專利名稱：外源物質去細胞化的方法用于制備生物假體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及借助生物洗滌劑將同種異體和異種的外源物質去細胞化的方法，用于制備由假體受體的自體細胞包覆的生物假體。
用于制備由受體的自體細胞包覆同種異體和異種的外源物質的生物假體，需要提供一種從外源細胞分離出來的“無細胞”結構，以避免免疫反應和確保新生的自體細胞的生長和繁殖。但是，已知的去細胞化方法和生物洗滌劑的應用不可能從組織基質中解離全部的細胞物質，以致不能排除目前未知病毒的作用，例如在豬組織中含有的病毒。
本發(fā)明的任務因此在于，提供將外源物質去細胞化的方法，以保證完全地但是溫和地將細胞從外源組織中清除，隨后用自體細胞包覆該外源物質。
根據本發(fā)明，此任務是由含有權利要求1的特征的方法解決的。
換言之，本發(fā)明的基本思路是，從擬用自體細胞重新包覆的同種異體和異種的起始產物中脫去外源細胞，結合膽汁酸處理，醇處理和之間之后進行的洗滌步驟以及在組織基質和要去除的細胞上通過流動介質至少在最后的洗滌步驟中施加機械性影響。
優(yōu)選使用膽汁酸以去氧膽酸的形式，逐步地-或者在機械性影響下加速地-用酸包覆細胞，以致在膠原和彈性蛋白構成的基質(在下文中稱為“膠原基質”)與細胞之間制造隔離層，并從基質中去除細胞。同時，去氧膽酸有溶細胞效應。在隨后的洗滌步驟中解離的細胞被沖走，去氧膽酸也被洗滌。在隨后的醇處理中，優(yōu)選乙醇或丙醇，將視情況殘存的易溶于醇的去氧膽酸徹底去除。在基質中殘留的細胞被視情況殘存的去氧膽酸和醇解離，而醇此外有殺細胞作用和抗病毒效應。接下來最后的洗滌步驟優(yōu)選脈動流，其力量一方面作用于相關的器官部件的壁上，并使基質膨脹，另一方面直接機械性影響于殘留細胞，并將其從膨脹的基質中除去。
也可以在本方法其它或所有步驟中，通過相關介質優(yōu)選脈動的液流與機械性影響相結合。因此上述脈動去氧膽酸流由于介質的移動和膨脹，在細胞和膠原基質之間較快地形成隔離層，并同時通過作用于細胞上的力使細胞更容易解離。
根據從屬權利要求和隨后的具體實施例的說明揭示了本發(fā)明其它特征和有利的設計。
使用提出的方法成功地提供了無細胞的，即無任何細胞物質并因而無病毒的器官部件作為起始產物，例如心臟瓣膜或血管，經各受體的自體細胞包覆用于制備生物假體。
用于處理在流動介質中由外源物質構成的器官部件的裝置包括，一個裝有相關器官部件的去細胞化室，一個產生介質液流的泵，其先后結合在一個環(huán)形管道中。環(huán)形管道中有分別用于輸入或排出各處理介質的輸入閥和排出閥。去細胞化室可以從環(huán)形管道中拆卸，以便可以移動去細胞化室和借此移動介質中的器官部件。在容器中，待處理的器官部件通過形如器官部件的適配器在事先加有張力的情形下縱向固定。
借助圖示進一步說明本發(fā)明的具體實施例。其展示

圖1循環(huán)流路中用于心臟瓣膜去細胞化的裝置；圖2連入循環(huán)流路的裝心臟瓣膜的去細胞化室的截面圖；圖3a 根據本發(fā)明的方法經去細胞化的主動脈瓣膜壁的顯微截面圖；圖3b 放大的圖3a的主動脈瓣膜壁的中間組織切片。
在此描述的具體實施例是，在屠宰場取出豬的主動脈瓣，去除脂肪，切塊測尺寸以及檢測病菌(真菌、需氧菌、厭氧菌、支原體)的存在性。中間存儲應在最高溫度4℃，不超過7天。
將如此準備的心臟瓣膜放入1-2％的去氧膽酸溶液(或者具有類似作用的膽汁酸)中，在其中以37℃存放24小時。去氧膽酸能與脂肪酸形成主賓絡合物形式的加合物，以便去氧膽酸可以逐漸全方位貼敷于細胞上，并由此解離細胞與組織基質的粘連。同時，去氧膽酸有殺細胞作用。
隨后，經如此處理的心臟瓣膜用系列稀釋的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)以遞減的濃度，并在同時心臟瓣膜的移動中，從組織基質中洗去經去氧膽酸處理過的細胞。
