPJV2003載體的制劑#4，含有pPJV2006和pPJV2003載體的制劑#5)聯(lián)合的兩個(gè)免疫組顯示了比接受gp120，而無(wú)佐劑的組(含有空載體對(duì)照和pCIA-EnvT的制劑#2)顯著高的生產(chǎn)IFN-γ的細(xì)胞數(shù)(分別是P＜0.000001和P＝0.0032)。這些數(shù)據(jù)證明在動(dòng)物模型中該CT佐劑聯(lián)合具有顯著增加對(duì)共施用HIV gp120抗原的抗原特異性細(xì)胞免疫的能力。此外，在這些研究中所觀察到增加的IFN-γ生產(chǎn)表明CT佐劑載體與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用在免疫動(dòng)物中提供了強(qiáng)Th1樣免疫應(yīng)答。
實(shí)施例6
用編碼HBcAg和HBsAg載體和CTA/CTB佐劑載體的同時(shí)遞送，對(duì)乙型肝炎核心和表面抗原的抗體應(yīng)答的增強(qiáng)如下文，構(gòu)建含有乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)編碼序列的載體質(zhì)粒。從HBV克隆pAM6(ATCC登記號(hào)45020)得到HBsAg和HbsAg編碼序列。為了產(chǎn)生HBsAg編碼序列，用NcoI切割pAM6構(gòu)建體，用綠豆核酸酶處理以除去X-抗原起始密碼子。然后用BamHI切割由此產(chǎn)生的DNA，用T4 DNA聚合酶處理成平末端DNA，產(chǎn)生HBsAg表達(dá)盒子。HBsAg表達(dá)盒子以1.2kB片段存在。用HindIII和BglII切割含有全長(zhǎng)人CMV(Towne株系)立即早期啟動(dòng)子(帶有增強(qiáng)子)的質(zhì)粒構(gòu)建體pPJV7077(Schmaljohn等(1997)J.Virol.719563-9569)，然后用T4 DNA聚合酶和小牛堿性磷酸酶處理以產(chǎn)生平末端DNA，HBsAg表達(dá)盒子連接到質(zhì)粒中產(chǎn)生pWRG7128構(gòu)建體。
為了產(chǎn)生HBcAg編碼序列，切割pAM6構(gòu)建體產(chǎn)生HBcAg表達(dá)盒子，之后，通過(guò)位點(diǎn)定向誘變截短HBcAg序列以除去核心抗原粒子的C-末端精氨酸富集區(qū)(其缺失不影響粒子形成)。然后克隆截短的HBcAg序列到含有人延長(zhǎng)因子啟動(dòng)子(“hELF”，Mizushima等(1990)Nucl.AcidsRes.185322)的質(zhì)粒構(gòu)建體中以提供HBcAg載體構(gòu)建體。
分別從JW4303載體構(gòu)建體(Harriet Robinson博士，University ofMassachusetts惠贈(zèng))獲得包含(a)CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，內(nèi)含子A-5’非翻譯區(qū)，和人組織血纖蛋白溶酶原激活物(hTPA)信號(hào)肽(“CMV-IA-TPA”)；或(b)牛生長(zhǎng)激素polyA序列(bGHpA)的表達(dá)盒子，并入插入到質(zhì)粒骨架中。用NheI切割由此產(chǎn)生的構(gòu)建體，用聚合酶補(bǔ)平，然后用BamHI切割以產(chǎn)生含有pUC19復(fù)制原點(diǎn)，氨芐青霉素抗性基因和bGHpA序列的載體片段。用SalI第二次切割質(zhì)粒骨架，用聚合酶補(bǔ)平，用BamHI切割以釋放含有CMV-IA-TPA載體片段的載體片段。連接兩個(gè)載體片段以產(chǎn)生命名為pWRG7054的構(gòu)建體。
用NheI切割pWRG7054構(gòu)建體，用聚合酶補(bǔ)平，用BamHI切割以產(chǎn)生載體片段。用NcoI切割HBcAg載體構(gòu)建體，用聚合酶補(bǔ)平，用BamHI切割以產(chǎn)生插入片段。然后連接兩個(gè)片段以產(chǎn)生命名為pWRG7063的構(gòu)建體。
用EcoRI切割PEL-Bos，用牛小腸磷酸酶去磷酸化以產(chǎn)生載體片段用HindIII切割pWRG7063質(zhì)粒，用聚合酶補(bǔ)平，用EcoRI切割以產(chǎn)生包含hTPA信號(hào)肽、HBcAg抗原序列和bGHpA區(qū)的插入片段。連接兩個(gè)片段以提供命名為pWRG7145的構(gòu)建體。
用EcoRI切割pWRG7128構(gòu)建體，用牛小腸磷酸酶去磷酸化以產(chǎn)生含有hCMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制的HbsAg編碼區(qū)的載體片段。用MfeI和EcoRI切割pWRG7145構(gòu)建體以產(chǎn)生包含hELF啟動(dòng)子/內(nèi)含子、hTPA信號(hào)肽序列、HBcAG抗原序列和bGHpA區(qū)域的插入片段。然后連接這些片段以提供含有HBcAg和HBsAg編碼序列的pPJV7193質(zhì)粒構(gòu)建體。
然后產(chǎn)生下面的DNA-金制劑用于豬DNA疫苗佐劑試驗(yàn)制劑#1對(duì)照、單獨(dú)的HBcAg/HBsAg載體(pWRG7193)、2微克DNA/每毫克金、0.5毫克金/每筒；和制劑#2在單獨(dú)一批金(1.0微克pWRG7193 DNA/每毫克金，pPJV2006和pPJV2003 DNA各0.5微克/每毫克金)上共沉淀所有HBcAg/HBsAg載體(pWRG7193)、CTA-KDEL(pPJV2006)和CTB(pPJV2003)DNA載體，0.5毫克金/每筒。
在上文實(shí)施例3所述過(guò)程后，再一次，在金粒子上以2微克DNA/每毫克金的最終濃度沉淀單獨(dú)或與pPJV2006和pPJV2003佐劑載體一起沉淀pWRG7193質(zhì)粒。用上文實(shí)施例3所述方法，加載包被的金粒子到TEFZEL管中。兩個(gè)試驗(yàn)組(每個(gè)由5頭家豬組成)分別接受用制劑#1和制劑#2的兩次免疫，其中兩次免疫的間隔是6周，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置，每次免疫包括遞送給腹股溝區(qū)的兩個(gè)一前一后500p.s.i.射擊，其中每次射擊用一個(gè)筒。因此，在對(duì)照組(制劑#1)中，每次免疫由總共1毫克金和2微克DNA疫苗載體pWRG7193的遞送構(gòu)成。類似地，在佐劑實(shí)驗(yàn)組(制劑#2)中，每次免疫包括總共1毫克金，2微克DNA疫苗載體pWRG7193，和佐劑載體pPJV2006和pPJV2003各1微克的遞送。在加強(qiáng)免疫(第6周)和加強(qiáng)免疫后2周(第8周)時(shí)，收集血液樣品。
如下文，進(jìn)行對(duì)核心抗原特異的抗體應(yīng)答檢測(cè)在PBS中，以100ng/ml乙型肝炎核心抗原(Biodesign)包被ELISA板。包被后，在4℃過(guò)夜。室溫，在PBS中，用5％脫脂奶粉封閉板1小時(shí)。然后用含有0.05％Tween-20的PBS洗板3次。在2％脫脂奶粉/PBS/0.01％Tween-20中連續(xù)稀釋豬血清樣品，加到ELISA板中。室溫，溫育2小時(shí)后，用PBS/0.05％Tween-20洗板3次。第二抗體由與辣根過(guò)氧化物酶共軛結(jié)合的羊抗豬IgG構(gòu)成(Kirkegaard and Perry)，在2％脫脂奶粉/PBS/0.01％Tween-20中以1∶2000稀釋，加入板中，室溫溫育1小時(shí)。然后用PBS/0.05％ Tween-20洗板5次，加入100μl-TMB底物。進(jìn)行顯色15分鐘，通過(guò)加入100μl1N H2SO4終止顯色。在450nm讀板。圖10和11分別表示在第6和8周時(shí)，兩組豬中每一組在4個(gè)不同血清稀釋度時(shí)的幾何平均吸光度值。這些數(shù)據(jù)證明在應(yīng)用CT佐劑載體pPJV2006和pPJV2003后，對(duì)乙型肝炎核心抗原的抗體效價(jià)的顯著增加。
