專利名稱：獲得抗原性聚集物的方法及其在制劑中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)學(xué)科，特別是新疫苗制劑的用途。
本申請(qǐng)發(fā)明的技術(shù)目的在于，開(kāi)發(fā)制備聚集的抗原性結(jié)構(gòu)的方法及其制劑，其能夠增強(qiáng)通過(guò)全身或粘膜途徑給予的現(xiàn)有抗原的免疫原性。
本發(fā)明描述的方法產(chǎn)生顆粒性抗原的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，加入其它抗原、具有聚集、去脂或氧化性質(zhì)的成分，然后選擇30-500nm大小的聚集顆粒，聚合物方便地與佐劑形成制劑，有利于所得抗原組合物的免疫原性。
HBsAg是有效免疫原，是第一個(gè)廣泛用于人類的候選疫苗，第一個(gè)被批準(zhǔn)普遍使用的抗乙型肝炎重組疫苗。HbsAg蛋白質(zhì)自我組裝成22nm顆粒(Heerman KH，Gerlich WH，1991 Surface protein ofHepatitis B virus.A.McLachlan，ed.CRC Press，Boca Raton，Ann Harbor，Boston，London，p.109)。在小鼠模型中，詳細(xì)研究了對(duì)HBsAg免疫應(yīng)答的分子、細(xì)胞和遺傳基礎(chǔ)(Milich，DR.1987.Genetic and molecular basis for T-and B-cell recognitionof hepatitis B viral antigens.Immunol Rev.9971)。先前已經(jīng)研究了該表面抗原理化性質(zhì)的變化是怎樣影響其對(duì)MHC I類限制性T細(xì)胞的免疫原性。證明只有低劑量注射22nm顆粒狀天然抗原或者無(wú)佐劑的去污劑變性的單體，才能產(chǎn)生有效的MHC I類限制性CTL應(yīng)答(Schirmbeck，R.等人，1994.Eur J Immunol.241088)。還研究了通過(guò)熱變性產(chǎn)生直徑約1μm顆粒而得到的HBV表面抗原聚集物制劑的免疫原性。
體內(nèi)抗原性加工的類型對(duì)初級(jí)T細(xì)胞應(yīng)答效率以及所涉及T細(xì)胞的亞類范圍具有根本影響。在呈遞肽給MHC之中，顯然MHC II類CD4+限制性T細(xì)胞和MHC I類CD8+限制性T細(xì)胞進(jìn)行了可變加工(Germain，RN.等人，1993.Annu Rev Immunol.11403)。已經(jīng)描述了外源HBsAg顆粒加工以呈遞MHC I類限制性表位的新的內(nèi)體途徑。在巨噬細(xì)胞而非其它細(xì)胞類型中加工該直徑1μm的熱變性外源HBsAg顆粒，并伴有抗原性肽從加工巨噬細(xì)胞回流。該外源性抗原MHC I類限制性肽產(chǎn)生過(guò)程已暫定為吞噬細(xì)胞途徑。主要通過(guò)內(nèi)吞作用加工天然22nm HBsAg顆粒，則通過(guò)吞噬細(xì)胞途徑加工1μm聚集物。除了這兩種HBsAg外源制劑體外加工的差別之外，如果沒(méi)有佐劑，其體內(nèi)I類CTL免疫原性顯著不同。天然HBsAg顆粒免疫原性高，而變性的表面抗原聚集物免疫原性低(Schirmbeck，R.等人，1995.J Immunol 1554676-4684).