在接下來的第三步驟中，心臟瓣膜在室溫下用40％的醇處理10分鐘，以達到抗病毒效應，并進一步滅絕膠原骨架中殘留的細胞。由于醇是一種很好的溶劑，同時還可以洗滌掉可能殘留的酸并進一步解離細胞。
用另一套系列稀釋的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)再次洗滌心臟瓣膜，并隨即在脈動PBS-介質流中機械處理。通過脈動介質流使在去細胞化室中沿縱向順流并事先加有張力而固定的心臟瓣膜有節(jié)奏地舒張，并同時經受流體的機械沖擊。這個步驟也機械分離膠原骨架中的殘存細胞，最終去除所有的細胞物質后得到一個無細胞的結構，而且因此不含病毒。經如此處理的無細胞也無所使用的去細胞化介質的心臟瓣膜組織基質-如圖2所示-非常適于生物假體受體的自體內皮細胞的重新包覆。這種生物假體移植到人體內沒有任何免疫反應或病毒感染的風險。
鑒于擬用于制備生物假體的外源物質的類型和來源，鑒于操作參數，本發(fā)明不局限于如上例舉說明的處理方案，只要實施基本的實驗步驟，即在形成加合物的膽汁酸中的處理，在醇中處理和與用于在組織上產生溫和的機械性影響的優(yōu)選脈動流相結合的之間之后的洗滌，該脈動流流經相關的器官部件。因此也可以不是在最后的步驟中，而是附加地在其它或所有的處理階段中用流動的介質進行。借此各介質的作用得到機械性支持，較好地全方位地作用于細胞，并且通過脈動流的力作用較易從舒張的膠原基質中解離去除細胞。
圖1顯示用于心臟瓣膜去細胞化的裝置。其包括一個環(huán)形管道1，連接了用于容納并處理心臟瓣膜3的去細胞化室2、膜式泵3和可直接在去細胞化室后開啟的平衡室4。膜式泵3經由軟管套頭5連接到一個驅動設備上(未表示)。膜式泵3的兩個連接環(huán)形管道1的結合頭整合了排出閥6和輸入閥7，其功能相應于心臟瓣膜的功能。如果待處理的心臟瓣膜已存在閥瓣，排出閥6可以省略。
裝置的核心部分是去細胞化室2，用于借助附加的流動力作用將豬的主動脈瓣8去細胞化。去細胞化室2由如下構成，由Piacryl構造的透明空心柱9，配有置于開放端面中央并密閉固定由聚四氟乙烯構造的墊板10、11，其經由連接管12、13與環(huán)形管道1連接，分別具有突入空心柱9的帶有放射狀環(huán)繞排列的固定孔16、17的固定部分14、15，用于在端面邊緣的張力下緊繃固定主動脈瓣8。墊板10、11的兩個固定部分14、15的外圍直徑大約相應于主動脈瓣8的直徑。在流向中后置的墊板11經連接橋18和第一個密封圈27可與空心柱9的內側環(huán)橋20拉緊，并借助螺紋環(huán)21，其陰螺紋與墊板11的陽螺紋契合。墊板10具有套圈22，置于空心柱9的端面，并與其應用螺帽23的陰螺紋與空心柱9的陽螺紋的契合加固。使用第二個密封圈19用于液體防漏的加固。在去細胞化室后接的環(huán)形管道1的軟管由可彎曲物質(硅樹脂)制成，以便保證基于脈動泵作用的流動。
由于上述墊板10、11的構造和排列，可在空心柱9外面將相應的備用的主動脈瓣88縫制到相對而置的墊板10、11的固定部分14、15上。將主動脈瓣8以此形式插入空心柱9。經環(huán)形管道1中的輸入閥和排出閥24、25或者連接管13、14，首先將去氧膽酸輸入去細胞化室2和環(huán)形管道1，并隨后啟動膜式泵3，以使脈動的去氧膽酸流持續(xù)地流經或流過主動脈瓣8，并且由于在組織上的機械性影響起到完全解離和去除對于心臟瓣膜受體是異體的細胞的作用。在排出去氧膽酸后輸入生理鹽水或磷酸鹽緩沖液并洗滌直至完全去除去氧膽酸和其它毒性成分。洗滌過程之后是主動脈瓣8在醇中的處理，然后是在磷酸鹽緩沖液中的洗滌步驟。
在上述裝置中，去細胞化方法的所有處理步驟都在各介質的脈動流下得以實現。其流動方向在此大約相應于生物假體植入狀態(tài)下的自然流向。使用輸入閥和排出閥24、25交換介質，在此也可以輸入連續(xù)的新鮮洗滌溶液用于洗滌過程并將經使用的洗滌液排離。