除了對(duì)乙型肝炎核心抗原增加的體液應(yīng)答外，在佐劑實(shí)驗(yàn)組中也觀察到了對(duì)乙型肝炎表面抗原特異的抗體應(yīng)答可檢測(cè)的增加。在每個(gè)動(dòng)物血清樣品中，用商購(gòu)測(cè)定試劑盒(AUSAB，Abbott Laboratories)定量表面抗原特異性抗體。該試劑盒允許用標(biāo)準(zhǔn)板以毫國(guó)際單位(mIU/ml)進(jìn)行抗體應(yīng)答定量。在對(duì)照組(制劑#1)和佐劑實(shí)驗(yàn)組(制劑#2)中，幾何平均表面抗原抗體效價(jià)分別是285和662mIU/ml，證明了該佐劑質(zhì)粒(pPJV2006和pPJV2003)具有增加對(duì)分離載體編碼抗原的免疫應(yīng)答的能力。
實(shí)施例7對(duì)利用編碼CT或LT亞基質(zhì)粒載體的DNA疫苗的細(xì)胞Th1樣免疫應(yīng)答的增加用編碼甲型流感病毒M2蛋白質(zhì)的pM2-FL DNA疫苗載體檢測(cè)pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004、pPJV2005、pPJV2006和pPJV2007佐劑載體在粒子介導(dǎo)的DNA接種上下文中的佐劑效果。通過(guò)在顯微可見(jiàn)金粒子上沉淀有/無(wú)各種佐劑載體混合的M2 DNA疫苗載體，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJect Vaccines，Inc.Madison，WI)加速包被的金粒子進(jìn)入小鼠表皮，進(jìn)行粒子介導(dǎo)的DNA接種。在上述實(shí)施例3中描述了pM2-FL DNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建。
如上述，在2微米金粒子上沉淀pM2-FL質(zhì)粒為單一載體，或加佐劑載體樣品成為混合載體。具體地，在含有亞精胺小離心管中，質(zhì)粒DNA(單一pM2-FL載體或添加有一個(gè)或多個(gè)佐劑載體的pM2-FL載體)與2微米金粒子(Degussa)混合。在實(shí)施例3的方法后，進(jìn)行沉淀，然后也如實(shí)施例3所述，包被的金粒子包被到TEFZEL管內(nèi)表面。然后將管切成適于裝載到粒子遞送裝置的0.5英寸“筒”。
產(chǎn)生下面DNA-金制劑用于小鼠DNA疫苗佐劑試驗(yàn)。
制劑#1pM2-FL DNA載體與pWRG7054空質(zhì)粒載體在同一批金上沉淀前混合，2.1微克總DNA/每毫克金(0.1微克pM2-FL和2.0微克pWRG7054)，0.5毫克金/每筒；制劑#2pM2-FL DNA載體與CTA和CTB(pPJV2002和pPJV2003)DNA載體在同一批金上沉淀前混合，2.1微克總DNA/每毫克金(每種DNA佐劑載體各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#3在一批金上共沉淀所有混合有CTA-KDEL和CTB(pPJV2006和pPJV2003)DNA載體的pM2-FL DNA載體，2.1微克總DNA/每毫克金(每種DNA佐劑載體各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#4在一批金上混合和共沉淀所有混合有CTA-KDEL(pPJV2006)DNA載體和添加有pWRG7054空質(zhì)粒載體的pM2-FLDNA載體，2.1微克總DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2006、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#5混合有CTA(pPJV2002)DNA載體和添加有pWRG7054空質(zhì)粒載體的pM2-FL DNA載體，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克總DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2002、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#6混合有CTB(pPJV2003)DNA載體和添加有pWRG7054空質(zhì)粒載體的pM2-FL DNA載體，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克總DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2003、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#7pM2-FL DNA載體與LTA和LTB(pPJV2004和pPJV2005)DNA載體在一批金上共沉淀之前混合，2.1微克總DNA/每毫克金(每種DNA佐劑載體各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#8在一批金上共沉淀所有混合有LTA-RDEL和LTB(pPJV2007和pPJV2005)DNA載體的pM2-FL DNA載體，2.1微克總DNA/每毫克金(每種DNA佐劑載體各1.0微克/每毫克金，0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#9在一批金上混合和共沉淀所有混合有LTA-RDEL(pPJV2007)DNA載體和添加有pWRG7054空質(zhì)粒載體的pM2-FL DNA載體，2.1微克總DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2007、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；制劑#10混合有LTA(pPJV2004)DNA載體和添加有pWRG7054空質(zhì)粒載體的pM2-FL DNA載體，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克總DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2004、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒；和制劑#11混合有LTB(pPJV2005)DNA載體和添加有pWRG7054空質(zhì)粒載體的pM2-FL DNA載體，在一批金上混合和共沉淀所有DNAs，2.1微克總DNA/每毫克金(1.0微克pPJV2005、1.0微克pWRG7054、0.1微克pM2-FL)，0.5毫克金/每筒。
然后，如下所述給11組小鼠施用這些DNA疫苗制劑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含8只動(dòng)物，每只動(dòng)物用其各自制劑進(jìn)行兩次免疫，兩次免疫間有4周休息期。用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJect Vaccines Inc.，Madison，WI)，在400p.s.i.氦壓力，每次免疫由兩次一前一后遞送給腹部表皮的遞送構(gòu)成(每次一筒)。在第二次或加強(qiáng)免疫后兩周收集血清樣品。
除了利用對(duì)IgG1或IgG2a特異性的第二抗體共軛物外，用上文實(shí)施例3用于總IgG效價(jià)檢測(cè)的ELISA測(cè)定法檢測(cè)個(gè)體血清樣品對(duì)IgG和IgG2a亞類的M2特異性抗體應(yīng)答。從Southern BiotechnologyAssociates，Inc.(目錄#1070-08，濃度0.5mg/ml)獲得羊抗-鼠IgG1-生物素共軛結(jié)合的抗體，以1/8000稀釋度使用。從相同的來(lái)源(目錄#1080-08，濃度0.5mg/ml)獲得羊抗-鼠Ig2 a-生物素共軛結(jié)合的抗體，而且也是以1/8000稀釋度使用。分段測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的M2抗原特異性IgG1和IgG2a的幾何平均抗體效價(jià)，計(jì)算IgG1比IgG2的比率。在下面表5中報(bào)告了這些數(shù)據(jù)。
表5