利用熒光偏振的其它研究提示，HBsAg顆粒組成為與蛋白質(zhì)聚集物相互作用的脂雙分子層(Sonveaux N.1995 Res Virol 146(1)43-51)。
利用氯仿-甲醇(2∶1，v/v)50％1，1’，3，3’-四甲基脲(tetrametilurea)處理HBsAg，盡管釋放其大部分脂質(zhì)，但并不影響顆粒的形態(tài)完整性(其保持其平均直徑)。去脂作用沒(méi)有改變抗原性及HBsAg多肽組成(Neurath AR等人1978 Intervirology 10(5)265-75)。
考慮到在生產(chǎn)過(guò)程的壓力條件下(例如存在離液劑(chaotropicagents)、適當(dāng)溫度及高濃度溶液)不生成顆粒聚集物，綜合利用免疫親和以及分子大小排阻層析技術(shù)，已經(jīng)研究了重組乙型肝炎表面抗原顆粒聚集物來(lái)源。研究分子排阻層析中導(dǎo)致對(duì)應(yīng)HBsAg的峰值增大的因素，證明除HBsAg顆粒大小變動(dòng)以外，存在顆粒聚集物(Tleugabulova D.1998 J Chromatogr B Biomed Sci Appl 707(1-2)267-73，Tleugabulova D.1997 Chromatographia 45317-320)。從而在對(duì)應(yīng)獲得大顆粒聚集物的組分中而非發(fā)現(xiàn)天然HBsAg蛋白質(zhì)的組分中，得到聚集抗原，該文另一結(jié)果證實(shí)，該聚集物由22nm顆粒形成，其在SDS-PAGE中遷移為單體和二聚體，以及正確折疊的表面抗原(Tleugabulova D等人，1998 J Chromatogr B BiomedSci Appl 25；716(1-2)209-19)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是獲得比產(chǎn)生其的抗原免疫原性更高的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)的方法。所述方法包括以下步驟A)選擇目的抗原B)在有利于聚集過(guò)程的培養(yǎng)基中加入一種或幾種抗原的混合物，該培養(yǎng)基可包含具有聚集性能的化學(xué)劑、氧化劑或其它組分。
C)溫育該混合物D)利用截留這些分子大小的方法，例如分子排阻層析、滲濾和透析，選擇30-500nm大小的顆粒聚集物。
E)通過(guò)加入選擇的佐劑、也可能加入其它抗原、穩(wěn)定劑劑和保存劑，混合步驟(C)選擇的抗原性結(jié)構(gòu)，制備制劑。
利用本發(fā)明方法可獲得幾種只包含HBV表面抗原的聚集物，也包括該表面抗原及其它來(lái)自任何病毒、細(xì)菌、單細(xì)胞或多細(xì)胞病原體的脂蛋白、脂肽或脂類的同源或異源抗原的組合。
根據(jù)本發(fā)明方法，步驟(B)所得的部分結(jié)構(gòu)的抗原可通過(guò)疏水、靜電或共價(jià)相互作用，加入乙型肝炎病毒表面抗原中，產(chǎn)生不同大小的聚集物。
獲得抗原性結(jié)構(gòu)的方法，使乙型、丙型肝炎或HIV核殼抗原與乙型肝炎病毒表面抗原聚集，病毒和細(xì)菌的抗原，例如滅活病毒或細(xì)菌性病原體如腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白質(zhì)，也可聚集。
為獲得聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，β-環(huán)糊精可用作促進(jìn)去脂、膜結(jié)合以及該顆粒聚合的化學(xué)劑，其它化學(xué)劑為濃度10-50mM的銨鹽，由銅和鐵或其它可聚集的金屬鹽增強(qiáng)。
為此目的，本方法可共同或單獨(dú)使用的具有自發(fā)聚集活性的其它成分為已證實(shí)對(duì)HBsAg具有聚集活性的同源或異源抗原，其中有病毒核殼抗原以及細(xì)菌外膜衍生物或病毒脂蛋白或疏水性包膜。還發(fā)現(xiàn)同樣性質(zhì)的佐劑有利于HBsAg聚集以及HbsAg與其自身的聚集。
一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明方法可通過(guò)形成疏水性相互作用、靜電或共價(jià)連接，根據(jù)所選成分，溫育10分鐘至一周時(shí)間，使HBsAg聚集或者HBsAg與其它抗原或佐劑聚集。
通過(guò)分子大小排阻方法進(jìn)行聚集物的分離，其中包括分子排阻層析、透析、滲濾或可截留30-500nm分子大小的其它方法。
我們還表明，盡管有可能通過(guò)非變性方法(最高溫度28℃)產(chǎn)生約1μm大小的聚集物，與Schirmbeck得到的相類似(Schirmbeck，R.等人，1995.J Immunol 1554676-4684)，但在評(píng)價(jià)體液應(yīng)答和DTH時(shí)，它們免疫原性仍較低。已經(jīng)證明只有以明礬為佐劑的30-500nm大小的聚集物顆粒，產(chǎn)生的IgG水平顯著高于天然抗原對(duì)照，另外顯示DTH和IgG2a應(yīng)答顯著增強(qiáng)。所有這些證明其后通過(guò)分子排阻層析選擇抗原的重要性。此種性能差異可能由抗原或目的抗原不同呈遞和或加工所造成。
此外，本發(fā)明方法預(yù)知，所得結(jié)構(gòu)吸附佐劑，如明礬或鈣鹽、油質(zhì)或者其它商業(yè)使用的佐劑。也可能在最終制劑中添加其它抗原以及穩(wěn)定劑和保存劑。
本發(fā)明另一目的在于，根據(jù)前述方法獲得的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其有利于提高所得制劑的免疫原性，并有利于免疫系統(tǒng)分化識(shí)別(differential recognition)所涉及的表位。所述聚集的抗原性結(jié)構(gòu)特征在于存在乙型肝炎病毒表面抗原，其單獨(dú)存在或與其它抗原形成聚集物共同存在。這些其它抗原為脂蛋白或疏水性抗原，其中有HBcAg，另外具備有利于其間通過(guò)疏水連接形成聚集狀態(tài)的固有特性。其它疏水性病毒衣殼和脂蛋白抗原顯示了這種能力，其中有丙型肝炎病毒、人類乳頭狀瘤病毒以及HIV 1和2的核殼抗原，此外還有腦膜炎奈瑟球菌蛋白脂質(zhì)體囊泡外膜以及一些病毒包膜抗原。