也可以選擇性地將一個或多個處理步驟拆離環(huán)形管道和膜式泵，無細胞化室可視情況驅動或手擰裝卸，而不使液流通過，或者也可以如文端所述，在去細胞化室之外實施獨立的處理步驟。
附圖標記說明1.環(huán)形管道2.去細胞化室3.血液泵/膜式泵4.平衡室5.軟管(用于3)6.排出閥7.輸入閥8.動脈瓣9.空心柱10.第一墊板(在流向的上源)11.第二墊板(在流向的下源)12.連接管13.連接管14.固定部分15.固定部分16.固定孔17.固定孔18.11的連接橋19.密封圈20.9的環(huán)橋21.螺紋環(huán)22.10得套圈23.有帽封口螺圈24.輸入和排出閥25.輸入和排出閥26.膜式閥
權利要求
1.本方法借助生物洗滌劑將同種異體和異種的外源物質去細胞化，用于制備由假體受體的自體細胞包覆的生物假體，其特征在于，外源物質首先用膽汁酸處理，用于殺死細胞以及包裹細胞并分離其與組織基質的粘連，然后用醇處理進一步殺死細胞，這兩個步驟后都有洗滌程序，其中至少最后的洗滌過程是在介質流中由流動力產生機械性影響施加于組織基質和細胞上進行的。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，介質流是脈動的。
3.根據權利要求1的方法，其特征在于，用于解離細胞的膽汁酸使用的是包裹細胞的去氧膽酸。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于，使用1-2％的去氧膽酸。
5.根據權利要求1的方法，其特征在于，用于殺死細胞所用的醇濃度為30-60％。
6.根據權利要求5的方法，其特征在于，使用40％的醇。
7.根據權利要求1的方法，其特征在于，使用磷酸鹽緩沖液作為洗滌介質。
8.根據權利要求7的方法，其特征在于，在非流動介質中的洗滌以逐步降低的洗滌介質濃度進行。
9.根據權利要求1-7的方法，其特征在于，在非流動介質中的去氧膽酸處理時間直至24小時，醇處理大約20分鐘，洗滌約60分鐘。
10.根據權利要求1-7的方法，其特征在于，外源物質在去氧膽酸和/或醇和/或在其間啟動的洗滌循環(huán)的處理，是在接近于相關器官內自然流動條件的脈動介質流中進行的。
11.根據權利要求1和10方法，其特征在于，流動介質的速率可以變化。
12.根據權利要求1、10和11任意一項的方法，其特征在于，洗滌介質流連續(xù)或間斷地被更換。
13.根據權利要求11的方法，其特征在于，洗滌劑液流的濃度逐步下降。
14.根據權利要求1、10-13任意一項的方法，其特征在于，待處理的外源物質在各介質流中沿流向在事先加有張力的狀態(tài)下固定。
15.根據權利要求1和10-14，用于在介質流中處理外源物質的裝置，其特征在于，環(huán)形管道(1)和用于產生脈動介質流而與其相連的泵(3)和在環(huán)形管道(1)中連入的可拆卸的去細胞化室(2)，其中待處理的同種異體或異種的外源物質(8)沿處理介質流的流向，借助于拆卸裝入去細胞化室(2)，用連接管(12、13)連接于環(huán)形管道(1)的墊板(10、11)具有固定部分(14、15)，沿著流向在事先加有張力的情形下是可固定的。
全文摘要
本發(fā)明涉及將同種異體和異種的外源物質去細胞化的方法，用于隨后制備由假體受體的自體細胞包覆的生物假體，在該方法中將外源物質首先在膽汁酸中，然后在醇中進行化學性處理，并分別在之間和之后的用洗滌步驟處理，并且至少在最后的洗滌步驟中還與作用于組織和細胞上的由流動處理介質產生的力的機械性影響相結合。經處理后，組織完全脫離外源細胞物質和病毒，并表現為極好的用于包覆生物假體受體的細胞的起始產物。
文檔編號A61L2/18GK1535164SQ01819951
公開日2004年10月6日 申請日期2001年12月5日 優(yōu)先權日2000年12月20日
發(fā)明者W·科納茨, P·德曼, W 科納茨 申請人:組織培養(yǎng)自動化有限公司