如參考表5所觀察的，添加到M2 DNA疫苗制劑中A或B亞基，或A和B亞基的各種聯(lián)合引起IgG1-比-IgG2a比率的顯著降低，而該比率在缺乏佐劑(制劑#1)的情況下是M2 DNA疫苗(pM2-FL)誘導(dǎo)的。LTA加LTB，和LTA-RDEL加LTB載體聯(lián)合(分別是制劑#7和#8)應(yīng)用產(chǎn)生了最大比率的降低。在兩個(gè)制劑中，本發(fā)明多核苷酸佐劑的應(yīng)用引起了M2抗原特異性IgG2a效價(jià)高于IgG1許多，該特征是小鼠中Th1樣免疫應(yīng)答的明顯特點(diǎn)。
在圖12中繪制接受制劑#1，#2和#7實(shí)驗(yàn)組結(jié)果為IgG1-比-IgG2a比率的對(duì)數(shù)。從該圖可以看出，用CTA加CTB佐劑載體輔助pM2-FL DNA疫苗組合物(制劑#2)與沒(méi)有佐劑的pM2-FL疫苗組合物(制劑#1)比較，引起了2個(gè)數(shù)量級(jí)IgG1-比-IgG2a比率的降低。此外，當(dāng)用LTA加LTB佐劑載體輔助pM2-FL DNA疫苗(制劑#7)，觀測(cè)到這個(gè)比率進(jìn)一步降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例8向編碼CT或LT的佐劑載體添加信號(hào)肽編碼序列修飾含有CTA、CTB、LTA和LTB毒素亞基的載體構(gòu)建體(分別是pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004和pPJV2005)以除去tpa信號(hào)肽編碼序列，構(gòu)建用于下面實(shí)驗(yàn)的編碼乙型肝炎表面和核心抗原的雙DNA疫苗載體。
用于載體構(gòu)建/修飾的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件如下1.5mM MgCl2(PromegaCorp.，Madison，WI)的1x PCR核心緩沖液；每種引物各0.400μM；每種dNTP(USB Inc.，Cleveland，OH)各200μM；2.5μg Taq聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；1.0ng模板DNA；加水到100μl；和礦物油(Aldrich Chemical Inc.，Milwaukee WI)覆蓋。編程PTC-200熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.，Waltham，MA)以運(yùn)行下面的程序95℃，4分鐘；30個(gè)循環(huán)(95℃，1分鐘；55℃，1分鐘15秒；72℃，1分鐘。)，72℃，10分鐘；和4℃放置。在用限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)切割前，用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)從PCR反應(yīng)中移出擴(kuò)增產(chǎn)物。克隆后測(cè)序所有PCR產(chǎn)物以確保擴(kuò)增的忠實(shí)性。
更具體地，如下文，構(gòu)建編碼乙型肝炎表面和核心抗原的雙DNA疫苗載體。用一系列標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)修飾含有表面抗原編碼序列的pWRG7128構(gòu)建體(實(shí)施例4)以提供雙(表面/核心抗原)構(gòu)建體。開(kāi)始，修飾pWRG7128構(gòu)建體以除去牛生長(zhǎng)激素腺苷酸化區(qū)域，并用兔β-珠蛋白腺苷酸化區(qū)域置換該區(qū)區(qū)域。含有CMV啟動(dòng)子的第一插入片段和含有第二個(gè)兔β-珠蛋白腺苷酸化區(qū)域的第二插入片段連接入修飾的pWRG7128構(gòu)建體中，其中CMV啟動(dòng)子帶有外顯子1和外顯子2序列，在直接位于插入CMV啟動(dòng)子的上游的Sph1和Pst1位點(diǎn)間插入通過(guò)復(fù)性systentic寡核苷酸構(gòu)建的銜接子。
用下面引物對(duì)質(zhì)粒mpSmpCC(GlaxoSmithKline，UK)進(jìn)行PCR5’-GCC GCT AGC ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GA-3’(SEQ ID NO23)和5’-CCA GGA TCC TTA ACA TTG AGA TTC C-3’(SEQ ID NO24)以產(chǎn)生乙肝-adw2核心抗原編碼序列。用Nhe1和BamH1切割這個(gè)PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生插入片段，然后修飾該片段以包含下游Bgl2位點(diǎn)，插入克隆載體。用Pst1和EcoR1切割克隆載體以產(chǎn)生核心抗原插入片段；用Pst1和Mfe1切割修飾的pWRG7128質(zhì)粒以產(chǎn)生載體片段，連接核心抗原插入片段到載體片段中，產(chǎn)生雙表面/核心抗原質(zhì)粒構(gòu)建體。
通過(guò)用限制性酶僅僅切除tpa信號(hào)肽編碼序列修飾含有CTA、CTB、LTA和TB毒素亞基的載體構(gòu)建體(分別是pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004和pPJV2005)以除去tpa信號(hào)肽編碼序列以分別產(chǎn)生下面構(gòu)建體CTA w/oTPA、CTB w/o TPA、LTA w/o TPA和LTB w/o TPA。
雙表面/核心抗原質(zhì)粒與不相關(guān)質(zhì)粒DNA(用于無(wú)佐劑的對(duì)照)，或與毒素亞基載體構(gòu)建體混合，并在2微米金粒子上沉淀。更具體地，含亞精胺小離心管中混合外加兩個(gè)佐劑載體(提供CTA/CTB或LTA/LTB聯(lián)合)的質(zhì)粒DNA(雙表面/核心抗原質(zhì)粒載體)與2微米金粒子(Degussa)。在實(shí)施例3的方法后進(jìn)行沉淀，也如實(shí)施例3所述，然后包被的金粒子包被在TEFZEL管內(nèi)表面上。然后將管切成適于裝載到粒子遞送裝置的0.5英寸的筒。
因此，產(chǎn)生下面DNA-金制劑用于小鼠DNA疫苗佐劑試驗(yàn)制劑#1(“無(wú)佐劑”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μg不相關(guān)DNA質(zhì)粒載體；制劑#2(“CT”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，0.5μgpPJV2002(CTA)DNA質(zhì)粒載體，0.5μg pPJV2003(CTB)DNA質(zhì)粒載體；制劑#3(“CT w/o TPA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，0.5μg CTA w/o TPA DNA質(zhì)粒載體，0.5μg CTB w/o TPA DNA質(zhì)粒載體；制劑#4(“CTA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μgpPJV2002(CTA)DNA質(zhì)粒載體；
制劑#5(“CTA w/o TPA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μg CTA w/o TPA DNA質(zhì)粒載體；制劑#6(“CTB”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μgpPJV2003(CTB)DNA質(zhì)粒載體；制劑#7(“CTB w/o TPA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μg CTB w/o TPA DNA質(zhì)粒載體；制劑#8(“LT”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，0.5μgpPJV2004(LTA)DNA質(zhì)粒載體，0.5μg pPJV2005(LTB)DNA質(zhì)粒載體；制劑#9(“LT w/o TPA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，0.5μg LTA w/o TPA DNA質(zhì)粒載體，0.5μg LTB w/o TPA DNA質(zhì)粒載體；制劑#10(“LTA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μgpPJV2004(LTA)DNA質(zhì)粒載體；制劑#11(“LTA w/o TPA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μg LTA w/o TPA DNA質(zhì)粒載體；制劑#12(“LTB”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μgpPJV2005(LTB)DNA質(zhì)粒載體；和制劑#13(“LTB w/o TPA”)1μg雙表面/核心抗原DNA質(zhì)粒載體，1μg LTB w/o TPA DNA質(zhì)粒載體。