在本發(fā)明的抗原性結(jié)構(gòu)目的中，包括HBsAg與疏水性佐劑的結(jié)合，其可能是通過(guò)前述相同方法獲得的聚集物的一部分。一般而言，本發(fā)明的抗原性結(jié)構(gòu)可根據(jù)所述方法和至少一種顆粒特性，通過(guò)聚集至少一種、兩種或多種疏水性顆粒而獲得，并且應(yīng)該如實(shí)施例所述可由電子顯微鏡觀察到。這些結(jié)構(gòu)的聚集以一般方式有利于免疫調(diào)節(jié)、分化識(shí)別和免疫原性增強(qiáng)?？紤]到本發(fā)明抗原性結(jié)構(gòu)物的這些特征，有可能利用其合理設(shè)計(jì)通過(guò)全身或粘膜途徑預(yù)防和治療人和獸的疫苗，并用于診斷系統(tǒng)。
利用獲得此類抗原的方法所得到的新制劑具有以下優(yōu)點(diǎn)增強(qiáng)了免疫原性、在聚集過(guò)程中共俘獲新佐劑、免疫調(diào)節(jié)劑和抗原的能力。
可根據(jù)接種途徑和所免疫的物種，按0.01至高達(dá)10mL的量使用本發(fā)明方法獲得的制劑，最終疫苗制劑中的抗原劑量在0.001-1mg之間變化。
實(shí)施例實(shí)施例1.利用環(huán)糊精獲得乙型肝炎病毒表面抗原聚集的疫苗制劑的制備利用具有消除顆粒中脂質(zhì)活性的化合物可控處理22nm天然抗原獲得顆粒，在此情況下，使用濃度高于1mg/mL的環(huán)糊精。根據(jù)其濃度，溫育時(shí)間為24小時(shí)至7天。該實(shí)驗(yàn)中使用的溫育溫度為28℃，盡管已經(jīng)觀察到更高或更低溫度也可能獲得聚集物。盡管氧化作用和脂質(zhì)減少，溫度是有利于部分去脂作用的因素。隨后利用凝膠過(guò)濾和電子顯微術(shù)分析不同的聚集物，發(fā)現(xiàn)其大小由幾十納米直至顆粒由于太大而沉淀。離心去除沉淀殘留物之后，根據(jù)其大小選擇抗原，進(jìn)行免疫化學(xué)分析，證明脂質(zhì)水平相對(duì)蛋白質(zhì)水平下降。經(jīng)HPLC表明，這些聚集物在存儲(chǔ)期間具有高度穩(wěn)定性。利用5-100mg/mL β-環(huán)糊精于20-37℃可控處理抗原1-240小時(shí)，可獲得有可能以后選擇免疫化學(xué)分析的洗脫時(shí)間的粒度范圍。
然后該聚集抗原吸附到終濃度0.002-0.1mg/mL的明礬，用于免疫原性分析。
不同時(shí)間和溫度下與環(huán)糊精溫育的變化涉及加入免疫調(diào)節(jié)化合物，例如脂多糖和皂苷，作為吸附明礬的最終聚集物的一部分，制備最終的疫苗制劑。
實(shí)施例2.利用氧化劑制備乙型肝炎病毒表面抗原聚集物的疫苗制劑在標(biāo)準(zhǔn)抗原中加入氧化性化學(xué)物質(zhì)，有可能在可控的時(shí)間、溫度和濃度條件下，按與環(huán)糊精相同的方式進(jìn)行去脂作用。9-44mM過(guò)硫酸銨(ammionium peroxi-disultate)鹽可使22nm抗原顆粒形成去脂抗原，通過(guò)顆粒融合增加大小。利用凝膠過(guò)濾選擇最適大小。利用明礬進(jìn)行La佐劑吸附。
按實(shí)施例1相同方式，聚集物在溫育過(guò)程中有可能包括不同量的其它佐劑和免疫調(diào)節(jié)劑。
實(shí)施例3.制備通過(guò)改變酵母的溫育條件而得到的超顆粒狀化學(xué)結(jié)構(gòu)的疫苗制劑顆粒天然得自巴斯德畢赤(Picchia pastoris)酵母菌株，在純化過(guò)程中通過(guò)其物理化學(xué)特性選擇抗原?？乖苽浞椒ㄒ?jīng)受超過(guò)100小時(shí)的長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)間以及氧化壓力條件。通過(guò)對(duì)凝膠過(guò)濾各峰樣品進(jìn)行脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分析，證明該方法通過(guò)加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)氧化條件有可能使一部分抗原保持22nm顆粒大小的天然狀態(tài)，而主要部分聚集并去脂。最后利用TSK G5000柱通過(guò)HPLC凝膠過(guò)濾分離該組分。此物質(zhì)高達(dá)實(shí)際上扔掉的總抗原的10％。利用與普通抗原相似的條件，進(jìn)行明礬佐劑吸附。
分析兩種抗原，證明HBsAg在涉及各種脂質(zhì)大量丟失的過(guò)程中聚集，兩種抗原的磷脂如下表所示通過(guò)硅膠分離的HBsAg磷脂(PL)的組成

此實(shí)施例證明，正常氧化和去脂處理后，可獲得新的超顆粒狀抗原。這些聚集物的穩(wěn)定性將取決于在顆粒去脂過(guò)程中(可暴露疏水區(qū)，顆粒間蛋白質(zhì)在暴露巰基(sulphydril groups)時(shí)聚合)發(fā)生的聚集過(guò)程。
實(shí)施例4.評(píng)價(jià)聚集的HBsAg的免疫原性為了評(píng)價(jià)實(shí)施例3所獲的聚集HBsAg的免疫原性(明礬吸附或在PBS中(為粘膜途徑))，進(jìn)行免疫程序第0、14和28天接種，第42天后眼窩(retro-orbital)取血，通過(guò)鼻內(nèi)或肌內(nèi)途徑免疫10-15周齡的雌性Balb/c小鼠。在本實(shí)施例末的表中列出每只小鼠的劑量，結(jié)果如

圖1A所示，HbsAg聚集物如圖1B所示。