在第一個(gè)研究中，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJectVaccines Inc.，Madison，WI)，給5組小鼠施用各種上述DNA疫苗制劑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含5個(gè)動(dòng)物，每個(gè)動(dòng)物用各自的制劑接受兩次免疫，在兩次免疫間有4周休息期。檢測(cè)的制劑如下制劑#1(無(wú)佐劑)；制劑#2(CT)；制劑#3(CT w/o TPA)；制劑#8(LT)；和制劑#9(LT w/o TPA)。第二次免疫后2周處死所有動(dòng)物，收集脾臟用于IFN-γ和IL-4 ELISPOT測(cè)定中。對(duì)于細(xì)胞免疫測(cè)定，在與小鼠已知T細(xì)胞抗原表位(來(lái)源于表面或核心抗原)對(duì)應(yīng)的肽存在的情況下，在體外培養(yǎng)免疫動(dòng)物脾臟脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。在DMSO(10mg/ml)中溶解肽和在培養(yǎng)中稀釋到10ug/ml。
對(duì)于ELISPOT測(cè)定法，用50μl適合抗血清(15μg/ml抗IFN-γ或IL-4抗血清，Pharmingen)在無(wú)菌0.1M碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中包被微孔多篩選膜過(guò)濾板，4℃過(guò)夜。用無(wú)菌PBS洗板6次，然后用含有10％胎牛血清(FBS)的組織培養(yǎng)基在室溫下封閉1-2小時(shí)。除去培養(yǎng)基，按照每孔1×106細(xì)胞總數(shù)，向孔中分配脾臟細(xì)胞。對(duì)于少于1×106免疫動(dòng)物細(xì)胞的孔，加入首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物細(xì)胞達(dá)到1×106總數(shù)。在上述肽存在情況下，細(xì)胞在組織培養(yǎng)的培養(yǎng)箱中溫育過(guò)夜。然后用PBS洗板2次，用蒸餾水洗1次。隨后用PBS洗3次。向板中(PBS中1μg/ml溶液50μl)加入生物素?；目笽FN-γ或抗IL-4單克隆抗體(Pharmingen)，室溫溫育2小時(shí)。用PBS洗板6次，之后，加入50μl鏈霉抗生物素蛋白素堿性磷酸酶共軛物(PBS中1∶1000，Pharmingen)，室溫溫育2小時(shí)。用PBS洗板6次，加入堿性磷酸酶顯色底物(BioRad)，進(jìn)行這個(gè)反應(yīng)直到暗斑出現(xiàn)。通過(guò)用水洗3次終止反應(yīng)?？諝飧稍锇?，在顯微鏡下計(jì)數(shù)斑。
通過(guò)測(cè)定對(duì)雙表面/核心抗原構(gòu)建體編碼的乙肝表面和核心抗原(“sAg”and“cAg”)的IFN-γ和IL-4 ELISPOT應(yīng)答評(píng)估分泌或非分泌毒素亞基編碼序列的佐劑效果，如圖13A-13D所報(bào)告比較這些結(jié)果。如所觀察到的，在IFN-γ對(duì)表面和核心抗原的應(yīng)答及IL-4對(duì)表面抗原的應(yīng)答方面，分泌的(含有信號(hào)序列)CT和LT佐劑載體(分別是制劑#2和#8)產(chǎn)生了顯著的增加(P≤0.05)(參見(jiàn)圖13A、13B和13C)。關(guān)于IL-4對(duì)核心抗原的應(yīng)答，LT載體(制劑#8和#9)佐劑效果的缺乏與LT毒素比CT毒素為更多Th1佐劑的觀察結(jié)果是一致的。最重要地，缺乏信號(hào)序列的CT和LT載體(分別是制劑#3和#9)顯示了較弱的佐劑效果，特別是在IFN-γELISPOT數(shù)據(jù)中所看到的對(duì)表面和核心抗原(參見(jiàn)，圖13A和13C)，其中由于缺失信號(hào)肽序列，佐劑活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。
最后，在分泌的(制劑#2和#8)和非分泌的(制劑#3和#9)間佐劑效果的清楚可觀測(cè)到的差異幫助證明了可觀測(cè)到的佐劑效果不是因?yàn)樽魟┹d體內(nèi)的CpG基序，因?yàn)橛行盘?hào)和無(wú)信號(hào)的載體在細(xì)菌DNA(CpG)含量沒(méi)有任何不同，但是它們?cè)谠黾颖砻婵乖禺愋訧FN-γ應(yīng)答的能力方面卻顯示了顯著差異。
在第二個(gè)研究中，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJectVaccines Inc.，Madison，WI)給8組小鼠施用上述DNA疫苗制劑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含5個(gè)動(dòng)物，每個(gè)動(dòng)物用各自的制劑接受兩次免疫，在兩次免疫間有4周休息期。檢測(cè)的制劑如下制劑#1(無(wú)佐劑)；制劑#2(CT)；制劑#4(CTA)；制劑#5(CTA w/o TPA)；制劑#6(CTB)；制劑#7(CTB w/oTPA)；制劑#8(LT)；制劑#10(LTA)；制劑#11(LTA w/o TPA)；制劑#12(LTB)和制劑#13(LTB w/o TPA)第二次免疫后2周處死所有動(dòng)物，收集脾臟用于IFN-γ和IL-4 ELISPOT測(cè)定中，如上所述。
作為第二次研究的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示)，再一次觀察到了在各種佐劑質(zhì)粒中，沒(méi)有可能由CpG含量引起的可辨別的佐劑效果。盡管對(duì)大部分各種毒素亞基佐劑載體沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的佐劑效果，但是LT亞基載體(制劑#10-13)確實(shí)顯示了對(duì)表面抗原(sAg)的IFN-γ和IL-4應(yīng)答的佐劑效果，而該應(yīng)答受分泌信號(hào)序列存在/缺乏的影響。
實(shí)施例9在病毒攻擊研究中，編碼CTA/CTB或LTA/LTB亞基肽的佐劑質(zhì)粒載體為了評(píng)測(cè)本發(fā)明佐劑質(zhì)粒載體在皰疹單純病毒類型2(HSV-2)病毒攻擊模型中提供保護(hù)效果的能力，進(jìn)行下面的研究。構(gòu)建編碼HSV-2抗原的DNA疫苗，然后將其與本發(fā)明佐劑質(zhì)粒載體的各種聯(lián)合進(jìn)行混合以提供疫苗組合物。免疫后，用HSV-2病毒攻擊免疫動(dòng)物，并且測(cè)定各種疫苗組合物的保護(hù)效果。
在DNA抗原質(zhì)粒構(gòu)建方面，用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒。用于載體構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)PCR條件如下1.5mM MgCl2(Promega Corp.，Madison，WI)的1x PCR核心緩沖液；每種引物各0.400μM；每種dNTP(USB Inc.，Cleveland，OH)各200μM；2.5μg Taq聚合酶(Promega Corp.，Madison，WI)；1.0ng模板DNA；加水到100μl；和礦物油(Aldrich Chemical Inc.，Milwaukee WI)覆蓋。編程PTC-200熱循環(huán)儀(MJ Research Inc.，Waltham，MA)以運(yùn)行下面的程序95℃，4分鐘；30個(gè)循環(huán)(95℃，1分鐘；55℃，1分鐘15秒；72℃，1分鐘。)，72℃，10分鐘，和4℃放置。在用限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA)切割前，用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen Inc.，Valencia CA)從PCR反應(yīng)中移出擴(kuò)增產(chǎn)物?？寺『鬁y(cè)序所有PCR產(chǎn)物以確保擴(kuò)增的忠實(shí)性。
更具體地，如下所述，構(gòu)建編碼HSV-2早期ICP27抗原的DNA疫苗質(zhì)粒載體。HSV是有約150-160kbp基因組的雙鏈DNA病毒。病毒基因組在20面體核衣殼內(nèi)包裝，該核衣殼包被在膜中。膜(或包膜)包含至少10個(gè)病毒編碼的糖蛋白，最豐富的糖蛋白是gB、gC、gD和gE。病毒基因組也編碼70多個(gè)其它蛋白質(zhì)，包括一組約5個(gè)ICP抗原。與僅在病毒生命循環(huán)晚期產(chǎn)生的包膜糖蛋白相比，這些早期蛋白質(zhì)是在病毒復(fù)制循環(huán)的早期合成的。對(duì)于HSV的分子結(jié)構(gòu)和組織的述評(píng)參見(jiàn)，例如Roizman和Sears(1996)“Herpes simplex viruses and their replication”in Fields Virology，第三版Fields等eds.，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，PA。從HSV-2基因組，例如HSV-2基因組的范圍從約核苷酸114589到134980的基因組區(qū)，或HSV-2基因組的核苷酸110931到139697范圍的EcoRI片段，容易得到HSV-2 ICP27抗原。從公開(kāi)的來(lái)源可得到HSV-2基因組序列，例如存儲(chǔ)在GenBank中登記號(hào)NC_001798的序列為了構(gòu)建用在本研究中的ICP27載體，用下面引物5’-GCC ACT CTCTTC CGA CAC-3’(SEQ ID NO25)和5’-CAA GAA CAT CAC ACG GAA C-3’(SEQ ID NO26)從HSV-2基因組對(duì)ICP27編碼區(qū)進(jìn)行PCR，以獲得與ICP27編碼區(qū)對(duì)應(yīng)的，含有HSV-2核苷酸序列114523-116179(GenBank)的核苷酸片段。然后克隆ICP27片段到pTarget載體(Promega Corp.，Madison，WI)的多克隆區(qū)。
混合含有CTA、CTB、LTA和LTB毒素亞基(分別是pPJV2002、pPJV2003、pPJV2004和pPJV2005)的佐劑質(zhì)粒載體構(gòu)建體以提供CTA/CTB(pPJV2002+pPJV2003)和LTA/LTB(pPJV2004+pPJV2005)佐劑。ICP27抗原質(zhì)粒與毒素亞基載體構(gòu)建體對(duì)混合，并且在2微米金粒子上沉淀。更具體地，在含有亞精胺的小離心管中，混合外加有兩個(gè)佐劑載體(提供CTA/CTB或LTA/LTB聯(lián)合)的質(zhì)粒DNA(ICP27抗原質(zhì)粒載體)與2微米金粒子(Degussa)。在實(shí)施例3的方法后，進(jìn)行沉淀，然后也如實(shí)施例3所述，包被的金粒子包被在TEFZEL管內(nèi)表面。然后將管切成適于裝載到粒子遞送裝置的0.5英寸筒。
因此，產(chǎn)生下面DNA-金制劑用于HSV-2攻擊研究制劑#1(無(wú)佐劑)2μg ICP27抗原DNA質(zhì)粒載體；制劑#2(“高CT”)900ng ICP27抗原DNA質(zhì)粒載體，50ngpPJV2002(CTA)，50ngpPJV2003(CTB)；制劑#3(“低CT”)500ng ICP27抗原DNA質(zhì)粒載體，250ng pPJV2002(CTA)，250ng pPJV2003(CTB)；制劑#4(“高LT”)900ng ICP27抗原DNA質(zhì)粒載體，50ngpPJV2004(LTA)，50ng pPJV2005(LTB)；和制劑#5(“低LT”)500ng ICP27抗原DNA質(zhì)粒載體，250ngpPJV2004(LTA)，250ng pPJV2005(LTB)。
在該研究中，用PowderJectXR-1粒子遞送裝置(PowderJectVaccines Inc.，Madison，WI)，給5個(gè)不同組小鼠施用上述DNA疫苗制劑。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含12個(gè)動(dòng)物，每個(gè)動(dòng)物用各自的制劑接受兩次免疫(應(yīng)用于腹部的單射擊)，在兩次免疫間有4周休息期。設(shè)置6組小鼠作為陰性(首次用于實(shí)驗(yàn))對(duì)照，不接受任何接種。第二次免疫后2周，每組取出4只小鼠用于IFN-γELISPOT測(cè)定(數(shù)據(jù)未示出)。
第二次免疫后2周，用1×106PFU，MS株系的HSV-2病毒通過(guò)鼻內(nèi)滴注攻擊所有剩下的小鼠(8只/每組)。在圖14中說(shuō)明了描述攻擊結(jié)果的存活圖。如可觀察到的，100％首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物在攻擊后4天內(nèi)死亡。在圖上用(●)曲線描繪首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物。此外，100％單獨(dú)接受ICP27抗原質(zhì)粒載體(制劑#1)的動(dòng)物在攻擊后7天內(nèi)死亡。在圖上用()曲線描繪接受制劑#1的動(dòng)物。明顯的對(duì)比，25％(2/8)接受低劑量CT佐劑的ICP27質(zhì)粒(制劑#3)的動(dòng)物獲得免受病毒攻擊的保護(hù)，38％(3/8)接受高劑量CT佐劑的ICP27質(zhì)粒(制劑#2)的動(dòng)物獲得免受病毒攻擊的保護(hù)。在圖上用(■)曲線描繪接受制劑#3的動(dòng)物。在圖上用(◆)曲線描繪接受制劑#2的動(dòng)物。最后，低劑量LT佐劑(制劑#5)和高劑量LT-佐劑(制劑#4)的ICP27疫苗在免疫動(dòng)物中提供了完全(100％)的保護(hù)。在圖上用(▲)曲線描繪接受制劑#5的動(dòng)物。在圖上用(○)曲線描繪接受制劑#4的動(dòng)物。
因此，已經(jīng)說(shuō)明了新的多核苷酸佐劑分子、包含這些佐劑分子的組合物、及常規(guī)核酸免疫技術(shù)。盡管已詳細(xì)描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，但是可以進(jìn)行不偏離所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明精神和范圍的明顯變化，這是可以理解的。
序列表<110>寶德杰克特疫苗有限公司<120>核酸佐劑<130>P03GB051797<150>US 09/724,315<151>2000-11-27<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5500<212>DNA<213>pPJV2002質(zhì)粒<400>1gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt120tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat180aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt240ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg300ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga360tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc420tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac480actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg540gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca600acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg660gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg720acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg780gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag840ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg900gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct960