利用Student檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p＜0.05認(rèn)為差異顯著。
此實(shí)驗(yàn)證明，利用粘膜或全身途徑免疫時(shí)，在同樣條件下有可能產(chǎn)生比普通抗原更高的抗HBsAg IgG應(yīng)答。在同一圖形中比較了DTH應(yīng)答的效果(條形)，該聚集的變體也顯著較高。
免疫組如下表所示A- 5μg HBsAg去脂(50-500nm)/PBS 1X INB- 10μg HBsAg去脂(50-500nm)/PBS 1X IN
C- 5μg HBsAg普通(22nm)/PBS 1X IND- 5μg HBsAg去脂(50-500nm)/明礬0.5mg/mLIME- 5μg HBsAg普通(22nm)/明礬0.5mg/mLIM實(shí)施例5.抗HBsAg IgG應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)為了研究抗HBsAg IgG應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)，免疫10組雌性10-15周齡Balb/c小鼠。所用程序?yàn)榈?、2和18周接種，4、6、8、10、12、14、16、20周免疫前取血。測(cè)試組如下表所述1-5μg HBsAg普通(22nm)/明礬 IM2-5μg HBsAg普通(22nm)/PBS 1X IM3-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例3)/明礬0.5mg/mL IM4-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例3)/PBS 1XIM5-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例1)/明礬0.5mg/mL IM6-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例1)/PBS 1XIM7-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例1)/明礬0.5 mg/mL IM8-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例1)/PBS 1XIM9-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例1)/明礬0.5mg/mL IM10-5μg HBsAg去脂(實(shí)施例1)/PBS 1X IM第5和6、7和8、以及9和10組的抗原是通過(guò)不同濃度環(huán)糊精溫育不同時(shí)間，形成不同聚集度而獲得的。
DTH實(shí)驗(yàn)在以下天數(shù)進(jìn)行測(cè)定1(1，3)，2(1’，3’)，3(1”，3”)和5(1，3)利用Student檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析p＜0.05認(rèn)為差異顯著。
此實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同聚集度的去脂HBsAg具有各自不同的免疫學(xué)特性。盡管根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的抗體表觀動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)，強(qiáng)免疫原性與高聚集度的變體相對(duì)應(yīng)，但強(qiáng)免疫原性以及DTH應(yīng)答并不對(duì)應(yīng)于大抗原，而是對(duì)應(yīng)于中等抗原大小。然而觀察到明礬佐劑免疫組的DTH應(yīng)答較之PBS抗原免疫組顯著升高，中等大小聚集抗原組升高較大，第56天達(dá)到最大。圖2a顯示第56天所有免疫組的各自滴度。該圖還顯示第22周的5天中進(jìn)行的DTH實(shí)驗(yàn)結(jié)果，右腿使用20g HBsAg，左腿PBS，接種量20μL。按照左右腿直徑的差別，其余各組的應(yīng)答與第3組比較也顯著下降，如實(shí)施例3所述，接種明礬佐劑的中等聚集水平HBsAg，得到第3組。值得考慮的是，后者實(shí)施例證實(shí)，就所識(shí)別的HBsAg表位而言，超顆粒狀結(jié)構(gòu)物的識(shí)別較廣，表明此類結(jié)構(gòu)物性能較好。盡管大部分時(shí)間內(nèi)，第5-10組的抗天然HBsAg反應(yīng)性類似于天然HBsAg免疫，但也獲得了抗聚集抗原中其它表位的較強(qiáng)應(yīng)答，參見(jiàn)實(shí)施例8、圖4。
實(shí)施例6.評(píng)價(jià)IgG1/IgG2a的比例為了研究是否由于其TH1/TH2應(yīng)答的聯(lián)系而存在IgG1/IgG2a比例的變化，測(cè)試實(shí)施例4免疫程序中D和E組血清的抗IgG1和IgG2a抗體水平。利用第42天所取血清進(jìn)行分析。與明礬佐劑的普通HBsAg相比，超顆粒狀抗原(50-500nm)免疫組的IgG2a抗體水平顯著增強(qiáng)，高達(dá)IgG1/IgG2a的比例接近1(圖4)。
同明礬一起免疫的普通HBsAg組的IgG1/2a比例比中等大小的去脂HBsAg組高6.2倍。由此實(shí)驗(yàn)可得出結(jié)論，表面抗原的不同呈遞不僅導(dǎo)致所激發(fā)的IgG類型數(shù)量上而且質(zhì)量上的變化，IgG亞類形式的變化與細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)有關(guān)，證實(shí)了DTH評(píng)價(jià)的結(jié)果。