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<212>DNA<213>pPJV2003質(zhì)粒<400>2gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt120tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat180aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt240ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg300ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga360tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc420tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac480actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg540gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca600acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg660gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg720acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg780gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag840ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg900gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct960cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
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<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>9ggagctagca cacctcaaaa tattactgat 30<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>14ggagctagcg ctccccagtc tattacagaa 30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>16cctggatcct caaattctgt tatatatgtc 30
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<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>19Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys1 5 10 15Arg<210>20<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>20Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu1 5 10
<210>21<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>21Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Ile Thr Gly Lys1 5 10 15<210>22<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成構(gòu)建體<400>22Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 10
權(quán)利要求
1.一種含有第一和第二核酸序列的組合物，其中所述第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素截短的A亞基編碼區(qū)，所述第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素截短的B亞基編碼區(qū)，條件是每個(gè)所述截短的亞基編碼區(qū)具有5’缺失，并且編碼不具氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于單一核酸構(gòu)建體中。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中第一和第二核酸序列可操作地連接于轉(zhuǎn)錄控制元件。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述轉(zhuǎn)錄控制元件是異源啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于分離的核酸構(gòu)建體中。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述分離的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
8.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中截短的亞基編碼區(qū)是獲自或來(lái)源于相同的細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述的細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素是霍亂毒素(CT)。
10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素是大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。
11.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少一個(gè)截短的亞基編碼區(qū)已被基因修飾以除去其編碼的亞基肽的毒性。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中截短的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以破壞或失活其編碼的亞基肽中ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中截短的A亞基編碼區(qū)已被進(jìn)一步基因修飾以缺失其編碼的亞基肽中C-末端KDEL或RDEL基序。
14.如權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含目的抗原。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述抗原來(lái)源于細(xì)菌、病毒或寄生病原體。