實(shí)施例7.研究不同抗原性變體免疫小鼠的血清的抗天然HBsAg反應(yīng)性利用根據(jù)實(shí)施例1、2和3獲得的去脂抗原免疫小鼠之后，其血清反應(yīng)性與用普通抗原免疫的小鼠血清相比較。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到，不同變體免疫的小鼠的血清中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對(duì)普通HBsAg(22nm)的反應(yīng)性不同，普通抗原免疫的小鼠的血清的反應(yīng)性較大，而去脂程度不同，對(duì)HBsAg的反應(yīng)性也不同。利用高度氧化的變體免疫的小鼠的血清，即使針對(duì)其自身免疫原的滴度高，但并不識(shí)別HBsAg，證明不同免疫原產(chǎn)生的抗體的識(shí)別不同，并證明該新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的不同的抗原性性質(zhì)。因此分析實(shí)施例5的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到盡管后三種聚集抗原變體獲得的抗天然HBsAg應(yīng)答相似，但也針對(duì)不為天然HBsAg免疫所識(shí)別的其它HBsAg蛋白質(zhì)表位產(chǎn)生應(yīng)答。
實(shí)施例8.不同抗原變體免疫的小鼠的血清對(duì)線性表位的識(shí)別為了比較由實(shí)施例2所述氧化變體獲得的超顆粒狀HBsAg所產(chǎn)生的抗體的識(shí)別作用，在包含線性HBsAg序列(S區(qū))的纖維素膜上進(jìn)行定位，合成了37條12個(gè)氨基酸的肽，每條重疊6個(gè)氨基酸，直至完成全部蛋白質(zhì)序列。
根據(jù)Ronald Frank方法(Frank，R.1992 Tetrahedron 489217-9232)，在纖維素膜上進(jìn)行表位定位。按1/100稀釋度分析血清樣品。
利用普通抗原以及相同抗原的不同聚集變體接種的小鼠的血清結(jié)果證明兩種抗原之間的線性識(shí)別方式不相似，得出結(jié)論為，HBsAg及其聚集變體表面上B表位的呈遞不同(圖4)。
實(shí)施例9.HBsAg和核殼抗原之間形成聚集物。免疫學(xué)評(píng)價(jià)。
兩種包含0.1mg/mL HBsAg和HBcAg的等體積制劑于4℃溫育過(guò)夜，然后由TSK G6000 HPLC分子排阻層析獲得聚集物。這些聚集物的一個(gè)樣品利用電子顯微術(shù)可視化技術(shù)處理，另一樣品用于免疫學(xué)評(píng)價(jià)，分別利用兩種抗原以及經(jīng)電子顯微術(shù)證實(shí)的聚集物，通過(guò)鼻內(nèi)接種進(jìn)行Balb/c小鼠的免疫程序(圖5A)。
結(jié)果證明，通過(guò)鼻內(nèi)途徑的兩種聚集抗原的混合物可以增強(qiáng)對(duì)HBsAg的應(yīng)答(圖5B)。該圖中各組如下表所示1-10μg HBsAg/PBS 1X IN2-10μg HBsAg/乙酰化甘露聚糖(acemannan)3mg/mL IN3-10μg HBsAg/10μg HBcAg/PBS 1X IN4-10μg HBsAg/明礬0.5mg/mL SC
如果使用其它病毒衣殼抗原，例如丙型肝炎病毒和HIV，制備該混合物，則得到類似結(jié)果。
(B)2個(gè)劑量程序(0、14天)。分析第26天的血清。
序列表<110>CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA<120>獲得抗原性聚集物的方法及其在制劑中的用途<130>AGREG<140>PCT/CU01/00009<141>2001-09-29<150>2000-0279<151>2000-12-01<160>37<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>1Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>2Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>3Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>4Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>5Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>6Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><22l>肽<222>(1)..(12)<400>7Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys1 5 10<210>8<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>8Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln1 5 10<210>9<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>9Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His1 5 10<210>10<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>10Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>11Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>12Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg1 5 10<210>13<211>12<212>PRT<213>Hepatica americana<220><22l>肽<222>(1)..