16.如權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含編碼目的抗原的第三核酸序列。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述抗原來(lái)源于細(xì)菌、病毒或寄生病原體。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述第三核酸序列存在于不含有所述第一或第二核酸序列的核酸構(gòu)建體中。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其中含有第三核酸序列的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
20.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述第三核酸序列存在于也含有至少一個(gè)所述第一或所述第二核酸序列的核酸構(gòu)建體中。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中含有第三核酸序列的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
22.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是粒子形式。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述粒子組合物適于通過(guò)粒子遞送裝置經(jīng)皮遞送。
24.如權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
25.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中第一和第二核酸序列包被于核心載體粒子上。
26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其中核心載體粒子具有約0.1到約10μm的平均直徑。
27.如權(quán)利要求25所述的組合物，其中核心載體粒子包括金屬。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中金屬是金。
29.一種粒子遞送裝置，其中用權(quán)利要求23所述粒子疫苗組合物裝載所述裝置。
30.如權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是脂質(zhì)體。
32.一種含有第一和第二核酸序列的組合物，其中所述第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的修飾的A亞基編碼區(qū)，所述第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的B亞基編碼區(qū)，條件是所述修飾的A亞基編碼區(qū)和B亞基編碼區(qū)分別編碼成熟亞基肽，并且進(jìn)一步條件是修飾的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以缺失其編碼的亞基肽中C-末端KDEL或RDEL基序。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于單一核酸構(gòu)建體中。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
35.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中第一和第二核酸序列可操作地連接于轉(zhuǎn)錄控制元件。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述轉(zhuǎn)錄控制元件是異源啟動(dòng)子。
37.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述第一和第二核酸序列存在于分離的核酸構(gòu)建體中。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述分離的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
39.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中B和修飾的A亞基編碼區(qū)是獲自或來(lái)源于相同細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素是霍亂毒素(CT)。
41.如權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素是大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)。
42.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中至少一個(gè)B或修飾的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以除去其編碼的亞基肽的毒性。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其中修飾的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以破壞或失活其編碼的亞基肽中ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
44.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中通過(guò)5’缺失已分別截短修飾的A亞基編碼區(qū)和B亞基編碼區(qū)，因此，所述每個(gè)截短的亞基編碼區(qū)編碼不具有氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽。
45.如權(quán)利要求32所述的組合物，其進(jìn)一步包含目的抗原。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述抗原來(lái)源于細(xì)菌、病毒或寄生病原體。
47.如權(quán)利要求32所述的組合物，其進(jìn)一步包含編碼目的抗原的第三核酸序列。
48.如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述抗原來(lái)源于細(xì)菌、病毒或寄生病原體。
49.如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述第三核酸序列存在于不含有所述第一或第二核酸序列的核酸構(gòu)建體中。
50.如權(quán)利要求49所述的組合物，其中含有第三核酸序列的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
51.如權(quán)利要求47所述的組合物，其中所述第三核酸序列存在于也包含至少一個(gè)所述第一或所述第二核酸序列的核酸構(gòu)建體中。
52.如權(quán)利要求51所述的組合物，其中含有第三核酸序列的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒載體。
53.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述組合物是粒子形式。
54.如權(quán)利要求53所述的組合物，其中所述粒子組合物適于通過(guò)粒子遞送裝置的經(jīng)皮遞送。
55.如權(quán)利要求32所述的組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
56.如權(quán)利要求55所述的組合物，其中第一和第二核酸序列包被于在核心載體粒子上。
57.如權(quán)利要求56所述的組合物，其中核心載體粒子具有約0.1到約10μm的平均直徑。
58.如權(quán)利要求56所述的組合物，其中核心載體粒子包括金屬。
59.如權(quán)利要求58所述的組合物，其中金屬是金。
60.一種粒子遞送裝置，其中用權(quán)利要求54所述粒子疫苗組合物裝載所述裝置。