(12)<400>13Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu1 5 10<210>14<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>14Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys1 5 10<210>15<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>15Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val1 5 10<210>16<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>16Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly1 5 10<210>17<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>17Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro1 5 10<210>18<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>18Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr1 5 10<210>19<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>19Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro1 5 10<210>20<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>20Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr1 5 10<210>21<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>21Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser1 5 10<210>22<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>22Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys1 5 10<210>23<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>23Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp1 5 10<210>24<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>24Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile1 5 10<210>25<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>25Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp1 5 10<210>26<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>26Pro Ile Pro ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu1 5 10<210>27<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>27Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val1 5 10<210>28<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400> 28Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser1 5 10<210>29<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>29Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val1 5 10<210>30<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>30Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu1 5 10<210>31<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>31Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu1 5 10<210>32<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>32Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met1 5 10<210>33<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>33Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser1 5 10<210>34<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>34Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser1 5 10<210>35<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>35Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu1 5 10<210>36<211>12<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>36Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu1 5 10<210>37<211>12<212>PRT<213>Hepatica americana<220><221>肽<222>(1)..(12)<400>37Leu Leu Pro Ile Phe phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile1 5 10
權(quán)利要求
1.獲得高免疫原性的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)的方法，其中包含以下步驟A)選擇目的抗原B)在有利于聚集過(guò)程的培養(yǎng)基中加入一種或幾種抗原混合物，例如具有聚集性能的化學(xué)的或氧化的或其它組分C)溫育該混合物D)利用能截留這些分子大小的方法，例如分子排阻層析、滲濾和透析，選擇30-500nm大小的顆粒聚集物。E)通過(guò)加入選擇的佐劑、也可能加入其它抗原、穩(wěn)定劑和保存劑，由步驟(C)選擇的抗原性結(jié)構(gòu)混合物制備制劑。
2.權(quán)利要求1的制備抗原性結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，在步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原當(dāng)中，存在任何病毒、細(xì)菌、單細(xì)胞或多細(xì)胞病原體的脂蛋白、脂肽或脂類抗原。
3.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原為乙型肝炎病毒表面抗原，形成僅由該抗原整合的聚集物。
4.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原當(dāng)中，存在兩種或多種同源或異源抗原，其能夠通過(guò)疏水或共價(jià)相互作用，與乙型肝炎表面抗原聚集，產(chǎn)生不同抗原的聚集物。
5.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原當(dāng)中，存在乙型肝炎病毒核殼和乙型肝炎病毒表面抗原。
6.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原當(dāng)中，存在丙型肝炎病毒核殼和乙型肝炎病毒表面抗原。
7.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原當(dāng)中，存在人類免疫缺陷性病毒1型或2型的核殼抗原和乙型肝炎病毒表面抗原。
8.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)所得部分結(jié)構(gòu)的抗原當(dāng)中，存在腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白質(zhì)和乙型肝炎表面抗原。
9.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)抗原結(jié)合的部分培養(yǎng)基成分當(dāng)中存在β-環(huán)糊精。
10.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)抗原結(jié)合的部分培養(yǎng)基成分當(dāng)中存在濃度為10-50mM的銨鹽，由銅或鐵金屬鹽或具有同樣聚集作用的其它物質(zhì)強(qiáng)化。
11.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)抗原結(jié)合的部分培養(yǎng)基成分當(dāng)中，存在證實(shí)具有聚集能力的抗原，例如具有促進(jìn)自發(fā)聚集能力的HBcAg及其它病毒核殼抗原。
12.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)抗原結(jié)合的部分培養(yǎng)基成分當(dāng)中，存在具有促進(jìn)與HBsAg自發(fā)聚集能力的疏水性抗原，例如病毒表面抗原衍生物、細(xì)菌外膜或脂質(zhì)衍生物。
13.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)抗原結(jié)合的部分培養(yǎng)基成分當(dāng)中，存在具有促進(jìn)與HBsAg自發(fā)聚集能力的部分或全部疏水性的佐劑。
14.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，在步驟(B)抗原結(jié)合的部分培養(yǎng)基成分當(dāng)中，存在任何天然能有利于HBsAg聚集或者通過(guò)疏水、共價(jià)或靜電連接使其與其它化學(xué)結(jié)構(gòu)聚集的化合物。
15.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，步驟(C)的溫育時(shí)間依據(jù)所選擇的聚集方法可能是10分鐘至一周。
16.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，通過(guò)分子排阻層析、透析、滲濾或其它可截留30-500nm所述分子大小的方法，從步驟(D)選擇30-500nm的顆粒聚集物。
17.權(quán)利要求1的抗原性結(jié)構(gòu)的制備方法，其特征在于，由步驟(C)選擇的抗原性結(jié)構(gòu)與選擇的佐劑，其可能是明礬或鈣鹽、油質(zhì)或其它商業(yè)上使用的佐劑，以及其它抗原、穩(wěn)定劑或保存劑的混合物制備步驟(E)的制劑。
18.權(quán)利要求1所獲聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其有利于提高所得制劑的免疫原性以及免疫系統(tǒng)的分化識(shí)別。
19.權(quán)利要求18所獲聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該聚集物中包含的抗原為乙型肝炎病毒表面抗原。
20.權(quán)利要求18的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，其可包含兩種或多種聚集抗原。
21.權(quán)利要求18的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg及其它疏水性顆粒狀抗原的混合物。
22.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBs和HBc抗原的混合物。
23.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg和HCV核殼抗原的混合物。
24.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg和HPV、HCV及HIV 1和2的核殼抗原的混合物。
25.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg及其它病毒表面抗原的混合物。
26.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg和疏水性佐劑的混合物。
27.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg和病毒或細(xì)菌抗原及其衍生物的混合物。
28.權(quán)利要求21的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該抗原可能是HBsAg和疏水性佐劑的混合物。
29.權(quán)利要求1的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其特征在于，該聚集結(jié)構(gòu)包含附著于其它蛋白質(zhì)或佐劑顆粒的病毒顆?；虿《緲宇w粒。
30.權(quán)利要求18-29的抗原性結(jié)構(gòu)在診斷系統(tǒng)中的用途
31.權(quán)利要求18-29的抗原性結(jié)構(gòu)在預(yù)防和治療性疫苗中的用途
32.疫苗制劑，其包含權(quán)利要求18-29中任一項(xiàng)的抗原性結(jié)構(gòu)以及佐劑、穩(wěn)定劑和保存劑。
33.權(quán)利要求32的疫苗制劑，供全身性或粘膜應(yīng)用。
34.權(quán)利要求32和33的疫苗制劑的用途，用于預(yù)防感染性和自身免疫性疾病以及癌癥。
35.權(quán)利要求32和33的疫苗制劑的用途，用于治療感染性和自身免疫性疾病以及癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及獲得聚集的抗原性結(jié)構(gòu)的方法，其能夠增強(qiáng)對(duì)全身和/或粘膜給予的聚集抗原的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生強(qiáng)的免疫應(yīng)答，并涉及由應(yīng)用所述方法產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)、由該結(jié)構(gòu)獲得的制劑及其用途。該方法描述了利用聚合劑、去脂劑或氧化劑或者能夠釋放顆粒的脂質(zhì)的化合物及其異源聚集物，獲得新的聚集的抗原性結(jié)構(gòu)，其中隨后利用分子排阻方法選擇顆粒大小為30－500nm的聚集物。還可以在酵母內(nèi)通過(guò)改變培育條件，形成聚集狀態(tài)。產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)可與佐劑或在引入幾種抗原的制劑中方便使用，其中就所獲應(yīng)答的免疫原性在所述成分之間存在協(xié)同作用。該制劑也可能包含穩(wěn)定劑和保存劑。產(chǎn)生的抗原性結(jié)構(gòu)可用于制藥工業(yè)，作為人和獸醫(yī)應(yīng)用的預(yù)防或治療使用的疫苗制劑，以及診斷系統(tǒng)的一部分。
文檔編號(hào)A61K47/40GK1477972SQ01819823
公開(kāi)日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2001年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月1日
發(fā)明者J·C·阿吉拉盧比多, E·潘頓阿利亞斯, D·特里加布洛瓦, M·瑟沃曼希斯, V·L·穆吉奧岡薩雷斯, G·E·吉爾侖尼托, I·A·西蒙伯納德, L·J·克魯茲里康多, V·法爾康卡馬, Y·塔姆巴拉赫南德茲, J C 阿吉拉盧比多, 侔⒗ 撬, 克魯茲里康多, 吉爾侖尼托, 悼, 穆吉奧岡薩雷斯, 致 Ｋ, 西蒙伯納德, 釩屠 漳系倫, 錛硬悸逋 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心