61.如權(quán)利要求32所述的組合物，其進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。
62.如權(quán)利要求61所述的組合物，其中轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑是脂質(zhì)體。
63.含有第一和第二核酸序列的組合物在藥劑制造中的用途，其中每個(gè)所述序列包含細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素亞基的編碼區(qū)，所述藥劑用于提高脊椎動(dòng)物個(gè)體對(duì)所述個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答，通過(guò)給所述個(gè)體施用目的抗原和組合物，因此表達(dá)由第一和第二核酸序列編碼的毒素亞基，其量足以誘導(dǎo)提高的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，其中所述第一核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亞基編碼區(qū)，所述第二核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亞基編碼區(qū)，條件是每個(gè)所述截短的亞基編碼區(qū)具有5’缺失，并且編碼不具氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的用途，其中給個(gè)體相同位點(diǎn)施用目的抗原和組合物。
65.根據(jù)權(quán)利要求63所述的用途，其中同時(shí)施用目的抗原和組合物。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的用途，其中目的抗原與組合物聯(lián)合以提供單疫苗組合物。
67.根據(jù)權(quán)利要求63所述的用途，其中目的抗原來(lái)源于細(xì)菌、病毒或寄生病原體。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的用途，其中給個(gè)體施用第三核酸序列，并且第三核酸序列編碼所述目的抗原。
69.根據(jù)權(quán)利要求63所述的用途，其中以粒子形式給個(gè)體施用第一和第二核酸序列。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的用途，其中含有第一和第二核酸序列的組合物包被于核心載體粒子上，并且用粒子介導(dǎo)的遞送技術(shù)施用給個(gè)體。
71.根據(jù)權(quán)利要求63所述的用途，其中個(gè)體是人。
72.含有第一和第二核酸序列的組合物在制造藥劑中的用途，其中每個(gè)所述序列包含細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素亞基的編碼區(qū)，所述藥劑用于提高脊椎動(dòng)物個(gè)體對(duì)所述個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答，通過(guò)給所述個(gè)體施用目的抗原和組合物，因此，表達(dá)由第一和第二核酸序列編碼的毒素亞基，其量足以誘導(dǎo)提高的對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，其中所述第一核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的修飾的A亞基編碼區(qū)，所述第二核酸序列含有獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的B亞基編碼區(qū)，條件是所述修飾的A亞基編碼區(qū)和B亞基編碼區(qū)分別編碼成熟亞基肽，并且進(jìn)一步條件是修飾的A亞基編碼區(qū)已被基因修飾以缺失由其編碼的亞基肽的C-末端KDEL或RDEL基序。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的用途，其中給個(gè)體相同位點(diǎn)施用目的抗原和組合物。
74.根據(jù)權(quán)利要求72所述的用途，其中同時(shí)施用目的抗原和組合物。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的用途，其中目的抗原與組合物聯(lián)合以提供單疫苗組合物。
76.根據(jù)權(quán)利要求72所述的用途，其中目的抗原來(lái)源于細(xì)菌、病毒或寄生病原體。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的用途，其中給個(gè)體施用第三核酸序列，并且第三核酸序列編碼所述目的抗原。
78.根據(jù)權(quán)利要求72所述的用途，其中以粒子形式給個(gè)體施用第一和第二核酸序列。
79.根據(jù)權(quán)利要求78所述的用途，其中含有第一和第二核酸序列的組合物包被于核心載體粒子上，并且用粒子介導(dǎo)的遞送技術(shù)施用給個(gè)體。
80.根據(jù)權(quán)利要求72所述的用途，其中個(gè)體是人。
81.用于提高對(duì)個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括(a)給個(gè)體施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐劑組合物，其中所述第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的A亞基編碼區(qū)，所述第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的截短的B亞基編碼區(qū)，條件是每個(gè)所述截短的亞基編碼區(qū)具有5’缺失，并且編碼不具氨基末端細(xì)菌信號(hào)肽的亞基肽；(c)給個(gè)體施用所述佐劑組合物，藉此通過(guò)引入到所述個(gè)體，表達(dá)第一和第二核酸序列，以提供足夠量的亞基肽來(lái)誘導(dǎo)提高的對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答。
82.用于提高對(duì)個(gè)體中目的抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括(a)給個(gè)體施用目的抗原；(b)提供含有第一和第二核酸序列的佐劑組合物，其中所述第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的修飾的A亞基編碼區(qū)，所述第二核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP-核糖基化外毒素的B亞基編碼區(qū)，條件是所述修飾的A亞基編碼區(qū)和所述B亞基編碼區(qū)分別編碼成熟亞基肽，并且進(jìn)一步的條件是修飾A的亞基編碼區(qū)已經(jīng)被基因修飾以缺失由其編碼的亞基肽的C-末端KDEL或RDEL基序；和(c)給個(gè)體施用所述佐劑組合物，藉此通過(guò)引入到所述個(gè)體，表達(dá)第一和第二核酸序列，以提供足夠量的亞基肽來(lái)誘導(dǎo)提高的對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明描述了重組核酸分子。該分子有兩個(gè)核酸序列，其中第一核酸序列是獲自或來(lái)源于細(xì)菌ADP－核糖基化外毒素截短的A亞基編碼區(qū)，第二核酸序列是截短的B亞基編碼序列。也描述了含有這些分子的載體和組合物。也描述了利用這些重組核酸分子和組合物增加對(duì)目的抗原免疫應(yīng)答的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1537013SQ01819570
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2001年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月27日
發(fā)明者約爾·R·海恩斯, 約書(shū)亞·E·阿林頓, E 阿林頓, 約爾 R 海恩斯 申請(qǐng)人:寶德杰克特疫苗有限公司